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CN116836265B - 一种羊脊柱纤维环胶原蛋白及其提取方法和应用 - Google Patents

一种羊脊柱纤维环胶原蛋白及其提取方法和应用 Download PDF

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CN116836265B CN202310985391.6A CN202310985391A CN116836265B CN 116836265 B CN116836265 B CN 116836265B CN 202310985391 A CN202310985391 A CN 202310985391A CN 116836265 B CN116836265 B CN 116836265B
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Abstract

本发明涉及一种胶原蛋白，尤其涉及了一种胶原蛋白提取方法和应用，其提取方法包括步骤(1)将切开的羊脊柱去除上下背膜后提取纤维环；(2)将上述纤维环碎化后用胰蛋白酶酶解，得到去细胞纤维环；(3)将去细胞纤维环清洗后用核酸酶酶解，得到去核酸纤维环；(4)将去核酸纤维环清洗后经酸酶结合法提取、离子平衡、透析得到羊脊柱纤维环胶原蛋白。本发明能够大大减少细胞碎片和核酸碎片对胶原蛋白提取效率的影响，有效解决了传统纤维环内胶原蛋白提取过程中杂质较多，胶原蛋白纯度和提取效率不足的问题，也为羊脊柱提供了良好的生物资源再生方法。

Description

一种羊脊柱纤维环胶原蛋白及其提取方法和应用
技术领域
本发明涉及一种胶原蛋白，尤其涉及了一种胶原蛋白提取方法和应用。
背景技术
纤维环是由多种蛋白质和生物纤维组成的环状物，其在人体和动物体内广泛存在且发挥着重要的生理功能。
胶原蛋白作为纤维环中最主要的成分之一，对纤维环结构支撑，力学增强以及活性维持起到至关重要作用。除此之外，胶原蛋白作为自然界中分布最为广泛的一种糖蛋白，也借助其自身特殊的三螺旋结构受到广泛关注。
在食品领域，胶原蛋白被认为是具有极高营养价值的天然增稠剂、增粘剂；在医美领域，胶原蛋白由于其高度生物相容性而被广泛用在皮肤填充、保湿和抗衰老产品中；在科研领域，胶原蛋白作为细胞外基质的主要成分而被用于细胞3D培养、伤口愈合、药物递送和人工血管等生物材料的研发中。
羊作为被人类最早驯化的家畜之一，其自身需求量随着人类社会进步和生活水平提高而逐年增加。然而占肉质原料重量10％-15％的羊脊柱则通常被视为非肉质边角料(除特殊用途外)而被抛弃。
羊脊柱纤维环中胶原蛋白的提取恰好为羊脊柱边角料的处理提供了渠道，不但实现了生物资源的再生，同时利用纤维环来源的胶原蛋白独有特性也能够实现促进骨骼健康、增强骨组织生长相关医美产品的生产。
目前胶原蛋白提取的传统方法包括热水提取法、酸提取法、酶提取法和碱提取法等，但上述方法由于提取时间较长(产业化中时间通常长达数周)容易对提取容器与设备造成严重腐蚀，对原料造成二次污染。
同时，由于羊脊柱纤维环中含有多种神经细胞，传统方法提取后细胞碎片、核酸碎片、以及多种细胞内杂蛋白无法去除，造成提取所得的羊脊柱纤维环胶原蛋白杂质较多，纯度和提取率较低等工业生产问题。
发明内容
本发明针对现有技术中羊脊柱纤维环中胶原蛋白的提取问题，提供了一种羊脊柱纤维环胶原蛋白及其提取方法。
为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：
一种羊脊柱纤维环胶原蛋白提取方法，其包括以下步骤：
步骤S1、将切开的羊脊柱剔除筋膜与脂肪组织，提取纤维环；
步骤S2、将步骤S1中得到的纤维环碎化后用胰蛋白酶酶解，去除多种细胞，得到去细胞纤维环；
通过对新鲜提取的纤维环进行胰蛋白酶处理，可以有效去除纤维环中的多种细胞，包括神经元细胞或神经胶质细胞，能够有效减少细胞内杂蛋白对目标胶原蛋白提取的影响，提高胶原蛋白提取效率。
步骤S3、将步骤S2中得到的去细胞纤维环清洗后用核酸酶酶解，去除内部杂DNA与RNA，得到去核酸纤维环；
通过对纤维环进行核酸酶处理，可以有效减少破碎细胞外泄核酸对目标胶原蛋白提取的影响，有效减少胶原蛋白内杂质含量，减少酸酶法提取时间，提高胶原蛋白提取效率。
步骤S4、将步骤S3中得到的去核酸纤维环清洗后经酸酶结合法提取得到纤维环胶原蛋白上清液；
步骤S5、对步骤S4中的纤维环胶原蛋白上清液调节pH平衡和离子平衡，得到纤维环胶原蛋白溶液；
步骤S6、对步骤S5中的纤维环胶原蛋白溶液进行透析；
步骤S7、透析后经冻干干燥得到羊脊柱纤维环胶原蛋白。
同时通过对纤维环进行胰蛋白酶与核酸酶处理，可以有效避免因单独使用胰蛋白酶导致的核酸污染，或因单独使用核酸酶导致的细胞去除不足造成的杂蛋白污染。
作为优选，步骤S1具体包括以下步骤：
步骤S11、对切开的羊脊柱剔除膜和脂肪组织；
步骤S12、利用清洗液清洗3次，清洗后提取纤维环，其中清洗液为灭菌水、磷酸盐缓冲液或细胞培养基溶液。
作为优选，步骤S2具体包括以下步骤：
步骤S21、将纤维环剪成或切成小块；
步骤S22、将小块的纤维环浸泡于胰蛋白酶溶液中酶解，浸泡时间为24～48h，浸泡温度为30℃～37℃，得到去细胞纤维环，其中胰蛋白酶包括酸性胰蛋白酶、中性胰蛋白酶、碱性胰蛋白酶中的一种或多种；纤维环与胰蛋白酶溶液的质量体积比为0.1g～2g:40～80mL，胰蛋白酶溶液浓度为0.1％～0.6％。
作为优选，步骤S3具体为将去细胞纤维环浸泡于浓度为3％～8％的核酸酶溶液中酶解，得到去核酸纤维环，其中核酸酶包括核糖核酸内切酶、脱氧核糖核酸内切酶、核糖核酸外切酶、脱氧核糖核酸外切酶、去甲基化酶或核苷酸剪切酶，纤维环与核酸酶溶液质量体积比为0.5g～3g:50～200mL，浸泡时间为8～16h，浸泡温度为30℃～37℃。
作为优选，步骤S4具体包括以下步骤：
步骤S41、将去核酸纤维环浸泡于清洗液中24～48h，得到去杂质纤维环；其中清洗液包括磷酸盐缓冲液、聚乙二醇辛基苯基醚溶液或灭菌水；
步骤S42、去杂质纤维环经酸酶结合法提取，得到纤维环胶原蛋白上清液，其中，酸酶结合法具体为将去杂质纤维环加入酸性溶液中，其中，酸酶结合法中所使用的酸性溶液为浓度为0.3～0.8mol/L的乙酸或盐酸溶液，酸酶结合法所使用的酶为胃蛋白酶，胃蛋白酶用量与酶解的纤维环质量之比为1～3：10～15，酸酶结合法提取温度为1～8℃，提取时间为24～48h；
步骤S43、酸酶结合法提取完成后使用2000g～8000g超速离心，得到纤维环胶原蛋白上清液。
作为优选，步骤S5具体包括以下步骤：
步骤S51、将纤维环胶原蛋白上清液静置24～48h；
步骤S52、利用2～8mol/L的NaOH溶液进行对纤维环胶原蛋白上清液进行pH平衡调节；
步骤S53、用磷酸盐缓冲液对经步骤S52调节后的纤维环胶原蛋白上清液进行离子平衡调节,得到纤维环胶原蛋白溶液。
作为优选，步骤S6中通过透析袋对纤维环胶原蛋白溶液进行透析，透析袋的截留分子量为5000～10000，透析时间为24～48h。
作为优选，步骤S7中冷冻干燥温度为-40℃～-80℃；冻干时间为24～72h。
一种羊脊柱纤维环胶原蛋白，其采用一种羊脊柱纤维环胶原蛋白提取方法提取得到，提取得到羊脊柱纤维环胶原蛋白具有I型胶原蛋白特征，含有至少两条不同的α链和一条β链段。
一种羊脊柱纤维环胶原蛋白的应用，应用于水凝胶。
本发明由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果：
本发明操过简单，易于工业化，其可有效去纤维环来源胶原蛋白中的细胞碎片、核酸碎片以及杂蛋白，不仅可以制备得到高纯度的胶原蛋白，且其可以有效提高胶原蛋白的提取率，减少提取所用时间。所提取的胶原蛋白动感后呈出白色海绵状固体，水溶性良好，与人体胶原蛋白在组分上有极高的相似度，除可广泛应用于医美的皮肤保湿、填充产品外，也可也用于可植入生物医用材料、骨修复与再生促进材料、药物递送材料的制备和生产。
附图说明
图1为实施例1中的纤维环胶原蛋白提取前与提取后实物对比图。
图2为实施例1中的纤维环胶原蛋白的SDS-PAGE电泳图谱。
图3为实施例1中纤维环胶原蛋白的细胞粘附性与细胞相容性测试。
图4为实施例1中双键改性纤维环纤维环胶原蛋白核磁氢谱图。
图5为实施例1中纤维环胶原蛋白水凝胶的实物照片与光固化流变测试。
图6为实施例1中纤维环胶原蛋白水凝胶的细胞黏附于细胞相容性测试。
图7为实施例1～5中纤维环胶原蛋白的提取率。
具体实施方式
下面结合附图与实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
如图1-图7所示，一种羊脊柱纤维环胶原蛋白提取方法，包括以下步骤：
步骤S1、取剔除结缔组织和弹性纤维的羊脊柱，
步骤S2、利用PBS清洗3次，随后将纤维环剪成1cm X 1cm的小块，得到所述碎化纤维环后，将纤维环浸泡于0.4％浓度的胰蛋白酶溶液于37℃下中酶解36h，浸泡过程中每4h更换一次胰蛋白酶溶液，去除纤维环中多种细胞，如心肌细胞和纤维细胞等，得到去细胞纤维环。
步骤S3、将去细胞纤维环浸泡于5％浓度的脱氧核糖内切酶核酸酶溶液中酶解于37℃下中酶解12h，为去除纤维环中多种核酸，如脱氧核糖核酸等，得到去核酸纤维环。
步骤S4、将去核酸纤维环浸泡于聚乙二醇辛基苯基醚溶液(1％)中清洗48h。将清洗后的纤维环称重并加入0.5mol/L乙酸溶液中，随后向混合液中加入纤维环重量1/8的胃蛋白酶，于4℃下酶解24h，酶解完成后用5000g超速离心，得到纤维环胶原蛋白上清液。
步骤S5、将纤维环胶原蛋白上清液静置24h，随后利用5mol/L的NaOH溶液将上清液pH调节至7.0，并用加入5倍上清液体积的磷酸盐缓冲液对上清液调节离子平衡，得到纤维环胶原蛋白溶液。
步骤S6、得到纤维环胶原蛋白溶液后，利用截留分子量7500的透析袋将溶液透析24h.
步骤S7、随后于-80℃下冻干48h，得到羊脊柱纤维环胶原蛋白，如图1所示。
如图2所示，本实施例中对所得羊脊柱纤维环胶原蛋白进行SDS-PAGE电泳测试，测试结果证明所得蛋白为胶原蛋白，没有杂带，纯度较高；
如图3所示，利用人胚肺成纤维细胞(NHFL)、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)人非小细胞肺癌细胞(A549)对所得羊脊柱纤维环胶原蛋白进行细胞黏附与细胞相容性实验，测试结果证明所得纤维环胶原蛋白生物相容性良好，可促进细胞黏附。
实施例2
同实施例1，所不同的是本实施例步骤S2中纤维环浸泡于0.4％浓度的胰蛋白酶溶液于37℃下中酶解24h。
实施例3
同实施例1，所不同的是本实施例纤维环步骤S2中纤维环浸泡于0.2％浓度的胰蛋白酶溶液中。
实施例4
同实施例1，所不同的是本实施例步骤S3中去细胞纤维环浸泡于5％浓度的脱氧核糖内切酶核酸酶溶液中酶解于37℃下中酶解16h。
实施例5
同实施例1，所不同的是本实施例步骤S3中去细胞纤维环浸泡于3％浓度的脱氧核糖内切酶核酸酶溶液中。
对比例1：
同实施例1，所不同的是本实施例具体包括以下步骤：
步骤S1、取剔除结缔组织和弹性纤维的羊脊柱，
步骤S2、利用PBS清洗3次，随后将纤维环剪成1cm X 1cm的小块，得到所述碎化纤维环后，将纤维环浸泡于0.4％浓度的胰蛋白酶溶液于37℃下中酶解36h，浸泡过程中每4h更换一次胰蛋白酶溶液，得到去细胞纤维环。
步骤S3、将去细胞纤维环浸泡于聚乙二醇辛基苯基醚溶液(1％)中清洗48h。将清洗后的纤维环称重并加入0.5mol/L乙酸溶液中，随后向混合液中加入纤维环重量1/8的胃蛋白酶，于4℃下酶解24h，酶解完成后用5000g超速离心，得到纤维环胶原蛋白上清液。
步骤S4、将纤维环胶原蛋白上清液静置24h，随后利用5mol/L的NaOH溶液将上清液pH调节至7.0，并用加入5倍上清液体积的磷酸盐缓冲液对上清液调节离子平衡，得到纤维环胶原蛋白溶液。
步骤S5、得到纤维环胶原蛋白溶液后，利用截留分子量7500的透析袋将溶液透析24h.
步骤S6、随后于-80℃下冻干48h，得到羊脊柱纤维环胶原蛋白。
对比例2：
同实施例1，所不同的是本实施例具体包括以下步骤：
步骤S1、取剔除结缔组织和弹性纤维的羊脊柱，
步骤S2、利用PBS清洗3次，随后将纤维环剪成1cm X 1cm的小块，得到所述碎化纤维环后；
步骤S3、将碎化纤维环浸泡于5％浓度的脱氧核糖内切酶核酸酶溶液中酶解于37℃下中酶解12h，得到去核酸纤维环。
步骤S4、将去核酸纤维环浸泡于聚乙二醇辛基苯基醚溶液(1％)中清洗48h。将清洗后的纤维环称重并加入0.5mol/L乙酸溶液中，随后向混合液中加入纤维环重量1/8的胃蛋白酶，于4℃下酶解24h，酶解完成后用5000g超速离心，得到纤维环胶原蛋白上清液。
步骤S5、将纤维环胶原蛋白上清液静置24h，随后利用5mol/L的NaOH溶液将上清液pH调节至7.0，并用加入5倍上清液体积的磷酸盐缓冲液对上清液调节离子平衡，得到纤维环胶原蛋白溶液。
步骤S6、得到纤维环胶原蛋白溶液后，利用截留分子量7500的透析袋将溶液透析24h。
步骤S7、随后于-80℃下冻干48h，得到羊脊柱纤维环胶原蛋白。
对比例3：
采用传统胶原蛋白提取方式提取羊脊柱纤维环胶原蛋白，具体操作步骤为：
步骤S1、取剔除结缔组织和弹性纤维的羊脊柱；
步骤S2、利用PBS清洗3次，随后将纤维环剪成1cm×1cm的小块。得到所述碎化纤维环后，将清洗后的纤维环称重并加入0.5mol/L乙酸溶液中，随后向混合液中加入纤维环重量1/8的胃蛋白酶，于4℃下酶解24h。
步骤S3、酶解完成后用5000g超速离心，将上清液静置24h。
步骤S4、向纤维环胶原蛋白上清液中加入NaCl直至的混合液中NaCl的最终浓度为5mol/L，静置24h后，5000g离心取沉淀，得到盐析纤维环胶原蛋白。
步骤S5、随后利用灭菌水将盐析纤维环胶原蛋白复溶利用截留分子量7500的透析袋将溶液透析24h，随后于-80℃下冻干48h，得到羊脊柱纤维环胶原蛋白。
如图7所示，通过实施例1与实施例2和实施例3的胶原蛋白提取率对比，说明本发明羊脊柱纤维环胶原蛋白的提取过程中，胰蛋白酶的最佳使用浓度为0.4％，酶解时间为36h。
通过实施例1与实施例4和实施例5的胶原蛋白提取率对比，说明本发明羊脊柱纤维环胶原蛋白的提取过程中，核酸酶的最佳使用浓度为5％，酶解时间为12h
通过实施例1～5和对比例1与对比例2的胶原蛋白提取率对比，说明本发明羊脊柱纤维环胶原蛋白的提取过程中，由于同时通过对纤维环进行胰蛋白酶与核酸酶处理，可以有效避免因单独使用胰蛋白酶导致的核酸污染，或因单独使用核酸酶导致的细胞去除不足造成的杂蛋白污染，因而胰蛋白酶和核酸酶的结合处理会显著增加胶原蛋白提取率。
通过实施例1～5和对比例3的胶原蛋白提取率对比，说明本发明羊脊柱纤维环胶原蛋白的提取方法对于羊脊柱纤维环中的胶原蛋白提取率显著优于传统胶原蛋白提取方法。
实施例6
一种羊脊柱纤维环胶原蛋白，如图1所示，其采用实施例1-5任意一实施例中的一种羊脊柱纤维环胶原蛋白提取方法提取得到，提取得到羊脊柱纤维环胶原蛋白具有I型胶原蛋白特征，含有至少两条不同的α链和一条β链段。
本实施例得到的羊脊柱纤维环胶原蛋白溶解性良好，可以高浓度(＞30mg/mL)溶解于多种溶剂(如灭菌水、乙酸、盐酸等)，有效解决羊脊柱边角料的浪费，有效实现了生物资源的再生。
同时提取得到的羊脊柱纤维环胶原蛋白可以达到工程医用材料的要求，填补国内市场纤维环胶原蛋白空白。
实施例7
一种羊脊柱纤维环胶原蛋白的应用，将实施例6中的一种羊脊柱纤维环胶原蛋白应用于水凝胶，具体包括以下步骤：
步骤(1)、得到所述羊脊柱纤维环胶原蛋白后，利用活性分子对羊脊柱纤维环胶原蛋白表面修饰双键，其中活性分子可以为甲基丙烯酸酐、烯丙基氨盐酸盐、降冰片烯二酸酐、丙烯酸酐中的一种或几种，本实施例中利用甲基丙烯酸酐对胶原蛋白表面修饰双键，得到双键修饰羊脊柱纤维环胶原蛋白。
如图4所示，利用核磁氢谱图对双键改性羊脊柱纤维环胶原蛋白进行表征，测试结果证明双键改性羊脊柱纤维环胶原蛋白合成成功。
步骤(2)、得到上述双键修饰羊脊柱纤维环胶原蛋白后，利用中性溶液溶解胶原蛋白，其中中性溶液优选为PBS或灭菌水，本实施例中利用灭菌水将双键改性羊脊柱纤维环胶原蛋白溶解成5％～20％浓度的溶液，得到双键修饰羊脊柱纤维环胶原蛋白溶液；
步骤(3)、得到上述双键修饰羊脊柱纤维环胶原蛋白溶液后，加入浓度为0.01％～0.1％的光引发剂，利用紫外光照射20s～40s后得到羊脊柱纤维环胶原蛋白水凝胶，本实施例中光引发剂为LAP、DPB或2959，加入上述溶液后的浓度优选为0.01％～0.1％，优选为0.05％。
并向其中加入适量LAP使LAP最终浓度为0.05％。
如图5所示，利用流变仪对双双键改性羊脊柱纤维环胶原蛋白进行光固化过程测试，测试结果证明双键改性羊脊柱纤维环胶原蛋白可以在20s内固化形成水凝胶，水凝胶模量在常见商用生物医用水凝胶模量范围内。
如图6所示，利用人胚肺成纤维细胞(NHFL)、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)人非小细胞肺癌细胞(A549)对所得羊脊柱纤维环胶原蛋白水凝胶进行细胞黏附与细胞相容性实验，测试结果证明所得纤维环胶原蛋白生物相容性良好，细胞黏附性良好。
容易理解的是，本领域技术人员在本申请提供的一个或几个实施例基础上，可以对本申请的实施例进行结合、拆分、重组等得到其他实施例，这些实施例均没有超出本申请的保护范围。
总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。

Claims (7)

1.一种羊脊柱纤维环胶原蛋白提取方法，其特征在于其包括以下步骤：
步骤S1、将切开的羊脊柱剔除筋膜与脂肪组织，提取纤维环；
步骤S2、将步骤S1中得到的纤维环碎化后用胰蛋白酶酶解，得到去细胞纤维环；
步骤S3、将步骤S2中得到的去细胞纤维环清洗后用脱氧核糖内切酶核酸酶酶解，得到去核酸纤维环；
步骤S4、将步骤S3中得到的去核酸纤维环清洗后经酸酶结合法提取得到纤维环胶原蛋白上清液；
步骤S5、对步骤S4中的纤维环胶原蛋白上清液调节pH平衡和离子平衡，得到纤维环胶原蛋白溶液；
步骤S6、对步骤S5中的纤维环胶原蛋白溶液进行透析；
步骤S7、透析后经冻干干燥得到羊脊柱纤维环胶原蛋白；
步骤S2具体包括以下步骤：
步骤S21、将纤维环剪成或切成小块；
步骤S22、将小块的纤维环浸泡于胰蛋白酶溶液中酶解，浸泡时间为24~48 h，浸泡温度为30℃ ~ 37℃，得到去细胞纤维环；纤维环与胰蛋白酶溶液的质量体积比为0.1 g ~ 2 g :40 ~ 80 mL，胰蛋白酶溶液浓度为0.1%~0.6%；
步骤S3具体为将去细胞纤维环浸泡于浓度为3% ~ 8%的脱氧核糖内切酶核酸酶溶液中酶解，得到去核酸纤维环，其中纤维环与核酸酶溶液质量体积比为0.5 g ~ 3 g : 50 ~200 mL，浸泡时间为8 ~ 16 h，浸泡温度为30℃ ~ 37℃；
步骤S4具体包括以下步骤：
步骤S41、将去核酸纤维环浸泡于清洗液中24~48 h，得到去杂质纤维环；其中清洗液包括磷酸盐缓冲液、聚乙二醇辛基苯基醚溶液或灭菌水；
步骤S42、去杂质纤维环经酸酶结合法提取，得到纤维环胶原蛋白上清液，其中，酸酶结合法具体为将去杂质纤维环加入酸性溶液中，其中，酸酶结合法中所使用的酸性溶液为浓度为0.3 ~ 0.8 mol/L的乙酸或盐酸溶液，酸酶结合法所使用的酶为胃蛋白酶，胃蛋白酶用量与酶解的纤维环质量之比为1~3：10~15，酸酶结合法提取温度为1~8℃，提取时间为24~48h；
步骤S43、酸酶结合法提取完成后使用2000 g ~8000 g超速离心，得到纤维环胶原蛋白上清液。
2.根据权利要求1所述的一种羊脊柱纤维环胶原蛋白提取方法，其特征在于：
步骤S1具体包括以下步骤：
步骤S11、对切开的羊脊柱剔除膜和脂肪组织；
步骤S12、利用清洗液清洗3次，清洗后提取纤维环，其中清洗液为灭菌水、磷酸盐缓冲液或细胞培养基溶液。
3.根据权利要求1所述的一种羊脊柱纤维环胶原蛋白提取方法，其特征在于：
步骤S5具体包括以下步骤：
步骤S51、将纤维环胶原蛋白上清液静置24 ~ 48 h；
步骤S52、利用2 ~ 8 mol/L的NaOH 溶液进行对纤维环胶原蛋白上清液进行pH平衡调节；
步骤S53、用磷酸盐缓冲液对经步骤S52调节后的纤维环胶原蛋白上清液进行离子平衡调节, 得到纤维环胶原蛋白溶液。
4.根据权利要求1所述的一种羊脊柱纤维环胶原蛋白提取方法，其特征在于：
步骤S6中通过透析袋对纤维环胶原蛋白溶液进行透析，透析袋的截留分子量为5000 ~10000，透析时间为24 ~ 48 h。
5.根据权利要求1所述的一种羊脊柱纤维环胶原蛋白提取方法，其特征在于：
步骤S7中冷冻干燥温度为-40℃ ~ -80℃；冻干时间为24 ~72 h。
6.一种羊脊柱纤维环胶原蛋白，其特征在于：其采用权利要求1-5任意一项所述的一种羊脊柱纤维环胶原蛋白提取方法提取得到，提取得到羊脊柱纤维环胶原蛋白具有I型胶原蛋白特征，含有至少两条不同的α链和一条β链段。
7.一种羊脊柱纤维环胶原蛋白的应用，其特征在于：权利要求6所述的一种羊脊柱纤维环胶原蛋白在制备水凝胶中的应用。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118557798A (zh) * 2024-06-20 2024-08-30 苏州先觉新材料科技有限公司 一种水凝胶-静电纺丝膜双层混合支架及其制备方法和应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4789663A (en) * 1984-07-06 1988-12-06 Collagen Corporation Methods of bone repair using collagen
KR20180028229A (ko) * 2016-09-08 2018-03-16 주식회사 엘앤씨바이오 고농도, 고순도의 동종 콜라겐 제조 방법 및 동종 콜라겐 지지체의 제조방법
CN109939262A (zh) * 2019-03-19 2019-06-28 皖南医学院第一附属医院（皖南医学院弋矶山医院） 一种bFGF水凝胶的制备方法及其应用
CN110655568A (zh) * 2019-09-27 2020-01-07 成都维德医疗器械有限责任公司 一种酸性酶解法提取胶原蛋白的方法
CN110652611A (zh) * 2019-11-08 2020-01-07 华中科技大学同济医学院附属协和医院 京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶及其制备方法
CN110935067A (zh) * 2019-12-09 2020-03-31 皖南医学院第一附属医院（皖南医学院弋矶山医院） 一种聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架及其制备和应用
WO2021118379A1 (en) * 2019-12-12 2021-06-17 Ineb - Instituto De Engenharia Biomédica Fetal decellularized nucleus pulposus material and methods for obtaining pharmaceutic compositions to be used in the treatment of intervertebral disc degeneration and back pain

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20190160109A1 (en) * 2016-01-11 2019-05-30 Technische Universiteit Eindhoven Notochordal cell matrix as a bioactive lubricant for the osteoarthritic joint

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4789663A (en) * 1984-07-06 1988-12-06 Collagen Corporation Methods of bone repair using collagen
KR20180028229A (ko) * 2016-09-08 2018-03-16 주식회사 엘앤씨바이오 고농도, 고순도의 동종 콜라겐 제조 방법 및 동종 콜라겐 지지체의 제조방법
CN109939262A (zh) * 2019-03-19 2019-06-28 皖南医学院第一附属医院（皖南医学院弋矶山医院） 一种bFGF水凝胶的制备方法及其应用
CN110655568A (zh) * 2019-09-27 2020-01-07 成都维德医疗器械有限责任公司 一种酸性酶解法提取胶原蛋白的方法
CN110652611A (zh) * 2019-11-08 2020-01-07 华中科技大学同济医学院附属协和医院 京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶及其制备方法
CN110935067A (zh) * 2019-12-09 2020-03-31 皖南医学院第一附属医院（皖南医学院弋矶山医院） 一种聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架及其制备和应用
WO2021118379A1 (en) * 2019-12-12 2021-06-17 Ineb - Instituto De Engenharia Biomédica Fetal decellularized nucleus pulposus material and methods for obtaining pharmaceutic compositions to be used in the treatment of intervertebral disc degeneration and back pain

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Preparation and Characterization of a Novel Decellularized Fibrocartilage "Book" Scaffold for Use in Tissue Engineering;Liyun Guo等;PLoS One;20151204;第10卷(第12期);第1-11页 *
京尼平交联脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶与兔纤维环源干细胞的生物相容性;刘晨等;中国组织工程研究;20160520;第20卷(第21期);第3143-3149页 *
水凝胶再生修复退变椎间盘的研究进展;石坤等;中国修复重建外科杂志;20200315;第34卷(第3期);第275-284页 *

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