CN1367835A - 经修饰的细胞色素p450单加氧酶 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及到一些经修饰的细胞色素P450单加氧酶,这些单加氧酶具有改变的底物分布,本发明还涉及到编码该酶的核酸序列、表达结构体和载体、含有这些载体的重组微生物体以及用于进行末端或者次末端羟化的脂肪族羧酸的微生物生产的加工过程。
Description
本发明涉及到一些经修饰的细胞色素P450单加氧酶，这些单加氧酶具有改变的底物分布，本发明还涉及到编码该酶的核酸序列、表达结构体和载体、含有这些载体的重组微生物体以及用于进行末端或者次末端(subterminally)羟化的脂肪族羧酸的生物生产的加工过程。
名为P450BM-3的单加氧酶为来自巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)的一种细胞色素P450酶，并且该酶同哺乳类P450酶具有显著的序列同源性(1)。由于这些相关性，P450 BM-3便构成了该类P450酶的一个优秀的模式系统。P450 BM-3主要在长链饱和脂肪酸的ω-1、ω-2和ω-3碳原子上进行羟化。酰胺或醇类似物以及不饱和脂肪酸的环氧化物也可被转化(1-3)。对饱和脂肪酸的催化活性取决于其链长，最佳链长为14至16个碳原子。该酶对链长短于12个碳原子的脂肪酸不表现出催化活性(1)。
发明概述
本发明的一个目的是提供一些细胞色素P450单加氧酶突变体，该突变体同野生型酶相比表现出经修饰的底物分布。特别地，一个目的为提供一种新的突变体，该突变体在另一个链位置羟化饱和的脂肪羧酸并且/或者具有一种经修饰的底物特异性。特别地，一个目的为提供一种对中等链长的脂肪族羧酸具有催化活性的突变体，特别是对链长为8到12个碳原子的脂肪族羧酸，如，8到10个碳原子，并且该突变体在次末端对该羧酸进行羟化，特别是在位置ω-1、ω-2和/或ω-3。
我们发现，该目的已经通过提供经修饰的细胞色素P450单加氧酶而实现，由于其底物结合区域上的直接进化以及位点特异性突变的综合作用，该酶在对脂肪族羧酸进行的末端和/或次末端酶促羟化上同野生型相比较表现出变化的反应模式或底物分布。
发明详述
同野生型的酶相比较，本发明的突变体中观察到了“变化的底物分布”。根据本发明的目的，“变化的底物分布”指的是，a)一种改善的反应性，例如，比活的提高(以nmol反应羧酸/分钟/nmol P450酶表示)或者至少一种动力学参数的提高，该参数选自Kcat、Km和Kcat/Km，例如该突变体对于至少一种可羟化的脂肪族羧酸或者一种脂肪族羧酸的一种可羟化的衍生物具有至少1％的提高，例如，10到1000％、10到500％或10到100％的提高，以及/或者b)在该羧酸的羟化中的一种改变的区域选择性，特别是一种提高的区域选择性。由此产生了在至少一种可羟化的脂肪族羧酸或者一种脂肪族羧酸的一种可羟化的衍生物中的优选的末端或次末端(ω-1、ω-2、ω-3、ω-4，特别是ω-1到ω-3)羟化位置的变动。可观察到与本发明一致的“变化的底物分布”的可羟化脂肪族羧酸或其衍生物为具有8到30个碳原子的分支羧酸或者在优选的情况下为8到30个碳原子的直链的羧酸。该底物分布的本发明的变化可在全部长度(即，C8-C30)或者仅在某些部分上显示，例如对于C8-C12、C10-C12、C12-C30、C12-C25或C12-C20的羧酸或者来自这些部分的单个羧酸。
可能提及的根据本发明可被羟化的羧酸的非限制性的例子为：辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、十二烷酸、十三烷酸、十四烷酸、十五烷酸、棕榈酸、十七烷酸、十八烷酸、十九烷酸、二十烷酸、廿二烷酸、二十四烷酸、二十六烷酸以及三十烷酸。适当的羧酸衍生物的例子为C1-C4烷基酯、酰胺或者酐，在优选的情况下它们具有短链的C1-C4羧酸。
本发明的单加氧酶在优选的情况下衍生自细胞色素P450单加氧酶，该P450单加氧酶来自E.C.1.14.-.-类别的酶，特别来自P450家族CYP102，并且该单加氧酶为真核或者原核来源，特别是细菌来源。
这些突变体的一个特别优选的群体来自巨大芽孢杆菌细胞色素P450单加氧酶BM-3，其氨基酸序列见SEQ ID NO：2，该序列具有至少一个在下列氨基酸序列区域之一的功能性突变：，24-28、45-51、70-72、73-82(螺旋5)、86-88(螺旋6)、172-224(F/G转角(loop))以及352-356(β-strand 8)，这些突变的前提是如果该酶具有突变F87A，则这些区域中的多个被突变，该群体还来自这些突变体的功能性等价物。
在本描述中，所讨论的突变以氨基酸单字母编码表示。原氨基酸在显示该突变的序列位置的数字前标示，而变动的氨基酸在该数字后标示。
“功能性突变”根据本发明的目的包括在上述区域的一种氨基酸交换，该交换导致一种上文定义的“变化的反应模式”或“变化的底物分布”。
根据本发明，P450 BM-3单加氧酶突变体(群体(A))是优选的，在氨基酸区域86-88、172-224、73-82、45-51以及24-28(根据SEQ IDNO：2)，该突变体单独地或组合地至少在每种情况下含有一种功能性突变。
由此，例如，Phe87可以被具有脂肪族侧链的氨基酸替换，如Ala、Val、Leu，特别是Val或者Ala；Leu188可以被具有一个氨基或者氨基侧链的氨基酸替换，如Asn、Gln、Arg或者，特别是Lys，或者诸如Ala、Gly、Ser以及Trp这样的氨基酸；Ala74可以被具有脂肪族侧链的另一种氨基酸替换，如Val，特别是Gly；Arg47可以被一种具有环状侧链基团的氨基酸替换，如His、Try或者，特别是Phe；Val26可以被一种具有羟基侧链基团的氨基酸替换，如Ser或者，特别是Thr。
优选的群体群体(A)突变体表现出至少一种以下的氨基酸替换模式：
a)F87V；
b)F87A，L188K；
c)F87V，L188K；
d)F87A，L188K；A74G；
e)F87V，L188K，A74G；
f)F87A，L188K，A74G，R47F；
g)F87V，L188K，A74G，R47F；
h)F87A，L188K，A74G，R47F，V26T；或
i)F87V，L188K，A74G，R47F，V26T；
以及它们的功能性等价物。
适当的突变体的一个进一步的群体，群体(B)在上述的序列区域之一或者在序列区域70-72以及352-356之一中表现出一个单独的氨基酸替换。在这两个刚刚提及的序列区域内，Ser72，例如，可以被具有脂肪侧链的氨基酸替换，如Ala、Val、Leu、Ile以及，特别地，Gly，并且Met354可被具有羟基侧链基团的氨基酸替换，例如，Ser，或者，特别地，Thr。
特别地，群体B表现出来自以下的一个氨基酸替换：
a)V26T，
b)R47F，
c)S72G
d)A74G，
e)F87V
f)L188z，其中z为K、R、W、Q、N、G、A或S
以及
g)M354T；
以及它们的功能性等价物。
“功能性等价物”应被理解作根据本发明的突变体的意思，这些突变体在上述的序列位点中的至少一个上表现出一种氨基酸替换，该替换不同于具体提到过的替换，但仍然可产生一种突变体，该突变体同具体提及的突变体一样对于野生型表现出上文定义的“变化的底物分布”。功能性等价物特别在该反应模式的变化在质上相应的情况下存在。
“功能性等价物”还自然地涵盖P450单加氧酶突变体，该突变体与具体提及的P450 BM3突变体类似，可通过对来自其它生物体的P450酶进行突变而获得。例如，同源序列区域可通过序列比较而鉴别。根据在本发明具体建立的原理，分子构模(molecular modeling)的现代方法允许进行影响反应模式的等价突变。
“功能性等价物”还涵盖了一些突变体，这些突变体可通过一个或者多个额外的氨基酸添加、替换、删除和/或反转而获得，上述的额外的变动可能在任何序列位置上发生，只要这些变动产生具有上述意义的“变化的底物分布”的突变体。
本发明进一步涉及到编码一种单加氧酶或者一种根据上文定义的“功能性等价物”的核酸序列。这些序列在优选的情况下可通过密码子交换获自SEQ ID NO：1，该交换根据上述的氨基酸替换模式进行。
本发明还包括一些核酸序列，这些序列含有所谓的沉默突变序列或者同具体提及的序列相比有所变化，该变化根据具体来源或宿主生物体的密码子偏倚性而进行，本发明还包括这些核苷酸序列的天然存在的变体。本发明还包括通过遗传密码的简并性(即，不改变其对应的氨基酸序列)或者通过保守核苷酸替换(即，所对应的氨基酸被另一个氨基酸替换，该氨基酸具有相同的电荷、大小、极性和/或溶解度)所获得的该核苷酸序列的变体，本发明还包括通过对核苷酸进行添加、插入、反转或删除所加以变化的序列以及编码本发明的具有“变化的底物分布”单加氧酶的序列。
本发明进一步涉及到一些表达结构体，这些表达结构体含有一种核苷酸序列，该序列编码本发明的一种突变体并且该序列处于调控核酸序列的控制之下；以及含有至少一种这样的表达结构体的载体。
在优选的情况下，本发明的结构体在所述的编码序列的5’-上游含有一种启动子并且在3’-下游含有一种终止子序列，并且在适当的情况下含有其它的通用调控元件，该各种情况下这些序列均与编码序列可操作性地连接。操作性连接应被理解为启动子、编码序列、终止子以及在适当情况下的其它调控元件以一种方式顺序排列，该方式可使这些调控元件在该编码序列的表达上发挥需要其被需要的功能。操作性可连接的序列的例子为目的序列、或者还有翻译增强子、多腺苷酸化信号、选择标记、扩增信号、复制原点及其它类似物。
除人工的调控序列之外，天然的调控序列也存在于实际结构基因(structural gene)的上游。如果需要，该天然调控可以通过遗传变化而关闭，并且这些基因的表达可被增强或降低。然而，该基因结构体还可在结构上更加简单，即，不在该构成基因的上游插入额外的调控信号并且具有调控作用的天然启动子不被除去。作为替代，该天然调控序列经突变以使调控不再进行并且该基因表达被提高或降低。该基因结构体中可存在该核酸序列的一个或多个拷贝。
启动子的例子包括：cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、gal、trc、ara、SP6、1-PR或者1-PL启动子，所有这些均可在革兰氏阴性菌中有利地使用；以及革兰氏阳性启动子amy和SPO2，酵母启动子ADC1、Mfa、AC、P-60、CYC1、GAPDH或者植物启动子CaMv/35S、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、nos或者泛素或菜豆蛋白启动子。
原则上，所有具有其调节序列的天然启动子均可使用。另外，人工合成的启动子也可以在有利的方式下使用。
上述的调控序列被期望实现该核酸序列的直接表达。根据其宿主生物体，这可能意味着，例如，该基因仅仅在诱导发生后进行表达或者过表达，或者该基因被瞬时表达或者过表达。
该调控序列或者因子在优选的情况下可对表达具有正性影响并且以此方式提高或降低该表达。由此，可通过使用诸如启动子和/或“增强子”这样的强转录信号在转录水平上产生调控元件的增强。另外，还可通过，例如提高mRNA的稳定性，来增强翻译。
通过将一种适当的启动子同一种适当的单加氧酶核苷酸序列以及一种终止子信号或者多聚腺苷酸化信号进行融合而产生了一种表达框。为此目的，通用的重组和克隆工艺被使用，这些工艺根据，例如，T.Maniatis，E.F.Fritsh and J.Sambrook，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，NY(1989)以及T.J.Silhavy，M.L.Berman and L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)以及Ausubel，F.M.et al.，CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.andWiley Interscience(1987)所作的描述而进行。
为在适当的宿主中进行表达，该重组核酸结构体或基因结构体被有利地插入一种宿主特异性载体，该载体可使该基因在该宿主中进行最佳的表达。这些载体为技术人员所熟知，并可见于，例如，“克隆载体”(Pouwels P.H.et al.，Ed.，Elsevier，Amsterdam-NewYork-Oxford，1985)。载体应被理解为不仅指质粒，而且还指技术人员已知的其它载体，例如，噬菌体、病毒，如SV40、CMV、杆状病毒以及腺病毒，转位子、IS元件、质粒、粘粒以及线性或者环状DNA。这些载体可在宿主体内自行复制或者在染色体上复制。
本发明的载体产生了重组微生物体，这些微生物体可以以至少一种本发明的载体进行转化并且可用于生产该突变体。上文所描述的重组结构体可被有利地引入一种适当的宿主系统并且进行表达。为在所讨论的表达系统中进行上文提及的核酸的表达，使用技术人员已知的常用的克隆和转染方法是优选的，该方法的例子如共沉淀、原生质体融合、电穿孔、反转录病毒转染以及类似方法。适当的系统的描述见Current Protocols in Molecular Biology，F.Ausubel et al.，Ed.，Wiley Interscience，New York 1997。
适当的宿主生物体主要有，允许本发明的核酸、它们的等位变体、它们的功能性等价物或衍生物表达的所有生物体。宿主生物体的意思应被理解为，例如，细菌、真菌、酵母或植物或者动物细胞。优选的生物体为细菌，例如埃希杆菌类的细菌，如大肠埃希氏杆菌、链霉菌、芽胞杆菌或假单胞菌，真核微生物，如酿酒酵母、曲霉，以及来自动物或者植物的高等真核细胞，例如Sf9或者CHO细胞。
如果需要，该基因产物的表达还可以在转基因生物体内进行，例如转基因动物，如，特别地，小鼠、绵羊，或者转基因植物。转基因生物体还可以是敲除动物或者植物，在它们中对应的内源基因已被去除，例如，通过突变或部分或完全删除。
可通过标记基因的方法选择被成功转化的生物体，该基因包含于该载体或者表达框中。这样的标记基因的例子为对抗生素产生抗性的基因以及催化一种颜色反应的酶的基因，该颜色反应导致被转化的细胞显色。这些细胞可通过自动细胞分选的方法进行选择。以某种载体成功进行转化并且携带有一种抵抗抗生素(例如G418或潮霉素)的适当的基因的微生物可以通过含有抗生素的适当的固体或者液体培养基进行选择。存在于细胞表面的标记蛋白可被用于通过亲和层析进行的选择。
宿主生物体和同该生物体匹配的载体的组合形成了一个表达系统，该载体的的例子如质粒、病毒或者噬菌体，例如具有RNA聚合酶/启动子系统的质粒、噬菌体λ、μ或其它温和(temperate)噬菌体或者转位子和/或进一步有利的调控序列。术语“表达系统”应被理解为，例如哺乳细胞和适于哺乳细胞的载体，哺乳细胞如CHO细胞，载体的例子如pcDNA3neo载体。
如上文所描述，该基因产物可在有利情况下在转基因动物中表达，如小鼠、绵羊，或在转基因植物中表达。等价地，可以设置具有来自该核酸的RNA的无细胞翻译系统。
本发明进一步涉及到用于制备本发明的一种单加氧酶的加工过程，在该加工过程中，一种产生单加氧酶的微生物被培养，在适当的情况下对单加氧酶的表达进行了诱导，该单加氧酶被分离自该培养物。通过这种方式，本发明的单加氧酶还可在需要的情况下进行工业规模的生产。
该微生物可通过已知方法进行培养和发酵。例如，可在20到40℃和6到9的pH下在LB或TB培养基中扩增细菌。适当的培养条件的详细描述见，例如T.Maniatis，E.F.Fritsh and J.Sambrook，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)。
除非该单加氧酶被分泌入培养基，这些细胞随后被破碎，并且该单加氧酶通过已知的蛋白分离方法从裂解物中获得。根据需要这些细胞的裂解可通过高频超声、高压，如在一个French pressure cell中进行，通过渗透，通过去污剂、细胞溶解酶或有机溶剂的作用，通过匀浆器或通过综合使用以上几种方法来进行。
该单加氧酶可通过层析的已知方法来进行纯化，例如分子筛层析(凝胶过滤)，如在Q-Sepharose上进行的层析，离子交换层析以及疏水性层析，该单加氧酶的纯化还可通过其它常用方法进行，例如超滤、结晶、盐析出、透析以及活性凝胶电泳进行。适当的方法的描述见，例如，Cooper，F.G.，Biochemische Arbeitsmethoden(Methodsin Biochemistry)，Verlag Walter de Gruyter，Berlin，New York或者Scopes，R.，Protein Purification，Springer Verlag，New York，Heidelberg，Berlin。
为分离该重组蛋白，使用某些载体系统或寡核苷酸是特别有利的，这些载体系统或寡核苷酸通过特定的核酸序列延伸该cDNA并由此而编码用于纯化目的的变化的多肽或融合蛋白。这样的适当的修饰为，例如，作为锚定物的标记，如被称为六组氨酸锚定物的的修饰或者可被识别为抗体的抗原的表位(描述例见Harlow，E.and Lane，D.，1988，Antibodies：A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor(N.Y.)Press)。这些锚定物可被用于将这些蛋白粘附于固体支持物，例如，一种多聚物基体，该支持物可被填充入一种层析柱或在一种酶标板或者任何其它的载体上使用。
与此同时，这些锚定物还可以被用于识别该蛋白。为识别该蛋白而使用传统的标记也是可以的，例如单独使用荧光染料、酶标记或者放射性标记或将其同该锚定物联合使用以产生该蛋白，其中的酶标记在同底物反应之后形成一种可检测的反应产物。
本发明进一步涉及到用于进行末端或者次末端(ω-1到ω-4)羟化的脂肪族羧酸的酶学生产的生化过程，该过程包括
a1)在存在一种培养基的情况下通气培养一种本发明的重组微生物，该培养基含有至少一种可羟化的羧酸或者至少一种可羟化的羧酸衍生物；或者
a2)通气温浴培养一种反应介质及本发明的一种突变株，该介质含有至少一种可羟化的羧酸或者至少一种可羟化的羧酸衍生物，并且
b)从该培养基中分离所产生的羟化产物或产物混合物。
在本发明中可使用该羧酸自身或其衍生物，例如，特别地，C1-C4-烷基酯或者羧酸酰胺。
可在本发明的加工过程中被优选地应用的可羟化羧酸为一种C8-C30-单羧酸或其一种衍生物，
可在本发明的加工过程中被特别优选地应用的可羟化羧酸为一种C8-C12-单羧酸或其一种衍生物，并且可在本发明的加工过程中被特别优选地应用的单加氧酶为上文群体(A)中的一种突变体。
根据本发明的另一种加工过程，所使用的可羟化羧酸为一种C12-C30-单羧酸或其一种衍生物，并且该单加氧酶为一种选自单突变体F87A、F87V、V26T、S72G、A74G和M354T以及上文群体(A)的f)到i)的多突变体的突变体。
本发明的氧化反应通常在存在大气氧以及电子供体(或还原性等价物)的情况下进行，电子供体的例子如，特别是，NADH、NADPH和Zn/Co(III)Sepulchrat。Zn/Co(III)Sepulchrat的使用的描述见，例如，DE-A-199 35 115，在此其被特别地引用。
如果本发明的羟化以一种重组微生物来进行，首先在有氧条件下在一种复合培养基中对该微生物进行培养直至达到充足的细胞密度是优选的，该复合培养基的例子如TB或者LB培养基，该培养的温度为约在20到40摄氏度，pH值为约6到9。为更好地控制该氧化反应，一种可诱导启动子，特别是一种温度诱导启动子的使用是优选的。在此，提高该温度至所需要的诱导温度，例如，对于PrP1启动子为42℃，维持一段时间以表达该单加氧酶活性，例如1到10或者5到6小时，并且该温度被随后降至约30到40℃。随后在有氧条件下连续进行12小时至3天的培养。
如果，与之相比，本发明的氧化以纯化或者浓缩的酶进行，则本发明的该突变体被溶于一种含有外源底物的介质(约0.01到10mM，或者0.05到5mM)并且该反应在约10到50℃的温度下，如30到40℃，以及约6到9的pH值下(例如，以100到200mM磷酸或者Tris缓冲液进行调节)在存在一种还原试剂的情况下进行，在优选情况下该反应在有氧条件下进行，在该过程期间含有底物的培养基可进一步表现出1到100倍摩尔数过量的还原等价物，以待氧化的底物计。如果需要，该还原试剂可分批加入。
如果需要，氧可以一种已知的方式通过该反应介质。
如果本发明的该加工过程以一种富集或者纯化的酶来进行，可建立如下的反应条件：
底物浓度： 0.1到20mg/ml
酶浓度： 0.1到10mg/ml
反应温度： 20到40℃
pH： 6到8
缓冲液： 0.05到0.2M磷酸钾，Tris/HCl
电子供体： 在优选的情况下分批加入(初始浓度
约为0.1到2mg/ml)
在通过加入电子供体起始反应之前，可以通过加入浓度为1到5％的丙酮(v/v)并且进行简短的预保温(在20到40℃进行1到5分钟)来提高活性。
技术人员可通过常规实验变动这些条件并对所涉及的反应条件进行最优化。
在用于产生具有变化的酶学活性的蛋白工程中存在两种不同的策略：第一种为“理论设计(rational design)”法(4)，第二种为“定向进化”法(5-7)。对于成功的理论设计，高解析度的3维结构模型以及对酶机制的深入了解是至关重要的。尽管经表明理论设计可产生对非天然底物具有高活性的酶突变体(4)，单一氨基酸点替换的效果在突变体的稳定性、活性和特异性上经常无法保证。
即使P45 0 BM-3的X射线结构已经保存于蛋白质数据库(8)，底物和P450在关键的羟化阶段的构象仍是未知的(9-11)。对于定向进化法，一种用于筛选随机突变体的大型文库的有效的检测方法至关重要。对于利用ω-对-硝基苯氧基羧酸(ω-para-nitrophenoxycarboxylic acid)(pNCA)的P450 BM-3突变体F87A，一种光学测试已被证明是有用的(12，13)。单突变体F87A将脂肪酸的羟化位置从位置ω-1、ω-2和ω-3变至ω-位置(13)，并且同在野生型酶中观察到的33％转化率相比该突变体还导致了12-pNCA的完全转化(12)。但是，由于P450 BM-3的单加氧酶结构域包括了400个氨基酸，随机突变的文库的筛选犹如大海捞针一般。
为提高搜索程序的效率，理论设计方法同定向进化方法进行了综合以产生具有修饰的反应性的突变体，特别是用于产生对于中等链长的脂肪酸具有特异性的突变体。本发明的“理论设计”方法基于计算机辅助的蛋白构模以产生一种实随机文库并且很有可能影响所需的特征的残基进行鉴别。通过随机化这些残基和对阳性突变体的筛选而产生了一种亚文库。从结构模型出发，第一步为对对于链长选择性可能很重要的残基进行测定。为产生具有改善的特性的突变体，通过饱和诱变产生的辅助对该模型所提出的突变位点进行了修正。随后，将理论设计考虑在内将具有最佳特性的单突变之间互相进行组合。这一组合策略的应用使得提高P450 BM-3对于中等链长的底物的活性成为可能。
这一策略的应用以及不同来源的P450的序列同源性允许技术人员可以类似地产生其它突变体，这些突变体也是本发明的对象。
本发明在此通过以下实验描述并参考附图进行阐述。这些图形所示为：
图1：P450 BM-3对于新的8-pNCA的分步最优化。对于各突变体显示其对8-pNCA的催化效率，以及
图2：P450 BM-3突变体LARVF同底物8-pNCA的复合物的模型。所示为显示了突变体的5个最佳位点的侧链，这些侧链组合成为突变体LARVF(V26T、R47F、A74G、F87V、L188K)。
模型1：底物/P450 BM-3复合物的构模
底物/P450 BM-3复合物的构模基于P450 BM-3同十四烷酸的复合结构，P450 BM-3的结构已经通过晶体学进行了测定。该结构保存于蛋白质数据库(8)。所述的解析度为2.9Å的晶体结构在一个非对称单位格中含有4个分子。链A被选作为构模复合物中的参照。使用SYBYL“Molecular Builder”(Tripos，Inc.，St.Louis，USA)产生8-pNCA的一种模型作为底物分子。使用SYBYL生物多聚体工具(BiopolymerTool)产生F87A突变体。该底物中的碳原子1到4被置于结合位点以匹配同棕榈酸相结合的碳原子6到9。根据转构象步骤来选择该脂肪酸链的扭角。对P450 BM-3/十二烷酸复合物的NMR研究表明被羟化的碳原子的质子(C10和C11)同血红素铁的距离约为3.0Å，该铁处于II氧化态(10，13)。作为这一发现的结果，所对应的8-pNCA的原子C7和C8分别被置于同该血红素铁4Å和3.6Å的距离上。对硝基苯氧基基团(para-nitrophenoxy)被手工置于结合腔内。另外，该复合体的能量通过对骨架原子进行固定而最小化。
方法2：饱和诱变产生
根据本发明而产生的突变体在饱和诱变产生的辅助下使用Stratagene Quickchange试剂盒(La Jolla，Califonia，USA)来产生。在底物结合通道附近的九个位点，即，P25、V26、R47、Y51、S72、A74、F87、L188和M354，经过P450 BM-3构模这些位点被选择用于突变。用于这些位点的各自的引物编于表1中。
表1：
| 所选位置 | 引物 | 序列号 |
| P25 | 5′-gttattaaacacagataaannngttcaagctttgatg-3′5′-catcaaagcttgaacnnntttatctgtgtttaataac-3′ | SEQ ID NO：9SEQ ID NO：10 |
| V26 | 5′-gttattaaacacagataaaccgnnncaagctttgatg-3′5′-catcaaagcttgnnncggtttatctgtgtttaataac-3′ | SEQ ID NO：11SEQ ID NO：12 |
| R47 | 5′-cgaggcgcctggtnnngtaacgcgctacttatc-3′5′-gataagtagcgcgttacnnnaccaggcgcctcg-3′ | SEQ ID NO：13SEQ ID NO：14 |
| Y51 | 5′-cctggtcgtgtaacgcgcnnnttatcaagtcagc-3′5′-gctgacttgataannngcgcgttacacgaccagg-3′ | SEQ ID NO：15SEQ ID NO：16 |
| S72 | 5′-gctttgataaaaacttannncaagcgcttaaatttgtacg-3′5′-cgtacaaatttaagcgcttgnnntaagtttttatcaaagc-3′ | SEQ ID NO：17SEQ ID NO：18 |
| A74 | 5′-gctttgataaaaacttaaagtcaannncttaaatttgtacg-3′5′-cgtacaaatttaagnnnttgacttaagtttttatcaaagc-3′ | SEQ ID NO：7SEQ ID NO：8 |
| L188 | 5′-gaagcaatgaacaagnnncagcgagcaaatccag-3′5′-ctggatttgctcgctgnnncttgttcattgcttc-3′ | SEQ ID NO：5SEQ ID NO：6 |
| M354 | 5′-ggcgacgaactannngttctgattcctcag-3′5′-ctgaggaatcagaacnnntagttcgtcgcc-3′ | SEQ ID NO：19SEQ ID NO：20 |
| F87 | 5′-gcaggagacggggttgnnnacaagctggacg-3′5′-cgtccagcttgtnnncaaccccgtctcctgc-3′ | SEQ ID NO：3SEQ ID NO：4 |
反应条件对于所有的诱变PCR过程是相同的，除退火温度例外，该温度如下变化：对于位点25、26、188和354为50℃；对于位点47和51为52℃；对于位点72、74和87为46℃。这些反应的反应体积为50μl，每份含17.5pmol的引物、20pmol的模板质粒、3U的Pfu聚合酶以及3.25nmol的各种dNTP。该反应的起始在95℃下进行4分钟，随后各份进行以下的热循环20次：95℃，1分钟；46～52℃，2.5分钟；72℃，17分钟；这样的20个循环后在72℃下进行该反应15分钟。为通过PCR进行位点特异性突变，单独的一个密码子经变动以替换一个氨基酸。为随机化一个特定的氨基酸，所使用的引物中的“nnn”编码一种特定的氨基酸。在37℃下以20U DpnI处理所有的PCR产物溶液3小时以降解原始的未突变的模板DNA。随后转化入E.coliDH5α。
方法3：野生型以及突变体酶的表达和纯化
P450BM-3野生型基因以及其突变体在强温度诱导PRPL启动子pCYTEXP1的控制下在E.coli DH5α(supE44，lacU169[80lacZ M15]，hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1)中表达。根据先前工艺引入单点突变F87A。被转化的细胞被涂于LB琼脂平板上，该平板含有100μg/ml的氨苄青霉素。菌落生长12到24小时后以灭菌牙签挑出并置于96孔板中，该板各孔含有200μl TB培养基(12g胰蛋白胨，24g酵母抽提物，4ml甘油，加蒸馏水至1升)以及100μg/ml的氨苄青霉素。在37℃下过夜培养该平板。随后从各孔中取40μl转入培养试管中，该试管含有2mlTB培养基以及100μg/ml的氨苄青霉素，随后在37℃下培养各份2小时并随后在42℃下培养6小时。通过在4000rpm下离心5分钟取出细胞，以鸡雏白蛋白溶菌酶处理(1U/ml)并随后进行两次冻融。通过在14,000rpm下离心10分钟来获得细胞粗提物。在所产生的上清中测量酶活性。为产生大量的酶，使用含有300ml TB培养基以及100μg/ml的氨苄青霉素的2升摇瓶，在37℃下保温2小时，在200rpm下振荡2小时(OD578nm＝0.8～1.0)并且随后在42℃下保温6小时。通过在4000rpm下离心5分钟收集细胞并且悬浮于15ml的0.1M，pH7.4的磷酸钾缓冲液。在Branson sonifer W25(Dietzenbach，Germany)的辅助之下破碎冰浴中的细胞(80W，2分钟，3个循环)。以32570×g离心该悬浮物20分钟。该粗抽提物被用于测定酶活性或用于酶的纯化。
酶的纯化如(14)中的描述进行，但使用的为BioPilot层析系统(Pharmacia，Sweden)。通过测定总蛋白和酶的量来测定酶的纯度。纯化的酶的含量通过铁(II)形式的羰基符合物同铁(II)形式的吸收光谱的差异来测定，对于波长对450nm和490nm使用摩尔消光值为91mM-1cm-1(1)。
方法4：对于较短链长的底物具有较高活性的突变体的分离
作为野生型的替代，P450 BM-3突变体F87A被用作为模板DNA。对于所涉及的位置的突变如上文所述而产生。在各种情况下，约100个菌落被挑选用于筛选在各位点上的序列区域，并且令其在培养试管中生长，从中分离该细胞并将至裂解。来自各被选中的菌落的细胞粗提物被用于活性测试。同F87A相比，对于至少一种具有比15-pNCA更短链长的底物表现出更高的活性的突变体被测序以鉴定其突变。
在所有具有相同位置的突变体中，对12-pNCA、10-pNCA或者8-pNCA具有最高活性的突变体被选中同其它突变进行下一步组合。组合突变通过位点特异性突变分步进行。组合的程序见图1。从个组合步骤中分离出6个菌落以测定底物活性。一个具有代表性底物特异性的菌落被选中并且测定了纯酶的底物特异性。所选菌落的质粒被用于下一步的位点特异性突变。通过DNA测序鉴定最终突变体中的突变(ABI PRISMRBigD)yeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit and ABIPrismTM 377 DNA Sequencer)。
方法5：酶活性分析
为进行pNCA活性分析，将DMSO中的8μl 10mM的pNCA加入一个一次性的小杯中，其终体积为1ml。向所涉及的pNCA/DMSO溶液中加入850μl的Tris/HCl缓冲液(0.1M，pH8.2)以及0.1到0.4nmol的P450，在以加入50μl的1mN NADPH水溶液来起始反应之前先预保温这些样品5分钟。为测定Kcat和Km，对于各种pNCA底物使用一系列的浓度(关于检测方法的细节，见(12))。
使用一个96孔板(Greiner，Frickenhausen，Germany)以进行酶标板中的pNCA测试。在总反应体积为250μl的Tris/HCl缓冲液(0.1M，pH8.2)中，每个反应含有60nmol 8-pNCA、15nmol 10-pNCA、15nmol12-pNCA或者15nmol 8-pNCA中的一种，在各种情况下均溶于2.5μl的DMSO。在样品同40μl的P450 BM-3样品预保温5分钟后，通过向各小杯中注入30μl的1mM的NADPH溶液而起始该反应。加入NADPH溶液之后立即在405nm下在酶标仪上对这些酶标板进行测定。
方法6：使用本发明的方法对羧酸的转化以及产物的鉴定
a.化学反应
选用以下批组在存在P450 BM-3或其突变体的情况下羟化脂肪酸：
P450 BM-3突变体 20mg
反应缓冲液 20ml(Tris/HCl 50mM，KCl 250mM，pH7.8)
脂肪酸 10mg
丙酮 400μl(2％v/v)(使反应加速2倍)
在反应之前，将酶冻干粉溶于1ml反应缓冲液中并先在36℃下保温30分钟。与2％ v/v的丙酮的加入相类似，该保温导致活性分别提高60到75％。
5分钟的保温之后加入500μl的预制NADPH溶液(12.5mg/ml)。通过在340nm下的吸光测量来监测该反应的过程，可以观测到NADPH的消耗。理论上，对于定比转化需要4ml的NADPH溶液，然而反应溶液中的不适当的高NADPH浓度导致酶的失活，这就是为什么要加入500μl的该辅因子的原因。
反应结束之后，以5M盐酸将该溶液酸化至pH为2。脂肪酸或者羟化的脂肪酸在这期间沉淀并在溶液中导致可见的混浊。此后对于各组以10ml的二氯甲烷抽提该混合物两次并在硫酸钠中干燥。在通过折叠滤纸进行干燥之后使用氮气通过旋转蒸发器除去二氯甲烷。所余留的白色固体在2ml的二氯甲烷中吸收并用于GC分析。
b)通过气相色谱进行的分析
装备有FID的Fisons气相色谱系统(Fisons Instruments MegaSeries，Mainz，Germany)被用于该分析(Optima 5-柱，内径25m×0.25mm，Macherey & Nagel，Düren，Germany)。
为进行分析，起始材料和产物均以MSHFBA进行硅化。在此期间，所有的羟基和酸基团均被分别转化成为三甲基硅烷醚和酯(trimethylsilyl ether and ester)。必须小心使该样品中不含水，否则将导致其它的侧链同硅化试剂的反应。向10μl的含有羟基脂肪酸的二氯甲烷中加入15μl的MSHFBA并在室温下温浴该混合物15分钟。在加入25μl的二氯甲烷之后进行该GC分析。
为此目的，1μl的硅化样品被注入气相色谱。注样器和检测器温度为350℃。所使用的为以下的温度程序：
辛酸
辛酸
辛酸
实施例1：起始突变体的选择
P450 BM-3单突变体F87A被用作起始模板。如所述及，该突变将其在饱和C12和C14脂肪酸的羟化位置从ω-1、ω-2和ω-3变至ω-位置(13)。对于12-pNCA和15-pNCA的转化，同样表明该ω-羟化同野生型相比显著地提高了(12)。关于12-pNCA的ω-羟化，已经获得到完全的转化，与之相比野生型的转化率为33％。除区域选择性的提高之外，对于12-pNCA和15-pNCA还观察到了增强的活性(比较表2)。
表2：所选择的P450 BM-3突变体对于具有不同链长的各种pNCA衍生物的的比活1
1比活单位：nmol/min/nmol P450
| 底物 | WT | F87A | L188K | V26T | R47F | S72G | A74G | M354T |
| 15-pNCA | 405 | 410 | 288 | 519 | 258 | 439 | 474 | 560 |
| 12-pNCA | 141 | 284 | 316 | 555 | 233 | 596 | 517 | 480 |
| 10-pNCA | 339 | 92 | 207 | 106 | 52 | 150 | 103 | 171 |
| 8-pNCA | 15 | 2 | 69 | 16 | 13 | 3 | 6 | 4 |
参考结构模型可以理解F87A的区域活性的提高。苯丙氨酸对庞大的F87的替换增大了由F87、V78、A82、T260、I263和A264所形成的对-硝基苯氧基基团的结合腔。另外还增进了巨大的对-硝基苯氧基基团同该结合腔的接近，并且还消除了F87同pNCA的碳原子ω-2和ω-1的空间相互作用。这导致了ω-位置对于血红素铁原子更有利的定向。
实施例2：通过构模进行的单一突变位点的选择、所选位点的位点特异性随机诱变以及筛选
1.突变位点的选择
结合C8-pNCA底物的模型显示羧基同羧基结合残基R47以及Y51的距离分别为9和11Å。为诱导对于C8底物的活性，必须产生一个新的结合位点，该位点同该底物的羧基基团在一个适当的距离上。额外的残基被定位于结合位点以辅助8-pNCA的结合。所选择的为以下的残基：残基R47和Y51，它们形成了原初的羧基结合位点。对于R47，该残基的胍基团被认为同底物的羧基残基形成了离子对；Y51同该底物的羧基基团形成了氢键(9)。在十四烷酸/P450 BM-3复合体中R47的Cα原子同该脂肪酸羧基基团的碳原子的距离为12Å。在8-pNCA模型的羧基基团的12Å半径的半球内的所有残基被鉴定，并且只有在结合腔内具有朝向该脂肪酸的羧基基团的侧链的残基被选中。以此方式，P25、V26、S72、A74、L188和M354被选中，这些残基可能形成对于短链pNCA化合物的新的羧基结合位点。这6个残基均以一种弹性构象位于二级结构元件中(11)。
2.突变和筛选
通过对所述位置的野生型密码子进行的位点特异性随机突变产生了8个被选中的残基各自的突变体。为保证19个可能的氨基酸种类被尽可能多地测试，各位置的100个菌落被分离、培养和活性测试(除对于色氨酸和甲硫氨酸的可能性为79％之外，各种氨基酸被测试的可能性由此而大于95％)。对于至少一种具有比15-pNCA更短的链长的底物具有较高活性的突变体被选择进行测序以鉴定突变。
位点188表现得相对可变化。100个菌落中的大多数对于pNCA表现出活性。由此，根据其对8-pNCA的活性，37个菌落被选中。检测到了包括野生型在内的16个不同的氨基酸类型。这些结果进一步证实选择100个菌落足以保证20个氨基酸尽可能多地被测试。在15个替换中，替换K、R、W、Q、N、G、A和S显著地提高了对于较短链长底物的催化活性。负电氨基酸对L的替换产生了对于10-pNCA、12-pNCA和15-pNCA的活性，该活性降低了3到7倍。
其余的7个位点以同位点188类似的方式进行随机化。对于每个位点选择7到19个菌落进行突变检测。这些基因的多数不是未被突变，就是该基因产物对于较短链长的底物表现出降低的活性(该测试以纯酶进行)。在各种情况下位点26、47、74和354仅有一种突变体，位点72有两种突变体并且位点P25和Y51没有突变体对于链长短于15-pNCA的底物表现出较高的活性。位点188和位点72的对8-pNCA具有最高活性的突变体以及位点26、47、74和354的单一突变体被选择用于组合。列于上文表2中的这些突变含有以下的替换：V26T、R47F、S72G、A74G、L188K以及M354T。同F87A相比较，对于8-pNCA的比活提高了0.5到33.5倍。这些突变均逐步同原突变F87A进行了组合。
实施例3：突变体的逐步组合所产生的多突变体及其筛选
1.突变体L(F87A，L188K)
由于单一突变体的组合不一定导致个体效能的积累，第一种突变体的选择十分关键。第一种突变的错误选择可能导致一种不产生最佳复合突变的进化途径。对于一个巨大的单突变体起始库，组合多样性很有可能巨大无比，因此，找到所需的复合突变体是不可能的。
选择突变体L作为起始材料符合了两个标准：同所有其它的突变体相比较其所具有的对于8-pNCA的提高的活性(表2)，以及酶/底物相互作用和结合位点特征的变化。为证实这些变化，通过在SYBYL方法的辅助之下置换该突变位点的侧链来产生所选突变体的模型。L188位于α-螺旋F的C末端。底物结合使该螺旋及其附近的G螺旋进行了最大的变动(9)。该模型表明亮氨酸同赖氨酸的交换导致了一种新的理论上的羧基结合位点的形成。K188的氨基基团同8-pNCA的羧基残基之间的距离为6Å，这样该距离同十四烷酸的羧基基团与R47(原结合残基)的胍基基团之间的距离便是可以比较的，该数值可经实验测定。8-pNCA的羧基基团与R47的胍基基团之间的距离为11.4Å。因此可以认为底物的羧基基团同K188以及被羟化的C8原子之间的离子配对反应在血红素铁原子的反应距离内进行。
其它的5种突变体通过位点特异的诱变同突变体L逐步进行组合(比较图1)。对于各突变步骤产生了所选突变体的结构模型。参考这一模型对所选突变体在底物结合上的效果进行了研究，并且在此基础上提出了突变体的最优化特性及其组合的理论解释。
2.突变体LA(F87A，L188K，A74G)
通过向突变体L引入突变A74G而提高了对8-pNCA的催化效率。A74位于α-螺旋B’的N-末端。由于A74侧链同K188的氨基基团的进行空间相互作用，该相互作用通过甘氨酸同A74的交换而消除，由此而允许了该侧链相对于该底物的羧基基团的更有利的定向。
3.突变体LAR(F87A，L188K，A74G，R47F)
通过引入突变R47F，对于8-pNCA的催化效率被成功地提高了。该突变具有两种可能的效果。苯丙氨酸阻碍了原羧基的结合并且增大了位于结合通道的暴露于溶剂的疏水部分，该通道由残基F11、L14、L17、P18、P45和A191(比较图2)。该疏水部分对于底物的接触特别重要(11)。
4.突变体LARV(F87A，L188K，A74G，R47F，V26T)
如果突变M354T被加入至突变LAR，对8-pNCA Kcat值会降低。M354T因此不再参与进一步的组合实验。然而，如果突变V26T被加入至突变体LAR，所产生的突变体表现出比LAR略高的Kcat值以及略低的Km值。对8-pNCA的催化效率被提高了。如果，替代地，在突变体LAR中进行突变S72G，8-pNCA的Kcat值被降低。这就是为什么突变LARV被选用于进一步的突变。
V26位于α-螺旋A的N-末端。模型提示T26可能扮演结合位点的Y51的角色并且可能通过形成氢键来稳定该底物的羧基基团。T26的羟基基团同K188的氨基基团的距离为6.9Å。同原结合位点相比，该距离提高了约2Å(Y51的羟基基团同R47的胍基基团之间为4.8Å)。由此含有K188的F螺旋有可能被用于进一步的构象变换，这是因为对于该变换8-pNCA保持更深入于结合区域，并且T26同K188的距离被降低。
5.突变体LARVF(F87A，L188K，A74G，R47F，V26T)
位点87能够被证实对于催化活性以及酶的底物特异性具有特别的重要性(3，13)。这就是通过位点特异性随机化诱变在位点87上对突变体LARV进行最优化的原因。在100个菌落中获得了一个突变体，该突变体对8-Pnca表现出的催化效率为3.5×104s-1M-1。DNA序列揭示位置87的丙氨酸为缬氨酸所替换。
从晶体结构(11)以及较早的实验中已知(3，13)，R87对于底物对血红素铁的接近十分重要。这一底物的的庞大的对-硝基苯氧基使得通过以丙氨酸替换苯丙氨酸来增大结合位点的十分必要。通过以缬氨酸替换A87，出于醚氧基和V87的侧链的空间作用，Cω同血红素铁原子的接触被改善了。
数据揭示，从F87A到L以及LARV到LARVF的两个关键步骤提高了对于8-pNCA的催化效率。这就产生了一个问题，是否可在不失去对8-pNCA的活性的情况下对突变体LARVF中的其它突变进行回复。因此产生了含有F87V以替代F87A的突变体。这些突变体具有以下的名称：
1.)具有突变F87V L188K的L7V
2.)具有突变F87V L188K A74G的AL7V
3.)具有突变F87V L188K A74GR47F的ARL7V
在活性分析中获得了以下的结果。
表3：P450 BM-3突变体对于不同链长的pNCA衍生物的动力学参数，测定在pH 8.0以及25c下进行
| Kcat(s-1) | Km(μM) | Kcat/Km(s-1M-1) | |||||||
| 12 | 10 | 8 | 12 | 10 | 8 | 12 | 10 | 8 | |
| F87V | 0,7 | 1,8 | - | 3,8 | 8,5 | - | 1,7·105 | 2,1·105 | - |
| L7V | 2,8 | 4,7 | - | 6,4 | 14,2 | - | 4,3·105 | 3,3·105 | - |
| AL7V | 2,2 | 5,9 | 4,3 | 15,1 | 22,7 | 197,6 | 1,4·105 | 2,6·105 | 2,0·104 |
| ARL7V | 1,4 | 5,5 | 3,9 | 8,9 | 17,5 | 41,4 | 1,7·105 | 3,1·105 | 9,3·104 |
| ARVLF | 1,4 | 7,2 | 0,2 | 12,3 | 44,8 | 6,5 | 9,2·104 | 1,6·105 | 3,5·104 |
这些结果显示突变体F87V和L7V对于底物8-pNCA不表现出可检测到的转化。这些结果进一步显示四突变体ARL7V表现出比五突变体ARVLF更好的催化效率。
进一步，突变体ARL7F以及ARVLF对于癸酸(C10)具有高活性，该酸比野生型酶的最短天然脂肪酸底物短两个碳原子。进一步，当十二烷酸(C12)被用作为底物时观察到了ω-4-单羟化产物，而P450 BM-3的野生型酶仅在位置ω-1、ω-2和ω-3具有活性。
实施例4：对于不同链长的羧酸以及不同的突变体的优选羟化位置的测定以及同野生型酶的比较
根据上文所述的方法进行各反应组并进行分析(6)。
结果编于下文表4中。
表4
| 羟化位点 | 癸酸(C10)[％] | 十二烷酸(C12)[％] |
| 野生型 | ||
| ω-3 | - | 34 |
| ω-2 | - | 28 |
| ω-1 | - | 38 |
| 突变体L7V | ||
| ω-3 | - | 53 |
| ω-2 | - | 30 |
| ω-1 | - | 17 |
| 突变体F8V | ||
| ω-3 | - | 51 |
| ω-2 | - | 25 |
| ω-1 | - | 24 |
| 突变体AL7V | ||
| ω-3 | - | 28 |
| ω-2 | - | 54 |
| ω-1 | - | 18 |
| 突变体ARLL7V | ||
| ω-3 | 14 | 35 |
| ω-2 | 33 | 50 |
| ω-1 | 53 | 15 |
| 突变体ARVLF | ||
| ω-3 | 15 | 34 |
| ω-2 | 30 | 53 |
| ω-1 | 55 | 13 |
在十二酸的羟化中，引人注意的是在从野生型向P450 BM-3 F87V转变的过程中发生了区域选择性的变化，P450 BM-3 F87V优选地催化ω-3的羟化，对于P450 BM-3 L7V也是如此。在转变为三突变体的过程中，该区域选择性同样发生变化；P450 BM-3 AL7V、P450 BM-3 ARL7V以及P450 BM-3 ARVLF优选地引导对ω-2位置的羟化。
所有的GC分析均表明，癸酸仅仅为P450 BM-3 ARVLF以及P450 BM-3ARL7V所转化，而在其它突变体中仅发现了1％的转化。这两种酶均表现出实际相同的区域选择性，ω-1为其所优选。
为测定反应产率，对标准物的气相色谱进行了记录。所使用的起始材料标准物为癸酸或者十二烷酸溶液，以二氯甲烷作为溶剂(浓度0.5mg/ml)。由于FID方法，在起始材料和产物之间简单比较峰域是不可能的，这是因为具有不同结构和经验式(expirical formulae)的分子在燃烧下产生不同的离子流(ion flux)。这些离子流与起始材料和产物的比例不成正比。因此所使用的产物标准物为可购得的10-羟癸酸和12-羟十二烷酸。这些标准物同产物的的经验式是相同的，并且其结构仅仅在羟基基团的位置上有差异，这就是对于相同的量可预期大致相同的可检测离子流的原因。
在以P450 BM-3 ARVLF以及P450 BM-3 ARL7V的催化进行的癸酸的羟化中，累积产物产率分别为57％和38％。在十二烷酸的羟化中，P450 BM-3 ARVLF的产率为51％，其它突变体及野生型的产率为38％到40％。
参考文献1. Boddupalli，S.S.，et al.，(1990)J.Biol.Chem.265，
4233-42392. Capdevila，J.H.，et al.，(1996) J.Biol.Chem.271，
22663-226713. Graham-Lorence，S.，et al.，(1997)J.Biol.Chem.272，
1127-11354. Cleland，J.L.und Craik，C.S.，Eds.(1996)Protein Enginee-
ring：Principles and Practice，Wiley-Liss，New York5. Kuchner，O.und Arnold，F.H.，(1997)Trends Biotechnol.15，
523-5306. Stemmer，W.P.C.(1994)Nature(London)370，389-3917. Bornscheuer，U.T.，(1998) Angew.Chem 110，3285-32888. Bernstein，F.C.，et al.，(1977)J.Mol.Biol.112，525-5429. Li，H.und Poulos，T.L.(1997)Nat.Structural Biol.4，
140-14610. Modi，S.，et al.，(1996)Nat.Structural Biol.3，414-41711. Ravichandran，K.G.，et al.，(1993)Science 261，731-73612. Schwaneberg，U.，et al.，(1999)Anal.Biochem.269，359-36613. Oliver，c.F.，et al.，(1997)Biochemistry，36，1567-157214. Schwaneberg，U.，et al.，J.Chromatography A，in press15. Cherry，J.R.，et al.，(1999)Nature Biotechnology，17，
379-384
序列表<110>BASF Aktiengesellschaft<120>Modified cytochrome P450 monooxygenases<130>M/40434<140><141><160>20<170>PatentIn Ver. 2.1<210>1<211>3150<212>DNA<213>巨大芽胞杆菌<220><221>CDS<222>(4)..(3150)<400>1atg aca att aaa gaa atg cct cag cca aaa acg ttt gga gag ctt aaa 48Thr Ile Lys Glu Met Pro Gln Pro Lys Thr Phe Gly Glu Leu Lys
1 5 10 15aat tta ccg tta tta aac aca gat aaa ccg gtt caa gct ttg atg aaa 96Asn Leu Pro Leu Leu Asn Thr Asp Lys Pro Val Gln Ala Leu Met Lys
20 25 30att gcg gat gaa tta gga gaa atc ttt aaa ttc gag gcg cct ggt cgt 144Ile Ala Asp Glu Leu Gly Glu Ile Phe Lys Phe Glu Ala Pro Gly Arg
35 40 45gta acg cgc tac tta tca agt cag cgt cta att aaa gaa gca tgc gat 192Val Thr Arg Tyr Leu Ser Ser Gln Arg Leu Ile Lys Glu Ala Cys Asp
50 55 60gaa tca cgc ttt gat aaa aac tta agt caa gcg ctt aaa ttt gta cgt 240Glu Ser Arg Phe Asp Lys Asn Leu Ser Gln Ala Leu Lys Phe Val Arg
65 70 75gat ttt gca gga gac ggg tta ttt aca agc tgg acg cat gaa aaa aat 288Asp Phe Ala Gly Asp Gly Leu Phe Thr Ser Trp Thr His Glu Lys Asn80 85 90 95tgg aaa aaa gcg cat aat atc tta ctt cca agc ttc agt cag cag gca 336Trp Lys Lys Ala His Asn Ile Leu Leu Pro Ser Phe Ser Gln Gln Ala
100 105 110atg aaa ggc tat cat gcg atg atg gtc gat atc gcc gtg cag ctt gtt 384Met Lys Gly Tyr His Ala Met Met Val Asp Ile Ala Val Gln Leu Val
115 120 125caa aag tgg gag cgt cta aat gca gat gag cat att gaa gta ccg gaa 432Gln Lys Trp Glu Arg Leu Asn Ala Asp Glu His Ile Glu Val Pro Glu
130 135 140gac atg aca cgt tta acg ctt gat aca att ggt ctt tgc ggc ttt aac 480Asp Met Thr Arg Leu Thr Leu Asp Thr Ile Gly Leu Cys Gly Phe Asn145 150 155tat cgc ttt aac agc ttt tac cga gat cag cct cat cca ttt att aca 528Tyr Arg Phe Asn Ser Phe Tyr Arg Asp Gln Pro His Pro Phe Ile Thr160 165 170 175agt atg gtc cgt gca ctg gat gaa gca atg aac aag ctg cag cga gca 576Set Met Val Arg Ala Leu Asp Glu Ala Met Asn Lys Leu Gln Arg Ala
180 185 190aat cca gac gac cca gct tat gat gaa aac aag cgc cag ttt caa gaa 624Asn Pro Asp Asp Pro Ala Tyr Asp Glu Asn Lys Arg Gln Phe Gln Glu
195 200 205gat atc aag gtg atg aac gac cta gta gat aaa att att gca gat cgc 672Asp Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Val Asp Lys Ile Ile Ala Asp Arg
210 215 220aaa gca agc ggt gaa caa agc gat gat tta tta acg cat atg cta aac 720Lys Ala Ser Gly Glu Gln Ser Asp Asp Leu Leu Thr His Met Leu Asn225 230 235gga aaa gat cca gaa acg ggt gag ccg ctt gat gac gag aac att cgc 768Gly Lys Asp Pro Glu Thr Gly Glu Pro Leu Asp Asp Glu Asn Ile Arg240 245 250 255tat caa att att aca ttc tta att gcg gga cac gaa aca aca agt ggt 816Tyr Gln Ile Ile Thr Phe Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr Ser Gly
260 265 270ctt tta tca ttt gcg ctg tat ttc tta gtg aaa aat cca cat gta tta 864Leu Leu Ser Phe Ala Leu Tyr Phe Leu Val Lys Asn Pro His Val Leu
275 280 285caa aaa gca gca gaa gaa gca gca cga gtt cta gta gat cct gtt cca 912Gln Lys Ala Ala Glu Glu Ala Ala Arg Val Leu Val Asp Pro Val Pro
290 295 300agc tac aaa caa gtc aaa cag ctt aaa tat gtc ggc atg gtc tta aac 960Ser Tyr Lys Gln Val Lys Gln Leu Lys Tyr Val Gly Met Val Leu Asn305 310 315gaa gcg ctg cgc tta tgg cca act gct cct gcg ttt tcc cta tat gca 1008Glu Ala Leu Arg Leu Trp Pro Thr Ala Pro Ala Phe Ser Leu Tyr Ala320 325 330 335aaa gaa gat acg gtg ctt gga gga gaa tat cct tta gaa aaa ggc gac 1056Lys Glu Asp Thr Val Leu Gly Gly Glu Tyr Pro Leu Glu Lys Gly Asp
340 345 350gaa cta atg gtt ctg att cct cag ctt cac cgt gat aaa aca att tgg 1104Glu Leu Met Val Leu Ile Pro Gln Leu His Arg Asp Lys Thr Ile Trp
355 360 365gga gac gat gtg gaa gag ttc cgt cca gag cgt ttt gaa aat cca agt 1152Gly Asp Asp Val Glu Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe Glu Asn Pro Ser
370 375 380gcg att ccg cag cat gcg ttt aaa ccg ttt gga aac ggt cag cgt gcg 1200Ala Ile Pro Gln His Ala Phe Lys Pro Phe Gly Asn Gly Gln Arg Ala385 390 395tgt atc ggt cag cag ttc gct ctt cat gaa gca acg ctg gta ctt ggt 1248Cys Ile Gly Gln Gln Phe Ala Leu His Glu Ala Thr Leu Val Leu Gly400 405 410 415atg atg cta aaa cac ttt gac ttt gaa gat cat aca aac tac gag ctg 1296Met Met Leu Lys His Phe Asp Phe Glu Asp His Thr Asn Tyr Glu Leu
420 425 430gat att aaa gaa act tta acg tta aaa cct gaa ggc ttt gtg gta aaa 1344Asp Ile Lys Glu Thr Leu Thr Leu Lys Pro Glu Gly Phe Val Val Lys
435 440 445gca aaa tcg aaa aaa att ccg ctt ggc ggt att cct tca cct agc act 1392Ala Lys Ser Lys Lys Ile Pro Leu Gly Gly Ile Pro Ser Pro Ser Thr
450 455 460gaa cag tct gct aaa aaa gta cgc aaa aag gca gaa aac gct cat aat 1440Glu Gln Ser Ala Lys Lys Val Arg Lys Lys Ala Glu Asn Ala His Asn465 470 475acg ccg ctg ctt gtg cta tac ggt tca aat atg gga aca gct gaa gga 1488Thr Pro Leu Leu Val Leu Tyr Gly Ser Asn Met Gly Thr Ala Glu Gly480 485 490 495acg gcg cgt gat tta gca gat att gca atg agc aaa gga ttt gca ccg 1536Thr Ala Arg Asp Leu Ala Asp Ile Ala Met Ser Lys Gly Phe Ala Pro
500 505 510cag gtc gca acg ctt gat tca cac gcc gga aat ctt ccg cgc gaa gga 1584Gln Val Ala Thr Leu Asp Ser His Ala Gly Asn Leu Pro Arg Glu Gly
515 520 525gct gta tta att gta acg gcg tct tat aac ggt cat ccg cct gat aac 1632Ala Val Leu Ile Val Thr Ala Ser Tyr Asn Gly His Pro Pro Asp Asn
530 535 540gca aag caa ttt gtc gac tgg tta gac caa gcg tct gct gat gaa gta 1680Ala Lys Gln Phe Val Asp Trp Leu Asp Gln Ala Ser Ala Asp Glu Val545 550 555aaa ggc gtt cgc tac tcc gta ttt gga tgc ggc gat aaa aac tgg gct 1728Lys Gly Val Arg Tyr Ser Val Phe Gly Cys Gly Asp Lys Asn Trp Ala560 565 570 575act acg tat caa aaa gtg cct gct ttt atc gat gaa acg ctt gcc gct 1776Thr Thr Tyr Gln Lys Val Pro Ala Phe Ile Asp Glu Thr Leu Ala Ala
580 585 590aaa ggg gca gaa aac atc gct gac cgc ggt gaa gca gat gca agc gac 1824Lys Gly Ala Glu Asn Ile Ala Asp Arg Gly Glu Ala Asp Ala Ser Asp
595 600 605gac ttt gaa ggc aca tat gaa gaa tgg cgt gaa cat atg tgg agt gac 1872Asp Phe Glu Gly Thr Tyr Glu Glu Trp Arg Glu His Met Trp Ser Asp
610 615 620gta gca gcc tac ttt aac ctc gac att gaa aac agt gaa gat aat aaa 1920Val Ala Ala Tyr Phe Asn Leu Asp Ile Glu Asn Ser Glu Asp Asn Lys625 630 635tct act ctt tca ctt caa ttt gtc gac agc gcc gcg gat atg ccg ctt 1968Ser Thr Leu Ser Leu Gln Phe Val Asp Ser Ala Ala Asp Met Pro Leu640 645 650 655gcg aaa atg cac ggt gcg ttt tca acg aac gtc gta gca agc aaa gaa 2016Ala Lys Met His Gly Ala Phe Ser Thr Asn Val Val Ala Ser Lys Glu
660 665 670ctt caa cag cca ggc agt gca cga agc acg cga cat ctt gaa att gaa 2064Leu Gln Gln Pro Gly Ser Ala Arg Ser Thr Arg His Leu Glu Ile Glu
675 680 685ctt cca aaa gaa gct tct tat caa gaa gga gat cat tta ggt gtt att 2112Leu Pro Lys Glu Ala Ser Tyr Gln Glu Gly Asp His Leu Gly Val Ile
690 695 700cct cgc aac tat gaa gga ata gta aac cgt gta aca gca agg ttc ggc 2160Pro Arg Asn Tyr Glu Gly Ile Val Asn Arg Val Thr Ala Arg Phe Gly705 710 715cta gat gca tca cag caa atc cgt ctg gaa gca gaa gaa gaa aaa tta 2208Leu Asp Ala Ser Gln Gln Ile Arg Leu Glu Ala Glu Glu Glu Lys Leu720 725 730 735gct cat ttg cca ctc gct aaa aca gta tcc gta gaa gag ctt ctg caa 2256Ala His Leu Pro Leu Ala Lys Thr Val Ser Val Glu Glu Leu Leu Gln
740 745 750tac gtg gag ctt caa gat cct gtt acg cgc acg cag ctt cgc gca atg 2304Tyr Val Glu Leu Gln Asp Pro Val Thr Arg Thr Gln Leu Arg Ala Met
755 760 765gct gct aaa acg gtc tgc ccg ccg cat aaa gta gag ctt gaa gcc ttg 2352Ala Ala Lys Thr Val Cys Pro Pro His Lys Val Glu Leu Glu Ala Leu
770 775 780ctt gaa aag caa gcc tac aaa gaa caa gtg ctg gca aaa cgt tta aca 2400Leu Glu Lys Gln Ala Tyr Lys Glu Gln Val Leu Ala Lys Arg Leu Thr785 790 795atg ctt gaa ctg ctt gaa aaa tac ccg gcg tgt gaa atg aaa ttc agc 2448Met Leu Glu Leu Leu Glu Lys Tyr Pro Ala Cys Glu Met Lys Phe Ser800 805 810 815gaa ttt atc gcc ctt ctg cca agc ata cgc ccg cgc tat tac tcg att 2496Glu Phe Ile Ala Leu Leu Pro Ser Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile
820 825 830tct tca tca cct cgt gtc gat gaa aaa caa gca agc atc acg gtc agc 2544Ser Ser Ser Pro Arg Val Asp Glu Lys Gln Ala Ser Ile Thr Val Ser
835 840 845gtt gtc tca gga gaa gcg tgg agc gga tat gga gaa tat aaa gga att 2592Val Val Ser Gly Glu Ala Trp Ser Gly Tyr Gly Glu Tyr Lys Gly Ile
850 855 860gcg tcg aac tat ctt gcc gag ctg caa gaa gga gat acg att acg tgc 2640Ala Ser Asn Tyr Leu Ala Glu Leu Gln Glu Gly Asp Thr Ile Thr Cys865 870 875ttt att tcc aca ccg cag tca gaa ttt acg ctg cca aaa gac cct gaa 2688Phe Ile Ser Thr Pro Gln Ser Glu Phe Thr Leu Pro Lys Asp Pro Glu880 885 890 895acg ccg ctt atc atg gtc gga ccg gga aca ggc gtc gcg ccg ttt aga 2736Thr Pro Leu Ile Met Val Gly Pro Gly Thr Gly Val Ala Pro Phe Arg
900 905 910ggc ttt gtg cag gcg cgc aaa cag cta aaa gaa caa gga cag tca ctt 2784Gly Phe Val Gln Ala Arg Lys Gln Leu Lys Glu Gln Gly Gln Ser Leu
915 920 925gga gaa gca cat tta tac ttc ggc tgc cgt tca cct cat gaa gac tat 2832Gly Glu Ala His Leu Tyr Phe Gly Cys Arg Ser Pro His Glu Asp Tyr
930 935 940ctg tat caa gaa gag ctt gaa aac gcc caa agc gaa ggc atc att acg 2880Leu Tyr Gln Glu Glu Leu Glu Asn Ala Gln Ser Glu Gly Ile Ile Thr945 950 955ctt cat acc gct ttt tct cgc atg cca aat cag ccg aaa aca tac gtt 2928Leu His Thr Ala Phe Ser Arg Met Pro Asn Gln Pro Lys Thr Tyr Val960 965 970 975cag cac gta atg gaa caa gac ggc aag aaa ttg att gaa ctt ctt gat 2976Gln His Val Met Glu Gln Asp Gly Lys Lys Leu Ile Glu Leu Leu Asp
980 985 990caa gga gcg cac ttc tat att tgc gga gac gga agc caa atg gca cct 3024Gln Gly Ala His Phe Tyr Ile Cys Gly Asp Gly Ser Gln Met Ala Pro
995 1000 1005gcc gtt gaa gca acg ctt atg aaa agc tat gct gac gtt cac caa gtg 3072Ala Val Glu Ala Thr Leu Met Lys Ser Tyr Ala Asp Val His Gln Val
1010 1015 1020agt gaa gca gac gct cgc tta tgg ctg cag cag cta gaa gaa aaa ggc 3120Ser Glu Ala Asp Ala Arg Leu Trp Leu Gln Gln Leu Glu Glu Lys Gly1025 1030 1035cga tac gca aaa gac gtg tgg gct ggg taa 3150Arg Tyr Ala Lys Asp Val Trp Ala Gly1040 1045<210>2<211>1048<212>PRT<213>巨大芽胞杆菌<400> 2Thr Ile Lys Glu Met Pro Gln Pro Lys Thr Phe Gly Glu Leu Lys Asn1 5 10 15Leu Pro Leu Leu Asn Thr Asp Lys Pro Val Gln Ala Leu Met Lys Ile
20 25 30Ala Asp Glu Leu Gly Glu Ile Phe Lys Phe Glu Ala Pro Gly Arg Val
35 40 45Thr Arg Tyr Leu Ser Ser Gln Arg Leu Ile Lys Glu Ala Cys Asp Glu
50 55 60Ser Arg Phe Asp Lys Asn Leu Ser Gln Ala Leu Lys Phe Val Arg Asp65 70 75 80Phe Ala Gly Asp Gly Leu Phe Thr Ser Trp Thr His Glu Lys Asn Trp
85 90 95Lys Lys Ala His Asn Ile Leu Leu Pro Ser Phe Ser Gln Gln Ala Met
100 105 110Lys Gly Tyr His Ala Met Met Val Asp Ile Ala Val Gln Leu Val Gln
115 120 125Lys Trp Glu Arg Leu Asn Ala Asp Glu His Ile Glu Val Pro Glu Asp130 135 140Met Thr Arg Leu Thr Leu Asp Thr Ile Gly Leu Cys Gly Phe Asn Tyr145 150 155 160Arg Phe Asn Ser Phe Tyr Arg Asp Gln Pro His Pro Phe Ile Thr Ser
165 170 175Met Val Arg Ala Leu Asp Glu Ala Met Asn Lys Leu Gln Arg Ala Asn
180 185 190Pro Asp Asp Pro Ala Tyr Asp Glu Asn Lys Arg Gln Phe Gln Glu Asp
195 200 205Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Val Asp Lys Ile Ile Ala Asp Arg Lys210 215 220Ala Ser Gly Glu Gln Ser Asp Asp Leu Leu Thr His Met Leu Asn Gly225 230 235 240Lys Asp Pro Glu Thr Gly Glu Pro Leu Asp Asp Glu Asn Ile Arg Tyr
245 250 255Gln Ile Ile Thr Phe Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr Ser Gly Leu
260 265 270Leu Ser Phe Ala Leu Tyr Phe Leu Val Lys Asn Pro His Val Leu Gln
275 280 285Lys Ala Ala Glu Glu Ala Ala Arg Val Leu Val Asp Pro Val Pro Ser290 295 300Tyr Lys Gln Val Lys Gln Leu Lys Tyr Val Gly Met Val Leu Asn Glu305 310 315 320Ala Leu Arg Leu Trp Pro Thr Ala Pro Ala Phe Ser Leu Tyr Ala Lys
325 330 335Glu Asp Thr Val Leu Gly Gly Glu Tyr Pro Leu Glu Lys Gly Asp Glu
340 345 50Leu Met Val Leu Ile Pro Gln Leu His Arg Asp Lys Thr Ile Trp Gly
355 360 365Asp Asp Val Glu Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe Glu Asn Pro Ser Ala370 375 380Ile Pro Gln His Ala Phe Lys Pro Phe Gly Asn Gly Gln Arg Ala Cys385 390 395 400Ile Gly Gln Gln Phe Ala Leu His Glu Ala Thr Leu Val Leu Gly Met
405 410 415Met Leu Lys His Phe Asp Phe Glu Asp His Thr Asn Tyr Glu Leu Asp
420 425 430Ile Lys Glu Thr Leu Thr Leu Lys Pro Glu Gly Phe Val Val Lys Ala
435 440 445Lys Ser Lys Lys Ile Pro Leu Gly Gly Ile Pro Ser Pro Ser Thr Glu450 455 460Gln Ser Ala Lys Lys Val Arg Lys Lys Ala Glu Asn Ala His Asn Thr465 470 475 480Pro Leu Leu Val Leu Tyr Gly Ser Asn Met Gly Thr Ala Glu Gly Thr
485 490 495Ala Arg Asp Leu Ala Asp Ile Ala Met Ser Lys Gly Phe Ala Pro Gln
500 505 510Val Ala Thr Leu Asp Ser His Ala Gly Asn Leu Pro Arg Glu Gly Ala
515 520 525Val Leu Ile Val Thr Ala Ser Tyr Asn Gly His Pro Pro Asp Asn Ala530 535 540Lys Gln Phe Val Asp Trp Leu Asp Gln Ala Ser Ala Asp Glu Val Lys545 550 555 560Gly Val Arg Tyr Ser Val Phe Gly Cys Gly Asp Lys Asn Trp Ala Thr
565 570 575Thr Tyr Gln Lys Val Pro Ala Phe Ile Asp Glu Thr Leu Ala Ala Lys
580 585 590Gly Ala Glu Asn Ile Ala Asp Arg Gly Glu Ala Asp Ala Ser Asp Asp
595 600 605Phe Glu Gly Thr Tyr Glu Glu Trp Arg Glu His Met Trp Ser Asp Val610 615 620Ala Ala Tyr Phe Asn Leu Asp Ile Glu Asn Ser Glu Asp Asn Lys Ser625 630 635 640Thr Leu Ser Leu Gln Phe Val Asp Ser Ala Ala Asp Met Pro Leu Ala
645 650 655Lys Met His Gly Ala Phe Ser Thr Asn Val Val Ala Ser Lys Glu Leu
660 665 670Gln Gln Pro Gly Ser Ala Arg Ser Thr Arg His Leu Glu Ile Glu Leu
675 680 685Pro Lys Glu Ala Ser Tyr Gln Glu Gly Asp His Leu Gly Val Ile Pro690 695 700Arg Asn Tyr Glu Gly Ile Val Asn Arg Val Thr Ala Arg Phe Gly Leu705 710 715 720Asp Ala Ser Gln Gln Ile Arg Leu Glu Ala Glu Glu Glu Lys Leu Ala
725 730 735His Leu Pro Leu Ala Lys Thr Val Ser Val Glu Glu Leu Leu Gln Tyr
740 745 750Val Glu Leu Gln Asp Pro Val Thr Arg Thr Gln Leu Arg Ala Met Ala
755 760 765Ala Lys Thr Val Cys Pro Pro His Lys Val Glu Leu Glu Ala Leu Leu770 775 780Glu Lys Gln Ala Tyr Lys Glu Gln Val Leu Ala Lys Arg Leu Thr Met785 790 795 800Leu Glu Leu Leu Glu Lys Tyr Pro Ala Cys Glu Met Lys Phe Ser Glu
805 810 815Phe Ile Ala Leu Leu Pro Ser Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile Ser
820 825 830Ser Ser Pro Arg Val Asp Glu Lys Gln Ala Ser Ile Thr Val Ser Val
835 840 845Val Ser Gly Glu Ala Trp Ser Gly Tyr Gly Glu Tyr Lys Gly Ile Ala850 855 860Ser Asn Tyr Leu Ala Glu Leu Gln Glu Gly Asp Thr Ile Thr Cys Phe865 870 875 880Ile Ser Thr Pro Gln Ser Glu Phe Thr Leu Pro Lys Asp Pro Glu Thr
885 890 895Pro Leu Ile Met Val Gly Pro Gly Thr Gly Val Ala Pro Phe Arg Gly
900 905 910Phe Val Gln Ala Arg Lys Gln Leu Lys Glu Gln Gly Gln Ser Leu Gly
915 920 925Glu Ala His Leu Tyr Phe Gly Cys Arg Ser Pro His Glu Asp Tyr Leu930 935 940Tyr Gln Glu Glu Leu Glu Asn Ala Gln Ser Glu Gly Ile Ile Thr Leu945 950 955 960His Thr Ala Phe Ser Arg Met Pro Asn Gln Pro Lys Thr Tyr Val Gln
965 970 975His Val Met Glu Gln Asp Gly Lys Lys Leu Ile Glu Leu Leu Asp Gln
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995 1000 1005Val Glu Ala Thr Leu Met Lys Ser Tyr Ala Asp Val His Gln Val Ser1010 1015 1020Glu Ala Asp Ala Arg Leu Trp Leu Gln Gln Leu Glu Glu Lys Gly Arg1025 1030 1035 1040Tyr Ala Lys Asp Val Trp Ala Gly
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Claims (17)
1.一种经修饰的细胞色素P450单加氧酶，由于该酶底物结合区域的位点特异诱变，同野生型相比该酶在对脂肪族羧酸的末端和/或次末端的酶促羟化上表现出变化的底物分布(Substratprofil)。
2.权利要求1的一种单加氧酶，该酶衍生自细菌来源的细胞色素P450单加氧酶。
3.权利要求2的一种单加氧酶，该酶衍生自巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)细胞色素P450单加氧酶BM-3，该BM-3酶具有SEQ ID No：2的氨基酸序列，所要求的酶在下列氨基酸序列区域中具有至少一种功能性突变：24-28、45-51、70-72、73-82、86-88、172-224以及352-356，前提条件为如果该酶具有突变F87A则这些区域中多于一个被突变。
4.权利要求3的一种单加氧酶，该酶在氨基酸序列区域86-88以及172-224中含有至少一个功能性突变。
5.权利要求4的一种单加氧酶，该酶具有下列氨基酸替换模式中的至少一种：
a)F87V；
b)F87A L188K；
c)F87V L188K；
d)F87A L188K A74G；
e)F87V L188K A74G；
f)F87A L188K A74G R47F；
g)F87V L188K A74G R47F；
h)F87A L188K A74G R47F V26T；或
i)F87V L188K A74G R47F V26T；
以及其功能性等价物。
6.权利要求3的一种单加氧酶，该酶在具有下列氨基酸替换模式中的一种：
a)V26T，
b)R47F，
c)S72G，
d)A74G，
e)F87V，
f)L188z，其中z代表一个氨基酸，选自K，R，W，Q，N，G，A和S；以及
g)M354T；
以及它们的功能性等价物。
7.一种核酸序列及其互补核酸序列，该序列编码前述 中任意一个的单加氧酶。
8.一种表达结构体，该结构体含有一种编码序列，该序列含有权利要求7的一种核酸序列并处于调控核酸序列的遗传控制之下。
9.一种载体，该载体含有至少一种权利要求8所要求的表达结构体。
10.一种重组微生物体，该微生物体经权利要求9所要求的至少一种载体的转化。
11.权利要求10的一种微生物体，该微生物体选自埃希杆菌属的细菌。
12.一种用于末端或次末端羟化的脂肪族羧酸的酶法生产的加工方法，该方法包括：
a1)在存在一种培养基的情况下通气培养权利要求10或11的重组微生物，该培养基含有至少一种可羟化的羧酸或者至少一种可羟化的羧酸衍生物；或者
a2)温浴一种反应介质及权利要求1到6中任意一个所要求的一种酶，该介质含有至少一种可羟化的羧酸或者至少一种可羟化的羧酸衍生物，并且
b)从该培养基中分离所产生的羟化产物或产物混合物。
13.权利要求12的一种方法，其中可羟化的羧酸为C8-C30的单羧酸或其一种衍生物
14.权利要求13的一种方法，其中该可羟化的羧酸为一种C8-C12的单羧酸或其一种衍生物并且所使用的单加氧酶为权利要求5所要求的一种突变体。
15.权利要求13的一种方法，其中该可羟化的羧酸为一种C12-C30的单羧酸或其一种衍生物并且所使用的单加氧酶选自单突变体F87A、F87V、V26T、S72G、A74G以及M354T以及复合突变体
F87A L188K A74G R47F；
F87V L188K A74G R47F；
F87A L188K A74G R47F V26T；或
F87V L188K A74G R47F V26T；
16.权利要求12到15中所要求的方法，其中该反应在存在一种电子供体或还原性等价物的情况下进行。
17.权利要求16的方法，其中该电子供体或还原性等价物选自NADH、NADPH以及Zn/Co(III)Sepulchrat。
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Cited By (13)
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