CN1152956C

CN1152956C - 新的乙内酰脲水解酶及其应用

Info

Publication number: CN1152956C
Application number: CNB01105347XA
Authority: CN
Inventors: 杨蕴刘; 许祯; 白骅; 姜卫红; 陶正利; 陈军; 焦瑞身
Original assignee: SHANGHAI INST OF PLANT PHYSIOL
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 2001-02-15
Filing date: 2001-02-15
Publication date: 2004-06-09
Anticipated expiration: 2021-02-15
Also published as: CN1369559A

Abstract

本发明提供了一种新的海因酶、编码该海因酶的多核苷酸和经重组技术产生这种海因酶的方法。本发明还公开了含该海因酶的载体和宿主细胞，及其在生产药物中间体D-对羟基苯甘氨酸(D-pHPG)方面的用途。本发明还公开了可用于生产D-pHPG的氨甲酰水解酶及工程菌。

Description

新的乙内酰脲水解酶及其应用

技术领域

本发明涉及微生物工程、发酵和药物中间体合成领域。更具体地，本发明涉及一种新的海因酶(又称为乙内酰脲水解酶或乙内酰脲酶)、编码该海因酶的多核苷酸和经重组技术产生这种海因酶的方法。本发明还涉及含该海因酶的载体和宿主细胞及其在生产药物中间体D-对羟基苯甘氨酸(D-pHPG)方面的用途。本发明还涉及了可用于生产D-pHPG的氨甲酰水解酶。

背景技术

由于羟氨苄青霉素(Amoxyeillin)、头孢羟氨苄(cefadroxil)、头孢哌酮(cefoperazone)、头孢罗奇(cefaprozil)等半合成β-内酰胺抗生素，具有抗菌活力强，广谱低毒等特性，已成为临床控制细菌感染的首选药物。作为该类药物合成中间体之一的D-对羟基苯甘氨酸，也因此受到制药和化工产业的重视。

D-对羟基苯甘氨酸(D-pHPG)的传统生产工艺是指通过化学合成和拆分的方法，但该工艺存在收率低，环境污染严重等弊端。

自八十年代以来，酶法制备D-对羟基苯甘氨酸的研究和应用得到重视。一般而言，先由乙醛酸、苯酚、脲缩合得到D，L-对羟基苯乙内酰脲(pHPH)，pHPH可被D-海因酶(D-hydantoinase，E.C.3.5.2.2，DHase)立体专一性水解开环生成D-N-氨甲酰-对羟基苯甘氨酸(D-CpHPG)，在碱性或存在消旋酶条件下，未被开环的L-型对映体消旋化为D-型而被进一步转化。因此，通过这种酶促不对称水解混消旋底物，pHPH可被完全转化，而不象化学拆分法，收率不到50％。在工业上已有采用固定化的D-海因酶或固定化细胞进行该步反应的报道。由D-海因酶催化生成的D-CpHPG，可通过以下二种方法而脱去氨甲酰基，得到终产物D-pHPG：(1)HNO₂重氮化的化学法，和(2)氨甲酰水解酶(D-Carbamylase，DCase)的生物转化法(图1)。

S.Takahashi等曾采用将乙内酰脲化学合成、酶促不对称水解和亚硝酸重氮化脱氨甲酰基三者相结合的酶化学工艺，由D，L-5-乙内酰脲生产D-氨基酸，但存在亚硝酸的化学诱变作用而导致的三废污染和劳动防护等问题。

以氨甲酰基的酶促水解取代化学重氮化法进行第二步反应的双酶法，不论从可行性和环境保护考虑，都是极有意义的。Kanegafuchi公司和我国山西太原生物研究所曾分别采用同时产生海因酶和氨甲酰水解酶的Agrobacteriumradiobacter或Pseudomonas sp2262的休止细胞将pHPH转化为D-pHPG。该技术的缺点是转化效率低，需要诱导物，诱导物产生的异味损害人体健康并污染环境。

近年来，在分离产酶菌株的同时，已对(1)产DHase的Pseudomonasfluorescens DSM84，Bacillus stearothermophilis NS1122A，Pseudomonasputida CCRC12857，(2)产DCase的Agrobacterium sp KNK003，以及(3)同时产DHase和DCase的Agrobacterium radiobacter B11921的相关酶基因进行克隆，得到了其中的相关酶基因，并对克隆后的基因进行分子生物学操作，以改进相关酶的酶学性质。然而，迄今为止还没有克隆出Burholderiapickettii(皮氏伯克霍尔德氏菌)的海因酶和氨甲酰水解酶的基因。

因此，本领域迫切需要开发不同来源的海因酶和氨甲酰水解酶，以及新的生产D-对羟基苯甘氨酸的工艺。

发明内容

本发明的目的就是提供一种新的海因酶以及其片段、类似物和衍生物，及其编码序列。

本发明的另一目的是提供生产海因酶的方法以及其用途。

本发明的另一目的是提供新的高效、无害的生产D-对羟基苯甘氨酸的工艺。

在本发明的第一方面，提供了新颖的分离出的海因酶，它包含：具有SEQ IDNO：4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO：4氨基酸序列的多肽。

在本发明的第二方面，提供编码分离的海因酶的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％相同性：(a)编码上述海因酶的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种：具有SEQ ID NO：3中1758-3128位的序列；具有SEQ ID NO：3中1-3439位的序列。

在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。

在本发明的第四方面，提供了制备具有海因酶活性的多肽的方法，该方法包含：(a)在适合表达海因酶的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有海因酶活性的多肽。

在本发明的第五方面，提供了本发明海因酶、其编码序列、载体或宿主细胞的用途。它们可用于生产D-对羟基苯甘氨酸。

在本发明的第六方面，提供了一种新的生产D-对羟基苯甘氨酸的工艺以及用于该工艺的氨甲酰水解酶和工程菌。

本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1是D-对羟基苯甘氨酸的合成图。

图2A是DCase表达载体pXZpC2的构建示意图。

图2B是DHase表达载体pXZpH2的构建示意图。

图3是海因酶和氨甲酰水解酶表达产物的电泳图。其中各泳道是：1.诱导前的pXZpH2/BL21；2.诱导后的pXZpH2/BL21；3，7.蛋白Maker；4.空载体；5.诱导前的pXZpC2/BL21；6.诱导后的pXZpC2/BL21。

图4是DCase的DNA和氨基酸序列。

图5是DHase的DNA和氨基酸序列。

发明内容

在本发明中，术语“海因酶”、“乙内酰脲酶”、“乙内酰脲水解酶”或“DHase”可互换使用，都指具有海因酶氨基酸序列(SEQ ID NO：4)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的海因酶。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的海因酶蛋白或多肽”是指海因酶基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化海因酶。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带

本发明的海因酶可以是重组的、天然的、合成的，优选是重组的。本发明的海因酶可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括海因酶的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然海因酶相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“海因酶”指具有海因酶活性的SEQ ID NO.4序列的多肽。该术语还包括具有与海因酶相同功能的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括海因酶的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与海因酶DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗海因酶的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含海因酶或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了海因酶的可溶性片段。通常，该片段具有海因酶序列的至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供海因酶或多肽的类似物。这些类似物与天然海因酶的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“海因酶保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：4的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。

表A

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
最初的残基	代表性的取代	优选的取代	Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys	Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys	Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu	Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu	Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn	Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn	Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala	Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala	His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu	His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu	Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg	Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg	Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu	Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu	Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr	Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr	Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr	Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr	Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu	Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：3所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：4的蛋白质，但与SEQ ID NO：3所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码海因酶成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列+各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)+非编码序列。

术语“编码海因酶的多核苷酸”可以是包括仅编码海因酶的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：4所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码海因酶的多聚核苷酸。

本发明的海因酶核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或海因酶编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的海因酶。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码海因酶的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，海因酶多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56：125)。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含海因酶编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a LaboratoryManual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；入噬菌体P_L启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、以及新霉素抗性，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞。较佳地是大肠杆菌。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的酶还包括固定在载体上的固定化酶。本领域熟知的各种固定化酶技术都可用于制备本发明的固定化的海因酶和或氨甲酰水解酶。

此外，本发明提供了海因酶、其编码序列、载体或宿主细胞的用途，它们被用于生产D-对羟基苯甘氨酸的双酶法工艺。该工艺包括步骤：

(a)在pH8-9条件下，通过海因酶的催化作用使D-对羟基苯乙内酰脲发生不对称水解，形成N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸；

(b)N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸通过氨甲酰水解酶或表达该氨甲酰水解酶的重组工程菌，被转化为D-对羟基苯甘氨酸。

此外，L-对羟基苯乙内酰脲被消旋化再形成D-对羟基苯乙内酰脲，作为步骤(a)的原料(图1)。

因此，本发明还提供了一种新的生产D-对羟基苯甘氨酸的工艺以及用于该工艺的氨甲酰水解酶和工程菌。一种从皮氏伯克霍尔德氏菌中新分离出的氨甲酰水解酶具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，其核酸序列示于SEQ ID NO：1，其中阅读框位于第2065-2976位。

与上面关于海因酶的描述相同，本发明提供了编码氨甲酰水解酶的多核苷酸，含有该多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。

鉴于海因酶和氨甲酰水解酶都用于D-对羟基苯甘氨酸的工艺，因此一种优选的工程菌是同时携带海因酶和氨甲酰水解酶基因，并表达海因酶和氨甲酰水解酶的工程菌，例如大肠杆菌。

本发明的工艺优点在于：克服了原生产工艺中的转化效率低，生产周期长，特别是严重的环境污染，以及工人的劳动保护问题。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：

皮氏伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pickettii)的培养和总DNA的分离

50ml的LB液体培养基(每升培养基含有10g酵母粉，5g蛋白胨，10g氯化纳，pH值7.0)中接种一个单菌落，28℃培养36小时。将收获的培养液4000转离心10分钟收集菌体，悬浮细菌沉淀于15ml TE缓冲液中，加入蛋白酶K和SDS至终浓度分别为100ug/ml和0.5％。混匀，并于37℃温育过夜至溶液清亮。加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，缓慢混匀后于8000转离心10分钟，用大口移液管移出上层水相。反复抽提，直至没有白色中间层。最后一次将上层转入新管(注意不要带入有机相)，加入1/10体积的3M的醋酸纳，再加入2倍体积的无水乙醇，混匀。用封口的玻璃滴管绕出DNA，将其转入新瓶中，用70％乙醇洗去盐份，干燥DNA，溶解于TE缓冲液。在其中加入RNAase至终浓度100ug/ml，于37℃温育1.5小时。然后在其中加入0.2体积的10M的醋酸铵，再加入2倍体积的无水乙醇，用封口的玻璃滴管绕出DNA，将其转入新瓶中，用70％乙醇洗去盐份，干燥DNA，溶解于TE缓冲液至终浓度250ng/ul。于4℃保存。

实施例2：

目的片段的检测

分别取40ul总DNA，在200ul的反应体系中用8ul ClaI，EcoRI，EcoRV，XhoI和20ul相应的反应缓冲液进行限制性酶切反应。反应两小时后，从反应体系中取出5ul，加入0.5ul加样缓冲液，用0.8％的琼脂糖进行凝胶电泳以观察是否酶切完全。待总DNA酶切完全后，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，混匀后与12000转离心5分钟，将上层水相转入新管，加入1/10体积的3M的醋酸钠，再加入2倍体积的无水乙醇，混匀后于-70℃放置5分钟，然后于12000转离心5分钟。倒去液体，用70％乙醇洗去盐份，室温晾干，溶于40ul双蒸水。用0.8％的琼脂糖进行凝胶电泳，1V/cm电泳过夜。将电泳后的琼脂糖凝胶室温下浸泡在20倍体积的0.25M盐酸溶液中5-15分钟，直至凝胶中的溴酚蓝恰好变为黄色为止。将胶转移至盛有20倍体积的1.5MNaCl，0.5M NaOH溶液中，室温下浸泡20分钟，更换新液，再浸泡20分钟。将胶转移至盛有20倍体积的1.0M Tris-Cl，1.5MNacl溶液(pH7.5)中，室温下浸泡20分钟，更换新液，再浸泡20分钟。将胶底朝上放在水平玻璃板的板面上，赶走两层之间的气泡。裁一张与凝胶一样大小的尼龙膜做好标记，使用前用蒸馏水浸湿，再用10×SSC浸没至少5分钟，放在凝胶上，赶走两层之间的气泡。裁两张与凝胶一样大小的新华二号滤纸，和尼龙膜进行相同的处理后，放在尼龙膜上，赶走气泡，再在滤纸上放一叠纸巾，在纸巾上方放一块玻板和500克的重物，转移约两小时或更长。取下转移好的尼龙膜，在4×SSC中浸泡5分钟，室温干燥30分钟，80℃烘干30分钟，供杂交用。

按照Roche公司提供的DIG High Primer DNA Labeling and DetectionStarter Kit II使用手册进行杂交。加1ug模板DNA用双蒸水稀释到16ul，煮沸10分钟后迅速冰浴，加入4ul DIG-High Primer 37℃放置过夜，再用65℃水浴10分钟灭活酶。检测标记效率为100ng/ul。用DIG Easy Hyb 10ml 42℃预杂交30分钟，换用新的DIG Easy Hyb在其中加入250ng已变性的DIG-标记的DNA探针，42℃放置过夜。68℃用0.5×SSC，0.1％SDS洗膜两次，每次15分钟。用洗涤缓冲液洗1-5分钟，用封闭缓冲液室温处理30分钟，再用抗体溶液处理30分钟，洗涤缓冲液作用2×15分钟，检测缓冲液处理2-5分钟后，将适量CSPD加到膜上，在膜上封口，室温放15-25分钟，37℃放10分钟，用X-光片曝光检测有杂交的条带。其中片段大小合适的是EcoR V的杂交条带。

实施例3

目的片段的分离

取40ul总DNA，在200ul的反应体系中用8ul EcoRV和20ul相应的反应缓冲液进行限制性酶切反应。反应两小时后，从反应体系中取出5ul，加入0.5ul加样缓冲液，用0.8％的琼脂糖进行凝胶电泳以观察是否酶切完全。待总DNA酶切完全后，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，混匀后与12000转离心5分钟，将上层水相转入新管，加入1/10体积的3M的醋酸钠，再加入2倍体积的无水乙醇，混匀后于-70℃放置5分钟，然后于12000转离心5分钟。倒去液体，用70％乙醇洗去盐份，室温晾干，溶于40ul双蒸水。用0.8％的琼脂糖进行凝胶电泳，1V/cm电泳过夜。割下电泳后与检测到有杂交的位置相同的琼脂糖条带，利用华舜公司生产的胶回收柱回收目的片段(50ng/ul)。

按照《分子克隆》中小量抽提质粒的方法，抽提pBluKS，将17ul抽提好的质粒(100ng/ul)在20ul的反应体系中用1ul EcoRI和2ul相应的反应缓冲液进行限制性酶切反应，反应两小时后用0.8％的琼脂糖进行凝胶电泳，5V/cm电泳30分钟。割下3kb附近的琼脂糖条带，利用华舜公司生产的胶回收柱回收到40ul的体系中。

取17ul回收物加入2ul去磷酸化酶缓冲液和0.1单位的去磷酸化酶(Promega公司)于37℃反应30分钟，用0.8％的琼脂糖进行凝胶电泳，5V/cm电泳30分钟。割下3kb附近的琼脂糖条带，利用华舜公司生产的胶回收柱回收(60ng/ul)。

按照MBI公司提供的连接酶最适反应体系20ul中加入外源片段2ul和载体1ul以及缓冲液2ul和酶0.5ul在22℃连接过夜，65℃灭活10分钟。取2ul加入100ul氯化钙法制备的转化效率达10⁷的大肠杆菌DH5α，冰上放置30分钟，42℃热激70秒，加700ulLB液体培养基37℃培养45分钟复壮，取200ul涂在含有规定浓度的X-gal和IPTG的氨苄青霉素平板。37℃培养过夜。

挑取白斑先接种到氨苄青霉素平板上，再接种到铺有尼龙膜的氨苄青霉素平板。37℃培养过夜，相对应于每一张滤膜，在一片Saran包装膜上制作一个装有0.5mol/L NaOH的小洼(0.75ml)，使菌落面朝上，将滤膜放到小洼上，展平Saran包装膜，使滤膜均匀湿润，让滤膜留于原处2-3分钟，用干的纸巾从滤膜的下方吸干滤膜，重复以上过程。再次吸干滤膜，将滤膜转移到新的带有1mol/L Tris-Cl(pH7.4)的Saran包装膜小洼上，5分钟后，吸干滤膜，重复这一步。吸干滤膜，将滤膜转移到新的带有1.5mol/L NaCl、0.5mol/LTris-Cl(pH7.4)的Saran包装膜小洼上，5分钟后，吸干滤膜，把它转移到一张干的3MM滤纸上，于室温晾至少30分钟，使滤膜干燥。将滤膜夹在两张干的3MM滤纸之间，在真空炉中于80℃干烤2小时，以固定DNA。

按实施例2中所述的方法，将膜进行杂交。杂交斑点所对应的克隆即为带有目的片段的克隆。结果得到一个阳性克隆-质粒pXZ-total。

实施例4

目的片段的分析

将带有目的片段的克隆用ClaI，EcoRV，HincII，NotI，SacI，SmaI，SpeI在20ul的反应体系中用1ul酶和2ul相应的反应缓冲液进行限制性酶切反应，反应两小时后用0.8％的琼脂糖进行凝胶电泳，5V/cm电泳30分钟。然后，与实施例2进行相同的转膜操作。同样按照Roche公司提供的DIG High PrimerDNA Labeling and Detection Starter Kit II使用手册进行杂交。

结果表明NotI所切出的片段适合测序。割下NotI切出的三条琼脂糖条带，利用华舜公司生产的胶回收柱回收。按照《分子克隆》中小量抽提质粒的方法抽提pBluKS。将17ul抽提好的质粒(100ng/ul)在20ul的反应体系中用1ul NotI和2ul相应的反应缓冲液进行限制性酶切反应，反应两小时后用0.8％的琼脂糖进行凝胶电泳，5V/cm电泳30分钟。割下3kb附近的琼脂糖条带，利用华舜公司生产的胶回收柱回收到40ul的体系中。

按照MBI公司提供的连接酶最适反应体系20ul中加入外源片段2ul和载体1ul以及缓冲液2ul和酶0.5ul在22℃连接过夜，65℃灭活10分钟。取2ul加入100ul转化效率达10⁷的大肠杆菌DH5α，冰上放置30分钟，42℃热激70秒，加700ul LB液体培养基37℃培养45分钟复壮，取200ul涂在含有规定浓度的X-gal和IPTG的氨苄青霉素平板。37℃培养过夜。挑取白斑用于测序。测序由上海基康公司的测序仪完成。

将分开测序的两目的基因用BioEdit分析，拼接为两个完整的读框(见SEQID NO：1-4)，SEQ ID NO：1和2为氨甲酰水解酶的DNA序列和氨基酸序列，阅读框位于SEQ ID NO：1中第2065-2976位，编码一个347个氨基酸的氨甲酰水解酶。SEQ ID NO：3和4为海因酶的DNA序列和氨基酸序列，阅读框位于SEQ ID NO：3中第1758-3128位，编码一个457个氨基酸的氨甲酰水解酶。有趣的是，这两个酶分别位于同一3439bp双链DNA的两条链上。

用GCG进行同源分析，结果表明：皮氏伯克霍尔德氏菌海因酶与Agrobacterim.radiobacter海因酶在氨基酸水平有85％的同源性，与Bacillus.sterothermophilus海因酶有47％的同源性，与Pseudomonas.putida的海因酶有35％的同源性。氨甲酰水解酶的基因与其他物种的氨甲酰水解酶基因高度同源：与Agrobacterim.sp KNK712有98％的同源性Agrobacterim.radiobacter有92％的同源性。

实施例5

含氨甲酰氨基酸水解酶目的基因表达载体和工程菌的构建

参见图2A。用Primer程序设计引物，氨甲酰氨基酸水解酶用5′cgagctagcatgacacgtcagatgatac和5′aagctttcagagttccgcga两条引物，以带有目的片段的克隆为模板，94℃变性5分钟后，94℃变性1分钟，52℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共进行30个循环，最后72℃放10分钟用于加A，得到大量目的基因片段。电泳后利用华舜公司生产的胶回收柱回收(50ng/ul)目的基因片段(外源片段)。

按照Promega公司pGEMT-EASY vector system提供的最适反应体系10ul中加入外源片段1ul和载体pGEMT-EASY 1ul以及缓冲液5ul和酶0.5ul在22℃连接1小时，65℃灭活10分钟。取5ul加入100ul转化效率达10⁷的大肠杆菌DH5α，冰上放置30分钟，42℃热激70秒，加500ulLB液体培养基37℃培养45分钟复壮，取200ul涂在含有规定浓度的X-gal和IPTG的氨苄青霉素平板。37℃培养过夜，挑取白斑接入试管。按照《分子克隆》中所述的方法小量抽提质粒pXZpC1，用0.5ul NheI和0.5ul HindIII在20ul含有相应的反应缓冲液的反应体系中进行限制性酶切反应，反应两小时后用0.8％的琼脂糖进行凝胶电泳，5V/cm电泳30分钟。割下0.9kb附近的琼脂糖条带，利用华舜公司生产的胶回收柱回收到20ul的体系中。

在连接反应体系10ul中加入外源片段4ul和经过NheI和HindIII酶切的载体pET28b 4ul以及缓冲液1ul和酶0.5ul在16℃连接过夜，65℃灭活10分钟。取5ul加入100ul转化效率达10⁷的大肠杆菌DH5α，冰上放置30分钟，42℃热激70秒，加500ulLB液体培养基37℃培养45分钟复壮，取200ul涂在含有规定浓度的卡那霉素平板。37℃培养过夜，挑取单菌落接入试管。按照《分子克隆》中所述方法小量抽提质粒pXZpC2，用0.5ul NheI和0.5ul HindIII在20ul含有相应的反应缓冲液的反应体系中进行限制性酶切反应，反应两小时后用0.8％的琼脂糖进行凝胶电泳，5V/cm电泳30分钟，以验证所挑取的克隆是否正确。

将构建好的表达载体pXZpC2用氯化钙法转化E.coli BL21(DE3)，得到大肠杆菌BL21(DE3)-pXZpC2工程菌。将获得的携带质粒pXZpC2的大肠杆菌于2000年12月6日并于2000年11月6日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京)，保藏号为CGMCC No.0520.2。

实施例6

含海因酶目的基因表达载体和工程菌的构建

参见图2B。用5′gctagcatggacatcattatcaaa和5′aagcttaatgccggtttactg两条引物，以带有目的片段的克隆为模板，94℃变性5分钟后，94℃变性1分钟，51℃退火1分钟，72℃延伸1.5分钟，共进行30个循环，最后72℃放10分钟用于加A，得到大量含乙内酰脲水解酶目的基因片段。电泳后利用华舜公司生产的胶回收柱回收(100ng/ul)。

按照Promega公司pGEMT-EASY vector system提供的最适反应体系10ul中加入外源片段1ul和载体1ul以及缓冲液5ul和酶0.5ul在22℃连接1小时，65℃灭活10分钟。取5ul加入100ul转化效率达10⁷的大肠杆菌DH5α，冰上放置30分钟，42℃热激70秒，加500ulLB液体培养基37℃培养45分钟复壮，取200ul涂在含有规定浓度的X-gal和IPTG的氨苄青霉素平板。37℃培养过夜，挑取白斑接入试管。按照《分子克隆》所述的方法小量抽提质粒pXZpH1，用0.5ul NheI和0.5ul HindIII在20ul含有相应的反应缓冲液的反应体系中进行限制性酶切反应，反应两小时后用0.8％的琼脂糖进行凝胶电泳，5V/cm电泳30分钟。割下1.4kb附近的琼脂糖条带，利用华舜公司生产的胶回收柱回收到20ul的体系中。在连接反应体系10ul中加入外源片段5.5ul和经过NheI和HindIII酶切的载体pET28b 3ul以及缓冲液1ul和酶0.5ul在16℃连接过夜，65℃灭活10分钟。取5ul加入100ul转化效率达10⁷的大肠杆菌DH5α，冰上放置30分钟，42℃热激70秒，加500ulLB液体培养基37℃培养45分钟复壮，取200ul涂在含有规定浓度的卡那霉素平板。37℃培养过夜，挑取单菌落接入试管。按照《分子克隆》中所述的方法小量抽提质粒pXZpH2，用0.5ul NheI和0.5ulHindIII在20ul含有相应的反应缓冲液的反应体系中进行限制性酶切反应，反应两小时后用0.8％的琼脂糖进行凝胶电泳，5V/cm电泳30分钟，以验证所挑取的克隆是否正确。

将构建好的表达载体pXZpH2用氯化钙法转化E.coli BL21(DE3)，得到大肠杆菌BL21(DE3)-pXZpH2工程菌。将获得的携带质粒pXZpH2的大肠杆菌于2000年12月6日并于2000年11月6日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京)，保藏号为CGMCC No.0520.1。

实施例7

目的基因的表达

挑取单菌落接入含有50ug/ml卡那霉素的LB试管，培养过夜，再按1％的接种量接入一管新的含有50ug/ml卡那霉素的LB试管中，37℃培养至OD600＝0.6时，加入终浓度1mM的IPTG，再培养2小时，分别收集诱导前和诱导后的菌体。将菌体全细胞进行SDS-PAGE，分析蛋白表达量(见图3)，其中海因酶的表达量占细菌总蛋白的30..8％，氨甲酰水解酶的表达量占细菌总蛋白的42.2％。

实施例8

带有目的片断的菌体活力测定

A.氨甲酰氨基酸水解酶酶活测定

方法：将过夜培养的pXZpC2/BL21(DE3)菌液，按1％接种量接种48mlLB液体摇瓶，培养至OD600＝0.6时，再加入IPTG，终浓度为1mM，37℃诱导2小时，离心收集菌体用20ml生理盐水洗涤，最后悬浮在3ml pH8.0 NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液中，稀释50倍测OD600。在冰箱中冻存过夜，取经40℃预热的菌液0.2ml和0.2ml 1％底物浓度的pH8.0的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液混匀在40℃反应30分钟，反应结束后，立刻离心沉淀菌体，取100ul上清加入100ul pH5.5的NaAc-HAc缓冲液，再加入3ml 0.5％ninhydrin和0.5％hydrindantin的乙二醇甲醚溶液，60℃反应30分钟，然后振荡于室温稳定1小时，测定OD₅₇₀。用已知浓度溶液100ul加入100ul pH5.5的NaAc-HAc缓冲液，再加入3ml 0.5％ninhydrin和0.5％hydrindantin的乙二醇甲醚溶液，60℃反应30分钟，然后振荡于室温稳定1小时，测定OD570，绘制标准曲线，求出K值，根据公式，计算酶活。

结果如表1所示：

表1：pXZpC2氨甲酰氨基酸水解酶活力测定

N-氨甲酰-对-羟基苯甘氨酸

121.94ug/ml·h

65.91ug/OD·h

0.45U/ml

测试菌是大肠杆菌-pXZpC2

酶活力(U/ml)＝K×OD570×4×15/0.5×48×M

1U酶活定义为每小时产生1um相应产物所需酶量。

B.乙内酰脲水解酶酶活测定

方法：将过夜培养的pXZpH2/BL21(DE3)菌液，按1％接种量接种48mlLB液体摇瓶，培养至OD600＝0.6时，再加入IPTG，终浓度为1mM，37℃诱导2小时，离心收集菌体用20ml生理盐水洗涤，最后悬浮在3ml pH8.0 NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液中，稀释50倍测OD600。将菌液分装为每管1ml，离心，菌体悬浮在1.2ml合适底物溶液(1％的对羟基苯海因，海因，0.5％的二氢尿嘧啶)的pH8.0的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液，每管0.3ml，40℃反应1小时，立刻离心取上清250ul加入550ul 5％对二甲胺基苯甲醛的6N盐酸溶液，测定OD₄₃₈。用已知浓度溶液250ul加入550ul 5％对二甲胺基苯甲醛的6N盐酸溶液，测定OD438，绘制标准曲线，求出K值，根据公式，计算酶活。

结果如表2所示：

表2：pXZpH2乙内酰脲酶活力测定结果

对-羟基苯海因	138.78ug/ml·h	100.48ug/OD·h	0.83U/ml
对-羟基苯海因	138.78ug/ml·h	100.48ug/OD·h	0.83U/ml	海因	68.28ug/ml·h	49.43ug/OD·h	0.58U/ml
二氢尿嘧啶	85.15ug/ml·h	61.65ug/OD·h	0.64U/ml	海因	68.28ug/ml·h	49.43ug/OD·h	0.58U/ml

测试菌是大肠杆菌-pXZpH2

酶活力(U/ml)＝K×OD438×300×12/250×48×M

1U酶活定义为每小时产生1um相应产物所需酶量。

实施例9

双酶法生产D-对羟基苯甘氨酸(D-pHPG)

取按实施例8，改用28℃诱导得到的的0.5克带有pXZpC2的大肠杆菌的湿菌体细胞，用0.035％的0.1M pH8.0的磷酸钠缓冲液进行转化反应，反应分别进行1、2、3、5小时后，测定体系中有0.45mg、0.81mg、1.18mg、1.26mg的D-对羟基苯甘氨酸生成。5小时后转化率为90.8％。

取按实施例8，改用28℃诱导得到的0.4克带有pXZpH2的大肠杆菌的湿菌体细胞，用0.45％的0.1M pH8.0的磷酸钠缓冲液进行转化反应，反应分别进行1、2、3、5小时后，测定体系中有14.64mg、20.89mg、23.23mg、23.75mg的N-氨甲酰-对羟基苯甘氨酸生成。5小时后转化率达96.7％。

所以当采用双酶法生产D-对羟基苯甘氨酸时，5小时后转化率达87.5％。

修改在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

(1)一般信息：

(ii)发明名称：新的乙内酰脲水解酶及其应用

(iii)序列数目：4

(2)SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：3439bp

(B)类型：核酸

(C)链性：双链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

tctcggggtc cgtcaccacg atgaccgaac acggtctgca tgttggagga tgtcgcagcc 60

gactgacccg ccgccatcag catttccagc gtgcctgggg ggagaggttc ccccgtgtag 120

cgtctgacgg aacggtgctt cagcatcagc gcgatgcagt ccgacaccag ccgttcgccc 180

gatggtatct gattgaatgt cggtgcgccg taacgcctgt cgaaggcgct tgcaacgctt 240

gtcgccgtca ggcgcgacga cacttgtcga agtgtgtatt gtcatcatcg ttctcgtaga 300

atgccggttt actgcttgta tttgcgacgt ttcaggaatt tcccgtccgt cggttcgccg 360

acataggaac cttcgtcgac gataaccttg ccacgcagga gcaccgtctt cggcacgccc 420

ttgaccttgt gtccctcgta ggaggagtaa tccatggcgt tgtgcatggc ggtctgttcg 480

atcaccattt cggcctcggg gtcccaaagg acgatgtcgg cgtccgaacc gaccgcgatc 540

gtcccctttt gcggaaacat tccgaagacc ttggccgggc gcgtggcgac cagttccacg 600

aactgggtaa gggaaatccg gccttcgttg acgccctgat agaccatcat caaccgttcc 660

tcgacgcccg gcgcgccgtt cgggatggcg cgaaagtcgt tccggccccg gtccttgtgc 720

cccttgaaga gccaggagca atggtcggag gaaaccgttt cgaacacacc gtttctgagt 780

gcgttccaga gaacgtcatg gtctttcttc gcgcgggccg gcggtgtgaa aacgtatttc 840

gcaccttcga aatccggccg ctccaggtct tccttggtga ggtaaaggta atgcgtgcag 900

gtttccgcca gagcgcggac gcctcgcgat tttgcgcgca tcacctcctc aagggactcc 960

tcgcaggtca catggactat gtagatcggg gcgttgacga tttcggccag ggcgagggcc 1020

cgcgcggttg cctcggcttc gacccggggc gggcggctga gcgcgtggta gatcggcgcg 1080

gttttgccct cggccacgaa cttgtcgcgc agatagtcgg cggcgtcgcc gttttccgcg 1140

tgcaccatga cgagcgatcc ggtcttgacc gccttgtcga gcgtcttcag cagcgtcacg 1200

tcgtcgatca tgttcatgcc gcgataggcc atgaagacct tgaaggaggt aatgccaaga 1260

tcgggaagca cctccagctc ctcaatcacg ctgtcggtcg ggtcgagcac gatgatgtgg 1320

tagccgtaat cgatcgccga cttgccgccg gccataccgt cccacttggc gacggcttcc 1380

gccaggctgt ggccgcgatc ctgctgacag aaatcgacga tggttgtcgt tccgccacag 1440

gcggccgcga ccgtcgctgt tgcgaacgtg tcggccgact gcgtgttgaa gctgaccgtt 1500

tcgacatgcg tgtgaacgtc tatgccgccc ggaaagacgt agcggccggc cgcgtcgatc 1560

gtccgctccg ctgggccgag cgcgccgccg atctgggtga tcttgccatc cttgatcccg 1620

agatcggcgc gagaaatgcc atccgcggtc acgatggttc cgtttttgat aatgatgtcc 1680

atgatgtcgc tctcaggatt gaagagtttg ttccgtatat ggaatgtaat tctttataca 1740

agtttgcatg gtgttttgaa gctgtcaagc ggaacggcgg cctagcgaag acgattctgt 1800

gcagagcgct ctcgttcgag gcggaacgag ttgaagtcga cggcgggctc gcgcgagagc 1860

ttgtcaagca gcgcaaattc cggttccgct ccggttgaca gatcaaaaat tttacgcctg 1920

ttattgtcgt gctgcatgta atatttcgta ctttatgtag aatttgcatt gcgccgcgag 1980

tcacaaagcc ggttttcggc gatgtgtttc acaacgtttt cccggccgct gggccggaca 2040

tcacctagga aggagcagag gttcatgaca cgtcagatga tacttgcagt gggacaacaa 2100

ggtccgatcg cgcgcgcgga gacacgcgaa caggtcgtcg ttcgtcttct ctacatgctg 2160

acgaaagccg cgagccgggg cgcgaatttc attgtcttcc ccgaactcgc gcttacgacc 2220

ttcttcccgc gctggcattt caccgacgag gccgagctcg atagcttcta tgagaccgaa 2280

atgcccggcc cggtggtccg tccactcttt gagaaggccg cggaactcgg gatcggcttc 2340

aatctgggct acgctgaact cgtcgtcgaa ggcggcgtca agcgtcgctt caacacgtcc 2400

attttggtgg ataagtcagg caagatcgtc ggcaagtatc gtaagatcca tttgccgggt 2460

cacaaggagt acgaggccta ccggccgttc cagcatcttg aaaagcgtta tttcgagccg 2520

ggcgatctcg gcttcccggt ctatgacgtc gacgccgcga aaatggggat gttcatctgc 2580

aacgatcgcc gctggcctga agcctggcgg gtgatgggcc tcaggggcgc cgagatcatc 2640

tgcggcggct acaacacgcc gacccacaat ccccctgttc cccagcacga ccacctgacg 2700

tccttccacc atctcctatc gatgcaggcc gggtcttatc agaacggggc ctggtccgcg 2760

gccgcgggca aggtgggcat ggaggagaac tgcatgctgc tcggccactc ctgcatcgtg 2820

gcgccgaccg gggaaatcgt cgctctcact acgacgctgg aagacgaggt gatcaccgcc 2880

gccgtcgatc tcgatcgctg ccgggaactg cgtgaacaca tcttcaactt caagcagcat 2940

cgtcagcccc agcactatgg tctgatcgcg gaactctgag gttgccgaaa agcatgtgtg 3000

tcgttgttct cggcgcctgg gtcacatcca ggcgcgccag ggtgacgctg gtggaatagt 3060

accacgaccg cttcagggcg atccgcaagg agatgcgggt cgccggagcg gcaaagcccg 3120

acattcgttt cgcaccgacg gccgtcgtga actcgacagt ccgcgagaag ggcgtattgc 3180

gcggcctgga cctgtacgtg gaactgtagc ccatatatag atttccaaag agtttcggcg 3240

aggcgcggcg cgcctagccc catgtgagcg agaaccgtgc ccagatcaaa gaatgagacc 3300

gacgcgccgg ccgcggcaaa ggatgatcct cagggtcgga tctatcgctc cgccctgaag 3360

caggagggcg cacgctggct gcttgacggc ggaggaaggg gttgctggca aagcccaagc 3420

cgcccggcct tgttccggc 439

(2)SEQ ID NO：2的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：304个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：多肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：

MTRQMILAVG QQGPIARAET REQVVVRLLY MLTKAASRGA NFIVFPELAL 50

TTFFPRWHFT DEAELDSFYE TEMPGPVVRP LFEKAAELGI GFNLGYAELV 100

VEGGVKRRFN TSILVDKSGK IVGKYRKIHL PGHKEYEAYR PFQHLEKRYF 150

EPGDLGFPVY DVDAAKMGMF ICNDRRWPEA WRVMGLRGAE IICGGYNTPT 200

HNPPVPQHDH LTSFHHLLSM QAGSYQNGAW SAAAGKVGME ENCMLLGHSC 250

IVAPTGEIVA LTTTLEDEVI TAAVDLDRCR ELREHIFNFK QHRQPQHYGL 300

IAEL 304

(2)SEQ ID NO：3的信息

(i)序列特征

(A)长度：3439碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：

gccggaacaa ggccgggcgg cttgggcttt gccagcaacc ccttcctccg ccgtcaagca 60

gccagcgtgc gccctcctgc ttcagggcgg agcgatagat ccgaccctga ggatcatcct 120

ttgccgcggc cggcgcgtcg gtctcattct ttgatctggg cacggttctc gctcacatgg 180

ggctaggcgc gccgcgcctc gccgaaactc tttggaaatc tatatatggg ctacagttcc 240

acgtacaggt ccaggccgcg caatacgccc ttctcgcgga ctgtcgagtt cacgacggcc 300

gtcggtgcga aacgaatgtc gggctttgcc gctccggcga cccgcatctc cttgcggatc 360

gccctgaagc ggtcgtggta ctattccacc agcgtcaccc tggcgcgcct ggatgtgacc 420

caggcgccga gaacaacgac acacatgctt ttcggcaacc tcagagttcc gcgatcagac 480

catagtgctg gggctgacga tgctgcttga agttgaagat gtgttcacgc agttcccggc 540

agcgatcgag atcgacggcg gcggtgatca cctcgtcttc cagcgtcgta gtgagagcga 600

cgatttcccc ggtcggcgcc acgatgcagg agtggccgag cagcatgcag ttctcctcca 660

tgcccacctt gcccgcggcc gcggaccagg ccccgttctg ataagacccg gcctgcatcg 720

ataggagatg gtggaaggac gtcaggtggt cgtgctgggg aacaggggga ttgtgggtcg 780

gcgtgttgta gccgccgcag atgatctcgg cgcccctgag gcccatcacc cgccaggctt 840

caggccagcg gcgatcgttg cagatgaaca tccccatttt cgcggcgtcg acgtcataga 900

ccgggaagcc gagatcgccc ggctcgaaat aacgcttttc aagatgctgg aacggccggt 960

aggcctcgta ctccttgtga cccggcaaat ggatcttacg atacttgccg acgatcttgc 1020

ctgacttatc caccaaaatg gacgtgttga agcgacgctt gacgccgcct tcgacgacga 1080

gttcagcgta gcccagattg aagccgatcc cgagttccgc ggccttctca aagagtggac 1140

ggaccaccgg gccgggcatt tcggtctcat agaagctatc gagctcggcc tcgtcggtga 1200

aatgccagcg cgggaagaag gtcgtaagcg cgagttcggg gaagacaatg aaattcgcgc 1260

cccggctcgc ggctttcgtc agcatgtaga gaagacgaac gacgacctgt tcgcgtgtct 1320

ccgcgcgcgc gatcggacct tgttgtccca ctgcaagtat catctgacgt gtcatgaacc 1380

tctgctcctt cctaggtgat gtccggccca gcggccggga aaacgttgtg aaacacatcg 1440

ccgaaaaccg gctttgtgac tcgcggcgca atgcaaattc tacataaagt acgaaatatt 1500

acatgcagca cgacaataac aggcgtaaaa tttttgatct gtcaaccgga gcggaaccgg 1560

aatttgcgct gcttgacaag ctctcgcgcg agcccgccgt cgacttcaac tcgttccgcc 1620

tcgaacgaga gcgctctgca cagaatcgtc ttcgctaggc cgccgttccg cttgacagct 1680

tcaaaacacc atgcaaactt gtataaagaa ttacattcca tatacggaac aaactcttca 1740

atcctgagag cgacatcatg gacatcatta tcaaaaacgg aaccatcgtg accgcggatg 1800

gcatttctcg cgccgatctc gggatcaagg atggcaagat cacccagatc ggcggcgcgc 1860

tcggcccagc ggagcggacg atcgacgcgg ccggccgcta cgtctttccg ggcggcatag 1920

acgttcacac gcatgtcgaa acggtcagct tcaacacgca gtcggccgac acgttcgcaa 1980

cagcgacggt cgcggccgcc tgtggcggaa cgacaaccat cgtcgatttc tgtcagcagg 2040

atcgcggcca cagcctggcg gaagccgtcg ccaagtggga cggtatggcc ggcggcaagt 2100

cggcgatcga ttacggctac cacatcatcg tgctcgaccc gaccgacagc gtgattgagg 2160

agctggaggt gcttcccgat cttggcatta cctccttcaa ggtcttcatg gcctatcgcg 2220

gcatgaacat gatcgacgac gtgacgctgc tgaagacgct cgacaaggcg gtcaagaccg 2280

gatcgctcgt catggtgcac gcggaaaacg gcgacgccgc cgactatctg cgcgacaagt 2340

tcgtggccga gggcaaaacc gcgccgatct accacgcgct cagccgcccg ccccgggtcg 2400

aagccgaggc aaccgcgcgg gccctcgccc tggccgaaat cgtcaacgcc ccgatctaca 2460

tagtccatgt gacctgcgag gagtcccttg aggaggtgat gcgcgcaaaa tcgcgaggcg 2520

tccgcgctct ggcggaaacc tgcacgcatt acctttacct caccaaggaa gacctggagc 2580

ggccggattt cgaaggtgcg aaatacgttt tcacaccgcc ggcccgcgcg aagaaagacc 2640

atgacgttct ctggaacgca ctcagaaacg gtgtgttcga aacggtttcc tccgaccatt 2700

gctcctggct cttcaagggg cacaaggacc ggggccggaa cgactttcgc gccatcccga 2760

acggcgcgcc gggcgtcgag gaacggttga tgatggtcta tcagggcgtc aacgaaggcc 2820

ggatttccct tacccagttc gtggaactgg tcgccacgcg cccggccaag gtcttcggaa 2880

tgtttccgca aaaggggacg atcgcggtcg gttcggacgc cgacatcgtc ctttgggacc 2940

ccgaggccga aatggtgatc gaacagaccg ccatgcacaa cgccatggat tactcctcct 3000

acgagggaca caaggtcaag ggcgtgccga agacggtgct cctgcgtggc aaggttatcg 3060

tcgacgaagg ttcctatgtc ggcgaaccga cggacgggaa attcctgaaa cgtcgcaaat 3120

acaagcagta aaccggcatt ctacgagaac gatgatgaca atacacactt cgacaagtgt 3180

cgtcgcgcct gacggcgaca agcgttgcaa gcgccttcga caggcgttac ggcgcaccga 3240

cattcaatca gataccatcg ggcgaacggc tggtgtcgga ctgcatcgcg ctgatgctga 3300

agcaccgttc cgtcagacgc tacacggggg aacctctccc cccaggcacg ctggaaatgc 3360

tgatggcggc gggtcagtcg gctgcgacat cctccaacat gcagaccgtg ttcggtcatc 3420

gtggtgacgg accccgaga 3439

(2)SEQ ID NO：4的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：457个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：多肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：

MDIIIKNGTI VTADGISRAD LGIKDGKITQ IGGALGPAER TIDAAGRYVF 50

PGGIDVHTHV ETVSFNTQSA DTFATATVAA ACGGTTTIVD FCQQDRGHSL 100

AEAVAKWDGM AGGKSAIDYG YHIIVLDPTD SVIEELEVLP DLGITSFKVF 150

MAYRGMNMID DVTLLKTLDK AVKTGSLVMV HAENGDAADY LRDKFVAEGK 200

TAPIYHALSR PPRVEAEATA RALALAEIVN APIYIVHVTC EESLEEVMRA 250

KSRGVRALAE TCTHYLYLTK EDLERPDFEG AKYVFTPPAR AKKDHDVLWN 300

ALRNGVFETV SSDHCSWLFK GHKDRGRNDF RAIPNGAPGV EERLMMVYQG 350

VNEGRISLTQ FVELVATRPA KVFGMFPQKG TIAVGSDADI VLWDPEAEMV 400

IEQTAMHNAM DYSSYEGHKV KGVPKTVLLR GKVIVDEGSY VGEPTDGKFL 450

KRRKYKQ 457

Claims

1.一种分离的海因酶，其特征在于，该酶选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：4氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO：4氨基酸序列经过一个或10个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有催化D-对羟基苯乙内酰脲发生不对称水解，形成N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸功能的由(a)衍生的多肽。

2.如权利要求1所述的海因酶，其特征在于，该酶具有SEQ ID NO：4氨基酸序列。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它含有一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：

(a)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸选自下组：

(a)编码具有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的多核苷酸；

(b)具有SEQ ID NO：3中1758-3128位的核苷酸序列；

(c)具有SEQ ID NO：3中1-3439位的核苷酸序列。

5.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。

6.一种转化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。

7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，它是大肠杆菌BL21(DE3)-pXZpH2，保藏号为CGMCC No.0520.1。

8.一种海因酶的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在适合表达海因酶的条件下，培养权利要求6所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出海因酶。

9.如权利要求1所述的海因酶或权利要求6所述的宿主细胞的用途，其特征在于，用于生产D-对羟基苯甘氨酸的工艺。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，该生产D-对羟基苯甘氨酸的工艺还包括：使用具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的氨甲酰水解酶或表达该氨甲酰水解酶的重组工程菌，将N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸转化为D-对羟基苯甘氨酸。