CN113647510A - 一种可降解发酵饲料中霉菌毒素的酶菌复合添加剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可降解发酵饲料中霉菌毒素的酶菌复合添加剂及其应用，利用筛选自亚洲象粪便样品中的益生菌地衣芽孢杆菌M08为基础，复配其他益生菌和酶制剂，发明了一种能够高效发酵非常规饲料原料的组分酶菌复合添加剂，该酶菌复合添加剂能够降解饲料黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮，替代常规饲料原料豆粕或与玉米，成本较为低廉，在促进动物营养物质消化吸收，降低腹泻率，提高饲料转化效率，促进生长等方面有一定积极作用。

Description

一种可降解发酵饲料中霉菌毒素的酶菌复合添加剂及其应用

技术领域

本发明属于发酵饲料添加剂技术领域，具体涉及一种可降解发酵饲料中霉菌毒素的酶菌复合添加剂及其应用。

背景技术

霉菌毒素污染给饲料工业、畜牧业带来了巨大经济损失，严重威胁人类动物源食品安全。世界卫生组织估测，全球约有25％的农作物受到霉菌毒素污染，2％以上不能食用，每年造成经济损失接近1万亿美元。我国谷物霉菌毒素阳性率90％以上，因霉变造成的粮食产后损失每年高达2100万吨，占粮食总产量4.2％，直接经济损失180～240亿元，间接损失每年超过1000亿元。由于人们习惯将不符合人类食用标准的霉菌毒素超标原料转为饲料原料饲喂动物，霉菌毒素对饲料安全的影响远远高于其对人类植物性食品安全的直接影响。动物采食霉变饲料后引起体重下降或引发疾病，还可导致畜产品及其加工制品中毒素及其代谢产物的残留，间接通过食物链进入人体的毒素具有极强的致病及致癌作用，严重威胁人类健康。

霉菌毒素是霉菌在生长过程中产生的有毒的次级代谢产物。霉菌毒素广泛存在于谷物、粮食和饲料原料中。在众多的霉菌毒素中，黄曲霉毒素B1(AFBI)和玉米赤霉烯酮(ZEA)被认为是饲料、农产品及副产物中主要霉菌毒素污染物。其中AFB1是最致命的具有肝毒性、致畸性和致物性，被工ARC定为T类致癌物。ZEA具有类雌激素作用。是雌激素强度的1/10，可造成雌性动物的雌激素水平提高，从而影响动物的生殖生理，产生类似雌激素过多的症状，象假发情、流产、死胎、生殖器官的功能和形态变化等，此外还会产生细胞毒性和遗传毒性，损伤肝肾并隆低免疫机能。

去除和降解霉菌毒素方法有传统的物理化学方法、吸附剂吸附法及生物降解法。传统的物理化学方法存在效果不稳定、处理过程对环境影响大、营养成分损失多以及难以规模化生产和广泛推广应用等缺陷。吸附剂吸附法是目前应用较多的方法，但是吸附剂吸附法主要对黄曲霉毒素具有较好的作用，对玉米赤霉烯酮和呕吐毒素等几乎没有效果，且吸附剂大多会影响饲料中维生素和微量元素等营养成分对动物的消化吸收。霉菌毒素生物降解技术通过微生物本身及其代谢产生的物质与毒素作用，能够达到破坏霉菌毒素毒性基团的效果，并且该技术还具有解毒效率高、特异性强、对饲料和环境没有污染等特点和优势，成为近年来行业关注的热点。

生物技术降解霉菌毒素主要有生物转化型、酶解型及吸附型等三种途径。生物转化型是通过筛选某些微生物，利用其代谢过程中生物转化作用，使霉菌毒素遭到破坏或转变为低毒或无毒的物质。酶解型是利用某些特殊的生物酶降解或分解霉菌毒素，使其转变为低毒或无毒的物质。吸附型是利用某些对霉菌毒素具有吸附功能的特殊生物材料吸附霉菌毒素，减轻对动物造成的危害。目前生物降解霉菌毒素技术要想实现规模化应用，仍然面临许多待解的难题。由于生物酶来源的特殊性、作用的专一性和应用条件苛刻等，对霉菌毒素降解酶及其

在实际生产应用的研究也很少。筛选能高效降解霉菌毒素的微生物，研发能高效降解霉菌毒素的生物酶制剂和益生菌的复合饲料添加剂是目前的突破口和研发方向。

发明内容

针对现有技术的问题，本发明公开了一种能同时降解玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)M08，结合其他益生菌和酶制剂复配了一种酶菌复合饲料添加剂为有效控制和消除霉菌毒素对粗食和饲料的污染，改善动物生产性能和保障人类食品安全有非常重要的意义。

为了实现本发明的技术目的，本发明具体采用以下技术方案：

一种可降解发酵饲料中霉菌毒素的酶菌复合添加剂，包括益生菌和酶制剂，其中益生菌选自地衣芽孢杆菌M08、嗜酸乳杆菌和酿酒酵母，酶制剂选自葡萄糖氧化酶、复合蛋白酶和纤维素酶。

所述酶菌复合添加剂中益生菌的含量分别为：地衣芽孢杆菌M08 100×10⁸CFU/g，嗜酸乳杆菌50×10⁸CFU/g，酿酒酵母10×10⁸CFU/g。

所述酶菌复合添加剂中酶制剂的含量分别为：葡萄糖氧化酶2000U/g，复合蛋白酶30000U/g，纤维素酶2000U/g。

本发明益生菌中地衣芽孢杆菌M08从云南省西双版纳野象谷亚洲象粪便中分离得到，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2021年7月27日，保藏地址：中国典型培养物保藏中心湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号：CCTCC M 2021942。

优选的，本发明益生菌中嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus CGMCCNo.1.1854)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No.2.3875)分别购自中国普通微生物菌种保藏中心。

本发明地衣芽孢杆菌M08能够产生细菌素等物质可以抑制畜禽肠道有害菌起到调节肠道微生物菌群平衡的作用，此外，地衣芽孢杆菌M08也能够产生外源酶，有利于发酵底物的水解；嗜酸乳杆菌可以产生大量有机酸，使得动物胃肠道pH降低，有助于有益菌的增值；酿酒酵母具有调节发酵饲料适口性的作用；

本发明酶制剂中葡萄糖氧化酶可以水解葡萄糖产生葡萄糖醛酸降低发酵饲料及动物胃肠道的pH，此外葡萄糖氧化酶也具有解毒功能，有利于霉菌毒素的降解。

本发明酶制剂中复合蛋白酶由酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶按照质量比1:1:1组成，该复合蛋白酶具有降解非常规蛋白饲料原料中抗原蛋白和使大分子蛋白质降解为小肽的作用，有利于动物的消化吸收。

本发明酶制剂中纤维素酶由木聚糖酶、β-葡聚糖酶按照质量比1:1组成，能够打开非常规饲料原料中植物细胞壁，使得非常规饲料原料中的蛋白、脂肪等物质被释放，有利于动物的消化吸收。

在本发明的另一方面，本发明从云南省西双版纳野象谷亚洲象粪便中分离得到的地衣芽孢杆菌M08也在本发明的保护范围之内。

所述的地衣芽孢杆菌M08对肠道有害菌大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和产气荚膜梭菌均具有印制效果，且具有良好的盐耐受特性。

其中，对大肠杆菌和沙门氏菌有轻微抑制作用，对金黄色葡萄球菌有中度抑制作用，对产气荚膜梭菌有强烈抑制作用；对0.3％的猪胆盐耐受活菌残留量在90.06％以上。

在本发明的另一方面，提供了上述酶菌复合添加剂在非常规蛋白饲料原料发酵中的应用。

所述非常规蛋白饲料原料包含碳源原料和氮源原料，其中，碳源原料选自玉米粉、土豆副产品、蔗糖糖蜜、碎米、木薯粒、小米、甜菜糖蜜、甘薯副产品中的一种或几种；氮源原料选自黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、酵母粉、亚麻仁粉、麦麸、酒糟中的一种或几种。

具体的，将本发明酶菌复合添加剂按照质量分数0.2％与非常规蛋白饲料原料混合发酵，发酵后的非常规蛋白资源高效饲料黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮降解率高达90％以上。

利用本发明酶菌复合添加剂发酵的非常规蛋白饲料，在使用时按照质量分数10％的比例取代原基础日粮中的豆粕或者玉米。

本发明的有益效果为：

本发明利用筛选自亚洲象粪便样品中的益生菌地衣芽孢杆菌M08为基础，复配其他益生菌和酶制剂，发明了一种能够高效发酵非常规饲料蛋白资源，能够降解饲料黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮，发酵高效饲料能够替代10％的常规饲料原料豆粕或与玉米，成本较为低廉，在促进动物营养物质消化吸收，降低腹泻率，提高饲料转化效率，促进生长等方面有一定积极作用。

附图说明

图1是本发明地衣芽孢杆菌M08的菌落形态；

图2是本发明地衣芽孢杆菌M08的系统发育树；

图3是本发明地衣芽孢杆菌M08的产酶效果；A为蛋白酶，B为淀粉酶；

图4是本发明地衣芽孢杆菌M08的抑制肠道有害菌效果。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1地衣芽孢杆菌M08的筛选、分离和鉴定

1)粪便样品采集

从中国云南省西双版纳国家级自然保护区的野象谷收集了三只野生亚洲象的新鲜粪便样本。跟踪野生亚洲大象的踪迹，直到它们排便，并立即从粪便的中间部分收集样本。将新鲜的粪便样品在液氮中运送到实验室，然后在-80℃下储存

2)富集培养和分离

称量约1g粪便倒入锥形瓶中，再加入100mL无菌生理盐水(0.9％NaCl)，充分摇晃使粪便散开后静置浸提1h，然后取1mL粪便浸提液加入至100mL LB的富集培养基中，160rpm，37℃通风培养至富集培养基变浑浊。用接种环蘸取富集菌液，在筛选培养基上划线分离，平板倒置于37℃培养箱中培养，直至出现明显单菌落，挑选形态不一的菌落并进一步在纯化培养基上划线分离(图1)。

3)地衣芽孢杆菌菌株的16S rDNA鉴定

将地衣芽孢杆菌细菌种子液接按1‰量种于LB培养基，37℃180rpm培养13h，菌液在5 000rpm，4℃离心5min收集菌体后按照天根试剂盒说明书提取DNA，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测DNA大小和纯度后-20℃保存备用。以试剂盒提取的各株细菌的总DNA为模板，用16SrDNA通用引物PCR扩增菌株的16S rDNA序列。

引物序列：

27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，

1492R：5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'。

PCR体系：40μL PCR反应体系中含有rTaq酶0.6μL，模板DNA 2μL，引物27F和1492R(20μmol·L^-1)各1μL，10x Buffer 4μL，dNTPs 2μL，ddH₂O 29.4μL。

PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸5min。

1.0％琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带，将阳性样品送至擎科生物公司进行测序，测序结果经DNAman拼接后，在NCBI上进行BlastN比对(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)。用所有活性菌株16S rDNA序列构建系统进化树。测序结果在Clustal X软件上进行多序列比对，根据Kimura双参数模型计算核苷酸的距离矩阵，再用MEGA 4.0软件的邻接算法构建系统发育树(图2)。

4)地衣芽孢杆菌菌株的生理生化鉴定

为进一步确认地衣芽孢杆菌菌株的种属，首先用该菌株的16S rDNA序列(SEQ IDNO.1)与NCBI数据库中柠檬酸杆菌属16S rDNA序列构建系统进化树分析菌株亲缘关系，用该菌株与选取的柠檬酸杆菌属16S rDNA序列在Clustal X软件中进行多序列比对，然后对其进行生理生化实验做最终鉴定，细菌经过革兰氏染色后，使用梅里埃生物公司的VITEK2Compact 2.0细菌鉴定仪革兰氏阴性鉴定卡(GN卡)进行生理生化反应实验和结果读取，然后对照生化反应数据库分析得到该菌株属于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。该地衣芽孢杆菌M08被保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC M 2021942。

实施例2益生地衣芽孢杆菌M08的益生性能评估

1)益生地衣芽孢杆菌M08的产酶效果

将活化后的地衣芽孢杆菌M08菌株分别点板至LB平板上(分别含有1％的脱脂奶粉和可溶性淀粉)，放入37℃培养箱中，过夜培养。16小时后观察LB+奶粉平板，测定透明圈大小，LB+可溶性淀粉平板用碘液进行显色后，测定透明圈大小。

结果如图3，该株地衣芽孢杆菌M08能够产蛋白酶，透明圈＝11.00mm，产淀粉酶能力微弱，透明圈＝10.00mm。

2)益生地衣芽孢杆菌M08对肠道有害菌的抑制

在超净工作台内，挑取新鲜的斜面保藏益生地衣芽孢杆菌M08和病原菌大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和产气荚膜梭菌，接种于培养基中，37℃，培养16h；吸取稀释后的病原菌100μL涂布固体平板上，三个重复组，用镊子夹取3个灭菌牛津杯于平板三角，吸取100μL地衣芽孢杆菌扩培液于牛津杯中，至于37℃培养箱，培养16小时，利用游标卡尺对抑菌圈大小进行测定。

结果如图4，地衣芽孢杆菌M08对大肠杆菌和沙门氏菌有轻微抑制作用，抑菌圈＝9.0mm，对金黄色葡萄球菌有中度抑制作用，抑菌圈＝14.0mm，对产气荚膜梭菌有强烈抑制作用，抑菌圈＝20.0mm。

3)益生地衣芽孢杆菌M08耐酸、耐胆盐的评估

将活化后的地衣芽孢杆菌M08接种于发酵培养基中，芽孢化的地衣芽孢杆菌M08菌株承受不同pH条件下耐受处理(pH2、3、4、5、6、7、8、9)2小时，残留量分别为79.29％、86.69％、91.75％、96.25％、96.96％、96.69％、97.30％和97.36％。芽孢化的地衣芽孢杆菌M08菌株在0.3％的猪胆盐耐受2、4、8、12、16小时，活菌残留量分别为97.83％、97.25％、93.99％、93.22％和90.06％。

实施例3益生地衣芽孢杆菌M08的制备

1)菌种活化

地衣芽孢杆菌M08活化培养基采用LB，配方为：酵母膏0.5％、胰蛋白胨1％、氯化钠1％，固体培养基加琼脂2％。将菌株接种到平板培养基上，37℃条件下培养24小时，获得活化菌种；

2)发酵培养

将1)中活化的菌种，分别接种到液体LB培养基中，制备2L的摇瓶种子，进而转接到50L和400L的一、二级发酵罐中，培养12小时。分别转接到三级10T发酵培养基中。发酵培养基配方为：葡萄糖1％、玉米粉1.5％、酵母粉1％、黄豆粉2.5％、柠檬酸钠0.45％、碳酸钙0.015％、硫酸镁0.002％，在37℃条件下培养48h，待芽孢率达到95％以上即可放罐。

3)益生菌半成品制备

将2)中发酵液中加入20％的淀粉，经喷雾干燥塔进行喷雾干燥，所得喷雾干粉进行计数，测定含量。地衣芽孢杆菌M08的有效活菌数可达300×10⁸CFU/g。

实施例4酶菌复合生物制剂饲料添加剂的制备

利用实施例3饲用益生菌地衣芽孢杆菌M08为基础，复配其他益生菌和酶制剂，最终地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis CCTCC NO.M08)M08含量为100×10⁸CFU/g，嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus CGMCC No.1.1854)含量为50×10⁸CFU/g、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No.2.3875)含量为10×10⁸CFU/g，葡萄糖氧化酶酶活力为2000U/g、蛋白酶酶活力为30000U/g和纤维素酶酶活力为2000U/g。

实施例5非常规饲料蛋白资源的发酵脱毒

将实施例4制备的酶菌复合生物制剂进行活化，活化方法为：红糖1公斤，灭菌水20公斤，黄豆粉3公斤，加入2公斤实例4制备的酶菌复合生物制剂，调节pH值为5.5，37℃下密封活化12小时。

活化后的菌株加入非常规饲料原料，其中，碳源选自玉米粉、土豆副产品、蔗糖糖蜜、碎米、木薯粒、小米、甜菜糖蜜、甘薯副产品中的一种或几种；氮源选自黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、酵母粉、亚麻仁粉、麦麸、酒糟中的一种或几种。

发酵产物中碳源和氮源的质量比为2.5:7.5，水分含量为38％，发酵pH和温度自然，时间36～48h。经过检测发酵后的非常规蛋白资源高效饲料黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮降解率高达90％以上。小肽含量提高了120％以上，还原糖含量提高了80％以上。

实施例6发酵、脱毒型非常规饲料蛋白资源动物养殖应用

对实施例5获得的高效发酵、脱毒型非常规饲料产品用于动物实验，本发明的高效发酵、脱毒型非常规饲料产品混合于动物日粮饲料中，可取代高成本的饲料原料，除了降低饲料成本，减少霉菌毒素，对动物生长效益的贡献，如下所示：

1、生长效果

以肉猪为研究对象，小(10-28kg)，中(28-60kg)，大猪(60-100kg)玉米-豆粕型混合日粮中加入本发明的高效发酵、脱毒型非常规饲料产品全期饲喂(加入量为10-15％，混合于日粮，取代玉米或豆粕)，较喂饲原混合日粮的肉猪增重平均提高4-6％，饲料转化率(料肉比)降低2-3％。

2、产蛋效果

以蛋鸡为研究对象，玉米-豆粕型混合日粮中加入本发明的高效发酵、脱毒型非常规饲料产品(加入量为5-10％，混合于日粮，取代玉米或豆粕)，蛋鸡产蛋率较喂饲原混合日粮平均提高2.8-3.6％，饲料转化率(料蛋比)降低2.9-3.5％。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 云南师范大学

<120> 一种可降解发酵饲料中霉菌毒素的酶菌复合添加剂及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1516

<212> DNA

<213> 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)

<400> 1

ttgagtttga ttctggctca tgaccagcgc tggtggcgtg cgtaggacat gcaaggctag 60

tggacgacgg gaggtggctc ccttctgtca gcggcggacg ggtgagtgac ccgtgggtaa 120

cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat gcttgattga 180

accgcatggt tccaatcata aaaggtggct tttagctacc acttacagat ggacccgcgg 240

cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcga cgatgcgtag ccgacctgag 300

agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagta 360

gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt gatgaaggtt 420

ttcggatcgt aaaactcgtg tagggaagaa caagtaccgt tcgaataggg cggcaccttg 480

acggtaccta accagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg 540

tggcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt aaagcgcgcg caggcggttt cttaagtctg 600

atgtgaaagc ccccggctca accggggagg gtcattggaa actggggaac ttgagtgcag 660

aagaggagag tggaattcca cgtgtagcgg tgaaatgcgt agagatgtgg aggaacacca 720

gtggcgaagg cgactctctg gtctgtaact gacgctgagg cgcgaaagcg tggggagcga 780

acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg agtgctaagt gttagagggt 840

ttccgccctt tagtgctgca gcaaacgcat taagcactcc gcctggggag tacggtcgca 900

agactgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat 960

tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatcct ctgacaaccc tagagatagg 1020

gcttcccctt cgggggcaga gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga 1080

gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgatc ttagttgcca gcattcagtt 1140

gggcactcta aggtgactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca 1200

tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg ggcagaacaa agggcagcga 1260

agccgcgagg ctaagccaat cccacaaatc tgttctcagt tcggatcgca gtctgcaact 1320

cgactgcgtg aagctggaat cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt 1380

cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt tgtaacaccc gaagtcggtg 1440

aggtaacctt ttggagccag ccgccgaagg tgggacagat gattggggtg aagtcgtaac 1500

aaggtaacca atctct 1516

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tacggctacc ttgttacgac tt 22

Claims (7)

1.一种可降解发酵饲料中霉菌毒素的酶菌复合添加剂，其特征在于，包括：地衣芽孢杆菌100×10⁸CFU/g，嗜酸乳杆菌50×10⁸CFU/g，酿酒酵母10×10⁸CFU/g，葡萄糖氧化酶2000U/g，复合蛋白酶30000U/g，纤维素酶2000U/g。

2.根据权利要求1所述的一种可降解发酵饲料中霉菌毒素的酶菌复合添加剂，其特征在于，所述的地衣芽孢杆菌为从云南省西双版纳野象谷亚洲象粪便中分离得到的地衣芽孢杆菌M08，已于2021年7月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC M2021942。

3.根据权利要求1所述的一种可降解发酵饲料中霉菌毒素的酶菌复合添加剂，其特征在于，所述复合蛋白酶由酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶按照质量比1:1:1组成。

4.根据权利要求1所述的一种可降解发酵饲料中霉菌毒素的酶菌复合添加剂，其特征在于，所述纤维素酶由木聚糖酶和β-葡聚糖酶按照质量比1:1组成。

5.一种地衣芽孢杆菌M08，其特征在于，已于2021年7月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC M 2021942。

6.权利要求1所述的酶菌复合添加剂在非常规蛋白饲料原料发酵中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将所述酶菌复合生物制剂按照质量分数0.2％与非常规蛋白饲料原料混合发酵。

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