CN113402599A - 一种从人胎盘中提取纯化i型胶原蛋白的优化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种从人胎盘中提取纯化I型胶原蛋白的优化方法，包括以下步骤：步骤(1).原料预处理；步骤(2).碱浸泡：使组织充分溶胀、除去脂质及病毒灭活；步骤(3).酸浸泡：使抗原钝化及去除酸溶性杂蛋白成分；步骤(4).酶解；步骤(5).超滤浓缩更换缓冲；步骤(6).阴离子交换层析；步骤(7).超滤浓缩更换缓冲；步骤(8).盐析：分离纯化I型胶原蛋白；步骤(9).透析：除盐，使其维持在生理盐平衡状态，即得高纯度I型胶原蛋白。本发明的方法可以显著提高产能，而且易于放大生产，同时，耗时缩短、纯度高，易于形成产品，应用领域更广泛。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为一种从人胎盘中提取纯化I型胶原蛋白的优化方法。
背景技术
人胎盘作为维持胎儿在母体内生长发育的临时性器官,因其特殊的屏障功能与内分泌功能,自古以来就为人们所重视。近年来,人们对胎盘的研究逐步深入,在加工上也由简单的烘干与水煮发展到生物萃取,使人们对胎盘所含的有益成分及生物活性物质有了更深入的了解。其中,自人胎盘中提取胶原蛋白是人们感兴趣的研究方向之一。胶原蛋白是由动物的成纤细胞合成的一种生物高分子,是一种白色、不透明、无支链的纤维型蛋白质,它主要存在于动物肌腱、韧带、软骨、皮肤及其他结缔组织中。人胎盘中分布有大量的结缔组织，胶原蛋白含量丰富，是提取胶原蛋白的良好材料。
胶原蛋白因其本身的特殊结构和特殊性能，具有生物降解性、低的免疫原性、以及大规模生产的可行性等优点，已成为一种重要的天然高分子生物材料，在食品、生物医学、药物学、化妆品等工业中的应用和经济地位正日益突出。目前对胶原的研究主要集中于理论和实用性方面,如材料的制造方法、理化及生物学性能等研究,取得了许多有价值的成果,工业化应用也较普遍。在胶原蛋白家族的众多成员中，I型胶原蛋白是被人们了解得最为清楚的、也是组织分布最为广泛的胶原蛋白，具备非常高的应用价值。
目前胶原蛋白的来源多以动物的皮、角、骨骼、肌腱，以及软骨组织等异源材料为主，可能带有病原污染和免疫原性高，可能激发一定的免疫反应。而人胎盘具有同源性，免疫反应低，应用价值非常高。但是存在从人胎盘提取制备胶原蛋白的纯度不高、生产周期长、收率低及难以工业化制备等问题。因此，无论从数量上还是质量上，都不能够满足日益增长的对胶原蛋白的需求。目前应用生物技术生产药用或者食用及化妆品用蛋白的技术日渐成熟，因此，人源化胶原蛋白的生产与开发具有很好的应用前景。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于提供一种从人胎盘中提取纯化I型胶原蛋白的优化方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：一种从人胎盘中提取纯化I型胶原蛋白的优化方法，包括以下步骤：
步骤(1).原料预处理：检测合格的人胎盘解冻、清洗，之后剪碎、滤干称重备用；
步骤(2).碱浸泡：预处理的胎盘组织按W/V比1:10加入0.5MNaOH溶液在4℃条件下搅拌浸泡24h，1000╳g离心15min,收沉淀再按W/V比1:5加入0.5MNaOH溶液在4℃条件下搅拌浸泡24h，使组织充分溶胀、除去脂质及病毒灭活，1000╳g离心15min,收集沉淀；
步骤(3).酸浸泡：收集的沉淀按W/V比1:8加入0.5M乙酸溶液在4℃条件下搅拌浸泡12h，使抗原钝化及去除可溶性成分，1000╳g离心15min，收集沉淀；
步骤(4).酶解：将沉淀按W/V1:5比加入0.5M乙酸或0.5M柠檬酸溶液、按每克组织沉淀加入5mg胃蛋白酶的比例加入胃蛋白酶，校正pH值至2.4，在4℃条件下搅拌酶解24h，14000╳g离心15min，收集离心上清液置4℃冰箱暂存备用，沉淀在相同条件下再次酶解抽提一次，以充分提取胶原蛋白，14000╳g离心15min，去沉淀，收集离心上清，增加酶解次数提高收率；
步骤(5).超滤浓缩更换缓冲：混合离心上清，用30kD聚醚砜超滤膜浓缩2倍，缩小工作体积的同时提高蛋白浓度，利于后续工艺操作，缩短操作时间；浓缩结束后连续补加pH6.80.1MPB缓冲液5DV洗滤更换缓冲，使缓冲溶液与后续阴离子层析平衡条件相同，同时去除大部分小分子杂质，具有初步的分离纯化效果，超滤更换缓冲替代透析，可明显缩短操作时间；
步骤(6).阴离子交换层析；
步骤(7).超滤浓缩更换缓冲；
步骤(8).盐析；
步骤(9).透析：取盐析沉淀按W/V比2:1加入pH7.220mMPBS缓冲液搅拌成糊状，然后在4℃条件下对pH7.220mMPBS缓冲液透析，使其维持在生理盐平衡状态，即得高纯度I型胶原蛋白。
所述步骤(1)中包括去除表面血污，剪掉脐带，按W/V比1:4加入9％NaCl+3％乙醇溶液清洗5次，以充分去除可溶性血液成分、脂质及杂蛋白。
所述步骤(6)中阴离子交换层析是指将上一步浓缩更换缓冲料液在4℃条件下上DEAE层析柱。以去除胃蛋白酶、内毒素及酸性大分子等有害物质，以保证产品安全，具有精纯效果。层析条件为：1)平衡缓冲液为pH6.80.1MPB；
2)RT为20h。收集流穿峰料液。
所述步骤(7)中浓缩更换缓冲是指将DEAE层析流穿峰料液用30kD聚醚砜超滤膜包浓缩8倍，使料液处于最佳盐析浓度，浓缩结束后连续补加0.5M柠檬酸溶液5DV洗滤更换缓冲，以去除缓冲溶液和杂质，同时使料液处于酸性条件而易于盐析分离出I型胶原蛋白。
所述步骤(8)中盐析是指往料液缓慢加入固态NaCl，边加边搅拌，使固态NaCl完全溶解至终浓度为2M，4℃条件下静置12h，14000╳g离心15min，分离出I型胶原蛋白。弃上清，沉淀按W/V比1:10加入0.5M柠檬酸溶液复溶，14000╳g离心15min，弃沉淀，以去除不溶性胶原蛋白。上清缓慢加入固态NaCl，边加边搅拌，使NaCl完全溶解至终浓度为2M，4℃条件下静置12h，14000╳g离心15min，进一步提纯分离出I型胶原蛋白，收集沉淀。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过将碱浸泡工艺和酸浸泡工艺同时使用，避免了单独使用酸浸泡工艺或单独使用碱浸泡工艺所带来的不足，同时增加酶解次数，充分抽提目标蛋白，增加目标蛋白的提取量，增加杂质的去除量，可明显提高目标蛋白的收率，另外，通过超滤浓缩更换缓冲替代传统的透析工艺可明显减少制备时间，缩短生产周期。
综上所述，本发明的方法可以显著提高产能，易于放大生产，同时，大大缩短制备时间，纯度得到提高，易于形成产品，应用领域更广泛。
Ⅰ型胶原蛋白(typeⅠcollagen)肽链由重复出现的Gly-X-Y氨基酸序列组成，所有的胶原蛋白均具有由三条聚肽链单元组成的三螺旋结构，由2条α1链与1条α2链交互缠绕所形成。α2链是I型胶原蛋白的特征链，所以α2链的存在说明I型胶原蛋白的存在。I型胶原蛋白富含甘氨酸(Gly)、L-丙氨酸(L-Ala)、L-脯氨酸(L-Pro)和4-羟脯氨酸(4-Hypro)，硫含量较低，且不含L-色氨酸(L-Try)。
在胶原蛋白纯化过程中残留的除I型胶原蛋白外的其他蛋白质，主要包括(但不限于)：弹性蛋白其他结构性分子(氨基多糖类、脂蛋白及糖蛋白复合物等)、未正确排列的胶原分子、酶制剂等。可能与I型胶原伴随的Ⅲ型胶原不作为杂蛋白考虑。
附图说明
图1为本发明的制备工艺流程图。
图2为本发明的人胎盘I型胶原蛋白SDS-PAGE图谱。
具体实施方式
为了使本发明的实现技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。
一、人胎盘来源
本发明的原材料人胎盘系以严格无菌操作采集的供生物制品生产用的健康人胎盘，为保证其质量及安全性，采集内容除人胎盘外，还包括产妇血浆、胎盘血浆、产妇签署的《知情合同》和填写完整的《胎盘血及胎盘采集登记表》。采集医院为二级甲等以上，具备HBV、HCV、TP、HIV初筛检测资质。
按《中国药典》2020年版和《中国生物制品主要原辅材料质控标准》的要求，对原料胎盘的采集对象进行严格的筛选，对采集的胎盘采用国家药品管理当局批准的试剂盒，逐个对其胎盘血进行HBsAg、梅毒、HIV-1/HIV-2抗体和HCV抗体检查，全阴性者的胎盘方可投入使用。
二、制备方法
如图1所示，一种从人胎盘中提取纯化I型胶原蛋白的优化方法，包括以下步骤：
步骤(1).原料预处理：检测合格的人胎盘解冻、去除表面血污，剪掉脐带，按W/V比1:4加入9％NaCl+3％乙醇溶液清洗5次，以充分去除可溶性血液成分、脂质及杂蛋白，之后剪碎、滤干称重备用；
步骤(2).碱浸泡：预处理的胎盘组织按W/V比1:10加入0.5MNaOH溶液在4℃条件下搅拌浸泡24h，1000╳g离心15min,收沉淀再按W/V比1:5加入0.5MNaOH溶液在4℃条件下搅拌浸泡24h，使组织充分溶胀、除去脂质及病毒灭活，1000╳g离心15min,收集沉淀；
步骤(3).酸浸泡：收集的沉淀按W/V比1:8加入0.5M乙酸溶液在4℃条件下搅拌浸泡12h，使抗原钝化及去除可溶性成分，1000╳g离心15min，收沉淀；
步骤(4).酶解：将沉淀按W/V1:5比加入0.5M乙酸或0.5M柠檬酸溶液、按每克组织沉淀加入5mg胃蛋白酶的比例加入胃蛋白酶，校正pH值至2.4，在4℃条件下搅拌酶解24h，14000╳g离心15min，收集离心上清液置4℃冰箱暂存备用，沉淀在相同条件下再次酶解抽提一次，以充分提取胶原蛋白，14000╳g离心15min，去沉淀，收集离心上清；
步骤(5).超滤浓缩更换缓冲：混合离心上清，用30kD聚醚砜超滤膜包浓缩2倍，缩小工作体积的同时提高蛋白浓度，利于后续工艺操作，缩短操作时间；浓缩结束后连续补加pH6.80.1MPB缓冲液5DV洗滤更换缓冲，使缓冲溶液与后续阴离子层析平衡条件相同，同时去除大部分小分子杂质，具有初步的分离纯化效果；
步骤(6).阴离子交换层析：收集流穿峰料液，去除胃蛋白酶、内毒素及酸性大分子等有害物质，以保证产品安全，具有精纯效果；浓缩更换缓冲料液在4℃条件下上DEAE层析柱，层析条件为：平衡缓冲液为pH6.80.1MPB；RT为20h；
步骤(7).超滤浓缩更换缓冲：DEAE层析流穿峰料液用30kD聚醚砜超滤膜包浓缩8倍，使料液处于最佳盐析浓度，浓缩结束后连续补加0.5M柠檬酸溶液5DV洗滤更换缓冲，以去除缓冲溶液和杂质，同时使料液处于酸性条件而易于盐析分离出I型胶原蛋白；
步骤(8).盐析：缓慢加入NaCl固体，边加边搅拌，使NaCl固体完全溶解至终浓度为2M，4℃条件下静置12h，14000╳g离心15min，分离出I型胶原蛋白；弃上清，沉淀按W/V比1:10加入0.5M柠檬酸溶液复溶，14000╳g离心15min，弃沉淀，以去除不溶性胶原蛋白；上清缓慢加入NaCl固体，边加边搅拌，使NaCl固体完全溶解至终浓度为2M，4℃条件下静置12h，14000╳g离心15min，进一步提纯分离出I型胶原蛋白，收集沉淀；
步骤(9).透析：取盐析沉淀按W/V比2:1加入pH7.220mMPBS缓冲液搅拌成糊状，然后在4℃条件下对pH7.220mMPBS缓冲液透析，使其维持在生理盐平衡状态，即得高纯度I型胶原蛋白。
三、实验结果
1.外观为乳白色粘稠状半固体。
2.按《中华人民共和国药典(四部)》(2015年版)通则0541第五法规定的SDS-PAGE凝胶电泳法对所得I型胶原蛋白进行分子量分布测定，所得结果与I型胶原蛋白标准品电泳结果一致(见附图2)。
3.按《YY0954-2015无源外科植入物Ⅰ型胶原蛋白植入剂》附录A天狼星红染色法对所得I型胶原蛋白进行含量测定，此优化方法提取纯化的I型胶原蛋白收率较已有报道方法有了明显提高(见表1)。
表1 I型胶原蛋白收率
| 方法 | 胎盘质量(g) | 胶原蛋白质量(g) | 收率(％) |
| 已有方法 | 1000 | 1.02 | 0.102 |
| 本发明方法 | 922 | 3.573 | 0.388 |
4.色氨酸检查：按《YY0954-2015无源外科植入物Ⅰ型胶原蛋白植入剂》附录E规定的方法进行检测，醋酸与硫酸两液界面未出现紫红色环。
5.杂蛋白分析：按《YY0954-2015无源外科植入物Ⅰ型胶原蛋白植入剂》附录B的方法进行检测，杂蛋白总量在总蛋白的1％以下。
6.制备周期：本发明中提取纯化I型胶原蛋白的方法较传统工艺操作时间有了明显缩短(见表2)。
表2 I型胶原蛋白制备周期
| 方法 | 制备周期(天) |
| 已有方法 | 15 |
| 本发明方法 | 10 |
综上，本发明方法制备的人胎盘源I型胶原蛋白收率提高3倍以上，制备周期缩短了
质量稳定；而且本发明方法简单易行、适合大规模生产，具有良好的应用前景。
以上显示和描述了本发明的主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明的要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (5)
1.一种从人胎盘中提取纯化I型胶原蛋白的优化方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤(1).原料预处理：检测合格的人胎盘解冻、清洗，之后剪碎、滤干称重备用；
步骤(2).碱浸泡：预处理的胎盘组织按W/V比1:10加入0.5M NaOH溶液在4℃条件下搅拌浸泡24h，1000╳g离心15min,收沉淀再按W/V比1:5加入0.5MNaOH溶液在4℃条件下搅拌浸泡24h，1000╳g离心15min,收集沉淀；
步骤(3).酸浸泡：收集的沉淀按W/V比1:8加入0.5M乙酸溶液在4℃条件下搅拌浸泡12h，1000╳g离心15min，收集沉淀；
步骤(4).酶解：将沉淀按W/V1:5比加入0.5M乙酸或0.5M柠檬酸溶液、按每克组织沉淀加入5mg胃蛋白酶的比例加入胃蛋白酶，校正pH值至2.4，在4℃条件下搅拌酶解24h，14000╳g离心15min，收集离心上清液置4℃冰箱暂存备用，沉淀在相同条件下再次酶解抽提一次，以充分提取胶原蛋白，14000╳g离心15min，去沉淀，收集离心上清；
步骤(5).超滤浓缩更换缓冲：混合离心上清，用30kD聚醚砜超滤膜浓缩2倍，缩小工作体积的同时提高蛋白浓度，利于后续工艺操作，缩短操作时间；浓缩结束后连续补加pH6.80.1M PB缓冲液5DV洗滤更换缓冲；
步骤(6).阴离子交换层析；
步骤(7).超滤浓缩更换缓冲；
步骤(8).盐析；
步骤(9).透析：取盐析沉淀按W/V比2:1加入pH7.220mM PBS缓冲液搅拌成糊状，然后在4℃条件下对pH7.220mM PBS缓冲液透析，使其维持在生理盐平衡状态，即得高纯度I型胶原蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种从人胎盘中提取纯化I型胶原蛋白的优化方法，其特征在于：所述步骤(1)中包括去除表面血污，剪掉脐带，按W/V比1:4加入9％NaCl+3％乙醇溶液清洗5次，以充分去除可溶性血液成分、脂质及杂蛋白。
3.根据权利要求1所述的一种从人胎盘中提取纯化I型胶原蛋白的优化方法，其特征在于：所述步骤(6)中阴离子交换层析是指将上一步浓缩更换缓冲料液在4℃条件下上DEAE层析柱；层析条件为：1)平衡缓冲液为pH6.80.1MPB；2)RT为20h；收集流穿峰料液。
4.根据权利要求1所述的一种从人胎盘中提取纯化I型胶原蛋白的优化方法，其特征在于：所述步骤(7)中浓缩更换缓冲是指将DEAE层析流穿峰料液用30kD聚醚砜超滤膜包浓缩8倍，使料液处于最佳盐析浓度，浓缩结束后连续补加0.5M柠檬酸溶液5DV洗滤更换缓冲。
5.根据权利要求1所述的一种从人胎盘中提取纯化I型胶原蛋白的优化方法，其特征在于：所述步骤(8)中盐析是指往料液缓慢加入固态NaCl，边加边搅拌，使固态NaCl完全溶解至终浓度为2M，4℃条件下静置12h，14000╳g离心15min，分离出I型胶原蛋白；弃上清，沉淀按W/V比1:10加入0.5M柠檬酸溶液复溶，14000╳g离心15min，弃沉淀，以去除不溶性胶原蛋白；上清缓慢加入固态NaCl，边加边搅拌，使NaCl完全溶解至终浓度为2M，4℃条件下静置12h，14000╳g离心15min，进一步提纯分离出I型胶原蛋白，收集沉淀。
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