CN115957310B

CN115957310B - 一种霉菌毒素解毒剂及其制备方法与应用

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Publication number: CN115957310B
Application number: CN202211688011.4A
Authority: CN
Inventors: 单宝龙; 陈静; 兰江华; 王红; 谷巍; 曾佳佳; 徐海燕; 陈雷; 谢全喜; 辛国芹; 汪祥燕; 郝木强; 张冠军; 崔海英
Original assignee: Shandong Boly Lely Bioengineering Co ltd
Current assignee: Shandong Boly Lely Bioengineering Co ltd
Priority date: 2022-12-28
Filing date: 2022-12-28
Publication date: 2023-08-25
Anticipated expiration: 2042-12-28
Also published as: CN115957310A

Abstract

本发明公开了一种霉菌毒素解毒剂及其制备方法与应用，属于霉菌毒素处理技术领域。本发明的霉菌毒素解毒剂由茶多酚、葡萄糖氧化酶和益生菌组成；所述茶多酚和葡萄糖氧化酶按重量比(3‑15)：(5‑15)复配；所述益生菌是由枯草芽孢杆菌、粪肠球菌和地衣芽孢杆菌复配而成。本发明将茶多酚、葡萄糖氧化酶和益生菌进行复配，在降解霉菌毒素方面具有良好效果，可有效缓解动物机体受霉菌毒素侵害造成的氧化损伤。

Description

一种霉菌毒素解毒剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及霉菌毒素处理技术领域，具体涉及一种霉菌毒素解毒剂及其制备方法与应用。

背景技术

霉菌毒素是由生长活跃的霉菌以次级代谢产物形式产生的一类化学物质，种类较多，目前已鉴定出300多种霉菌代谢产物对人和动物有毒性作用，其中在饲料中常见的有黄曲霉毒素B₁(AFB₁)和玉米赤霉烯酮(ZEN)等。刘胜利(2011)对来自山东地区420份饲料样品进行了毒素含量检测，样品中ZEN、AFB₁的检出率分别为85.24％和83.81％，且含量普遍超标。霉菌毒素广泛存在于饲料和人类食品中，严重危害动物和人类健康，给畜牧业等行业造成巨大经济损失。

目前实际生产中针对霉菌毒素污染大多采用物理吸附方法，但只能起到减少畜禽对霉菌毒素吸收量的作用，对机体中毒后的氧化损伤没有效果，为了加大吸附量往往造成过量添加问题，并且无机吸附剂具有饱和性和不选择性，受制于材料科学和分子科学的发展，目前仍在使用水合硅铝酸盐等矿物材料，效果极差。

生物解毒剂是目前国内外解决霉菌毒素污染的研究重点和方向，近来的研究发现，促进机体脂质过氧化是霉菌毒素毒性的作用机理之一，动物在正常的生理状态下，机体会不断产生氧自由基，同时体内的抗氧化因子也会不断清除自由基，二者形成一个动态平衡。当受霉菌毒素侵害后机体内氧自由基产生过多或机体抗氧化能力下降时，氧化系统和抗氧化系统之间的平衡就会打破，给机体造成损伤。因此在解毒剂中添加抗氧化剂是保护摄入霉菌毒素动物的一项有效措施。

抗氧化剂是一种添加到动物饲料中以防止脂肪或维生素氧化的物质。市售的抗氧化剂包括乙氧基喹啉、二丁基羟基甲苯(BHT)、丁基羟基茴香醚(BHA)以及没食子酸丙酯、叔丁基对苯二酚、茶多酚和L-抗坏血酸棕榈酸酯等。抗氧化剂不仅能抑制霉菌毒素引发的器官的脂质过氧化损伤，还能提高机体在抗脂质过氧化方面的免疫力。并能协助机体清除体内过量自由基，使机体抗氧化作用趋于平衡，保护机体免受损伤。

全国饲料工业办公室颁布的《1996—2020年中国饲料工业发展战略研究》中已明确提出“用绿色环保产品替代饲用抗生素等化学合成物质滥用非常迫切”，替代这些污染物质最优方法就是利用生物技术。霉菌毒素生物降解是指通过微生物、植物及其代谢产生的酶与毒素进行作用，破坏毒素分子结构中的毒性基团从而生成无毒降解产物的过程。霉菌毒素的生物降解具有效率高、特异性强、对饲料和环境无污染等特点和优势，备受研究者的关注。但由于微生物种类繁多，不同微生物对霉菌毒素的去除能力不同，单一种类的微生物对霉菌毒素的去除效果有限；若将多种微生物组合使用，由于不同微生物之间存在拮抗、共生、竞争等多种复杂的关系，筛选出具有优异霉菌毒素去除效果的微生物组合的难度较大。而且，目前也很少见有将益生菌和抗氧化组分联合应用于降解霉菌毒素的报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种霉菌毒素解毒剂及其制备方法与应用。本发明将益生菌和抗氧化组分进行复配，在降解霉菌毒素方面具有良好效果，可有效缓解动物机体受霉菌毒素侵害造成的氧化损伤。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种霉菌毒素解毒剂，由茶多酚、葡萄糖氧化酶和益生菌组成；

所述茶多酚和葡萄糖氧化酶按重量比(3-15)：(5-15)复配；

所述益生菌是由枯草芽孢杆菌、粪肠球菌和地衣芽孢杆菌复配而成。

优选的，所述霉菌毒素解毒剂中，枯草芽孢杆菌的含量为3×10⁸-5×10⁸CFU/g，地衣芽孢杆菌的含量为3×10⁸-5×10⁸CFU/g，粪肠球菌的含量为2×10⁸-5×10⁸CFU/g。

更优选的，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌B7348，保藏编号为CCTCC M2010260；记载在申请人的另一专利CN 102120975 B中。

所述粪肠球菌为粪肠球菌SRG，保藏编号为CCTCC M 2010046；记载在申请人的另一专利CN 101792726 B中。

所述地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌BLCC1-0441，保藏编号为CCTCC NO:M2018253；记载在申请人的另一专利CN 108865931 B中。

上述优选的枯草芽孢杆菌B7348、粪肠球菌SRG和地衣芽孢杆菌BLCC1-0441三株菌株之间无拮抗作用，并且将菌株复配后，对霉菌毒素的去除效果显著增强。

本发明的第二方面，提供上述霉菌毒素解毒剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)将茶多酚和葡萄糖氧化酶按重量比(3-15)：(5-15)混合均匀，得到第一组分；

(2)将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌分别通过生物发酵和喷雾干燥，制备得到枯草芽孢杆菌菌粉和地衣芽孢杆菌菌粉；将粪肠球菌通过生物发酵和冷冻干燥，制备得到粪肠球菌菌粉；将枯草芽孢杆菌菌粉、地衣芽孢杆菌菌粉和粪肠球菌菌粉混匀，得到第二组分；

(3)将第一组分和第二组分混合均匀，制备得到霉菌毒素解毒剂；使制备的霉菌毒素解毒剂中，枯草芽孢杆菌的含量为3×10⁸-5×10⁸CFU/g，地衣芽孢杆菌的含量为3×10⁸-5×10⁸CFU/g，粪肠球菌的含量为2×10⁸-5×10⁸CFU/g。

优选的，所述枯草芽孢杆菌菌粉由如下方法制备而成：

将保藏编号为CCTCC M 2010260的枯草芽孢杆菌B7348的种子液接种到第一发酵培养基中，于32-40℃条件下静置培养16-24h，待发酵液黏度达12000-15000cp时，收集发酵液，喷雾干燥，制备得到枯草芽孢杆菌菌粉；

所述第一发酵培养基中含有：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠5g/L；pH为6.5-7.5。

优选的，所述地衣芽孢杆菌菌粉由如下方法制备而成：

将保藏编号为CCTCC NO:M 2018253的地衣芽孢杆菌BLCC1-0441接种到第二发酵培养基中，35-40℃发酵培养14-18h，收集发酵液，喷雾干燥，制备得到地衣芽孢杆菌菌粉；

所述第二发酵培养基的组成为：以质量百分比计，葡萄糖0.6％、酵母膏0.5％、L-谷氨酸钠0.8％、MnSO₄·H₂O 0.05％、NaCl 0.5％，pH7.0。

优选的，所述粪肠球菌菌粉由如下方法制备而成：

将保藏编号为CCTCC M 2010046的粪肠球菌SRG接种到第三发酵培养基中，于30-42℃条件下静置培养12-20h，待发酵液黏度达12000-15000cp时，收集发酵液，发酵液离心、冷冻干燥，制备得到粪肠球菌菌粉；

所述第三发酵培养基中含有：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L；pH为5.5-6.7。

本发明的第三方面，提供上述霉菌毒素解毒剂在制备缓解动物机体受霉菌毒素侵害造成的氧化损伤的产品中的应用。

上述应用中，所述霉菌毒素包括：AFB₁和ZEN。

本发明的有益效果：

本发明将复合益生菌菌粉、茶多酚和葡萄糖氧化酶组合使用，能同时从微生物降解途径和氧化损伤修复途径发挥降低霉菌毒素产生的毒害的作用，达到1+1＞2的效果。其中，复合益生菌菌粉由枯草芽孢杆菌菌粉、粪肠球菌菌粉和地衣芽孢杆菌菌粉复配而成，三种菌株之间无拮抗作用，并且对于霉菌毒素的降解具有协同增效的作用；茶多酚和葡萄糖氧化酶一方面协同起到抗氧化活性，参与体内的氧化还原反应，抑制霉菌毒素引发的器官的脂质过氧化损伤，还能提高机体在抗脂质过氧化方面的免疫力。并能协助机体清除体内过量自由基，使机体抗氧化作用趋于平衡，保护机体免受损伤；而且，另一方面，葡萄糖氧化酶还作为一种氧化还原酶，可直接抑制黄曲霉、黑根霉、青霉等多种霉菌，促进肝脏内的氧化还原反应，通过肝脏代谢解毒；上述成分共同作用，从而提高了对霉菌毒素的解毒效果。

附图说明

图1：肉鸡肝脏组织切片。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

如前所述，霉菌毒素广泛存在于饲料和人类食品中，并且多种霉菌毒素普遍共存，这些霉菌毒素的叠加毒性远大于单一毒素的作用，严重危害动物和人类健康，给畜牧业等行业造成巨大经济损失。

基于此，为降低或消除霉菌毒素产生的毒害作用，本发明对霉菌毒素解毒剂进行了如下深入研究：

本发明首先对能够降解霉菌毒素的菌株进行了筛选。考虑到饲料领域的特殊要求，本发明从菌种库中选取了符合《饲料添加剂目录》中允许添加的微生物种类的菌株，并对其降解AFB₁和ZEN的能力进行了考察，发现不同种的菌株降解能力存在差异，同一种的不同分离来源的菌株，其降解性能也存在差异。从中筛选降解AFB₁能力最强的枯草芽孢杆菌B7348和降解ZEN能力最强的地衣芽孢杆菌BLCC1-0441。结合菌种库中已有的能够吸附霉菌毒素的粪肠球菌SRG，然后进一步采用滤纸片法考察了这3种菌之间相互作用关系，以确定不同菌株组合使用的可行性。结果发现：枯草芽孢杆菌B7348、粪肠球菌SRG和地衣芽孢杆菌BLCC1-0441三株菌株之间无拮抗作用。

由此，本发明选择枯草芽孢杆菌B7348、粪肠球菌SRG和地衣芽孢杆菌BLCC1-0441组合使用，并进一步考察了上述三株菌组合后对AFB₁和ZEN的降解效果，结果发现：与单一菌株相比，将枯草芽孢杆菌B7348、粪肠球菌SRG和地衣芽孢杆菌BLCC1-0441组合使用，其能显著提高对AFB₁和ZEN的降解效果，具有协同增效作用。

动物机体受霉菌毒素侵害后，氧化系统和抗氧化系统之间的平衡就会打破，给机体造成损伤。因此添加抗氧化剂是保护摄入霉菌毒素动物的一项有效措施。本发明进一步通过体外DPPH自由基清除、超氧阴离子自由基清除和羟基自由基清除，对抗氧化剂进行了体外评价及筛选，结果发现茶多酚的综合抗氧化效果最优，因此，选择茶多酚作为抗氧化剂用于降低霉菌毒素毒害的研究。

葡萄糖氧化酶是一种具有氧化还原作用的酶制剂，可直接抑制黄曲霉、黑根霉、青霉等多种霉菌，促进肝脏内的氧化还原反应，通过肝脏代谢毒素；同时还可作为一种抗氧化剂，通过其独特的去氧产酸的效果，使动物消化道形成良好的酸性厌氧环境，从而使有益微生物大量生长繁殖，消化道环境在各方面都得到极大的平衡。因此，本发明考虑将葡萄糖氧化酶和茶多酚共同作为抗氧化组分使用，同时利用葡萄糖氧化酶其他独特的优势，以提高霉菌毒素的降解效果。

本发明在获得枯草芽孢杆菌B7348、粪肠球菌SRG和地衣芽孢杆菌BLCC1-0441的益生菌组合，以及葡萄糖氧化酶和茶多酚抗氧化组合之后，尝试将其复配作为霉菌毒素解毒剂，考察霉菌毒素解毒剂对受霉菌毒素侵害的肉鸡的保护效果。结果发现：将益生菌组分和葡萄糖氧化酶、茶多酚复合之后形成的霉菌毒素解毒剂对缓解肉鸡受霉菌毒素侵害造成的氧化损伤的能力明显提升，具有显著的协同增效作用，由此提出了本发明。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。其中：

AFB₁、ZEN购自青岛普瑞邦生物工程有限公司。

黄曲霉毒素B₁(AFB₁)ELISA检测试剂盒和玉米赤霉烯酮(ZEN)ELISA检测试剂盒均购自青岛普瑞邦生物工程有限公司。

实施例1：降解霉菌毒素菌株的筛选

1材料

50株芽孢杆菌由山东宝来利来生物工程股份有限公司生物研究院菌种保藏中心提供；

芽孢杆菌液体培养基：以质量百分比计，氯化钠0.5％、酵母膏0.5％、蛋白胨1％，pH7.0。

AFB₁溶液：将1mgAFB₁标准品，溶解于100毫升甲醇中，得到10μg/mL的AFB1母液备用。

ZEN溶液：将1mg ZEN标准品，溶解于20毫升甲醇中，得到50μg/mL的ZEN母液备用。

2方法

2.1降解黄曲霉毒素B₁菌株的筛选

将活化后的50株芽孢杆菌分别按2％(体积分数)接种量接种于装有5mL新鲜芽孢杆菌液体培养基的三角瓶中，加入AFB₁溶液使其终浓度为100ng/mL，37℃培养24h，每个菌株三个重复。以含AFB₁终浓度为100ng/mL的芽孢杆菌液体培养基为阴性对照，不添加AFB₁的芽孢杆菌液体培养基作为空白对照。各菌株24h培养液在4000rpm离心15min，取上清液，用黄曲霉毒素B₁(AFB₁)ELISA检测试剂盒检测溶液中AFB₁的残留浓度。空白对照中AFB₁的残留浓度记为A0，阴性对照中AFB₁的残留浓度记为A1，发酵液中测得的AFB₁浓度记为A2，按照下面的公式计算AFB₁去除率。

去除率＝(A1-A0-A2)/(A1-A0)×100％

2.2降解玉米赤霉烯酮菌株的筛选

将活化后的50株芽孢杆菌分别按2％(体积分数)接种量接种于装有5mL新鲜芽孢杆菌液体培养基的三角瓶中，同时加入ZEN溶液，使得培养液中ZEN终浓度为500ng/mL。以含ZEN终浓度为500ng/mL的芽孢杆菌液体培养基为阴性对照，不添加ZEN的芽孢杆菌液体培养基作为空白对照。各菌株24h培养液在4000rpm离心15min，取上清液，用ZEN ELISA检测试剂盒检测溶液中ZEN的残留浓度。空白对照中ZEN的残留浓度记为A0，阴性对照中ZEN的残留浓度记为A1，发酵液中测得的ZEN浓度记为A2，按照下面的公式计算ZEN去除率。

去除率＝(A1-A0-A2)/(A1-A0)×100％

3结果

去除AFB₁和ZEN菌株的初筛结果如表1所示。

表1：菌株对AFB₁和ZEN的去除率

注：表中的“-”表示菌株不能在含有霉菌毒素的培养基中生长，或者对霉菌毒素没有去除效果。

在50株芽孢杆菌的初筛结果中，有4株芽孢杆菌在含有黄曲霉毒素B₁的培养基中生长良好，对AFB₁的去除率超过80％，分别为B7348、地衣S、dy6和ZFY5；有5株芽孢杆菌在含有玉米赤霉烯酮(ZEN)的培养基中生长良好，对ZEN的去除率超过60％，分别为BLCC1-0441、纳豆4、dy5、dy7和YJD(表1)。

综上，从中选择去除AFB₁效果最好的菌株B7348和去除ZEN效果最好的菌株BLCC1-0441进行后续试验。

实施例2：组合菌株体外去除霉菌毒素的试验

1试验方法

将实施例1筛选出的枯草芽孢杆菌B7348、地衣芽孢杆菌BLCC1-0441，以及已知具有霉菌毒素吸附能力的粪肠球菌SRG进行拮抗考察，发现三株菌之间无拮抗作用，具有组合使用的条件。

将枯草芽孢杆菌B7348菌粉、地衣芽孢杆菌BLCC1-0441菌粉、粪肠球菌SRG菌粉和3株菌混合菌粉(B7348菌粉、BLCC1-0441菌粉、SRG菌粉按重量比1:1:1混合)分别加入到PBS缓冲溶液(含AFB₁ 100ng/mL，ZEN 500ng/mL)，37℃，振荡24h后，4000rpm，离心10min。用黄曲霉毒素B₁(AFB₁)ELISA检测试剂盒和玉米赤霉烯酮(ZEN)ELISA检测试剂盒分别检测上清液中毒素残留。以不添加菌粉的含等量毒素的PBS缓冲溶液为对照。

AFB₁去除率＝(AFB₁初始浓度-AFB₁终浓度)/AFB₁初始浓度×100％

ZEN去除率＝(ZEN初始浓度-ZEN终浓度)/ZEN初始浓度×100％

2试验结果

试验结果见表2。

表2：不同益生菌对AFB₁、ZEN的降解效果

从表2可以看出，混合菌粉组对两种毒素的清除率要高于单一菌株，具有协同作用。

实施例3：抗氧化剂的体外评价及筛选

1材料与方法

1.1样品：茶多酚、抗氧剂BHT、乙氧基喹啉，抗坏血酸。

1.2DPPH自由基清除率的测定

将样品分别配制成0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL的浓度，每个待测样品溶液均与0.1mmol/L的DPPH溶液混匀，室温下反应30min后，在517nm波长下测定其吸光度，用同体积的无水甲醇代替样品溶液作为空白对照，采用Vc作为阳性对照。按下列公式计算其清除率:

清除率(％)＝(1-A1/A2)×100

式中：A1为待测样品溶液吸光值；A2为空白对照溶液吸光值。

1.3超氧阴离子自由基清除率的测定

将样品分别配制成0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL的浓度，依次加入1mL 0.078mol/L NBT、1mL 0.4mL的0.06mol/L PMS溶液，室温摇匀后静置5min，于560nm波长处测定吸光度。用蒸馏水作阴性对照，Vc作阳性对照。计算其清除率(同上)。

1.4羟基自由基清除作用的测定

将样品分别配制为0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL的浓度于试管中，依次加入1.5mL反应液[含0.1mmol/L EDTA、0.1mmol/L FeCl₃和2.8mmol/L DR的磷酸盐缓冲液(pH7.4)]、0.35mL H₂O₂(20mmol/L)，37℃恒温水浴作用40min后，终止反应，于532nm波长处测定吸光度，蒸馏水为阴性对照，Vc为阳性对照。计算其清除率(同上)。

IC50的值是清除率达到50％时，样品对应的浓度，通过SPSS的计算得出。

2结果

2.1抗氧化剂对活性氧自由基清除效果评价

表3：DPPH自由基清除率随抗氧化剂浓度的变化

由表3的IC50结果可以看出：对DPPH自由基的清除作用茶多酚>抗坏血酸>BHT>乙氧基喹啉。

2.2抗氧化剂对羟基自由基清除效果评价

表4：羟基自由基清除率随抗氧化剂浓度的变化

由表4的IC50结果可以看出：对羟基自由基的清除作用茶多酚>抗坏血酸>BHT>乙氧基喹啉。

2.3抗氧化剂对超氧阴离子自由基清除效果评价

表5：超氧阴离子自由基清除率随抗氧化剂浓度的变化

由表5的IC50结果可以看出：对羟基自由基的清除作用茶多酚>乙氧基喹啉>抗坏血酸>BHT。

综上，选择对自由基清除效果最好的茶多酚为产品中的抗氧化组分。

实施例4：霉菌毒素解毒剂的制备

1、益生菌菌粉的制备

(1)枯草芽孢杆菌菌粉的制备：

将保藏编号为CCTCC M 2010260的枯草芽孢杆菌B7348的种子液按体积比5％的接种量接种到第一发酵培养基中，于35℃条件下静置培养20h(发酵液黏度达12000-15000cp)，收集发酵液，喷雾干燥，制备得到枯草芽孢杆菌菌粉；

(2)地衣芽孢杆菌菌粉的制备：

将保藏编号为CCTCC NO:M 2018253的地衣芽孢杆菌BLCC1-0441的种子液按体积比10％的接种量接种到第二发酵培养基中，36℃发酵培养16h，收集发酵液，喷雾干燥，制备得到地衣芽孢杆菌菌粉；

(3)粪肠球菌菌粉的制备：

将保藏编号为CCTCC M 2010046的粪肠球菌SRG接种到第三发酵培养基中，于30℃条件下静置培养20h(发酵液黏度达12000-15000cp)，收集发酵液，发酵液离心、冷冻干燥，制备得到粪肠球菌菌粉；

2、将茶多酚和葡萄糖氧化酶按重量比3：5混合均匀，得到第一组分；将枯草芽孢杆菌菌粉、地衣芽孢杆菌菌粉和粪肠球菌菌粉按重量比1:1:1混合，得到第二组分。

3、将第一组分和第二组分混合均匀，制备得到霉菌毒素解毒剂，使所制备的霉菌毒素解毒剂中，枯草芽孢杆菌的含量为4×10⁸CFU/g，地衣芽孢杆菌的含量为3×10⁸CFU/g，粪肠球菌的含量为3×10⁸CFU/g。

实施例5：霉菌毒素解毒剂在肉鸡上的应用效果试验

1试验设计

选择1日龄健康且体重无差异的罗斯308肉鸡240只，随机分为6个组，每组5个平行，每个平行8只，试验过程分前期(1-21d)和后期(22-42d)两个阶段进行饲养，试验设计与分组如下：

A组：为对照组，饲喂基础日粮。

B组：基础日粮+AFB₁+ZEN，1-21d饲喂含AFB₁60μg/kg和150μg/kg ZEN的基础日粮；22-42d饲喂含AFB₁100μg/kg和500μg/kg ZEN的基础日粮。

C组：基础日粮+AFB₁+ZEN+本发明肉鸡霉菌毒素解毒剂，1-21d饲喂含AFB₁60μg/kg和150μg/kg ZEN的基础日粮；22-42d饲喂含AFB₁100μg/kg和500μg/kg ZEN的基础日粮；肉鸡霉菌毒素解毒剂为本发明实施例4制备，从试验的第1d开始添加，添加量为基础日粮重量的2‰。

D组：基础日粮+AFB₁+ZEN+益生菌组分，1-21d饲喂含AFB₁60μg/kg和150μg/kg ZEN的基础日粮；22-42d饲喂含AFB₁100μg/kg和500μg/kg ZEN的基础日粮；益生菌组分为实施例4制备的第二组分(枯草芽孢杆菌菌粉、地衣芽孢杆菌菌粉和粪肠球菌菌粉按重量比1:1:1混合)，从试验的第1d开始添加，添加量为基础日粮重量的2‰。

E组：基础日粮+AFB₁+ZEN+茶多酚，1-21d饲喂含AFB₁60μg/kg和150μg/kg ZEN的基础日粮；22-42d饲喂含AFB₁100μg/kg和500μg/kg ZEN的基础日粮；茶多酚从试验的第1d开始添加，添加量为基础日粮重量的2‰。

F组：基础日粮+AFB₁+ZEN+葡萄糖氧化酶，1-21d饲喂含AFB₁60μg/kg和150μg/kgZEN的基础日粮；22-42d饲喂含AFB₁100μg/kg和500μg/kg ZEN的基础日粮；葡萄糖氧化酶从试验的第1d开始添加，添加量为基础日粮重量的2‰。

各处理组的基础日粮相同，购自山农农牧(泰安)有限公司；各处理组的其他管理条件保持一致。饲养至第42d时，测定各处理组肉鸡的sIgA含量、丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽S-转移酶(GST)含量、超氧歧化酶(SOD)含量、总抗氧化能力(T-AOC)等指标。sIgA含量是采用上海酶联ELISA试剂盒测定的，其他指标是南京建成的试剂盒测定的。

2结果

2.1日粮中添加霉菌毒素解毒剂对肉鸡盲肠内容物sIgA含量的影响

表6：42d时肉鸡盲肠内容物sIgA含量的测定(ng/mL)

分组	sIgA
		A组	301.57±15.44ab
B组	244.46±19.14c
		C组	323.26±21.58a
D组	280.55±24.56bc
		E组	260.78±20.99c
F组	264.86±14.01c

由表6可知，饲料中添加本发明霉菌毒素解毒剂或混合菌粉有利于提高肉鸡盲肠sIgA活性，增强其肠道黏膜免疫能力；以C组盲肠内容物sIgA含量最高，显著高于E和F组(p<0.05)，表明本发明肉鸡霉菌毒素解毒剂对肠道sIgA活性的提高优于混合菌粉、茶多酚和葡萄糖氧化酶单独添加时。

2.2日粮中添加霉菌毒素解毒剂对肉鸡血清及肝脏丙二醛含量的影响

表7：42d时各组MDA含量分析

分组	血清(nmol/mL)	肝脏(nmol/mgprot)
			A组	3.42±0.23ab	1.28±0.12
B组	3.98±0.20c	1.49±0.21
			C组	3.37±0.21a	1.26±0.12
D组	3.97±0.13c	1.33±0.16
			E组	3.52±0.15ab	1.30±0.14
F组	3.77±0.21bc	1.32±0.08

丙二醛(MDA)是自由基攻击膜不饱和脂肪酸的产物，可以与蛋白质的游离氨基作用，引起蛋白质分子内和分子间交联，导致细胞损伤。正常生理状态下，体内的MDA含量是极低的，其含量的高低可以反映机体细胞受到自由基攻击的程度。

从表7可以看出，添加霉菌毒素解毒剂能够降低肉鸡血清和肝脏中MDA含量，其中以C组MDA含量最低，表明本发明肉鸡霉菌毒素解毒剂对缓解毒素造成的自由基伤害作用优于混合菌粉、茶多酚和葡萄糖氧化酶单独添加时。

2.3日粮中添加霉菌毒素解毒剂对肉鸡肝脏谷胱甘肽S-转移酶含量的影响

GST是一组与肝脏解毒功能有关的酶。该酶主要存在于肝脏内，当肝细胞损害时，酶迅速释放入血，导致肝脏中GST活性下降。GST为生物体内广泛存在的催化谷胱甘肽与某些疏水性化合物的亲电子基团相连接的胞质酶，可以消除体内自由基和达到解毒的功能。

表8：42d时各组肝脏GST含量分析(U/mgprot)

由表8可知，饲料中添加本发明霉菌毒素解毒剂、混合菌粉或茶多酚有利于提高肉鸡肝脏GST含量，增强其肝脏解毒能力；以C组肝脏GST含量最高，表明本发明肉鸡霉菌毒素解毒剂对肝脏的解毒作用优于混合菌粉、茶多酚和葡萄糖氧化酶单独添加时。

2.4日粮中添加霉菌毒素解毒剂对肉鸡肝脏SOD和T-AOC含量的影响

SOD(超氧歧化酶)具有抗氧化和抗衰老的作用，其作用机理主要是清除对机体有害的超氧阴离子自由基(O₂ ^-)。

总抗氧化能力(T-AOC)，是指各种抗氧化物质和抗氧化酶等构成的总抗氧化水平，如抗氧化物酶、维生素C、维生素E和胡萝卜素等，为保护细胞和机体免于活性氧自由基造成的氧化应激损伤，因此可用总抗氧化能力来评价生物活性物质的抗氧化能力。

表9：42d时各组肝脏SOD和T-AOC含量分析(U/mgprot)

分组	SOD	T-AOC
			A组	367.87±20.53bc	3.76±0.31
B组	288.28±22.09a	3.47±0.22
			C组	395.37±25.84c	3.79±0.17
D组	349.43±24.47b	3.61±0.26
			E组	378.85±19.37bc	3.63±0.30
F组	375.43±15.57bc	3.69±0.34

由表9可知，本发明肉鸡霉菌毒素解毒剂对SOD和T-AOC含量的提高优于混合菌粉、茶多酚和葡萄糖氧化酶单独添加时。

2.5日粮中添加霉菌毒素解毒剂对肉鸡肝脏组织结构的影响

选择A组-F组的肉鸡进行肝脏组织结构研究，肉鸡肝脏组织切片见图1，对照组A的肝脏细胞结构完整，无坏死现象，整齐排列，细胞索走向清晰。而不使用霉菌毒素解毒剂的B组肝脏细胞核变形，出现淋巴细胞浸润，细胞大面积坏死，肝细胞索不整齐。添加霉菌毒素解毒剂的C组可以显著改善细胞坏死和淋巴细胞浸润现象，与对照组接近，且优于D、E、F组。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims

1.一种霉菌毒素解毒剂，其特征在于，由茶多酚、葡萄糖氧化酶和益生菌组成；

所述茶多酚和葡萄糖氧化酶按重量比(3-15)：(5-15)复配；

所述益生菌是由枯草芽孢杆菌、粪肠球菌和地衣芽孢杆菌复配而成；

所述霉菌毒素解毒剂中，枯草芽孢杆菌的含量为3×10⁸-5×10⁸CFU/g，地衣芽孢杆菌的含量为3×10⁸-5×10⁸CFU/g，粪肠球菌的含量为2×10⁸-5×10⁸CFU/g；

所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌B7348，保藏编号为CCTCC M 2010260；所述粪肠球菌为粪肠球菌SRG，保藏编号为CCTCC M 2010046；所述地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌BLCC1-0441，保藏编号为CCTCC NO:M 2018253。

2.权利要求1所述的霉菌毒素解毒剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(3)将第一组分和第二组分混合均匀，制备得到霉菌毒素解毒剂；

所述枯草芽孢杆菌菌粉由如下方法制备而成：

所述第一发酵培养基中含有：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠5g/L；pH为6.5-7.5；

所述地衣芽孢杆菌菌粉由如下方法制备而成：

所述第二发酵培养基的组成为：以质量百分比计，葡萄糖0.6％、酵母膏0.5％、L-谷氨酸钠0.8％、MnSO₄·H₂O 0.05％、NaCl 0.5％，pH7.0；

所述粪肠球菌菌粉由如下方法制备而成：

3.权利要求1所述的霉菌毒素解毒剂在制备缓解动物机体受霉菌毒素侵害造成的氧化损伤的产品中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述霉菌毒素包括：AFB₁和ZEN。