JP2003517815A

JP2003517815A - 修飾されたシトクロムｐ４５０モノオキシゲナーゼ

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Publication number: JP2003517815A
Application number: JP2001512845A
Authority: JP
Inventors: ハウアー，ベルンハルド; プライス，ユエルゲン; シュワンベルク，ウルリッヒ; シュミット，ユッタ; フィシャー，マルクス; シュミッド，ロルフ; リ，クィン−シャン
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1999-07-27
Filing date: 2000-07-27
Publication date: 2003-06-03
Anticipated expiration: 2020-07-27
Also published as: US7531335B1; CN1367835A; PT1196603E; NO20020350D0; CN1376194A; ES2273716T3; DE50013609D1; EP1196545A1; US20100267083A1; CN100482789C; CN1196789C; CY1107811T1; DK1196603T3; CA2379518A1; NO20020350L; AU784049B2; WO2001007574A2; EP1196603A2; EP1196603B1; EP1196545B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、改変された基質プロフィールを有する修飾されたシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ、それをコードする核酸配列、発現構築物およびベクター、これらのベクターを含有する組換え微生物に関する。本発明はまた、末端または末端付近でヒドロキシル化された脂肪族カルボン酸の微生物学的製造方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、改変された基質プロフィールを有する修飾されたシトクロムＰ４５
０モノオキシゲナーゼ、それをコードする核酸配列、発現構築物およびベクター
、これらのベクターを含む組換え微生物、ならびに末端または末端付近（ｓｕｂ
ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ）でヒドロキシル化された脂肪族カルボン酸の微生物学的
製造方法に関する。

【０００２】Ｐ４５０ＢＭ−３と称されるモノオキシゲナーゼは、バシラス・メガテリウ
ム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のシトクロムＰ４５０酵素
であり、哺乳動物Ｐ４５０酵素に対して顕著な配列相同性を有する（１）。これ
らの類似性のため、Ｐ４５０ＢＭ−３は、このクラスのＰ４５０酵素の優れた
モデル系を構成する。Ｐ４５０ＢＭ−３は、主として、長鎖飽和脂肪酸をそれ
らのω−１、ω−２およびω−３炭素原子においてヒドロキシル化する。長鎖不
飽和脂肪酸のアミドまたはアルコール類似体およびエポキシドも変換される（１
−３）。飽和脂肪酸に対する触媒活性は鎖長に左右され、最適な鎖長は１４〜１
６炭素原子である。該酵素は、１２炭素原子未満の鎖長を有する脂肪酸に対して
は触媒活性を示さない（１）。

【０００３】発明の概要野生型酵素と比較して改変された基質プロフィールを示すシトクロムＰ４５０
モノオキシゲナーゼ突然変異体を提供することが、本発明の１つの目的である。
特に、飽和脂肪族カルボン酸を別の鎖位置でヒドロキシル化する及び／又は改変
された基質特異性を有する新規の突然変異体を提供することが１つの目的であっ
た。特に、中鎖長、特に８〜１２、例えば８〜１０炭素原子の鎖長の脂肪族カル
ボン酸に対する触媒活性を有し、これらのカルボン酸を末端付近で、特にω−１
、ω−２および／またはω−３位でヒドロキシル化する突然変異体を提供するこ
とが１つの目的であった。

【０００４】本発明者らは、基質結合領域の部位特異的突然変異誘発と定方向性進化との組
合せにより、野生型と比較して脂肪族カルボン酸の末端および／または末端付近
の酵素的ヒドロキシル化における改変された反応パターンまたは基質プロフィー
ルを示す修飾されたシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼを提供することによ
り、この目的が達成されることを見出した。

【０００５】詳細な説明本発明の突然変異体には野生型酵素と比較して「改変された基質プロフィール
」が認められる。「改変された基質プロフィール」は、本発明の目的においては
、ａ）少なくとも１つのヒドロキシル化されうる脂肪族カルボン酸またはヒドロ
キシル化されうる脂肪族カルボン酸誘導体に対する突然変異体の反応性の向上、
例えば比活性（反応したカルボン酸のｎｍｏｌ／分／Ｐ４５０酵素のｎｍｏｌと
して表される）および／または例えばＫｃａｔ、ＫｍおよびＫｃａｔ／Ｋｍから
選ばれる少なくとも１つの速度論的パラメーターの増加、例えば、少なくとも１
％、例えば１０〜１０００％、１０〜５００％または１０〜１００％の向上、お
よび／またはｂ）カルボン酸のヒドロキシル化における改変された、特に増加し
た、位置選択性を意味する。したがって、例えば、少なくとも１つのヒドロキシ
ル化されうるカルボン酸またはヒドロキシル化されうる脂肪族カルボン酸誘導体
における好ましい末端または末端付近（ω−１、ω−２、ω−３、ω−４、特に
ω−１〜ω−３）のヒドロキシル化位置の移動が生じる。本発明における「改変
された基質プロフィール」が認められるヒドロキシル化されうる脂肪族カルボン
酸またはその誘導体は、８〜３０炭素原子を有する分枝状または好ましくは直鎖
状のカルボン酸である。基質プロフィールの本発明の改変は、全長（すなわち、
Ｃ_８−Ｃ_３０）にわたり又は部分的にのみ（例えば、Ｃ_８−Ｃ_１２−、Ｃ_１０−
Ｃ_１２−、Ｃ_１２−Ｃ_３０−、Ｃ_１２−Ｃ_２５−もしくはＣ_１２−Ｃ_２０カルボ
ン酸またはこれらの部分からの個々のカルボン酸の場合に）現れうる。

【０００６】本発明においてヒドロキシル化されうるカルボン酸として挙げられうる非限定
的な具体例としては、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデカン酸、
ラウリン酸、トリデカン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、マ
ルガリン酸、ステアリン酸、ノナデカン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセ
リン酸、セロチン酸およびメリシン酸が挙げられる。適当なカルボン酸誘導体の
具体例としては、好ましくは短鎖Ｃ_１−Ｃ_４−カルボン酸とのＣ_１−Ｃ_４−アル
キルエステル、アミドまたは無水物が挙げられる。

【０００７】本発明のモノオキシゲナーゼは、好ましくは、酵素クラスＥ．Ｃ．１．１４．
−．−からのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ、特にＰ４５０ファミリー
ＣＹＰ１０２に由来し、真核生物または原核生物、特に細菌に由来するものであ
る。

【０００８】突然変異体の特に好ましい一群は、アミノ酸配列領域：２４−２８、４５−５
１、７０−７２、７３−８２（ヘリックス５）、８６−８８（ヘリックス６）、
１７２−２２４（Ｆ／Ｇループ）および３５２−３５６（βストランド８）の１
つにおいて少なくとも１つの機能的突然変異を有する（ただし、該酵素が突然変
異Ｆ８７Ａを保持する場合には、これらの領域の２以上が突然変異している）、
配列番号２に示すアミノ酸配列を有するバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼＢＭ−３
に由来するもの、ならびにこれらの突然変異体の機能的等価物である。

【０００９】本明細書においては、突然変異はアミノ酸の１文字表記で示されている。突然
変異の配列位置を示す番号の前には元のアミノ酸が示されており、該番号の後に
は修飾アミノ酸が示されている。

【００１０】本発明の目的における「機能的突然変異」は、前記定義による「改変された反
応パターン」または「改変された基質プロフィール」を与える前記配列領域内の
アミノ酸の置換を含む。

【００１１】本発明において特に好ましいのは、少なくとも各場合において、個々に又は組
合せて、アミノ酸配列領域８６−８８、１７２−２２４、７３−８２、４５−５
１および２４−２８（配列番号２による）における１つの機能的突然変異を含む
Ｐ４５０ＢＭ−３モノオキシゲナーゼ突然変異体（グループ（Ａ））である。

【００１２】したがって、例えば、Ｐｈｅ８７は、脂肪族側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ
ｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、特にＶａｌまたはＡｌａにより置換されうる。Ｌｅｕ１
８８は、アミンまたはアミド側鎖を有するアミノ酸、例えばＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ａ
ｒｇ、または特にＬｙｓ、またはＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐなどのアミノ
酸により置換されうる。Ａｌａ７４は、脂肪族側鎖を有する別のアミノ酸、例え
ばＶａｌおよび特にＧｌｙにより置換されうる。Ａｒｇ４７は、環状側鎖基を有
するアミノ酸、例えばＨｉｓ、Ｔｙｒまたは特にＰｈｅにより置換されうる。Ｖ
ａｌ１２６は、ヒドロキシル側鎖基を有するアミノ酸、例えばＳｅｒまたは特に
Ｔｈｒにより置換されうる。

【００１３】好ましいグループ（Ａ）突然変異体は、以下のアミノ酸置換パターンの少なく
とも１つを示す：ａ）Ｆ８７Ｖ；ｂ）Ｆ８７Ａ、Ｌ１８８Ｋ：ｃ）Ｆ８７Ｖ、Ｌ１８８Ｋ；ｄ）Ｆ８７Ａ、Ｌ１８８Ｋ、Ａ７４Ｇ；ｅ）Ｆ８７Ｖ、Ｌ１８８Ｋ、Ａ７４Ｇ；ｆ）Ｆ８７Ａ、Ｌ１８８Ｋ、Ａ７４Ｇ、Ｒ４７Ｆ；ｇ）Ｆ８７Ｖ、Ｌ１８８Ｋ、Ａ７４Ｇ、Ｒ４７Ｆ；ｈ）Ｆ８７Ａ、Ｌ１８８Ｋ、Ａ７４Ｇ、Ｒ４７Ｆ、Ｖ２６Ｔ；またはｉ）Ｆ８７Ｖ、Ｌ１８８Ｋ、Ａ７４Ｇ、Ｒ４７Ｆ、Ｖ２６Ｔ；およびそれらの機能的等価物。

【００１４】適当な突然変異体のもう１つの群であるグループ（Ｂ）は、前記配列領域の１
つにおける又は配列領域７０−７２および３５２−３５６の１つにおける単一ア
ミノ酸置換を示す。その２つの最後に挙げた配列領域においては、例えば、Ｓｅ
ｒ７２が、脂肪族側鎖を有するアミノ酸、例えばＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌ
ｅおよび特にＧｌｙにより置換されることが可能であり、Ｍｅｔ３５４が、ヒド
ロキシル側鎖基を有するアミノ酸、例えばＳｅｒまたは特にＴｈｒにより置換さ
れることが可能である。

【００１５】特に、グループＢの突然変異体は、以下から選ばれるアミノ酸置換を示す：ａ）Ｖ２６Ｔ、ｂ）Ｒ４７Ｆ、ｃ）Ｓ７２Ｇ、ｄ）Ａ７４Ｇ、ｅ）Ｆ８７Ｖ、ｆ）Ｌ１８８ｚ（ここで、ｚは、Ｋ、Ｒ、Ｗ、Ｑ、Ｎ、Ｇ、ＡまたはＳである）
、およびｇ）Ｍ３５４Ｔ；およびそれらの機能的等価物。

【００１６】「機能的等価物」は、本発明においては、前記配列位置の少なくとも１つにお
いて、特に挙げたもの以外のアミノ酸置換を示すが、特に挙げた突然変異体と同
様に、野生型と比較して前記定義による「改変された基質プロフィール」を示す
突然変異体を尚も与えるアミノ酸置換を示す突然変異体を意味すると理解される
べきである。機能的等価物は、特に、反応性パターンにおける改変が質的に一致
する場合にも存在する。

【００１７】もちろん、「機能的等価物」は、特に挙げたＰ４５０ＢＭ３突然変異体と同
様に、他の生物由来のＰ４５０酵素を突然変異させることにより得られうるＰ４
５０モノオキシゲナーゼ突然変異体をも含む。例えば、相同配列の領域を配列比
較により同定することができる。本発明において特に記載している原則に従い、
現代の分子モデリング方法は、反応性パターンに影響を及ぼす等価的突然変異が
施されるのを可能にする。

【００１８】「機能的等価物」はまた、１以上の追加的なアミノ酸の付加、置換、欠失およ
び／または逆位により得られうる突然変異体を含み、前記の追加的な改変は、そ
れが前記の意味で「改変された基質プロフィール」を有する突然変異体を与える
限り、配列のいかなる位置にも存在しうる。

【００１９】本発明は更に、突然変異モノオキシゲナーゼまたは前記定義による「機能的等
価物」をコードする核酸配列に関する。これらの配列は、好ましくは、前記アミ
ノ酸置換パターンに従うコドン交換により、配列番号１から得ることができる。

【００２０】本発明はまた、いわゆるサイレント突然変異を含む又は特に挙げた配列と比較
して特定の起源または宿主生物のコドン使用頻度に従い改変された核酸配列、お
よびそのような核酸配列の天然に存在する変異体を含む。また、本発明は、遺伝
暗号の縮重により（すなわち、対応するアミノ酸配列を改変することなく）また
は保存的ヌクレオチド置換（すなわち、対応するアミノ酸が、同じ電荷、サイズ
、極性および／または溶解度を有する別のアミノ酸により置換されること）によ
り得られる核酸配列の誘導体、および「改変された基質プロフィール」を有する
本発明のモノオキシゲナーゼをコードする、ヌクレオチドの付加、挿入、逆位ま
たは欠失により改変された配列、および対応する相補的配列を含む。

【００２１】本発明は更に、調節核酸配列の遺伝的制御下で本発明の突然変異体をコードす
る核酸配列を含む発現構築物、およびこれらの発現構築物の少なくとも１つを含
むベクターに関する。

【００２２】好ましくは、本発明の構築物は、コード配列の５’上流のプロモーターおよび
３’下流のターミネーター配列を、および必要に応じて、他の通常の調節要素を
含み、各場合において、それらは該コード配列に機能的に連結されている。機能
的な連結は、プロモーター、コード配列、ターミネーターおよび必要に応じて使
用する他の調節要素が、該調節要素のそれぞれが該コード配列の発現に際してそ
の意図される機能を果たしうるように、連続的に配置されていることを意味する
と理解されるべきである。機能的に連結されうる配列の具体例としては、ターゲ
ッティング配列、または翻訳エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、選択マー
カー、増幅シグナル、複製起点などが挙げられる。

【００２３】人工的調節配列に加えて、天然調節配列が実際の構造遺伝子の上流に尚も存在
しうる。また、所望により、この天然調節は遺伝的改変により無効にされること
が可能であり、該遺伝子の発現は増強または減弱されうる。しかし、遺伝子構築
物は構造的に更に単純でありうる。すなわち、追加的な調節シグナルを構造遺伝
子の上流に挿入せず、その調節を行う天然プロモーターを保存する。その代わり
に、もはや調節が生じず、遺伝子発現が増強も減弱もされないように、天然調節
配列を突然変異させる。核酸配列の１以上のコピーが遺伝子構築物内に存在しう
る。

【００２４】プロモーターの具体例としては、ｃｏｓ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｔｅｔ、ｔｒｐ−
ｔｅｔ、ｌｐｐ、ｌａｃ、ｌｐｐ−ｌａｃ、ｌａｃＩｑ、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇ
ａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ、ＳＰ６、ｌ−ＰＲまたはｌ−ＰＬプロモーター（それら
は全て、グラム陰性菌において有利に用いられる）；およびグラム陽性プロモー
ターａｍｙおよびＳＰＯ２、酵母プロモーターＡＤＣ１、ＭＦａ、ＡＣ、Ｐ−６
０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨまたは植物プロモーターＣａＭＶ／３５Ｓ、ＳＳＵ、
ＯＣＳ、ｌｉｂ４、ｕｓｐ、ＳＴＬＳ１、Ｂ３３、ｎｏｓまたはユビキチンまた
はファゼオリンプロモーターが挙げられる。

【００２５】原則として、調節配列を有する全ての天然プロモーターを使用することができ
る。また、合成プロモーターも有利に使用することができる。

【００２６】前記調節配列は、該核酸配列の指令的（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）発現を可能にする
と意図される。宿主生物に応じて、これは、例えば、誘導が生じた後に初めて該
遺伝子が発現または過剰発現されること、またはそれが直ちに発現および／また
は過剰発現されることを意味する。

【００２７】調節配列または因子は、好ましくは、発現に正の効果を及ぼし、このようにし
て、発現を増加または減少させる。したがって、調節要素の増強は、強力な転写
シグナル、例えばプロモーターおよび／または「エンハンサー」を使用すること
により転写レベルで有利に生じうる。また、翻訳は、例えば、ｍＲＮＡの安定性
を向上させることによっても増強されうる。

【００２８】発現カセットは、適当なプロモーターを適当なモノオキシゲナーゼヌクレオチ
ド配列とターミネーターシグナルまたはポリアデニル化シグナルとに融合させる
ことにより得られる。この目的には、例えばＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆ
ｒｉｔｓｃｈおよびＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎ
ｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａ
ｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ
Ｙ（１９８９）ならびにＴ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｍ．Ｌ．Ｂｅｒｍａｎおよび
Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ，ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｗｉｔｈＧｅｎｅＦｕ
ｓｉｏｎｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，
ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）ならびにＡｕｓｕｂ
ｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕ
ｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃ．
ａｎｄＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）に記載されている
通常の組換え及びクローニング技術を用いる。

【００２９】適当な宿主生物内での発現のためには、組換え核酸構築物または遺伝子構築物
を、宿主内での最適な遺伝子発現を可能にする宿主特異的ベクター内に挿入する
と有利である。ベクターは当業者によく知られており、例えば、“Ｃｌｏｎｉｎ
ｇＶｅｃｔｏｒｓ”（ＰｏｕｗｅｌｓＰ．Ｈ．ら編，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａ
ｍｓｔｅｒｄａｍ−ＮｅｗＹｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）に記載されて
いる。ベクターは、プラスミドだけではなく、当業者に公知の他のすべてのベク
ター、例えばファージ、ウイルス（例えばＳＶ４０、ＣＭＶ、バキュロウイルス
およびアデノウイルス）、トランスポゾン、ＩＳ要素、ファスミド、コスミドお
よび直鎖状または環状ＤＮＡをも意味すると理解されるべきである。これらのベ
クターは、宿主生物内で自律的に又は染色体内で複製されうる。

【００３０】本発明のベクターは、例えば本発明の少なくとも１つのベクターで形質転換さ
れて突然変異体の製造に使用されうる組換え微生物の作製を可能にする。本発明
の組換え構築物は、適当な宿主系内に有利に導入され発現されうる。対象とする
発現系内で前記核酸の発現を引き起こすためには、当業者に公知の通常のクロー
ニングおよびトランスフェクション方法、例えば共沈、プロトプラスト融合、エ
レクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクションなどを用いること
が好ましい。適当な系は、例えば、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎ
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｗｉｌｅｙ
Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮｅｗＹｏｒｋ１９９７に記載されている。

【００３１】適当な宿主生物は、原則として、本発明の核酸、それらの対立遺伝子変異体お
よびそれらの機能的に等価な置換体または誘導体の発現を可能にする全ての生物
である。宿主生物は、例えば、細菌、真菌、酵母または植物もしくは動物細胞を
意味すると理解されるべきである。好ましい生物は、細菌、例えばエシェリキア
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の細菌、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、バシラス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ）またはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、真核微
生物、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、および動物
または植物由来の高等真核細胞、例えばＳｆ９またはＣＨＯ細胞である。

【００３２】所望により、遺伝子産物の発現はまた、トランスジェニック生物、例えばトラ
ンスジェニック動物（例えば、特にマウス、ヒツジ）またはトランスジェニック
植物内で引き起こすこともできる。また、トランスジェニック生物は、例えば突
然変異または部分的もしくは完全な欠失により対応の内因性遺伝子が除去された
ノックアウト動物または植物でもありうる。

【００３３】うまく形質転換された生物は、同様にベクター内または発現カセット内に含有
されるマーカー遺伝子により選択することができる。そのようなマーカー遺伝子
の具体例としては、抗生物質耐性遺伝子、および形質転換細胞の着色を引き起こ
す呈色反応を触媒する酵素の遺伝子が挙げられる。ついでそれらを自動細胞選別
により選択することができる。ベクターでうまく形質転換され適当な抗生物質（
例えばＧ４１８またはハイグロマイシン）耐性遺伝子を保持する微生物は、抗生
物質を含有する適当な液体培地または固形培地により選択することができる。細
胞表面上に提示されたマーカータンパク質は、アフィニティークロマトグラフィ
ーによる選択に利用することができる。

【００３４】宿主生物と該生物に適合するベクター（例えばプラスミド、ウイルスまたはフ
ァージ、例えばＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系を伴うプラスミド、ファー
ジλ、μもしくは他のテンペレートファージまたはトランスポゾンおよび／また
は更に有利な調節配列）との組合せは、発現系を形成する。「発現系」なる語は
、例えば、哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ細胞）と哺乳動物細胞に適したベクター
（例えばｐｃＤＮＡ３ｎｅｏベクター）との組合せを意味すると理解されるべき
である。

【００３５】前記のとおり、遺伝子産物はまた、トランスジェニック動物（例えばマウス、
ヒツジ）またはトランスジェニック植物内でも有利に発現されうる。同様に、該
核酸由来のＲＮＡで無細胞翻訳系を設計することが可能である。

【００３６】本発明は更に、モノオキシゲナーゼ産生微生物を培養し、必要に応じてモノオ
キシゲナーゼの発現を誘導し、モノオキシゲナーゼを培養物から単離する、本発
明のモノオキシゲナーゼの製造方法に関する。このようにして、所望により工業
的規模においても、本発明のモノオキシゲナーゼを製造することができる。

【００３７】該微生物は、公知方法により培養し発酵させることができる。例えば細菌は、
ＴＢまたはＬＢ培地内で２０〜４０℃の温度および６〜９のｐＨで増殖させるこ
とができる。適当な培養条件は、例えば、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒ
ｉｔｓｃｈおよびＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ
：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒ
ｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ
（１９８９）に詳細に記載されている。

【００３８】モノオキシゲナーゼが培地内に分泌されない場合は、ついで該細胞を溶解し、
公知タンパク質単離方法により該ライセートからモノオキシゲナーゼを得る。該
細胞は、必要に応じて、高周波超音波により、高圧により（例えばフレンチプレ
スセル内）、オスモリシス（ｏｓｍｏｌｙｓｉｓ）により、界面活性剤、溶菌酵
素または有機溶媒の作用により、ホモジナイザーにより、または前記の複数の方
法の組合せにより破壊することができる。

【００３９】モノオキシゲナーゼは、公知のクロマトグラフィー法、例えば分子ふるいクロ
マトグラフィー（ゲル濾過）、例えばＱ−セファロース上でのクロマトグラフィ
ー、イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性クロマトグラフィーにより、お
よび他の通常の方法、例えば限外濾過、結晶化、塩析、透析および天然ゲル電気
泳動により精製することができる。適当な方法は、例えば、Ｃｏｏｐｅｒ，Ｆ．
Ｇ．，ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｃｈｅＡｒｂｅｉｔｓｍｅｔｈｏｄｅｎ［Ｍｅｔｈ
ｏｄｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ］，ＶｅｒｌａｇＷａｌｔｅｒｄ
ｅＧｒｕｙｔｅｒ，ＢｅｒｌｉｎＮｅｗＹｏｒｋまたはＳｃｏｐｅｓ，Ｒ
．，ＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌ
ａｇ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｂｅｒｌｉｎに記載されてい
る。

【００４０】組換えタンパク質を単離するためには、あるヌクレオチド配列によりｃＤＮＡ
を伸長させて、更に簡便な精製の目的で改変されたポリペプチドまたは融合タン
パク質をコードするベクター系またはオリゴヌクレオチドを用いることが特に有
利である。そのような適当な修飾としては、例えば、アンカーとして作用するタ
グ、例えばヘキサ−ヒスチジンアンカーとして公知の修飾、または抗体の抗原と
して認識されうるエピトープが挙げられる（例えば、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．および
Ｌａｎｅ，Ｄ．，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ（Ｎ．Ｙ．）Ｐｒｅｓ
ｓに記載されている）。これらのアンカーは、例えば、クロマトグラフィーカラ
ム内に充填されるか又はマイクロタイタープレート上もしくは他の任意の担体上
で使用される固相支持体（例えば高分子マトリックス）に該タンパク質を結合さ
せるように機能しうる。

【００４１】同時に、これらのアンカーは、タンパク質の認識にも利用されうる。タンパク
質を認識するためには、更に、通常の標識、例えば蛍光色素、基質との反応後に
検出可能な反応産物を形成する酵素標識、または放射能標識を、単独で又は該タ
ンパク質を誘導体化するためのアンカーと組合せて使用することが可能である。

【００４２】本発明は更に、ａ１）少なくとも１つのヒドロキシル化されうるカルボン酸または少なくとも１
つのヒドロキシル化されうるカルボン酸誘導体を含有する培地の存在下、本発明
の組換え微生物を好気的に培養するか又は、ａ２）少なくとも１つのヒドロキシル化されうるカルボン酸または少なくとも１
つのヒドロキシル化されうるカルボン酸誘導体を含有する反応媒体を本発明の突
然変異体と共に好気的にインキュベートし、ｂ）得られたヒドロキシル化産物または産物混合物を該培地または媒体から単離
することを含んでなる、末端または末端付近（ω−１〜ω−４）でヒドロキシル
化された脂肪族カルボン酸の酵素的製造のための生化学的製造方法に関する。

【００４３】カルボン酸は、本発明の方法において、それ自体で又はその誘導体（例えば、
特に、Ｃ_１−Ｃ_４−アルキルエステルまたはカルボキサミド）として使用するこ
とができる。

【００４４】本発明の方法において好ましく使用されるヒドロキシル化されうるカルボン酸
は、Ｃ_８−Ｃ_３０−モノカルボン酸またはその誘導体である。

【００４５】本発明の方法において特に好ましく使用されるヒドロキシル化されうるカルボ
ン酸は、Ｃ_８−Ｃ_１２−モノカルボン酸またはその誘導体であり、本発明の方法
において特に好ましく使用されるモノオキシゲナーゼは前記グループ（Ａ）の突
然変異体である。

【００４６】本発明のもう１つの方法では、使用するヒドロキシル化されうるカルボン酸が
Ｃ_１２−Ｃ_３０−モノカルボン酸またはその誘導体であり、モノオキシゲナーゼ
が単一突然変異体Ｆ８７Ａ、Ｆ８７Ｖ、Ｖ２６Ｔ、Ｓ７２Ｇ、Ａ７４ＧおよびＭ
３５４Ｔならびに前記グループ（Ａ）の多重突然変異体ｆ）〜ｉ）から選ばれる
突然変異体である。

【００４７】本発明の酸化反応は、通常は、大気酸素の存在下および電子供与体（または還
元当量）、例えば特にＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨおよびＺｎ／Ｃｏ（ＩＩＩ）セパル
クレートの存在下で行う。Ｚｎ／Ｃｏ（ＩＩＩ）セパルクレートの使用は、例え
ば、本明細書において明示的に言及するＤＥ−Ａ−１９９３５１１５に記載
されている。

【００４８】本発明のヒドロキシル化を組換え微生物で行う場合には、まず、十分な細胞密
度に達するまで、酸素の存在下および複合培地（例えばＴＢまたはＬＢ培地）内
で約２０〜４０℃の培養温度および約６〜９のｐＨで、該微生物を培養すること
が好ましい。必要に応じて外因性基質を加える。より良好に酸化反応を制御する
ためには、誘導性プロモーター、特に温度誘導性プロモーターを使用することが
好ましい。この場合、温度を、要求される誘導温度、例えばＰ_ｒＰ_１プロモータ
ーの場合には４２℃まで上昇させ、モノオキシゲナーゼ活性を発現させるために
十分な時間（例えば、１〜１０、または５〜６時間）にわたり維持し、ついで温
度を約３０〜４０℃まで低下させる。ついで培養を、酸素の存在下、１２時間〜
３日間継続する。

【００４９】一方、純化または濃縮された酵素で本発明の酸化を行う場合には、本発明の酵
素突然変異体を、外因性基質（約０．０１〜１０ｍＭ、または０．０５〜５ｍＭ
）を含む媒体に溶解し、該反応を、好ましくは酸素の存在下、約１０〜５０℃（
例えば３０〜４０℃）の温度および約６〜９のｐＨ（例えば１００〜２００ｍＭ
リン酸またはトリスバッファーで調節する）で、および還元剤の存在下で行い、
その過程中に、該基質含有媒体は更に、酸化される基質に対して約１〜１００倍
モル過剰の還元当量を示しうる。必要に応じて、該還元剤は、分割して加えるこ
とができる。

【００５０】必要に応じて、自体公知の方法により、酸素を該反応媒体内に通すことができ
る。

【００５１】本発明の方法を、富化または精製された酵素で行う場合には、例えば、以下の
反応条件を設定することができる：基質濃度：０．１〜２０ｍｇ／ｍｌ、酵素濃度：０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ、反応温度：２０〜４０℃、ｐＨ：６〜８、バッファー：０．０５〜０．２Ｍリン酸カリウム、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、電子供与体：好ましくは分割して加える（初期濃度は約０．１〜２ｍｇ／ｍｌ）
。

【００５２】電子供与体を加えることにより該反応を開始する前に、１〜５％（ｖ／ｖ）の
濃度のアセトンを加えプレインキュベート（約２０〜４０℃で１〜５分間）する
ことにより該活性を増加させることが可能である。

【００５３】当業者はこれらの条件を改変し、問題の反応条件を通常の実験により最適化す
ることが可能である。

【００５４】改変された酵素特性を有する変異体を得るためのタンパク質工学における２つ
の異なる方法がある。第１の方法は「論理的設計」法（４）であり、第２の方法
は「定方向性進化」法（５−７）である。論理的設計の成功のために極めて重要
なのは、酵素メカニズムの詳細な知見および高分解三次元構造モデルである。論
理的設計は、非天然基質に対して高い活性を有する酵素突然変異体を与えること
が示されているが（４）、該突然変異体の安定性、活性および特異性に対する個
々のアミノ酸の点置換の効果は予測できないことが多い。

【００５５】Ｐ４５０ＢＭ−３のＸ線構造がタンパク質データベース（８）に登録されて
いる場合であっても、決定的なヒドロキシル化段階の基質とＰ４５０とのコンホ
メーションは依然として不明である（９−１１）。定方向性進化法に極めて重要
なのは、ランダムな突然変異体の大きなライブラリーの迅速なスクリーニングの
ための効率的な検出方法である。ω−パラ−ニトロフェノキシカルボン酸（ｐＮ
ＣＡ）を使用するＰ４５０ＢＭ−３突然変異体Ｆ８７Ａに関する光学的試験は
有用であることが判明している（１２，１３）。単一突然変異体Ｆ８７Ａは脂肪
酸のヒドロキシル化位置をω−１、ω−２およびω−３からω−位に移動させ（
１３）、さらに１２−ｐＮＣＡの完全な変換をもたらすが、これに対して、野生
型酵素では３３％の変換しか認められない（１２）。しかし、Ｐ４５０ＢＭ−
３のモノオキシゲナーゼドメインは４００以上のアミノ酸を含むため、ランダム
突然変異体ライブラリーのスクリーニングは、干し草の山の中から針を捜し出す
ようなものである。

【００５６】この探索法の効率を改善するために、改変された反応性を有する突然変異体が
得られるよう、特に、中鎖長の脂肪酸に対する特異性を有する突然変異体が得ら
れるよう、論理的設計法を定方向性進化法に従い組合せる。本発明の「論理的進
化（ｒａｔｉｏｎａｌｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）」法は、仮想的ランダムライブラ
リーを与えるための及び所望の特性に影響を及ぼす可能性が高い残基を同定する
ためのコンピューター支援タンパク質モデリングに基づく。これらの残基をラン
ダム化することによりサブライブラリーを作製し、陽性突然変異体に関してスク
リーニングする。第１工程では、構造モデルから出発して、鎖長特異性に潜在的
に重要な残基を決定する。改善された特性を有する突然変異体を得るために、該
モデルにより提示された突然変異部位を飽和突然変異原により修飾する。ついで
、論理的設計を考慮して、最良の特性を有する個々の突然変異体をお互いに組合
せる。この組合せ法の適用は、特に、中鎖長の基質に対するＰ４５０ＢＭ−３
の活性の改善を可能にする。

【００５７】この方法の適用および種々の起源のＰ４５０酵素に対する配列相同性は、同様
に本発明の主題である他の突然変異体を当業者が同様に作製するのを可能にする
。

【００５８】つぎに、以下の実験の記載により及び添付図面を考慮することにより、本発明
を例示することとする。

【００５９】方法１：基質／Ｐ４５０ＢＭ−３複合体のモデリング基質／酵素複合体のモデリングは、パルミトレイン酸と複合体形成した結晶学
的に決定されたＰ４５０ＢＭ−３の構造に基づくものであった（９）。この構
造はタンパク質データベース（８）に登録されている。記載されている２．９Å
の分解能の結晶構造は、非対称単位格子内に４個の分子を含有する。該モデル化
複合体の基準として、鎖Ａを選択した。ＳＹＢＹＬ“ＭｏｌｅｃｕｌｅＢｕｉ
ｌｄｅｒ”（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）を用いて、
基質分子として８−ｐＮＣＡのモデルを作製した。ＳＹＢＹＬＢｉｏｐｏｌｙ
ｍｅｒＴｏｏｌを用いて、Ｆ８７Ａ突然変異体を作製した。該基質の炭素原子
１−４を、結合したパルミトレイン酸の炭素原子６−９に適合する結合部位内に
配置した。脂肪酸鎖のねじれ角は、該立体配置転移（ｔｒａｎｓｃｏｎｆｉｇｕ
ｒａｔｉｏｎ）工程に応じて選択した。Ｐ４５０ＢＭ−３／ラウレート複合体
およびＰ４５０ＢＭ−３／１２−ブロモラウレート複合体に関するＮＭＲ研究
は、該ヒドロキシル化炭素原子（Ｃ１０およびＣ１１）のプロトンが、ＩＩ酸化
状態にある（１０，１３）ヘム鉄から約３．０Åの距離に位置していることを示
した。この知見の結果として、８−ｐＮＣＡの対応原子Ｃ７およびＣ８を、該ヘ
ム鉄からそれぞれ４Åおよび３．６Åの距離に配置した。パラ−ニトロフェノキ
シ基は、該結合ポケット内に手動で配置した。また、固定されたバックボーン原
子により該複合体のエネルギーを最小にした。

【００６０】方法２：飽和突然変異誘発本発明で使用する突然変異体は、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＱｕｉｋＣｈａｎｇ
ｅＫｉｔ（ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を使用する飽
和突然変異誘発により作製した。Ｐ４５０ＢＭ−３モデリングを介した突然変
異のために、基質結合チャンネルの近傍の９個の位置、すなわちＰ２５、Ｖ２６
、Ｒ４７、Ｙ５１、Ｓ７２、Ａ７４、Ｆ８７、Ｌ１８８およびＭ３５４を選択し
た。これらの位置のそれぞれのプライマーを表１に列挙する。

【００６１】

【表１】

【００６２】反応条件は、すべての突然変異誘発ＰＣＲ法に関して同一であった。ただし、
アニーリング温度は以下のとおりに変化させた：２５、２６、１８８および３５
４位には５０℃；４７および５１位には５２℃；ならびに７２、７４および８７
位には４６℃。反応は５０μｌの反応容積中で行い、各バッチは、１７．５ｐｍ
ｏｌの各プライマー、２０ｐｍｏｌの鋳型プラスミドＤＮＡ、３ＵのＰｆｕポリ
メラーゼおよび３．２５ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰを含有していた。反応は９５℃、
４分で開始し、ついでバッチを以下の加熱サイクルに付した：９５℃、１分；４
６〜５２℃、２．５分；７２℃、１７分の２０サイクル。これらの２０サイクル
の後、該反応を７２℃で１５分間継続した。部位特異的突然変異誘発をＰＣＲに
より行うため、１つのアミノ酸を置換するために個々のコドンを改変した。特定
のアミノ酸をランダム化するために、「ｎｎｎ」がその特定のアミノ酸をコード
するプライマーを使用した。すべてのＰＣＲ産物溶液を、２０ＵＤｐｎＩで３
７℃で３時間処理して、元の未突然変異鋳型ＤＮＡを消化した。ついで大腸菌（
Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α内への形質転換を行った。

【００６３】方法３：野生型酵素および突然変異体の発現および精製Ｐ４５０ＢＭ−３野生型遺伝子およびその突然変異体を、強力な温度誘導性
Ｐ_ＲＰ_ＬプロモーターｐＣＹＴＥＸＰ１の制御下、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｄ
Ｈ５α（ｓｕｐＥ４４，ｌａｃＵ１６９［８０ｌａｃＺＭ１５］ｈｓｄＲ１
７ｒｅｃＡ１ｅｎｄＡ１ｇｙｒＡ９６ｔｈｉ−１ｒｅｌＡ１）内で発
現させた。単点突然変異Ｆ８７Ａを先行技術（１２）に従い導入した。該形質転
換細胞を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上にプ
レーティングした。該コロニーを１２〜２４時間培養した後、それらを無菌爪楊
枝で拾い上げ、１００μｇ／ｍｌアンピシリンと共に２００μｌのＴＢ培地（
１２ｇのトリプトファン、２４ｇの酵母エキス、４ｍｌのグリセロール、１リッ
トルまでの（蒸留）Ｈ_２Ｏ）を各ウェルが含有する９６ウェルマイクロタイター
プレート内に入れた。該プレートを３７℃で一晩インキュベートした。ついで４
０μｌを各ウェルから取り出し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンと共に２ｍｌ
のＴＢ培地を含有する培養チューブ内に移し、ついで該バッチを３７℃で２時間
、ついで４２℃で６時間インキュベートした。該細胞を４０００ｒｐｍで５分間
の遠心分離により取り出し、ニワトリアルブミンリゾチーム（１Ｕ／ｍｌ）で処
理し、ついで２回、凍結し除氷した。１４，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離
により粗細胞抽出物を得た。得られた上清中の該活性を測定した。大量の酵素を
得るために、１００μｇ／ｍｌアンピシリンと共に３００ｍｌのＴＢ培地を含
む２−ｌ振とうフラスコを使用し、３７℃でインキュベートし、２００ｒｐｍで
２時間振とうし（ＯＤ_{５７８ｎｍ}＝０．８〜１．０）、ついで４２℃で６時間イ
ンキュベートした。該細胞を４０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により集め、
１５ｍｌの０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．４）に懸濁させた。
該氷冷懸濁液をＢｒａｎｓｏｎ超音波処理装置Ｗ２５（Ｄｉｅｔｚｅｎｂａｃｈ
，Ｇｅｒｍａｎｙ）（８０Ｗ、２分間、３サイクル）により破砕した。該懸濁液
を３２５７０×ｇで２０分間遠心分離した。酵素活性の測定または酵素精製のた
めに、該粗抽出物を使用した。

【００６４】酵素精製は、ＢｉｏＰｉｌｏｔクロマトグラフィー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓ
ｗｅｄｅｎ）を使用する以外は（１４）に記載のとおりに行った。全タンパク質
および酵素の量を測定することにより、酵素純度を測定した。波長の組合せ４５
０ｎｍおよび４９０ｎｍに関する９１ｍＭ^−１ｃｍ^−１の分子吸光率を用いて、
鉄（ＩＩ）形態と鉄（ＩＩ）形態のカルボニル複合体との吸光スペクトルの差か
ら、精製された酵素の濃度を求めた。

【００６５】方法４：より短い鎖長の基質に対して、より高い活性を有する突然変異体の単離上記野生型の代わりに、Ｐ４５０ＢＭ−３突然変異体Ｆ８７Ａを鋳型ＤＮＡ
として使用した。問題の位置の突然変異を前記のとおりに作製した。各事例にお
いて、各位置における該配列領域をスクリーニングするために約１００個のコロ
ニーを拾い、培養チューブ内で増殖させ、細胞をチューブから取り出し、細胞溶
解した。選択した各コロニーからの粗細胞抽出物を活性試験に使用した。１５−
ｐＮＣＡより短い鎖長を有する少なくとも１つの基質に対してＦ８７Ａより高い
活性を示す全ての突然変異体を配列決定して、その突然変異を同定した。

【００６６】同じ位置の全ての突然変異体のうち、それぞれ１２−ｐＮＣＡ、１０−ｐＮＣ
Ａまたは８−ｐＮＣＡに対して、最も高い活性を有する突然変異体を、続いて行
う他の突然変異との組合せのために選択した。組合せた突然変異を、部位特異的
突然変異誘発法により段階的に施した。その組合せ法を図１に示す。基質特異性
を測定するために、各組合せ工程から６個のコロニーを単離した。典型的な基質
特異性を有するコロニーを選択し、その純粋な酵素に対する基質特異性を測定し
た。選択したコロニーのプラスミドを、部位特異的突然変異誘発法の次工程で使
用した。最終突然変異体内の突然変異をＤＮＡ配列決定（ＡＢＩＰＲＩＳＭ（
登録商標）ＢｉｇＤｙｅ（商標）ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅ
ｑｕｅｎｃｉｎｇＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔおよびＡＢＩＰｒ
ｉｓｍ（商標）３７７ＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅｒ）により同定した。

【００６７】方法５：酵素活性アッセイｐＮＣＡ活性アッセイでは、使い捨てセル中のＤＭＳＯ中１０ｍＭｐＮＣＡ
溶液８μｌ（最終容積１ｍｌ）を使用した。８５０μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッ
ファー（０．１Ｍ，ｐＨ８．２）および０．１〜０．４ｎｍｏｌのＰ４５０を問
題のｐＮＣＡ／ＤＭＳＯ溶液に加えた後、該サンプルを５分間プレインキュベー
トし、ついで５０μｌの１ｍＮＮＡＤＰＨ水溶液を加えることにより反応を開
始させた。ＫｃａｔおよびＫｍを求めるために、種々のｐＮＣＡ基質について一
連の濃度系列を確立した（検出方法の詳細に関しては、（１２）を参照されたい
）。

【００６８】９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒ
ｍａｎｙ）を使用して、マイクロタイタープレート中でｐＮＣＡ試験を行った。
Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー（０．１Ｍ，ｐＨ８．２）中の２５０μｌの全反応
容積中、反応バッチは６０ｎｍｏｌの８−ｐＮＣＡ、１５ｎｍｏｌの１０−ｐＮ
ＣＡ、１５ｎｍｏｌの１２−ｐＮＣＡまたは１５ｎｍｏｌの１５−ｐＮＣＡ（各
場合において２．５μｌのＤＭＳＯに溶解されている）を含有していた。サンプ
ルを４０μｌのＰ４５０ＢＭ−３サンプルと共に５分間プレインキュベートし
た後、３０μｌの１ｍＭＮＡＤＰＨ溶液を各ウェル内に注入することにより反
応を開始させた。ＮＡＤＰＨ溶液を加えた直後に、プレートを、プレートリーダ
ーにおいて４０５ｎｍで測定した。

【００６９】方法６：本発明の突然変異体を使用するカルボン酸の変換およびその産物の同定ａ）化学反応Ｐ４５０ＢＭ−３またはその突然変異体の存在下で脂肪酸をヒドロキシル化
するために、以下のバッチを選択した。Ｐ４５０ＢＭ−３突然変異体：２０ｍｇ反応バッファー：２０ｍｌ（Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ５０ｍＭ、ＫＣｌ２５０ｍＭ、ｐＨ７．８）脂肪酸：１０ｍｇアセトン：４００μｌ（２％ｖ／ｖ）（反応を２倍加速する）。

【００７０】反応を行う前に、酵素凍結乾燥物を１ｍｌの反応バッファーに溶解し、まず、
３６℃で３０分間インキュベートした。２％ｖ／ｖアセトンの添加と同様、
インキュベーションによって、活性がそれぞれ６０および７５％増大する。

【００７１】５分間のインキュベーションの後、５００μｌの既に調製されたＮＡＤＰＨ溶
液（１２．５ｍｇ／ｍｌ）を加えた。この反応の経過を３４０ｎｍでの吸光度測
定によりモニターし、ＮＡＤＰＨの消費を観察することができる。理論的には、
化学量論的変換には４ｍｌのＮＡＤＰＨ溶液が必要と考えられるが、該反応溶液
中の過度に高いＮＡＤＰＨ濃度によって、酵素の不活性化が引き起こされる。こ
のため、補因子を５００μｌずつ加える。

【００７２】上記反応が終了した後、該溶液を５Ｍ塩酸でｐＨ２に酸性化した。脂肪酸ま
たはヒドロキシル化脂肪酸はこの間に沈殿し、溶液の曇りが認められるようにな
る。ついでこの混合物を各事例で１０ｍｌのジクロロメタンで２回抽出し、硫酸
ナトリウムで乾燥した。折り重ねたフィルターで濾過した後、該ジクロロメタン
をロータリーエバポレーター上で又は窒素と共に蒸発させることにより除去した
。残存した白色固体を２ｍｌのジクロロメタン中に取り、ＧＣ分析で使用した。

【００７３】ｂ）ガスクロマトグラフィーによる分析ＦＩＤを備えたＦｉｓｏｎｓガスクロマトグラフ（ＦｉｓｏｎｓＩｎｓｔｒ
ｕｍｅｎｔｓＭｅｇａＳｅｒｉｅｓ，Ｍａｉｎｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を分析
に使用した（Ｏｐｔｉｍａ５−カラム、内径２５ｍ×０．２５ｍｍ，Ｍａｃｈ
ｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ，Ｄｕｒｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。

【００７４】分析のために、出発物質および産物をＭＳＨＦＢＡでシリル化した。この間、
すべてのヒドロキシル基および酸性基が、それぞれ対応するトリメチルシリルエ
ーテルおよびエステルに変換される。このサンプルは無水であることに注意しな
ければならない。なぜなら、そうでなければシリル化剤との副反応が生じるから
である。１５μｌのＭＳＨＦＢＡを１０μｌの該ヒドロキシ脂肪酸含有ジクロロ
メタン溶液中にピペッティングし、この混合物を室温で１５分間インキュベート
した。２５μｌのジクロロメタンを加えた後、ＧＣ分析を行った。

【００７５】このために、１μｌの上記シリル化サンプルを上記ガスクロマトグラフ内に注
入した。インジェクターおよび検出器の温度は３５０℃であった。以下の温度プ
ログラムを用いた：

【００７６】実施例１：出発突然変異体の選択Ｐ４５０ＢＭ−３単一突然変異体Ｆ８７Ａを出発鋳型として使用した。前記
のとおり、この突然変異は、飽和Ｃ１２−およびＣ１４−脂肪酸におけるω−１
、ω−２およびω−３のヒドロキシル化位置をω−位に変化させる（１３）。１
２−ｐＮＣＡおよび１５−ｐＮＣＡの変換に関しては、野生型の場合と比べてω
−ヒドロキシル化が有意に増大することも示された（１２）。１２−ｐＮＣＡの
ω−ヒドロキシル化に関しては、該野生型の場合には３３％の変換であるのに対
して、完全な変換が得られた。位置選択性の増加に加えて、１２−ｐＮＣＡおよ
び１５−ｐＮＣＡに対する活性の増加も認められた（表２で比較されたい）。

【００７７】

【表２】種々の鎖長を有する種々のｐＮＣＡ誘導体に対する選択されたＰ４５０ＢＭ−
３突然変異体の比活性^１

【００７８】Ｆ８７Ａの位置選択性の増加は、構造モデルを参照して理解しうる。嵩高い残
基Ｆ８７をアラニンで置換すると、Ｆ８７により並びにＶ７８、Ａ８２、Ｔ２６
０、Ｉ２６３およびＡ２６４により形成される、ｐ−ニトロフェノキシ基に対す
る結合ポケットが拡大する。また、その大きなｐ−ニトロフェノキシ基が該結合
ポケットに接近するのが容易になり、Ｆ８７とｐＮＣＡの炭素原子ω−２および
ω−１との間の立体相互作用が排除される。これは、ヘム鉄原子に対するω位の
、より有利な配向を可能にする。

【００７９】実施例２：モデリングによる個々の突然変異位置の選択、選択した位置の部位特異的ランダム化突然変異誘発およびスクリーニング１．突然変異位置の選択結合Ｃ８−ｐＮＣＡ基質のモデルは、カルボキシレートが該カルボキシレート
結合残基Ｒ４７およびＹ５１からそれぞれ９および１１Åの距離に位置すること
を示している。Ｃ８基質に対する活性を誘導するには、該基質のカルボキシレー
ト基から適当な距離に位置する新たな結合部位を生成させる必要がある。８−ｐ
ＮＣＡの結合を促進するには、追加する残基は該結合部位内に配置すべきである
。元のカルボキシレート結合部位を形成する残基Ｒ４７およびＹ５１を選択した
。Ｒ４７に関しては、そのグアニジニウム基と該基質のカルボキシレート残基と
の間でイオン対を形成することが提示されている。Ｙ５１は、基質のカルボキシ
レート基と水素結合を形成する（９）。パルミトレイン酸／Ｐ４５０ＢＭ−３
複合体においては、Ｒ４７のＣ_α原子と該脂肪酸カルボキシレート基のＣ原子と
の間の距離は１２Åである。８−ｐＮＣＡモデルのカルボキシレート基の周囲の
半径１２Åの半球内の全ての残基を同定し、脂肪酸のカルボキシレート基の方向
に向いている側鎖を有するものだけを該結合ポケット内で選択した。このように
して、Ｐ２５、Ｖ２６、Ｓ７２、Ａ７４、Ｌ１８８およびＭ３５４を選択した。
これらは、おそらく、短鎖ｐＮＣＡ化合物に対する新たなカルボキシレート結合
部位を形成しうるであろう。選択したこれらの６個の残基は、柔軟なコンホメー
ションで二次構造要素上に位置する（１１）。

【００８０】２．突然変異およびスクリーニング選択した８個の残基のそれぞれの突然変異体を、問題の位置における野生型コ
ドンの部位特異的ランダム化により作製した。１９の可能なアミノ酸種のほとん
どが試験されることを保証するために、各位置の１００個のコロニーを単離し、
培養し、活性に関して試験した（したがって、各アミノ酸が試験される確率は、
トリプトファンおよびメチオニンの場合に７９％の確率になることを除き、９５
％を超える）。１５−ｐＮＣＡより短い鎖長を有する少なくとも１つの基質に対
してより高い活性値を有する突然変異体を、該突然変異の同定のために選択して
配列決定した。

【００８１】１８８位は比較的に可変性であることが明らかになった。上記１００個のコロ
ニーのほとんどはｐＮＣＡに対する活性を示した。これらから、８−ｐＮＣＡに
対するそれらの活性に基づき３７個のコロニーを選択した。野生型を含めて１６
の異なるアミノ酸型が検出された。この結果は更に、可能性のある２０のアミノ
酸のほとんどが試験されることを保証するためには１００個のコロニーの選択で
十分であることを証明した。１５の置換のうち、置換Ｋ、Ｒ、Ｗ、Ｑ、Ｎ、Ｇ、
ＡおよびＳは、より短い鎖長の基質に対する触媒活性を有意に増大させた。負に
荷電したアミノ酸によるＬの置換によって、１０−ｐＮＣＡ、１２−ｐＮＣＡお
よび１５−ｐＮＣＡに対する活性が３〜７倍減少した。

【００８２】残りの７個の位置を、１８８位と同様にランダム化した。突然変異を検出する
ためのＤＮＡ配列決定のために、各位置から７〜１９個のコロニーを選択した。
これらの遺伝子のほとんどは突然変異していないか、または該遺伝子産物は、よ
り短い鎖長の基質に対する活性の減少を示した（この試験は純粋な酵素で行った
）。各場合において、１５−ｐＮＣＡと比較して、より短い鎖長の基質に対して
、より高い活性を示したのは、２６、４７、７４および３５４位の突然変異体で
は僅か１個、７２位の突然変異体では２個、そしてＰ２５およびＹ５１位の突然
変異体では０個であった。８−ｐＮＣＡに対して最大活性を有する１８８位およ
び７２位における突然変異体、ならびに２６、４７、７４および３５４位の単一
突然変異体を、組合せのために選択した。前記表２に列挙されているこれらの突
然変異は、以下の置換を含有する：Ｖ２６Ｔ、Ｒ４７Ｆ、Ｓ７２Ｇ、Ａ７４Ｇ、
Ｌ１８８ＫおよびＭ３５４Ｔ。Ｆ８７Ａと比較して、８−ｐＮＣＡに対する比活
性は、０．５〜３３．５倍増大した。これらの突然変異のそれぞれを、元の突然
変異Ｆ８７Ａと段階的に組合せた。

【００８３】実施例３：突然変異体の段階的組合せにより作製された多重突然変異体およびそれらのスクリーニング１．突然変異体Ｌ（Ｆ８７Ａ、Ｌ１８８Ｋ）単一突然変異体の組合せは個々の効果の累積を必ずしも与えないため、最初の
突然変異体の選択は決定的に重要である。最初の突然変異の誤った選択は、最適
な多重突然変異をもたらさない進化経路につながりうる。単一突然変異体の大き
な出発プールの場合、莫大な組合せ多様性が考えられ、その結果、所望の多重突
然変異体が見出されることはありそうもない。

【００８４】以下の２つの基準が出発物質としての突然変異体Ｌの選択を促進する。すなわ
ち、他の全ての突然変異体と比較した場合の８−ｐＮＣＡに対するその活性の増
加（表２）、および、酵素／基質相互作用および該結合部位の特性における変化
である。これらの変化を確認するために、ＳＹＢＹＬ法により該突然変異位置の
側鎖を置換することにより、選択した突然変異体の構造モデルを作製した。Ｌ１
８８は、αヘリックスＦのＣ末端上に位置する。このヘリックスおよび近傍のＧ
ヘリックスは、基質結合により最大のシフトを受ける（９）。このモデルは、ロ
イシンからリシンへの置換が新たな推定カルボキシレート結合部位の形成を招く
ことを示している。Ｋ１８８のアミノ基と８−ｐＮＣＡのカルボキシレート残基
との間の距離は６Åであり、したがって実験的に値が測定されているパルミトレ
イン酸のカルボキシレート基とＲ４７のグアニジニウム基（元の結合残基）との
距離に匹敵する。Ｒ４７のグアニジニウム基と８−ｐＮＣＡのカルボキシレート
基との間の距離は１１．４Åである。したがって、該ヒドロキシル化Ｃ８原子な
らびにＫ１８８および該基質のカルボキシレート基の間のイオン対反応はヘム鉄
原子への反応し易い距離において起こると提示されうる。

【００８５】残りの５つの突然変異体を、部位特異的突然変異誘発による突然変異体Ｌと段
階的に組合せた（図１で比較されたい）。選択した突然変異体の構造モデルを各
突然変異誘発工程について作製した。基質結合に対する作製した突然変異体の効
果をこのモデルに関して調べ、これに基づき、該突然変異体およびそれらの組合
せの最適化された特性に対する論理的説明を提示した。

【００８６】２．突然変異体ＬＡ（Ｆ８７Ａ、Ｌ１８８Ｋ、Ａ７４Ｇ）８−ｐＮＣＡに対する触媒効率は、突然変異Ａ７４Ｇを突然変異体Ｌ内に導入
することにより増加した。Ａ７４はα−ヘリックスＢ’のＮ末端に位置する。Ａ
７４の側鎖はＫ１８８のアミノ基と立体的に相互作用するため、この相互作用は
、Ａ７４をグリシンで置換することにより排除される。したがって、該基質のカ
ルボキシレート基に対する、該側鎖のより有利な配向を可能にする。

【００８７】３．突然変異体ＬＡＲ（Ｆ８７Ａ、Ｌ１８８Ｋ、Ａ７４Ｇ、Ｒ４７Ｆ）８−ｐＮＣＡに対する触媒効率は、追加的な突然変異Ｒ４７Ｆを導入すること
により成功裏のうちに改善された。突然変異Ｒ４７Ｆは、考えられうる２つの効
果を有していた。フェニルアラニンは元のカルボキシレートの結合を妨げる。そ
して、残基Ｆ１１、Ｌ１４、Ｌ１７、Ｐ１８、Ｐ４５およびＡ１９１により形成
される結合チャンネルの入り口にある疎水性部分（これは溶媒にさらされる）を
拡大する。この疎水性部分は、該基質に対する結合に特に重要である（１１）。

【００８８】４．突然変異体ＬＡＲＶ（Ｆ８７Ａ、Ｌ１８８Ｋ、Ａ７４Ｇ、Ｒ４７Ｆ、Ｖ２
６Ｔ）突然変異Ｍ３５４Ｔを突然変異体ＬＡＲに加えると、８−ｐＮＣＡに対するＫ
ｃａｔ値が減少する。したがって、更なる組合せ実験にはＭ３５４Ｔを加えなか
った。しかし、突然変異Ｖ２６Ｔを突然変異体ＬＡＲに加えると、得られる突然
変異体ＬＡＲＶはＬＡＲより若干高いＫｃａｔ値および若干低いＫｍ値を示す。
８−ｐＮＣＡに対する触媒効率は増加した。代わりに突然変異Ｓ７２Ｇを突然変
異体ＬＡＲに施すと、８−ｐＮＣＡのＫｃａｔ値は減少した。このため、突然変
異体ＬＡＲＶを更なる突然変異のために選択した。

【００８９】Ｖ２６はαヘリックスＡのＮ末端に位置する。モデルは、Ｔ２６が結合部位の
元の残基Ｙ５１の役割を果たしうること、および水素結合の形成により該基質の
カルボキシレート基を安定化しうることを示唆している。Ｔ２６のヒドロキシル
基とＫ１８８のアミノ基との間の距離は６．９Åである。元の結合部位と比較し
て、この距離は約２Å長い（Ｙ５１のヒドロキシル基とＲ４７のグアニジニウム
基との間の距離は４．８Å）。したがって、Ｋ１８８含有Ｆヘリックスを更なる
コンホメーション改変に付し、それにより、８−ｐＮＣＡは、より深い結合領域
内位置に保持され、Ｔ２６とＫ１８８との間の距離は減少する。

【００９０】５．突然変異体ＬＡＲＶＦ（Ｆ８７Ｖ、Ｌ１８８Ｋ、Ａ７４Ｇ、Ｒ４７Ｆ、Ｖ
２６Ｔ）８７位は該酵素の触媒活性および基質特異性に特に重要である可能性があった
（３，１３）。このため、部位特異的ランダム化突然変異誘発により８７位にお
いて突然変異体ＬＡＲＶを最適化した。１００個のコロニーのうち、８−ｐＮＣ
Ａに対して３．５＊１０^４ｓ^−１Ｍ^−１の触媒効率を示す１個の突然変異体を得
た。そのＤＮＡ配列データは、８７位のアラニンがバリンにより置換されている
ことを示した。

【００９１】ヘム鉄への基質の接近にはＲ８７が重要であることが、結晶構造（１１）およ
びより初期の実験（３，１３）から公知である。この物質の嵩高いパラ−ニトロ
フェニル基は、フェニルアラニンをアラニンで置換することにより該結合部位の
サイズを増加させることを必要にする。Ａ８７をバリンで置換することにより、
エーテル酸素とＶ８７側鎖との間の立体的相互作用により、Ｃ_ωとヘム鉄原子と
の接触が改善される。

【００９２】これらのデータは、２つの鍵となる工程（Ｆ８７ＡからＬ、およびＬＡＲＶか
らＬＡＲＶＦ）が８−ｐＮＣＡに対する触媒効率を増加させることを示している
。これは、突然変異体ＬＡＲＶＦにおけるその他の突然変異が、８−ｐＮＣＡに
対する活性を喪失することなく復元しうるか否かに関する問題を提起した。そこ
で、突然変異Ｆ８７Ａの代わりに突然変異Ｆ８７Ｖを含有する突然変異体を作製
した。これらの突然変異体は以下の名称を有する：１．）突然変異Ｆ８７ＶＬ１８８Ｋを有するＬ７Ｖ、２．）突然変異Ｆ８７ＶＬ１８８ＫＡ７４Ｇを有するＡＬ７Ｖ、３．）突然変異Ｆ８７ＶＬ１８８ＫＡ７４ＧＲ４７Ｆを有するＡＲＬ７Ｖ
。

【００９３】活性アッセイにおいては以下の結果が得られた。

【００９４】

【表３】ｐＨ８．０および２５℃で測定された種々の鎖長を有するｐＮＣＡ誘導体に対す
るＰ４５０ＢＭ−３突然変異体の速度論的パラメーター

【００９５】これらの結果は、突然変異体Ｆ８７ＶおよびＬ７Ｖが基質８−ｐＮＣＡに対し
ては測定可能な変換を示さないことを示している。この結果は更に、４重突然変
異体ＡＲＬ７Ｖが、５重突然変異体ＡＲＶＬＦより一層良好な触媒効率を示すこ
とを示している。

【００９６】さらに、突然変異体ＡＲＬ７ＶおよびＡＲＶＬＦは、野生型酵素の最も短い天
然脂肪酸基質より２炭素原子短いカプリン酸（Ｃ１０）に対して高い活性を示す
。さらに、ラウリン酸（Ｃ１２）を基質として使用した場合には、ω−４−モノ
ヒドロキシル化産物が認められ、一方、Ｐ４５０ＢＭ−３の野生型酵素はω−
１、ω−２およびω−３位においてのみ活性である。

【００９７】実施例４：種々の鎖長を有するカルボン酸および種々の突然変異体に関する好ましいヒドロキシル化位置の決定、および野生型酵素との比較反応バッチを、前記方法（６）に従い後処理し分析した。

【００９８】その結果を以下の表４に列挙する。

【表４】

【００９９】ラウリン酸のヒドロキシル化において認められるのは、位置選択性の変化が、
まず、野生型からＰ４５０ＢＭ−３Ｆ８７Ｖへの変化中に生じ、それがω−
３ヒドロキシル化を優先的に触媒する（これはＰ４５０ＢＭ−３Ｌ７Ｖの場
合と同様である）ということである。３重突然変異体への変化中に、その位置選
択性が再び変化し、Ｐ４５０ＢＭ−３ＡＬ７Ｖ、Ｐ４５０ＢＭ−３ＡＲ
Ｌ７ＶおよびＰ４５０ＢＭ−３ＡＲＶＬＦはヒドロキシル化をω−２位に優
先的に導く。

【０１００】すべてのＧＣ分析は、カプリン酸がＰ４５０ＢＭ−３ＡＲＶＬＦおよびＰ
４５０ＢＭ３ＡＲＬ７Ｖによってのみ変換され、一方、その他の突然変異体
においては１％未満の変換しか見出せないことを示している。両方の酵素は実質
的に同じ位置選択性を示し、ω−１位が好ましい。

【０１０１】反応収率を測定するために、基準物質のガスクロマトグラムを記録した。用い
た出発物質の基準物質は、溶媒としてジクロロメタンを使用するカプリン酸また
はラウリン酸溶液（濃度０．５ｍｇ／ｍｌ）であった。ＦＩＤ検出法により、出
発物質および生成物のピーク面積を互いに単純に比較することは可能ではなかっ
た。なぜなら、異なる構造式および実験式を有する分子は、燃焼に際して異なる
イオンフラックスを生成するからである。これらのイオンフラックスは、出発物
質と生成物との量比に比例しない。そこで、用いた生成物の基準物質は、商業的
に入手可能な１０−ヒドロキシカプリン酸または１２−ラウリン酸であった。該
基準物質および該生成物の実験式は同一であり、その構造はヒドロキシル基の位
置に関して異なるにすぎず、このため、同一量に関してほぼ同一の検出可能なイ
オンフラックスが推定されうる。

【０１０２】Ｐ４５０ＢＭ−３ＡＲＶＬＦおよびＰ４５０ＢＭ−３ＡＲＬ７Ｖ触媒で
のカプリン酸のヒドロキシル化においては、累積生成物収率はそれぞれ５７％お
よび３８％であった。ラウリン酸のヒドロキシル化においては、収率はＰ４５０
ＢＭ−３ＡＲＶＬＦ触媒では５１％、他の全ての突然変異体および野生型で
は３８％〜４０％であった。

【０１０３】参考文献

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】新規基質８−ｐＮＣＡに対するＰ４５０ＢＭ−３の段階的最適化。各突然変
異体について、８−ｐＮＣＡに対する触媒効率が示される（単位はＳ^−１Ｍ^−１）。

【図２】Ｐ４５０ＢＭ−３−突然変異体ＬＡＲＶＦと基質８−ｐＮＣＡとの複合体の
モデル。突然変異のための５つの最良の位置を示し、突然変異体ＬＡＲＶＦを与
えるように組合された側鎖が示されている（Ｖ２６Ｔ、Ｒ４７Ｆ、Ａ７４Ｇ、Ｆ
８７Ｖ、Ｌ１８８Ｋ）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＣＮ，ＪＰ，ＮＯ，ＵＳ (72)発明者シュワンベルク，ウルリッヒドイツ連邦共和国ディー−71336 ワイブリンゲンウーランドシュトラーセ 15 (72)発明者シュミット，ユッタドイツ連邦共和国ディー−70563 シュトットガルトフッガーシュトラーセ 19 (72)発明者フィシャー，マルクスドイツ連邦共和国ディー−71638 ルードヴィッヒスブルグウーランドシュトラーセ 14 (72)発明者シュミッド，ロルフドイツ連邦共和国ディー−70329 シュトットガルトシルバニアウェグ６ (72)発明者リ，クィン−シャン京都府左京区，北白川追分町Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA08 CA02 CA20 DA06 EA04 GA11 GA18 GA25 GA27 HA01 HA03 HA06 4B050 CC01 CC04 DD02 FF14E GG01 HH01 LL05 4B064 AD87 CA02 CA19 CA22 CC01 CC24 CD07 CD12 CE10 DA16 4B065 AA17Y AA26X AB01 AC14 BA02 BA16 BA24 BB01 BC03 BC26 BD14 CA13 CA28

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】修飾されたシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼであって
、野生型酵素と比較して、その基質結合領域の部位特異的突然変異誘発により、
脂肪族カルボン酸の末端および／または末端付近の酵素的ヒドロキシル化におい
て改変された基質プロフィールを示す、上記モノオキシゲナーゼ。
【請求項２】細菌由来のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼから誘導
される、請求項１記載のモノオキシゲナーゼ。
【請求項３】アミノ酸配列領域：２４−２８、４５−５１、７０−７２、
７３−８２、８６−８８、１７２−２２４および３５２−３５６の１つにおいて
少なくとも１つの機能的突然変異を有する（ただし、該酵素が突然変異Ｆ８７Ａ
を保持する場合には、これらの領域の２以上が突然変異している）、配列番号２
のアミノ酸配列を有するバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａ
ｔｅｒｉｕｍ）シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼＢＭ−３から誘導される
、請求項２記載のモノオキシゲナーゼ。
【請求項４】アミノ酸配列領域８６−８８および１７２−２２４において
少なくとも１つの機能的突然変異を含む、請求項３記載のモノオキシゲナーゼ。
【請求項５】下記のアミノ酸置換パターン：ａ）Ｆ８７Ｖ；ｂ）Ｆ８７ＡＬ１８８Ｋ：ｃ）Ｆ８７ＶＬ１８８Ｋ；ｄ）Ｆ８７ＡＬ１８８ＫＡ７４Ｇ；ｅ）Ｆ８７ＶＬ１８８ＫＡ７４Ｇ；ｆ）Ｆ８７ＡＬ１８８ＫＡ７４ＧＲ４７Ｆ；ｇ）Ｆ８７ＶＬ１８８ＫＡ７４ＧＲ４７Ｆ；ｈ）Ｆ８７ＡＬ１８８ＫＡ７４ＧＲ４７ＦＶ２６Ｔ；ｉ）Ｆ８７ＶＬ１８８ＫＡ７４ＧＲ４７ＦＶ２６Ｔ；およびそれらの機能的等価物のうちの少なくとも１つを含む、請求項４記載のモ
ノオキシゲナーゼ。
【請求項６】下記のアミノ酸置換：ａ）Ｖ２６Ｔ、ｂ）Ｒ４７Ｆ、ｃ）Ｓ７２Ｇ、ｄ）Ａ７４Ｇ、ｅ）Ｆ８７Ｖ、ｆ）Ｌ１８８ｚ（ここで、ｚは、Ｋ、Ｒ、Ｗ、Ｑ、Ｎ、Ｇ、ＡおよびＳから選ば
れるアミノ酸である）、およびｇ）Ｍ３５４Ｔ；ならびにそれらの機能的等価物からの単一アミノ酸置換を含む、請求項３記載の
モノオキシゲナーゼ。
【請求項７】請求項１〜６のいずれか１項記載のモノオキシゲナーゼをコ
ードする核酸配列またはその相補的核酸配列。
【請求項８】調節核酸配列の遺伝的制御下に、請求項７記載の核酸配列を
含むコード配列を含んでなる発現構築物。
【請求項９】少なくとも１つの請求項８記載の発現構築物を含んでなるベ
クター。
【請求項１０】請求項９記載の少なくとも１つのベクターで形質転換され
た組換え微生物。
【請求項１１】エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の細菌から選
ばれる、請求項１０記載の微生物。
【請求項１２】末端または末端付近でヒドロキシル化された脂肪族カルボ
ン酸の酵素的製造方法であって、ａ１）少なくとも１つのヒドロキシル化されうるカルボン酸または少なくとも１
つのヒドロキシル化されうるカルボン酸誘導体を含有する培地の存在下に、請求
項１０または１１記載の組換え微生物を培養するか、又はａ２）少なくとも１つのヒドロキシル化されうるカルボン酸または少なくとも１
つのヒドロキシル化されうるカルボン酸誘導体を含有する反応媒体を請求項１〜
６のいずれか１項記載の酵素と共にインキュベートし、ｂ）得られたヒドロキシル化産物を該培地又は媒体から単離する、ことを含んでなる上記方法。
【請求項１３】ヒドロキシル化されうるカルボン酸がＣ_８−Ｃ_３０−モノ
カルボン酸またはその誘導体である、請求項１２記載の製造方法。
【請求項１４】ヒドロキシル化されうるカルボン酸がＣ_８−Ｃ_１２−モノ
カルボン酸またはその誘導体であり、使用するモノオキシゲナーゼが請求項５記
載の突然変異体である、請求項１３記載の製造方法。
【請求項１５】ヒドロキシル化されうるカルボン酸がＣ_１２−Ｃ_３０−モ
ノカルボン酸またはその誘導体であり、使用するモノオキシゲナーゼが、単一突
然変異体：Ｆ８７Ａ、Ｆ８７Ｖ、Ｖ２６Ｔ、Ｓ７２Ｇ、Ａ７４ＧおよびＭ３５４
Ｔ、ならびに多重突然変異体：Ｆ８７ＡＬ１８８ＫＡ７４ＧＲ４７Ｆ；Ｆ８７ＶＬ１８８ＫＡ７４ＧＲ４７Ｆ；Ｆ８７ＡＬ１８８ＫＡ７４ＧＲ４７ＦＶ２６Ｔ；およびＦ８７ＶＬ１８８ＫＡ７４ＧＲ４７ＦＶ２６Ｔ；から選ばれる突然変異体である、請求項１３記載の製造方法。
【請求項１６】電子供与体または還元当量の存在下で該反応を行う、請求
項１２〜１５のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項１７】電子供与体または還元当量がＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨおよび
Ｚｎ／Ｃｏ（ＩＩＩ）セパルクレートから選ばれる、請求項１６記載の製造方法
。