CN115572328A - 一种医用级ⅲ型胶原蛋白的制备方法和ⅲ型胶原蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种医用级Ⅲ型胶原蛋白的制备方法，包含如下步骤：动物胎盘组织预处理、脱细胞、脱脂、除杂、酶切、盐析纯化、脱盐浓缩；所述的盐析方法为：在碱性条件下对含有Ⅲ型胶原蛋白的动物源胶原蛋白混合物进行盐析，一步盐析即可得到高纯度的Ⅲ型胶原蛋白，纯度达到95％以上；制备得到的动物胎盘Ⅲ型胶原蛋白具有良好的三螺旋结构以及特征性的纤维网状结构；内毒素含量低于0.5Eu/mL，达到医用标准；可应用于活性护肤品、皮肤修复敷料、植入剂、人工皮肤、医疗器械、保健食品等领域。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种医用级Ⅲ型胶原蛋白的制备方法和Ⅲ型胶原蛋白。
背景技术
胶原蛋白是动物体内含量最多、分布最广的蛋白质，是结缔组织的主要组成成分。Ⅲ型胶原蛋白是一种间质胶原，由3条α1(Ⅲ)链组成。它是皮肤、血管等组织的主要纤维蛋白成分之一。Ⅲ型胶原蛋白通常与Ⅰ型胶原蛋白共生，作为一种伴生胶原蛋白，Ⅲ型胶原蛋白在哺乳动物体内多以富有弹性的薄纤维层的形式与Ⅰ型胶原形成纤维组织。Ⅲ型胶原蛋白在人体创伤愈合、组织修复中发挥重要作用，在皮肤修复敷料中有良好的应用效果。Ⅲ型胶原蛋白呈现出独特的三螺旋结构，三螺旋结构是Ⅲ型胶原蛋白具有良好生物功能的关键因素。因此，从动物组织中提取Ⅲ型胶原蛋白的关键，是在保证其纯度的前提下，在提取过程中保持Ⅲ型胶原蛋白的结构完整性，防止其发生变性。同时，作为医用材料的Ⅲ型胶原蛋白，对于纯度和安全性均有严格的要求，对胶原蛋白中含有的内毒素等成分含量也设置了严格的行业标准。
胎盘是哺乳类胎生动物在怀胎时为胎儿供应养分、让胚胎生长的特殊组织，它在分娩时排出体外，胎盘在我国入药已有几千年的历史。哺乳动物胎盘含有丰富的胶原蛋白成分，其中Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型胶原蛋白的含量占比最高。中国专利CN1030528C利用胃蛋白酶，从人胎盘中提取得到不同类型胶原蛋白的混合物，其中Ⅲ型胶原蛋白的含量低。中国专利CN101717804B从新生犊牛皮中提取制备Ⅲ型胶原蛋白，该方法使用高浓度的盐酸胍和加热使胶原蛋白发生变性，丧失胶原蛋白生物功能必需的三螺旋结构。如何高效制备高纯度、具有完整三螺旋结构的III型胶原蛋白亟待研究。
盐析是蛋白质纯化的重要方法。目前已建立包含复溶、盐析沉淀、复溶脱盐步骤的多步盐析纯化工艺，从胶原蛋白混合物中纯化得到单一类型的胶原蛋白。然而，该工艺步骤繁琐、周期长，盐析都是在酸性或者中性条件下进行。发明专利CN103772734A公开的高纯度胶原蛋白海绵的制备方法中，盐析是在pH值为7.0条件下进行；发明专利CN111748030A公开的一种可溶性非变性II型胶原蛋白及其制备方法，盐析是在pH值为2.0-7.0条件下进行的；发明专利CN113061178A公开的梅花鹿鹿皮胶原蛋白及胶原蛋白肽的制备方法中，盐析是在pH为7.0条件下进行的；发明专利CN103882082B公开的一种I型和V型胶原蛋白的制备方法中，盐析是在pH为7.5条件下进行的。
发明人在研究过程中意外的发现，在碱性条件下，对含有Ⅲ型胶原蛋白的动物胶原蛋白混合物进行盐析，可以一步得到高纯度Ⅲ型动物胶原蛋白，且制备得到的Ⅲ型动物胶原蛋白，纯度达到95％以上；其保持良好的三螺旋结构，为非变性Ⅲ型胶原蛋白，并且内毒素含量低于0.5Eu/mL，达到医用标准；可用于制备护肤品、皮肤修复敷料、植入剂、医疗器械、保健食品等。
发明内容
针对以上技术问题，本发明的目的在于提供一种从动物组织中提取制备Ⅲ型胶原蛋白的方法，制备方法为：在碱性条件下，对含有Ⅲ型胶原蛋白的动物胶原蛋白混合物进行盐析，得到高纯度Ⅲ型胶原蛋白。
优选的，盐析条件：pH为：8.5-10.0，盐浓度为：0.1-1.5M。
优选的，所述动物组织为动物胎盘。
第二方面，本发明还提供了一种Ⅲ型胶原蛋白的制备方法，包含如下步骤：动物胎盘组织预处理、脱细胞、脱脂、除杂、酶切、盐析纯化、脱盐浓缩，所述的盐析方法为：在碱性条件下对含有Ⅲ型胶原蛋白的动物胶原蛋白混合物进行盐析，盐析条件：pH为：8.5-10.0，盐浓度为：0.1-1.5M。
优选的，所述的脱细胞方法为：用酸溶液，和/或盐溶液，和/或缓冲溶液，和/或表面活性剂，和/或过氧化物溶液处理动物胎盘组织；所述脱脂方法为：用正丁醇，和/或氯仿-甲醇溶液，和/或氯仿-甲醇-水溶液，和/或乙醚，和/或正己烷，和/或丙酮，和/或乙醇-正己烷溶液，和/或乙醇溶液，和/或表面活性剂处理动物胎盘组织；所述除杂方法为：用氢氧化钠溶液，和/或氢氧化钾溶液处理动物胎盘。
优选的，所述的制备方法包括以下步骤：
(1)动物胎盘预处理：将动物胎盘切碎为小块，在纯化水中洗涤除去杂质和组织外血液残留；
(2)脱细胞：通过定速搅拌的方法在容器中依次利用NaCl溶液、表面活性剂溶液和过氧化物溶液对预处理后的动物胎盘进行脱细胞处理；
(3)脱脂：通过定速搅拌的方法在新配制的浓度为5％-30％v/v的正丁醇溶液中处理脱细胞处理后的动物胎盘碎片3-5次，每次6-18h；
(4)除杂：通过定速搅拌的方法在0.01-2.0M的氢氧化钠溶液中对脱脂后的动物胎盘碎片0.5-72h进行杂蛋白去除处理；
(5)酶切：采用酶切法提取经过除杂处理后的动物胎盘中的胶原蛋白，获得动物胶原蛋白混合物；
(6)盐析：将动物胶原蛋白混合物pH调节至碱性条件，对动物胶原蛋白混合物进行盐析，获得Ⅲ型胶原蛋白沉淀；
(7)脱盐、浓缩：采用超滤、透析和凝胶色谱方法中的一种或者几种任意组合，对得到的Ⅲ型胶原蛋白溶液进行脱盐和浓缩处理。
优选的，步骤(2)中用浓度为5-30％m/v的NaCl溶液浸泡过夜；用纯化水冲洗至无残留后用浓度为0.1-2％v/v的表面活性剂浸泡处理0.5-6h；再次用纯化水冲洗后用浓度为3-10％v/v的过氧化物溶液浸泡处理30-60min。
优选的，所述表面活性剂包括SDS/TritonX-100、Na2EDTA、双氯苯双胍己烷、苯扎氯铵/十二烷基二甲基苄基氯化铵、苯扎溴铵中的任一种；所述过氧化物包括过氧化氢、过氧乙酸中的任一种。
第三方面，本发明提供了一种医用级Ⅲ型胶原蛋白的制备方法，所述方法为：将所述方法制备获得的Ⅲ型胶原蛋白在温度不高于25℃下进行辐射灭菌处理，即得。
第四方面，本发明提供了一种根据所述的方法制备得到的医用级Ⅲ型胶原蛋白。
第五方面，本发明提供了一种医用级Ⅲ型胶原蛋白，所述医用级Ⅲ型胶原蛋白中包括95％以上的Ⅲ型胶原蛋白，所述医用级Ⅲ型胶原蛋白内毒素低于0.5Eu/mL。
第六方面，本发明提供了所述的医用级Ⅲ型胶原蛋白在制备活性护肤品、皮肤修复敷料、植入剂、人工皮肤、医疗器械、保健食品中的应用。
本发明的有益效果是：
(1)本发明提供了一种医用级Ⅲ型胶原蛋白的制备方法，在碱性条件下，对含有Ⅲ型胶原蛋白的动物胶原蛋白混合物进行盐析，只通过一步盐析，即可制备得到高纯度的Ⅲ型胶原蛋白；
(2)本发明所述的制备方法，条件温和、绿色安全、步骤简单、易于操作、周期短、成本低，适于规模化制备。
(3)本发明制备得到的Ⅲ型胶原蛋白，纯度达到95％以上，保持良好的三螺旋结构以及特征性的纤维形貌，为非变性Ⅲ型胶原蛋白。
(4)本发明制备得到的Ⅲ型胶原蛋白，内毒素含量低于0.5Eu/mL，达到医用标准；
(5)本发明制备得到的Ⅲ型胶原蛋白，可应用于活性护肤品、皮肤修复敷料、植入剂、人工皮肤、医疗器械、保健食品等领域。
附图说明
图1本发明实施例制备的Ⅲ型胶原蛋白的SDS-PAGE结果；
注：Batch1代表实施例1制备的Ⅲ型胶原蛋白；Batch2代表实施例2制备的Ⅲ型胶原蛋白；Batch3代表实施例3制备的Ⅲ型胶原蛋白；
图2本发明对比例制备的Ⅲ型胶原蛋白的SDS-PAGE结果；
注：Batch1代表对比例1制备的胶原蛋白；Batch2代表对比例2制备的胶原蛋白；
图3本发明制备的Ⅲ型胶原蛋白的圆二色谱图；
图4本发明制备的Ⅲ型胶原蛋白的热变曲线；
图5本发明制备的Ⅲ型胶原蛋白的SEM图；
图6本发明制备的Ⅲ型胶原蛋白的TEM图；
图7本发明制备的Ⅲ型胶原蛋白的质谱图；
图8本发明制备的Ⅲ型胶原蛋白的非变性检测结果。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细的阐述，任何本领域的技术人员在本发明的基础上，结合本领域公知常识所能想到的技术方案，都属于本发明的保护范围。
实施例1Ⅲ型胶原蛋白的制备1
胎盘组织预处理：取牦牛胎盘组织切块，通过纯化水水浸泡洗涤去除表面残留杂质，处理为更小组织碎片备用；
脱细胞：将预处理后所得动物胎盘组织浸泡在5％的NaCl溶液中定速搅拌过夜；用纯化水将NaCl清除完全后，再将动物胎盘组织于0.1％醋酸洗必泰(双氯苯双胍己烷)溶液中定速搅拌处理6h，取动物胎盘组织沉淀；用纯化水将醋酸洗必泰清除完全后，再将动物胎盘组织浸泡于3％过氧化氢中定速搅拌处理60min，用纯化水将过氧化氢清除完全，取动物胎盘组织沉淀；
脱脂：将脱细胞处理后的动物胎盘组织沉淀浸泡于新配制的5％v/v的正丁醇溶液中，定速搅拌处理3次，每次6h，最后一次脱脂结束后用纯化水将正丁醇清除完全，取动物胎盘组织沉淀；
除杂：将脱脂处理后的动物胎盘组织沉淀浸泡于0.01M的氢氧化钠溶液，定速搅拌处理72h后用纯化水将氢氧化钠清除完全，取动物胎盘组织沉淀；
酶切：将完成除杂处理后的动物胎盘组织沉淀置于0.5M含胃蛋白酶的醋酸溶液中定速搅拌48h后获得动物胶原蛋白混合物；
盐析：将动物胶原蛋白混合物pH调节至8.5，在搅拌条件下缓慢添加氯化钠固体至浓度为0.1M对所获得的动物胶原蛋白混合物进行盐析；
脱盐：将盐析得到的沉淀在醋酸溶液中复溶至均一溶液后用醋酸溶液和纯化水交替透析得到Ⅲ型胶原蛋白水溶液。
所有实验操作温度均不高于25℃。
实施例2Ⅲ型胶原蛋白的制备2
胎盘组织预处理：取牦牛胎盘组织切块，通过纯化水水浸泡洗涤去除表面残留杂质，处理为更小组织碎片备用；
脱细胞：将预处理后所得动物胎盘组织浸泡在20％的NaCl溶液中定速搅拌过夜；用纯化水将NaCl清除完全后，再将动物胎盘组织于0.1％醋酸洗必泰(双氯苯双胍己烷)溶液中定速搅拌处理1h，取动物胎盘组织沉淀；用纯化水将醋酸洗必泰清除完全后，再将动物胎盘组织浸泡于5％过氧化氢中定速搅拌处理60min，用纯化水将过氧化氢清除完全，取动物胎盘组织沉淀；
脱脂：将脱细胞处理后的动物胎盘组织沉淀浸泡于新配制的30％v/v的正丁醇溶液中，定速搅拌处理3次，每次12h，最后一次脱脂结束后用纯化水将正丁醇清除完全，取动物胎盘组织沉淀；
除杂：将脱脂处理后的动物胎盘组织沉淀浸泡于0.5M的氢氧化钠溶液，定速搅拌处理1h后用纯化水将氢氧化钠清除完全，取动物胎盘组织沉淀；
酶切：将完成除杂处理后的动物胎盘组织沉淀置于0.5M含胃蛋白酶的醋酸溶液中定速搅拌48h后获得动物胶原蛋白混合物；
盐析：将动物胶原蛋白混合物的pH调节至10.0，在搅拌条件下缓慢添加氯化钠固体至浓度为1.5M对所获得的动物胶原蛋白混合物进行盐析；
脱盐：将盐析得到的沉淀在醋酸溶液中复溶至均一溶液后用醋酸溶液和纯化水交替透析得到Ⅲ型胶原蛋白水溶液。
所有实验操作温度均不高于25℃。
实施例3Ⅲ型胶原蛋白的制备3
胎盘组织预处理：取牦牛胎盘组织切块，通过纯化水水浸泡洗涤去除表面残留杂质，处理为更小组织碎片备用；
脱细胞：将预处理后所得动物胎盘组织浸泡在20％的NaCl溶液中定速搅拌过夜；用纯化水将NaCl清除完全后，再将动物胎盘组织于0.1％醋酸洗必泰(双氯苯双胍己烷)溶液中定速搅拌处理1h，取动物胎盘组织沉淀；用纯化水将醋酸洗必泰清除完全后，再将动物胎盘组织浸泡于5％过氧化氢中定速搅拌处理60min，用纯化水将过氧化氢清除完全，取动物胎盘组织沉淀；
脱脂：将脱细胞处理后的动物胎盘组织沉淀浸泡于新配制的10％v/v的正丁醇溶液中，定速搅拌处理3次，每次6h，最后一次脱脂结束后用纯化水将正丁醇清除完全，取动物胎盘组织沉淀；
除杂：将脱脂处理后的动物胎盘组织沉淀浸泡于0.5M的氢氧化钠溶液，定速搅拌处理1h后用纯化水将氢氧化钠清除完全，取动物胎盘组织沉淀；
酶切：将完成除杂处理后的动物胎盘组织沉淀置于0.5M含胃蛋白酶的醋酸溶液中定速搅拌48h后获得动物胶原蛋白混合物；
盐析：将动物胶原蛋白混合物pH调节至10.0，在搅拌条件下缓慢添加氯化钠固体至浓度为1.0M对所获得的动物胶原蛋白混合物进行盐析；
脱盐：将盐析得到的沉淀在醋酸溶液中复溶至均一溶液后用醋酸溶液和纯化水交替透析得到Ⅲ型胶原蛋白的水溶液。
所有实验操作温度均不高于25℃。
对比例1
胎盘组织预处理：取牦牛胎盘组织切块，通过纯化水水浸泡洗涤去除表面残留杂质，处理为更小组织碎片备用；
脱细胞：将预处理后所得动物胎盘组织浸泡在20％的NaCl溶液中定速搅拌过夜；用纯化水将NaCl清除完全后，再将动物胎盘组织于0.1％醋酸洗必泰(双氯苯双胍己烷)溶液中定速搅拌处理1h，取动物胎盘组织沉淀；用纯化水将醋酸洗必泰清除完全后，再将动物胎盘组织浸泡于5％过氧化氢中定速搅拌处理60min，用纯化水将过氧化氢清除完全，取动物胎盘组织沉淀；
脱脂：将脱细胞处理后的动物胎盘组织沉淀浸泡于新配制的10％v/v的正丁醇溶液中，定速搅拌处理3次，每次6h，最后一次脱脂结束后用纯化水将正丁醇清除完全，取动物胎盘组织沉淀；
除杂：将脱脂处理后的动物胎盘组织沉淀浸泡于0.5M的氢氧化钠溶液，定速搅拌处理1h后用纯化水将氢氧化钠清除完全，取动物胎盘组织沉淀；
酶切：将完成除杂处理后的动物胎盘组织沉淀置于0.5M含胃蛋白酶的醋酸溶液中定速搅拌48h后获得动物胶原蛋白混合物；
盐析：将动物胶原蛋白混合物pH调节至7.0，在搅拌条件下缓慢添加氯化钠固体至浓度为1.5M对所获得的动物胶原蛋白混合物进行盐析；
脱盐：将盐析得到的沉淀在醋酸溶液中复溶至均一溶液后用醋酸溶液和纯化水交替透析得到胶原蛋白水溶液。
所有实验操作温度均不高于25℃。
对比例2
胎盘组织预处理：取牦牛胎盘组织切块，通过纯化水水浸泡洗涤去除表面残留杂质，处理为更小组织碎片备用；
脱细胞：将预处理后所得动物胎盘组织浸泡在20％的NaCl溶液中定速搅拌过夜；用纯化水将NaCl清除完全后，再将动物胎盘组织于0.1％醋酸洗必泰(双氯苯双胍己烷)溶液中定速搅拌处理1h，取动物胎盘组织沉淀；用纯化水将醋酸洗必泰清除完全后，再将动物胎盘组织浸泡于5％过氧化氢中定速搅拌处理60min，用纯化水将过氧化氢清除完全，取动物胎盘组织沉淀；
脱脂：将脱细胞处理后的动物胎盘组织沉淀浸泡于新配制的10％v/v的正丁醇溶液中，定速搅拌处理3次，每次6h，最后一次脱脂结束后用纯化水将正丁醇清除完全，取动物胎盘组织沉淀；
除杂：将脱脂处理后的动物胎盘组织沉淀浸泡于0.5M的氢氧化钠溶液，定速搅拌处理1h后用纯化水将氢氧化钠清除完全，取动物胎盘组织沉淀；
酶切：将完成除杂处理后的动物胎盘组织沉淀置于0.5M含胃蛋白酶的醋酸溶液中定速搅拌48h后获得动物胶原蛋白混合物；
盐析：将动物胶原蛋白混合物pH调节至10.0，在搅拌条件下缓慢添加氯化钠固体至浓度为2.0M对所获得的动物胶原蛋白混合物进行盐析；
脱盐：将盐析得到的沉淀在醋酸溶液中复溶至均一溶液后用醋酸溶液和纯化水交替透析得到胶原蛋白水溶液。
所有实验操作温度均不高于25℃。
实施例4、Ⅲ型胶原蛋白的质量评价
1.SDS-PAGE凝胶电泳实验
取实施例与对比例条件制备的Ⅲ型胶原蛋白进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
图1为实施例1-3制备得到的Ⅲ型胶原蛋白电泳图，从图中可知，制备得到的产物分子量均分布在100KDa附近，仅有一条条带为α1(Ⅲ)带，符合典型的Ⅲ型胶原蛋白特征；在整个泳道低分子量处无其他条带，表明在提取过程中Ⅲ型胶原蛋白未发生降解。
图2为对比例1-2制备得到的胶原蛋白电泳图，从图中可知，利用对比例1、对比例2方法制备的胶原蛋白为胶原蛋白混合物，在100KDa附近从上到下分布有α1(Ⅲ)，α1(Ⅰ)和α2(Ⅰ)三条条带，说明对比例1、对比例2制备得到的胶原蛋白为Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白混合物。
2.圆二色谱
圆二色谱是用于表征蛋白质二级结构的常用方法，也是确定胶原蛋白特征三螺旋结构的常用方法。胶原蛋白的圆二色谱通过配备有温度控制器的圆二色谱仪测定。制备浓度为1mg/mL的Ⅲ型胶原蛋白储备液，在测定之前，样品在4℃平衡24小时以上。
实施例3制备的Ⅲ型胶原蛋白的圆二色谱结果如图3所示，Ⅲ型胶原蛋白在225nm处具有正峰，表明其具有胶原蛋白特征性的三重螺旋结构。
3.热变曲线
热稳定性是表征胶原蛋白稳定性和特征三股螺旋结构的方法，通过检测其在圆二色谱正峰处的特征CD峰值随温度梯度变化的变化值来表征Ⅲ型胶原蛋白的热变曲线。对于动物胶原蛋白，具体测定条件为：温度范围：4℃-20℃，升温速率：1℃/min,温度范围：20℃-50℃，升温速率：0.3℃/min,温度范围：50℃-60℃，升温速率：1℃/min,平衡时间为2min。
图4所示为实施例3制备的Ⅲ型胶原蛋白的热变曲线图，其热变温度为：40℃，与动物胶原蛋白的特征相符。
4.SEM测定
利用Hitachi S-4800扫描电子显微镜(Hitachi Limited，Japan)以5.0kV的操作电压表征Ⅲ型胶原蛋白的形貌。
实施例3制备的Ⅲ型胶原蛋白SEM结果如图5所示，表明本发明所得到的Ⅲ型胶原蛋白具有天然胶原蛋白特征性的纤维网状结构。
5.TEM测定
利用Talos F200S透射电子显微镜(FEI,America)进行TEM测定。将用于透射电镜制样的铜网平铺在滤纸上，在铜网上滴加15μL的胶原蛋白样品溶液，待1min后继续在上面滴加15μL的2％乙酸双氧铀溶液对样品进行着色，等待1min后吸干铜网上水分，在30℃烘箱中干燥后置于室温下干燥至少6小时等待测试，在200kV下记录TEM图像。
实施例3制备的Ⅲ型胶原蛋白TEM结果如图6所示，表明本发明所得到的Ⅲ型胶原蛋白具有天然胶原蛋白特征性的周期性明暗条带。
6.内毒素含量测定
参照Ⅰ型胶原蛋白内毒素检测工艺，对本发明实施例制备的Ⅲ型胶原蛋白的内毒素含量进行测定，具体检测方法为：采用ToxinSensorTM显色法LAL内毒素检测试剂盒，并按试剂盒说明书所述的方法，对Ⅲ型胶原蛋白的内毒素含量进行测定，该测定方法灵敏可靠。医药行业标准规定Ⅲ型胶原蛋白中内毒素的含量应低于0.5Eu/mL。本发明实施例制备的得到的Ⅲ型胶原蛋白中内毒素含量结果如表1所示，实施例1、实施例2、实施例3制备得到的胶原蛋白其内毒素含量均低于0.5EU/mL,符合行业标准要求。
表1
7.纯度测定
参照I型胶原蛋白纯度的检测方法(DB44/T 2080-2017)，本发明使用SDS-PAGE来检测Ⅲ型胶原蛋白的纯度。利用特异性的胶原酶对Ⅲ型胶原蛋白进行酶解，而后检测样品中没有被胶原酶消解的杂蛋白的含量；同时检测实验方法的染色灵敏度，确定杂蛋白的检测下限。通过ImageJ软件处理SDS-PAGE结果，从而确定Ⅲ型胶原蛋白的纯度。
具体检测方法为：通过SDS-PAGE对Ⅲ型胶原蛋白，胶原酶处理后的Ⅲ型胶原蛋白、胶原酶进行表征；将脱色后的胶片在影像分析系统中进行扫描，计算分子量大于100kDa的条带密度，Ⅲ型胶原蛋白样品结果为A，胶原酶处理后的Ⅲ型胶原蛋白样品结果为B，胶原酶样品结果为C，各密度以％表示。杂蛋白含量计算：a)当B-C＝0时，样品中胶原蛋白纯度(％)：(10000-BSA极限净值)/10000×100％；b)当B-C≠0时，样品中胶原蛋白纯度(％)＝A-(B-C)。在本实验条件下，考马斯亮蓝对BSA的染色极限能达到100ng，含量在0.5％以上的杂蛋白均能被测定。
胶原蛋白纯度测定结果如表2所示，实施例1、实施例2、实施例3制备得到的胶原蛋白其纯度均大于95％，对比例1、对比例2得到的胶原蛋白为胶原蛋白混合物，纯度无法达到Ⅲ型胶原蛋白95％的纯度标准。
表2
8.非变性检测
参照专利2020100021713所述多肽探针FAM-(GPO)8检测实施例及对比例制备的II型胶原蛋白是否发生变性。检测原理：多肽探针FAM-(GPO)8可以特异性结合变性胶原蛋白，而完全不结合具有完整三螺旋结构的未变性胶原蛋白。胶原蛋白变性程度越严重，检测得到的荧光强度越强。
具体检测方法：在具有高结合能力的96孔酶标板中加入实施例3制备得到的样品溶液，在4℃环境下放置吸附过夜后，吸干样品溶液；用PBS缓冲溶液洗涤三次酶标板，3min/次；加入1％牛血清白蛋白溶液进行封闭，4℃封闭1h后，按上述方法洗涤；随后加入20μM的荧光多肽探针FAM-(GPO)8，4℃孵育4h，使其与变性胶原蛋白特异性结合；按上述方法洗板，5min/次。使用Infinite M200多功能酶标仪检测荧光强度，每次测量重复三次。
实施例3所述Ⅲ型胶原蛋白的检测结果如图7所示，未经过加热处理的实施例3制备的胶原蛋白荧光强度很弱，而通过100℃加热20Min条件处理的Ⅲ型胶原蛋白荧光强度显著增加，表明通过实施例3得到的Ⅲ型胶原蛋白具有完整的三螺旋结构，未发生变性，而加热处理的Ⅲ型胶原蛋白发生了严重变性。
综上所述，本发明提供了一种医用级Ⅲ型胶原蛋白的制备方法，在碱性条件下，对含有Ⅲ型胶原蛋白的动物胶原蛋白混合物进行盐析，只通过一步盐析，即可制备得到高纯度的Ⅲ型胶原蛋白；本发明所述的制备方法，条件温和、绿色安全、步骤简单、易于操作、周期短、成本低，适于规模化制备。本发明制备得到的Ⅲ型胶原蛋白，纯度达到95％以上，保持良好的三螺旋结构以及特征性的纤维形貌，为非变性Ⅲ型胶原蛋白。本发明制备得到的Ⅲ型胶原蛋白，内毒素含量低于0.5Eu/mL，达到医用标准；可应用于活性护肤品、皮肤修复敷料、植入剂、人工皮肤、医疗器械、保健食品等领域。
Claims (12)
1.一种从动物组织中提取制备Ⅲ型胶原蛋白的方法，其特征在于，制备方法为：在碱性条件下，对含有Ⅲ型胶原蛋白的动物胶原蛋白混合物进行盐析，得到高纯度Ⅲ型胶原蛋白。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，盐析条件：pH为：8.5-10.0，盐浓度为：0.1-1.5M。
3.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述动物组织为动物胎盘。
4.一种Ⅲ型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：动物胎盘组织预处理、脱细胞、脱脂、除杂、酶切、盐析纯化、脱盐浓缩，所述的盐析方法为：在碱性条件下对含有Ⅲ型胶原蛋白的动物胶原蛋白混合物进行盐析，盐析条件：pH为：8.5-10.0，盐浓度为：0.1-1.5M。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的脱细胞方法为：用酸溶液，和/或盐溶液，和/或缓冲溶液，和/或表面活性剂，和/或过氧化物溶液处理动物胎盘组织；所述脱脂方法为：用正丁醇，和/或氯仿-甲醇溶液，和/或氯仿-甲醇-水溶液，和/或乙醚，和/或正己烷，和/或丙酮，和/或乙醇-正己烷溶液，和/或乙醇溶液，和/或表面活性剂处理动物胎盘组织；所述除杂方法为：用氢氧化钠溶液，和/或氢氧化钾溶液处理动物胎盘。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)动物胎盘预处理：将动物胎盘切碎为小块，在纯化水中洗涤除去杂质和组织外血液残留；
(2)脱细胞：通过定速搅拌的方法在容器中依次利用NaCl溶液、表面活性剂溶液和过氧化物溶液对预处理后的动物胎盘进行脱细胞处理；
(3)脱脂：通过定速搅拌的方法在新配制的浓度为5％-30％v/v的正丁醇溶液中处理脱细胞处理后的动物胎盘碎片3-5次，每次6-18h；
(4)除杂：通过定速搅拌的方法在0.01-2.0M的氢氧化钠溶液中对脱脂后的动物胎盘碎片0.5-72h进行杂蛋白去除处理；
(5)酶切：采用酶切法提取经过除杂处理后的动物胎盘中的胶原蛋白，获得动物胶原蛋白混合物；
(6)盐析：将动物胶原蛋白混合物pH调节至碱性条件，对动物胶原蛋白混合物进行盐析，获得Ⅲ型胶原蛋白沉淀；
(7)脱盐、浓缩：采用超滤、透析和凝胶色谱方法中的一种或者几种任意组合，对得到的Ⅲ型胶原蛋白溶液进行脱盐和浓缩处理。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中用浓度为5-30％m/v的NaCl溶液浸泡过夜；用纯化水冲洗至无残留后用浓度为0.1-2％v/v的表面活性剂浸泡处理0.5-6h；再次用纯化水冲洗后用浓度为3-10％v/v的过氧化物溶液浸泡处理30-60min。
8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述表面活性剂包括SDS/TritonX-100、Na2EDTA、双氯苯双胍己烷、苯扎氯铵/十二烷基二甲基苄基氯化铵、苯扎溴铵中的任一种；所述过氧化物包括过氧化氢、过氧乙酸中的任一种。
9.一种医用级Ⅲ型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法为：将权利要求4-8任一所述方法制备获得的Ⅲ型胶原蛋白在温度不高于25℃下进行辐射灭菌处理，即得。
10.一种根据权利要求9所述的方法制备得到的医用级Ⅲ型胶原蛋白。
11.一种医用级Ⅲ型胶原蛋白，其特征在于，所述医用级Ⅲ型胶原蛋白中包括95％以上的Ⅲ型胶原蛋白，所述医用级Ⅲ型胶原蛋白内毒素低于0.5Eu/mL。
12.如权利要求10或11所述的医用级Ⅲ型胶原蛋白在制备活性护肤品、皮肤修复敷料、植入剂、人工皮肤、医疗器械、保健食品中的应用。
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Citations (4)
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| CN113527466A (zh) * | 2021-04-13 | 2021-10-22 | 甘肃天际生物科技有限公司 | 一种植入级ⅱ型胶原蛋白的制备方法 |
-
2022
- 2022-07-24 CN CN202210874082.7A patent/CN115572328A/zh active Pending
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