CN104788546A - 一种含有24个氨基酸残基的线性直链肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种含有24个氨基酸残基的线性直链肽的制备方法，主要解决目前还没有工业化制备该化合物的方法。本发明采用固相合成方法及高效液相色谱纯化方法，主要包括以下几个步骤：1）以Fmoc-Tyr(tbu)-王树脂为起始树脂，采用Fmoc固相合成法逐一偶联每一个保护氨基酸，合成得到侧链全保护的肽链树脂；2）对侧链全保护的肽链树脂进行切割，将24肽从树脂上裂解下来并去除侧链保护基团，得到两条抗病毒多肽PY-24及FY-24的粗品；3）将得到的粗品采用高效液相色谱法纯化制备从而得到高纯度大于98%的多肽精品。本发明可低成本大规模化生产抗艾滋病毒组合多肽PY-24及FY-24。
Description
技术领域
本发明涉及线性直链肽的制备方法，特别涉及一种含有24个氨基酸残基的线性直链肽的制备方法。
背景技术
艾滋病是以全身免疫系统严重损害为特征的传染性疾病,自其被发现以来,已严重威胁人类的生存,对全球人口健康和社会经济的发展产生巨大的影响。伴随着多年来的研究,艾滋病在治疗上取得了很大的进展,譬如高效抗逆转录病毒治疗(Highly active antiretroviral therapy,HAART,又称为“鸡尾酒”疗法)的应用。鸡尾酒疗法是通过多种的抗病毒药物联合使用来治疗艾滋病，根据此方法的基本原理，针对HIV 1的膜融合抑制剂采用分子生物学手段重组和表达并设计出组合多肽即PY-24和FY-24，该两条多肽针对HIV的gp41,和gp120的靶点，在前期的实验中证明了它们可对HIV 1具有非常好的抑制活性。
PY-24是一种含有24个氨基酸残基的线性直链肽，它的分子式是C110H170N36O28，分子量：2444.81，多肽序列为H-Pro-His-Ser-Gly-Ala-His-Gly-Ile-Pro-Lys-Ile-Phe-Gly-Ala-Arg-Ala-Gln-Pro-Ala-Ala-Ala-Arg-Ala-Tyr-OH，结构式如下（切割两段）：
FY-24是一种含有24个氨基酸残基的线性直链肽，它的分子式是C115H176N42O29，分子量：2610.95，多肽序列为H-Phe-Thr-Ala-His-Leu-His-Thr-His-His-Arg-Ile-Gly-Gly-Ala-Arg-Ala-Gln-Pro-Ala-Ala-Ala-Arg-Ala-Tyr-OH，结构式如下（切割两段）：
。
发明内容
本发明的目的是提供了一种高收率、低成本、反应条件温和、环境污染小、有利于实现产业化的含有24个氨基酸残基的线性直链肽的制备方法。主要解决目前还没有工业化制备该化合物的方法。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
一种含有24个氨基酸残基的线性直链肽的制备方法，包括如下步骤：
1） 以Fmoc-Tyr(tbu)-Wang Resin为起始树脂，采用Fmoc固相合成法逐一偶联每一个保护氨基酸，合成得到侧链全保护的肽链树脂；
2） 用切割试剂对侧链全保护的肽链树脂进行切割，将24肽从树脂上裂解下来并去除侧链保护基团，得到抗病毒多肽PY-24及FY-24粗品；
3） 将得到的抗病毒多肽PY-24及FY-24粗品采用高效液相色谱法，并选取合适的色谱柱及流动相分离纯化，从而制备得到纯度大于98%的PY-24及FY-24精品。
具体步骤如下：
1. 取Fmoc-Tyr(tbu)-Wang Resin用DMF浸泡，使树脂充分溶胀，抽干，加入脱冒试剂，反应10-30分钟，抽干，用DMF洗涤5-10次，抽干，以DMF为溶剂，加入 Fmoc-Ala-OH，用HBTU/HOBT、TBTU/HOBT、DIC/HOBT中的一种混合物作为缩合剂，再加入NMM或DIEA中的一种作为有机碱调节反应溶液PH环境，反应0.5-2小时，茚三酮法检测反应终点，抽干，用DMF洗涤3-5次，抽干，获得Fmoc-Ala-Tyr(tbu)-Wang Resin；；
Fmoc-Tyr(tbu)- Wang Resin取代度为：0.2mmol/g~0.8mmol/g，更为优化的方案为0.35mmol/g；Fmoc-Ala-OH量为Fmoc-Tyr(tbu)-Wang Resin摩尔量的1-5倍，更为优化的方案为Fmoc-Tyr(tbu)-Wang Resin摩尔量的2倍；缩合试剂（HBTU/HOBT、TBTU/HOBT、DIC/HOBT中的一种混合物）的量为树脂摩尔量的1-5倍，更为优化的方案为HBTU/HOBT 的量为树脂摩尔量的2倍；有机碱(NMM或DIEA)的量为Fmoc-Tyr(tbu)-Wang Resin摩尔量的2-10倍，更为优化的方案为NMM为树脂摩尔量的4倍；
2. 在步骤（1）获得的树脂中，加入脱帽试剂，反应10-30分钟，抽干，用DMF洗涤5-10次，抽干，以DMF为溶剂，加入具有芴甲氧羰基保护的氨基酸，用HBTU/HOBT、TBTU/HOBT、DIC/HOBT中的一种混合物作为缩合剂，再加入NMM或DIEA中的一种作为有机碱调节反应溶液PH环境，反应0.5-2小时，茚三酮法检测反应终点，抽干，用DMF洗涤3-5次，抽干，然后再加入脱保护试剂，脱保护反应，再加入具有芴甲氧羰基保护的氨基酸，如此反复，PY-24直至连完最后一个脯氨酸，FY-24直至连完最后一个苯丙氨酸，用DMF洗涤3-5次，脱保护反应，DMF洗涤5-10次，再用甲醇和二氯甲烷交替洗涤3次，最后加甲醇收缩树脂，抽干，真空干燥，得到侧链全保护的肽链树脂PY-24和FY-24，PY-24即Pro-His(trt)-Ser(tbu)-Gly-Ala-His(trt)-Gly-Ile-Pro-Lys(boc)-Ile-Phe-Gly-Ala-Arg(pbf)-Ala-Gln(Trt)-Pro-Ala-Ala-Ala-Arg(pbf)-Ala-Tyr(tbu)-Wang Resin；FY-24即Phe-Thr(tbu)-Ala-His(trt)-Leu-His(trt)-Thr(tbu)-His(trt)-His(trt)-Arg(pbf)-Ile-Gly-Gly-Ala-Arg(pbf)-Ala-Gln(Trt)-Pro-Ala-Ala-Ala-Arg(pbf)-Ala-Tyr(tbu)-Wang Resin；
3. 脱帽试剂的配比为10%-30%的PIP/DMF(v/v)溶液，更为优化的方案为20%的PIP/DMF(v/v)溶液；
4. Fmoc保护的氨基酸的量为树脂摩尔量的1-5倍，更为优化的方案为树脂摩尔量的2倍；缩合试剂（HBTU/HOBT、TBTU/HOBT、DIC/HOBT中的一种混合物）的量为树脂摩尔量的1-5倍，更为优化的方案为HBTU/HOBT 的量为树脂摩尔量的2倍；有机碱(NMM或DIEA)的量为树脂摩尔量的2-10倍，更为优化的方案为NMM为树脂摩尔量的4倍；
5. PY-24所说的具有芴甲氧羰基保护的氨基酸，依次包括Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Lys(boc)-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-His(trt)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH， Fmoc-Ser(tbu)-OH，Fmoc-His(trt)-OH，Fmoc-Pro-OH；
6. FY-24所说的具有芴甲氧羰基保护的氨基酸，依次包括Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-His(trt)-OH，Fmoc-His(trt)-OH，Fmoc-Thr(tbu)-OH，Fmoc-His(trt)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-His(trt)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Thr(tbu)-OH，Fmoc-Phe-OH。
7. 按照本发明，所述的切肽包括如下步骤：将上述步骤2所获得的侧链全保护的肽链树脂中加入切割试剂，切割试剂的体积配比为三氟乙酸:三异丙基硅烷:水=95%:3%:2%，反应2.5小时，抽滤滤掉树脂颗粒，并收集滤液，然后加入乙醚结晶沉淀，离心收集沉淀，再用乙醚洗涤3-6次，真空干燥，获得PY-24及FY-24粗品。
8. 按照本发明，所述的多肽纯化工艺包括如下步骤：将PY-24和FY-24多肽粗品溶于水中，制成200mg/ml的水溶液，用0.45μm滤膜过滤，用反相制备型HPLC纯化收集所需组分，再用分析型HPLC分析检测所收集的组分，合并纯度在98%以上的组分，合并液在35~40℃条件下减压浓缩，将浓缩液放入低温冷冻干燥机进行冷冻干燥，从而得到PY-24及FY-24精品。反向制备型HPLC所采用的制备柱为C18类型，流动相为水、醋酸铵水溶液、乙腈、甲醇中的一种或几种。
本发明中一些常用缩写具有以下含义
Wang Resin：王树脂
HBTU：O-苯并三唑-N,N,N,N-四甲基脲鎓六氟磷酸盐
HATU：O-(7-偶氮苯并三氮唑-1-氧)-N,N,N,N-四甲基脲鎓六氟磷酸盐
TBTU：O-(苯并三唑-1-氧)-N,N,N,N-四甲基脲鎓六氟硼酸盐
DIC：二异丙基碳二亚胺
HOBT：1-羟基苯并三唑
HOAT：1-羟基-7-偶氮苯并三唑
DIEA：二异丙基乙胺
NMM：N-甲基吗啉
Fmoc：芴甲氧羰基
Pbf：2,2,4,6,7-五甲基-2H-苯并呋喃-5磺酰基
Trt：三苯甲基
Tbu：叔丁基
Boc：叔丁氧羰基
Pro：脯氨酸
Thr：苏氨酸
Gly：甘氨酸
Ala：丙氨酸
Ser：丝氨酸
Arg：精氨酸
Tyr：酪氨酸
Gln：谷氨酰胺
Leu：亮氨酸
Ile：异亮氨酸
His：组氨酸
Phe：苯丙氨酸
Lys：赖氨酸
PIP：哌啶
DMF：N,N-二甲基甲酰胺
DCM：二氯甲烷。
本发明的有益效果：能够实现该两条抗病毒组合多肽的产业化，同时提供了一种高收率、低成本、反应条件温和、环境污染小、有利于实现产业化的含有24个氨基酸残基的线性直链肽的制备方法，带来非常可观的经济效益。
具体实施方式
以下将参照实例对本发明做进一步的详细描述，但本发明不限于这具体实例。
实施例1
1） 制备Fmoc-Ala-Tyr(tbu)-Wang Resin
称取Fmoc-Tyr(tbu)-Wang Resin 23.1克(0. 65mmol/g, 15mmol)，用800ml DMF浸泡30分钟，使树脂充分溶胀，抽干，加入Fmoc-Ala-OH (MW:311.3，30mmol) 9.4g，TBTU(MW:321.1，30mmol) 9.7g，HOBT(MW:135.1，30mmol) 4.1g，DIEA(MW:129.24，60mmol)10ml，DMF500ml，反应1小时，茚三酮检测树脂无色透明，抽干，用DMF洗涤3次，抽干，获得Fmoc-Ala-Tyr(tbu)-Wang Resin。
2）制备Pro-His(trt)-Ser(tbu)-Gly-Ala-His(trt)-Gly-Ile-Pro-Lys(boc)-Ile-Phe-Gly-Ala-Arg(pbf)-Ala-Gln(Trt)-Pro-Ala-Ala-Ala-Arg(pbf)-Ala-Tyr(tbu)-Wang Resin(PY-24)及Phe-Thr(tbu)-Ala-His(trt)-Leu-His(trt)-Thr(tbu)-His(trt)-His(trt)-Arg(pbf)-Ile-Gly-Gly-Ala-Arg(pbf)-Ala-Gln(Trt)-Pro-Ala-Ala-Ala-Arg(pbf)-Ala-Tyr(tbu)-Wang Resin(FY-24)。
在步骤（1）获得的Fmoc-Ala-Tyr(tbu)-Wang Resin中，加入800ml脱帽试剂(20%的PIP/DMF(v/v)溶液)，反应30分钟，抽干，用DMF洗涤6次，抽干，以DMF做溶剂，加入具有Fmoc保护的氨基酸、TBTU/HOBT、DIEA，反应1小时，检测反应终点，抽干，用DMF洗涤3-5次，抽干，然后再加入脱保护试剂，脱保护反应，再加入具有Fmoc保护基团的氨基酸，如此反复，PY-24直至连完最后一个脯氨酸，FY-24直至连完最后一个苯丙氨酸，用DMF洗涤3-5次，脱保护反应，DMF洗涤5-10次，再用甲醇和二氯甲烷交替洗涤3次，最后加甲醇收缩树脂，抽干，真空干燥，获得侧链全保护的肽链树脂，PY-24即Pro-His(trt)-Ser(tbu)-Gly-Ala-His(trt)-Gly-Ile-Pro-Lys(boc)-Ile-Phe-Gly-Ala-Arg(pbf)-Ala-Gln(Trt)-Pro-Ala-Ala-Ala-Arg(pbf)-Ala-Tyr(tbu)-Wang Resin，共计70g；FY-24即Phe-Thr(tbu)-Ala-His(trt)-Leu-His(trt)-Thr(tbu)-His(trt)-His(trt)-Arg(pbf)-Ile-Gly-Gly-Ala-Arg(pbf)-Ala-Gln(Trt)-Pro-Ala-Ala-Ala-Arg(pbf)-Ala-Tyr(tbu)-Wang Resin，共计60g。
PY-24每一步缩合反应所加入的氨基酸的量分别为：
Fmoc-Arg(pbf)-OH(MW:648.8，30mmol)19.5g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，30mmol)9.4g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，30mmol)9.4g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，30mmol)9.4g，
Fmoc-Pro-OH(MW:337.4，30mmol)10.2g，
Fmoc-Gln(Trt)-OH(MW:610.7，30mmol)18.4g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，30mmol)9.4g，
Fmoc-Arg(pbf)-OH(MW:648.8，30mmol)19.5g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，30mmol)9.4g，
Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，30mmol)9g，
Fmoc-Phe-OH(MW:387.4，30mmol)11.7g，
Fmoc-Ile-OH(MW:353.4，30mmol)10.7g，
Fmoc-Lys(Boc)-OH(MW:468.55:，30mmol)14.1g，
Fmoc-Pro-OH(MW:337.4，30mmol)10.2g，
Fmoc-Ile-OH(MW:353.4，30mmol)10.7g，
Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，30mmol)9g，
Fmoc-His(Trt)-OH(MW:619.7，30mmol)18.6g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，30mmol)9.4g，
Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，30mmol)9g，
Fmoc-Ser(tbu)-OH(MW:383.4，30mmol)11.6g，
Fmoc-His(Trt)-OH(MW:619.7，30mmol)18.6g，
Fmoc-Pro-OH(MW:337.4，30mmol)10.2g；
FY-24每一步缩合反应所加入的氨基酸的量分别为：
Fmoc-Arg(pbf)-OH(MW:648.8，30mmol)19.5g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，30mmol)9.4g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，30mmol)9.4g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，30mmol)9.4g，
Fmoc-Pro-OH(MW:337.4，30mmol)10.2g，
Fmoc-Gln(Trt)-OH(MW:610.7，30mmol)18.4g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，30mmol)9.4g，
Fmoc-Arg(pbf)-OH(MW:648.8，30mmol)19.5g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，30mmol)9.4g，
Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，30mmol)9g，
Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，30mmol)9g，
Fmoc-Ile-OH(MW:353.4，30mmol)10.7g，
Fmoc-Arg(pbf)-OH(MW:648.8，30mmol)19.5g，
Fmoc-His(Trt)-OH(MW:619.7，30mmol)18.6g，
Fmoc-His(Trt)-OH(MW:619.7，30mmol)18.6g，
Fmoc-Thr(tbu)-OH(MW:397.5，30mmol)12g，
Fmoc-His(Trt)-OH(MW:619.7，30mmol)18.6g，
Fmoc-Leu-OH(MW:353.4，30mmol)10.7g，
Fmoc-His(Trt)-OH(MW:619.7，30mmol)18.6g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，30mmol)9.4g，
Fmoc-Thr(tbu)-OH(MW:397.5，30mmol)12g，
Fmoc-Phe-OH(MW:387.4，30mmol)11.7g。
每一步缩合反应所采用的缩合剂的量为：TBTU(MW:321.1，30mmol) 9.7g，HOBT(MW:135.1，30mmol)4.1g，
每一步缩合反应所添加的有机碱的量为：DIEA(MW:129.24，60mmol)10ml。
3）制备PY-24及FY-24粗品
取步骤（2）中的PY-24即Pro-His(trt)-Ser(tbu)-Gly-Ala-His(trt)-Gly-Ile-Pro-Lys(boc)-Ile-Phe-Gly-Ala-Arg(pbf)-Ala-Gln(Trt)-Pro-Ala-Ala-Ala-Arg(pbf)-Ala-Tyr(tbu)-Wang Resin共计70g，置于2L的圆底烧瓶中，加入700ml切割试剂，配比为三氟乙酸:三异丙基硅烷:水=95%:3%:2% (v/v)，置于恒温摇床中25℃振荡反应2.5小时，抽滤滤掉树脂颗粒，收集滤液，然后加入3500ml乙醚结晶沉淀，离心收集沉淀，再用乙醚洗涤3-6次，真空干燥，获得PY-24粗品30g。
取步骤（2）中的FY-24即Phe-Thr(tbu)-Ala-His(trt)-Leu-His(trt)-Thr(tbu)-His(trt)-His(trt)-Arg(pbf)-Ile-Gly-Gly-Ala-Arg(pbf)-Ala-Gln(Trt)-Pro-Ala-Ala-Ala-Arg(pbf)-Ala-Tyr(tbu)-Wang Resin共计60g置于2L的圆底烧瓶中，加入600ml切割试剂，配比为三氟乙酸:三异丙基硅烷:水=95%:3%:2% (v/v)，置于恒温摇床中25℃振荡反应2.5小时，抽滤滤掉树脂颗粒，收集滤液，然后加入3000ml乙醚结晶沉淀，离心收集沉淀，再用乙醚洗涤3-6次，真空干燥，获得FY-24粗品29g。
4) 对PY-24及FY-24粗品通过高效液相色谱分离纯化，得到纯度大于98%的精品。
将步骤（3）中获得的PY-24粗品共30g溶于150ml 水中，用0.45μm滤膜过滤，用反相制备型HPLC纯化收集所需组分，再用分析型HPLC分析检测所收集的组分，合并纯度在98%以上的组分，合并液在35~40℃条件下减压浓缩，将浓缩液放入低温冷冻干燥机进行冷冻干燥48小时，得到PY-24精品7.5克，总收率20.5%
将步骤（3）中获得的FY-24粗品共29g溶于145ml 水中，用0.45μm滤膜过滤，用反相制备型HPLC纯化收集所需组分，再用分析型HPLC分析检测所收集的组分，合并纯度在98%以上的组分，合并液在35~40℃条件下减压浓缩，将浓缩液放入低温冷冻干燥机进行冷冻干燥48小时，得到FY-24精品7.9克，总收率20.2%。
实施例2
1） 制备Fmoc-Ala-Tyr(tbu)-Wang Resin
称取Fmoc-Tyr(tbu)-Wang Resin 42.9克(0.35mmol/g, 15mmol)，用800ml DMF浸泡30分钟，使树脂充分溶胀，抽干，加入Fmoc-Ala-OH (MW:311.3，30mmol) 9.4g，HBTU(MW:379.2，30mmol) 11.4g，HOBT(MW:135.1，30mmol) 4.1g，NMM(MW:102.1，60mmol)6.8ml，DMF500ml，反应0.5小时，茚三酮检测树脂无色透明，抽干，用DMF洗涤3次，抽干，获得Fmoc-Ala-Tyr(tbu)-Wang Resin。
2）制备Pro-His(trt)-Ser(tbu)-Gly-Ala-His(trt)-Gly-Ile-Pro-Lys(boc)-Ile-Phe-Gly-Ala-Arg(pbf)-Ala-Gln(Trt)-Pro-Ala-Ala-Ala-Arg(pbf)-Ala-Tyr(tbu)-Wang Resin(PY-24)及Phe-Thr(tbu)-Ala-His(trt)-Leu-His(trt)-Thr(tbu)-His(trt)-His(trt)-Arg(pbf)-Ile-Gly-Gly-Ala-Arg(pbf)-Ala-Gln(Trt)-Pro-Ala-Ala-Ala-Arg(pbf)-Ala-Tyr(tbu)-Wang Resin(FY-24)。
在步骤（1）获得的Fmoc-Ala-Tyr(tbu)-Wang Resin中，加入800ml脱帽试剂(20%的PIP/DMF(v/v)溶液)，反应30分钟，抽干，用DMF洗涤6次，抽干，以DMF做溶剂，加入具有Fmoc保护的氨基酸、HBTU/HOBT、NMM，反应0.5小时，检测反应终点，抽干，用DMF洗涤3-5次，抽干，然后再加入脱保护试剂，脱保护反应，再加入具有Fmoc保护基团的氨基酸，如此反复，PY-24直至连完最后一个脯氨酸，FY-24直至连完最后一个苯丙氨酸，用DMF洗涤3-5次，脱保护反应，DMF洗涤5-10次，再用甲醇和二氯甲烷交替洗涤3次，最后加甲醇收缩树脂，抽干，真空干燥，获得侧链全保护的肽链树脂，PY-24即Pro-His(trt)-Ser(tbu)-Gly-Ala-His(trt)-Gly-Ile-Pro-Lys(boc)-Ile-Phe-Gly-Ala-Arg(pbf)-Ala-Gln(Trt)-Pro-Ala-Ala-Ala-Arg(pbf)-Ala-Tyr(tbu)-Wang Resin，共计96g；FY-24即Phe-Thr(tbu)-Ala-His(trt)-Leu-His(trt)-Thr(tbu)-His(trt)-His(trt)-Arg(pbf)-Ile-Gly-Gly-Ala-Arg(pbf)-Ala-Gln(Trt)-Pro-Ala-Ala-Ala-Arg(pbf)-Ala-Tyr(tbu)-Wang Resin，共计92g。
PY-24每一步缩合反应所加入的氨基酸的量分别为：
Fmoc-Arg(pbf)-OH(MW:648.8，30mmol)19.5g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，30mmol)9.4g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，30mmol)9.4g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，30mmol)9.4g，
Fmoc-Pro-OH(MW:337.4，30mmol)10.2g，
Fmoc-Gln(Trt)-OH(MW:610.7，30mmol)18.4g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，30mmol)9.4g，
Fmoc-Arg(pbf)-OH(MW:648.8，30mmol)19.5g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，30mmol)9.4g，
Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，30mmol)9g，
Fmoc-Phe-OH(MW:387.4，30mmol)11.7g，
Fmoc-Ile-OH(MW:353.4，30mmol)10.7g，
Fmoc-Lys(Boc)-OH(MW:468.55:，30mmol)14.1g，
Fmoc-Pro-OH(MW:337.4，30mmol)10.2g，
Fmoc-Ile-OH(MW:353.4，30mmol)10.7g，
Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，30mmol)9g，
Fmoc-His(Trt)-OH(MW:619.7，30mmol)18.6g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，30mmol)9.4g，
Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，30mmol)9g，
Fmoc-Ser(tbu)-OH(MW:383.4，30mmol)11.6g，
Fmoc-His(Trt)-OH(MW:619.7，30mmol)18.6g，
Fmoc-Pro-OH(MW:337.4，30mmol)10.2g；
FY-24每一步缩合反应所加入的氨基酸的量分别为：
Fmoc-Arg(pbf)-OH(MW:648.8，30mmol)19.5g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，30mmol)9.4g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，30mmol)9.4g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，30mmol)9.4g，
Fmoc-Pro-OH(MW:337.4，30mmol)10.2g，
Fmoc-Gln(Trt)-OH(MW:610.7，30mmol)18.4g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，30mmol)9.4g，
Fmoc-Arg(pbf)-OH(MW:648.8，30mmol)19.5g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，30mmol)9.4g，
Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，30mmol)9g，
Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，30mmol)9g，
Fmoc-Ile-OH(MW:353.4，30mmol)10.7g，
Fmoc-Arg(pbf)-OH(MW:648.8，30mmol)19.5g，
Fmoc-His(Trt)-OH(MW:619.7，30mmol)18.6g，
Fmoc-His(Trt)-OH(MW:619.7，30mmol)18.6g，
Fmoc-Thr(tbu)-OH(MW:397.5，30mmol)12g，
Fmoc-His(Trt)-OH(MW:619.7，30mmol)18.6g，
Fmoc-Leu-OH(MW:353.4，30mmol)10.7g，
Fmoc-His(Trt)-OH(MW:619.7，30mmol)18.6g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，30mmol)9.4g，
Fmoc-Thr(tbu)-OH(MW:397.5，30mmol)12g，
Fmoc-Phe-OH(MW:387.4，30mmol)11.7g。
每一步缩合反应所采用的缩合剂的量为：HBTU(MW:379.2，30mmol) 11.4g，HOBT(MW:135.1，30mmol)4.1g，
每一步缩合反应所添加的有机碱的量为：NMM(MW:102.1，60mmol)6.8ml。
3）制备PY-24及FY-24粗品
取步骤（2）中的PY-24即Pro-His(trt)-Ser(tbu)-Gly-Ala-His(trt)-Gly-Ile-Pro-Lys(boc)-Ile-Phe-Gly-Ala-Arg(pbf)-Ala-Gln(Trt)-Pro-Ala-Ala-Ala-Arg(pbf)-Ala-Tyr(tbu)-Wang Resin共计96g，置于2L的圆底烧瓶中，加入960ml切割试剂，配比为三氟乙酸:三异丙基硅烷:水=95%:3%:2% (v/v)，置于恒温摇床中25℃振荡反应2.5小时，抽滤滤掉树脂颗粒，收集滤液，然后加入4800ml乙醚结晶沉淀，离心收集沉淀，再用乙醚洗涤3-6次，真空干燥，获得PY-24粗品35g。
取步骤（2）中的FY-24即Phe-Thr(tbu)-Ala-His(trt)-Leu-His(trt)-Thr(tbu)-His(trt)-His(trt)-Arg(pbf)-Ile-Gly-Gly-Ala-Arg(pbf)-Ala-Gln(Trt)-Pro-Ala-Ala-Ala-Arg(pbf)-Ala-Tyr(tbu)-Wang Resin共计92g置于2L的圆底烧瓶中，加入920ml切割试剂，配比为三氟乙酸:三异丙基硅烷:水=95%:3%:2% (v/v)，置于恒温摇床中25℃振荡反应2.5小时，抽滤滤掉树脂颗粒，收集滤液，然后加入4600ml乙醚结晶沉淀，离心收集沉淀，再用乙醚洗涤3-6次，真空干燥，获得FY-24粗品36g。
4) 对PY-24及FY-24粗品通过高效液相色谱分离纯化，得到纯度大于98%的精品。
将步骤（3）中获得的PY-24粗品共35g溶于175ml 水中，用0.45μm滤膜过滤，用反相制备型HPLC纯化收集所需组分，再用分析型HPLC分析检测所收集的组分，合并纯度在98%以上的组分，合并液在35~40℃条件下减压浓缩，将浓缩液放入低温冷冻干燥机进行冷冻干燥48小时，得到PY-24精品9克，总收率24.5%
将步骤（3）中获得的FY-24粗品共36g溶于180ml 水中，用0.45μm滤膜过滤，用反相制备型HPLC纯化收集所需组分，再用分析型HPLC分析检测所收集的组分，合并纯度在98%以上的组分，合并液在35~40℃条件下减压浓缩，将浓缩液放入低温冷冻干燥机进行冷冻干燥48小时，得到FY-24精品10克，总收率25.5%。
实施例3
1) 制备Fmoc-Ala-Tyr(tbu)-Wang Resin
称取Fmoc-Tyr(tbu)-Wang Resin 60克(0.25mmol/g, 15mmol)，用800ml DMF浸泡30分钟，使树脂充分溶胀，抽干，加入Fmoc-Ala-OH (MW:311.3，45mmol) 14.1g，DIC(MW:126，45mmol) 7ml，HOBT(MW:135.1，45mmol) 6.1g，DIEA(MW:129.24，90mmol)15ml，DMF500ml，反应2小时，茚三酮检测树脂无色透明，抽干，用DMF洗涤3次，抽干，获得Fmoc-Ala-Tyr(tbu)-Wang Resin。
2）制备Pro-His(trt)-Ser(tbu)-Gly-Ala-His(trt)-Gly-Ile-Pro-Lys(boc)-Ile-Phe-Gly-Ala-Arg(pbf)-Ala-Gln(Trt)-Pro-Ala-Ala-Ala-Arg(pbf)-Ala-Tyr(tbu)-Wang Resin(PY-24)及Phe-Thr(tbu)-Ala-His(trt)-Leu-His(trt)-Thr(tbu)-His(trt)-His(trt)-Arg(pbf)-Ile-Gly-Gly-Ala-Arg(pbf)-Ala-Gln(Trt)-Pro-Ala-Ala-Ala-Arg(pbf)-Ala-Tyr(tbu)-Wang Resin(FY-24)。
在步骤（1）获得的Fmoc-Ala-Tyr(tbu)-Wang Resin中，加入800ml脱帽试剂(20%的PIP/DMF(v/v)溶液)，反应30分钟，抽干，用DMF洗涤6次，抽干，以DMF做溶剂，加入具有Fmoc保护的氨基酸、DIC/HOBT、DIEA，反应2小时，检测反应终点，抽干，用DMF洗涤3-5次，抽干，然后再加入脱保护试剂，脱保护反应，再加入具有Fmoc保护基团的氨基酸，如此反复，PY-24直至连完最后一个脯氨酸，FY-24直至连完最后一个苯丙氨酸，用DMF洗涤3-5次，脱保护反应，DMF洗涤5-10次，再用甲醇和二氯甲烷交替洗涤3次，最后加甲醇收缩树脂，抽干，真空干燥，获得侧链全保护的肽链树脂，PY-24即Pro-His(trt)-Ser(tbu)-Gly-Ala-His(trt)-Gly-Ile-Pro-Lys(boc)-Ile-Phe-Gly-Ala-Arg(pbf)-Ala-Gln(Trt)-Pro-Ala-Ala-Ala-Arg(pbf)-Ala-Tyr(tbu)-Wang Resin，共计105g；FY-24即Phe-Thr(tbu)-Ala-His(trt)-Leu-His(trt)-Thr(tbu)-His(trt)-His(trt)-Arg(pbf)-Ile-Gly-Gly-Ala-Arg(pbf)-Ala-Gln(Trt)-Pro-Ala-Ala-Ala-Arg(pbf)-Ala-Tyr(tbu)-Wang Resin，共计100g。
PY-24每一步缩合反应所加入的氨基酸的量分别为：
Fmoc-Arg(pbf)-OH(MW:648.8，45mmol)29.2g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，45mmol)14.1g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，45mmol)14.1g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，45mmol)14.1g，
Fmoc-Pro-OH(MW:337.4，45mmol)15.2g，
Fmoc-Gln(Trt)-OH(MW:610.7，45mmol)27.5g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，45mmol)14.1g，
Fmoc-Arg(pbf)-OH(MW:648.8，45mmol)29.2g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，45mmol)14.1g，
Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，45mmol)13.4g，
Fmoc-Phe-OH(MW:387.4，45mmol)17.5g，
Fmoc-Ile-OH(MW:353.4，45mmol)15.9g，
Fmoc-Lys(Boc)-OH(MW:468.55:，45mmol)21.1g，
Fmoc-Pro-OH(MW:337.4，45mmol)15.2g，
Fmoc-Ile-OH(MW:353.4，45mmol)15.9g，
Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，45mmol)13.4g，
Fmoc-His(Trt)-OH(MW:619.7，45mmol)27.9g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，45mmol)14.1g，
Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，45mmol)13.4g，
Fmoc-Ser(tbu)-OH(MW:383.4，45mmol)17.3g，
Fmoc-His(Trt)-OH(MW:619.7，45mmol)27.9g，
Fmoc-Pro-OH(MW:337.4，45mmol)15.2g；
FY-24每一步缩合反应所加入的氨基酸的量分别为：
Fmoc-Arg(pbf)-OH(MW:648.8，45mmol)29.2g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，45mmol)14.1g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，45mmol)14.1g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，45mmol)14.1g，
Fmoc-Pro-OH(MW:337.4，45mmol)15.2g，
Fmoc-Gln(Trt)-OH(MW:610.7，45mmol)27.5g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，45mmol)14.1g，
Fmoc-Arg(pbf)-OH(MW:648.8，45mmol)29.2g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，45mmol)14.1g，
Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，45mmol)13.4g，
Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，45mmol)13.4g，
Fmoc-Ile-OH(MW:353.4，45mmol)15.9g，
Fmoc-Arg(pbf)-OH(MW:648.8，45mmol)29.2g，
Fmoc-His(Trt)-OH(MW:619.7，45mmol)27.9g，
Fmoc-His(Trt)-OH(MW:619.7，45mmol)27.9g，
Fmoc-Thr(tbu)-OH(MW:397.5，45mmol)17.9g，
Fmoc-His(Trt)-OH(MW:619.7，45mmol)27.9g，
Fmoc-Leu-OH(MW:353.4，45mmol)15.9g，
Fmoc-His(Trt)-OH(MW:619.7，45mmol)27.9g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，45mmol)14.1g，
Fmoc-Thr(tbu)-OH(MW:397.5，45mmol)17.9g，
Fmoc-Phe-OH(MW:387.4，45mmol)17.5g。
每一步缩合反应所采用的缩合剂的量为：DIC(MW:126，45mmol) 7ml，HOBT(MW:135.1，45mmol)6.1g，
每一步缩合反应所添加的有机碱的量为：DIEA(MW:129.24，90mmol)15ml。
3）制备PY-24及FY-24粗品
取步骤（2）中的PY-24即Pro-His(trt)-Ser(tbu)-Gly-Ala-His(trt)-Gly-Ile-Pro-Lys(boc)-Ile-Phe-Gly-Ala-Arg(pbf)-Ala-Gln(Trt)-Pro-Ala-Ala-Ala-Arg(pbf)-Ala-Tyr(tbu)-Wang Resin共计105g，置于2L的圆底烧瓶中，加入1050ml切割试剂，配比为三氟乙酸:三异丙基硅烷:水=95%:3%:2% (v/v)，置于恒温摇床中25℃振荡反应2.5小时，抽滤滤掉树脂颗粒，收集滤液，然后加入5250ml乙醚结晶沉淀，离心收集沉淀，再用乙醚洗涤3-6次，真空干燥，获得PY-24粗品32g。
取步骤（2）中的FY-24即Phe-Thr(tbu)-Ala-His(trt)-Leu-His(trt)-Thr(tbu)-His(trt)-His(trt)-Arg(pbf)-Ile-Gly-Gly-Ala-Arg(pbf)-Ala-Gln(Trt)-Pro-Ala-Ala-Ala-Arg(pbf)-Ala-Tyr(tbu)-Wang Resin共计100g置于2L的圆底烧瓶中，加入1000ml切割试剂，配比为三氟乙酸:三异丙基硅烷:水=95%:3%:2% (v/v)，置于恒温摇床中25℃振荡反应2.5小时，抽滤滤掉树脂颗粒，收集滤液，然后加入5000ml乙醚结晶沉淀，离心收集沉淀，再用乙醚洗涤3-6次，真空干燥，获得FY-24粗品31g。
4) 对PY-24及FY-24粗品通过高效液相色谱分离纯化，得到纯度大于98%的精品。
将步骤（3）中获得的PY-24粗品共32g溶于160ml 水中，用0.45μm滤膜过滤，用反相制备型HPLC纯化收集所需组分，再用分析型HPLC分析检测所收集的组分，合并纯度在98%以上的组分，合并液在35~40℃条件下减压浓缩，将浓缩液放入低温冷冻干燥机进行冷冻干燥48小时，得到PY-24精品6.9克，总收率18.9%
将步骤（3）中获得的FY-24粗品共31g溶于160ml 水中，用0.45μm滤膜过滤，用反相制备型HPLC纯化收集所需组分，再用分析型HPLC分析检测所收集的组分，合并纯度在98%以上的组分，合并液在35~40℃条件下减压浓缩，将浓缩液放入低温冷冻干燥机进行冷冻干燥48小时，得到FY-24精品7克，总收率17.8%。
Claims (8)
1.一种含有24个氨基酸残基的线性直链肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）以Fmoc-Tyr(tbu)-王树脂为起始树脂，采用Fmoc固相合成法逐一偶联每一个保护氨基酸，合成得到侧链全保护的肽链树脂；
2）用切割试剂对侧链全保护的肽链树脂进行切割，将24肽从树脂上裂解下来并去除侧链保护基团，得到抗病毒多肽PY-24及FY-24粗品；
3）将得到的抗病毒多肽PY-24及FY-24粗品采用高效液相色谱法，并选取合适的色谱柱及流动相分离纯化，从而制备得到纯度大于98%的PY-24及FY-24精品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）具体内容包括如下步骤：
1）取Fmoc-Tyr(tbu)-王树脂用N,N-二甲基甲酰胺浸泡，使树脂充分溶胀，抽干，加入脱冒试剂，反应10-30分钟，抽干，用N,N-二甲基甲酰胺洗涤5-10次，抽干，以N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，加入 Fmoc-Ala-OH，用O-苯并三唑-N,N,N,N-四甲基脲鎓六氟磷酸盐/1-羟基苯并三唑、O-(苯并三唑-1-氧)-N,N,N,N-四甲基脲鎓六氟硼酸盐/1-羟基苯并三唑、二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑中的一种混合物作为缩合剂，再加入N-甲基吗啉或二异丙基乙胺中的一种作为有机碱调节反应溶液PH环境，反应0.5-2小时，茚三酮法检测反应终点，抽干，用N,N-二甲基甲酰胺洗涤3-5次，抽干，获得Fmoc-Ala-Tyr(tbu)-王树脂；
2）在步骤（1）获得的Fmoc-Ala-Tyr(tbu)-王树脂中，加入脱帽试剂，反应10-30分钟，抽干，用N,N-二甲基甲酰胺洗涤5-10次，抽干，以N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，加入具有芴甲氧羰基保护的氨基酸，用O-苯并三唑-N,N,N,N-四甲基脲鎓六氟磷酸盐/1-羟基苯并三唑、O-(苯并三唑-1-氧)-N,N,N,N-四甲基脲鎓六氟硼酸盐/1-羟基苯并三唑、二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑中的一种混合物作为缩合剂，再加入N-甲基吗啉或二异丙基乙胺中的一种作为有机碱调节反应溶液PH环境，反应0.5-2小时，茚三酮法检测反应终点，抽干，用N,N-二甲基甲酰胺洗涤3-5次，抽干，然后再加入脱保护试剂，脱保护反应，再加入具有芴甲氧羰基保护的氨基酸，如此反复，PY-24直至连完最后一个脯氨酸，FY-24直至连完最后一个苯丙氨酸，用N,N-二甲基甲酰胺洗涤3-5次，脱保护反应，N,N-二甲基甲酰胺洗涤5-10次，再用甲醇和二氯甲烷交替洗涤3次，最后加甲醇收缩树脂，抽干，真空干燥，得到侧链全保护的肽链树脂PY-24和FY-24，PY-24即Pro-His(trt)-Ser(tbu)-Gly-Ala-His(trt)-Gly-Ile-Pro-Lys(boc)-Ile-Phe-Gly-Ala-Arg(pbf)-Ala-Gln(Trt)-Pro-Ala-Ala-Ala-Arg(pbf)-Ala-Tyr(tbu)-王树脂；FY-24即Phe-Thr(tbu)-Ala-His(trt)-Leu-His(trt)-Thr(tbu)-His(trt)-His(trt)-Arg(pbf)-Ile-Gly-Gly-Ala-Arg(pbf)-Ala-Gln(Trt)-Pro-Ala-Ala-Ala-Arg(pbf)-Ala-Tyr(tbu)-王树脂；
PY-24所涉及具有芴甲氧羰基保护的氨基酸，依次包括Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Lys(boc)-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-His(trt)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH， Fmoc-Ser(tbu)-OH，Fmoc-His(trt)-OH，Fmoc-Pro-OH；
FY-24所涉及具有芴甲氧羰基保护的氨基酸，依次包括Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-His(trt)-OH，Fmoc-His(trt)-OH，Fmoc-Thr(tbu)-OH，Fmoc-His(trt)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-His(trt)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Thr(tbu)-OH，Fmoc-Phe-OH。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，Fmoc-Tyr(tbu)-王树脂的取代度在0.2mmol/g-0.8mmol/g之间，Fmoc-Ala-OH量为Fmoc-Tyr(tbu)-王树脂摩尔量的1-5倍；脱帽试剂为体积百分含量10-30%的哌啶/N,N-二甲基甲酰胺混合溶液，每一步保护氨基酸的量的是Fmoc-Tyr(tbu)-王树脂摩尔量的1-5倍，缩合试剂的量是Fmoc-Tyr(tbu)-王树脂摩尔量的1-5倍，有机碱的量是Fmoc-Tyr(tbu)-王树脂摩尔量的2-10倍，每一步反应终点的检测方法所采用的是茚三酮检测法。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，Fmoc-Tyr(tbu)-王树脂的取代度为0.35mmol/g，Fmoc-Ala-OH量为Fmoc-Tyr(tbu)-王树脂摩尔量的2倍；脱帽试剂为体积百分含量20%的哌啶/ N,N-二甲基甲酰胺混合溶液，每一步保护氨基酸的量的是Fmoc-Tyr(tbu)-王树脂摩尔量的2倍，缩合试剂为O-(苯并三唑-1-氧)-N,N,N,N-四甲基脲鎓六氟硼酸盐/1-羟基苯并三唑，其用量是Fmoc-Tyr(tbu)-王树脂摩尔量的2倍，有机碱为N-甲基吗啉，其用量为Fmoc-Tyr(tbu)-王树脂摩尔量的4倍。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2）包括如下步骤：在侧链全保护的肽链树脂中加入切割试剂，反应1-3小时，抽滤滤掉树脂颗粒，并收集滤液，然后加入乙醚结晶沉淀，离心收集沉淀，再用乙醚洗涤3-6次，真空干燥，获得PY-24及FY-24粗品。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述切割试剂的体积配比为三氟乙酸:三异丙基硅烷:水=95%:3%:2%，反应2.5小时。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3）具体内容为：将PY-24和FY-24多肽粗品溶于水中，制成200mg/ml的水溶液，用0.45μm滤膜过滤，用反相制备型HPLC纯化收集所需组分，再用分析型HPLC分析检测所收集的组分，合并纯度在98%以上的组分，合并液在35~40℃条件下减压浓缩，将浓缩液放入低温冷冻干燥机进行冷冻干燥，从而得到PY-24及FY-24精品。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于反向制备型HPLC所采用的制备柱为C18类型，流动相为水、醋酸铵水溶液、乙腈、甲醇中的一种或几种。
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