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CN110331155B - 携带2型BVDV-Erns基因的高繁殖力猪瘟弱毒标记疫苗的构建方法 - Google Patents

携带2型BVDV-Erns基因的高繁殖力猪瘟弱毒标记疫苗的构建方法 Download PDF

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CN110331155B CN201910551632.XA CN201910551632A CN110331155B CN 110331155 B CN110331155 B CN 110331155B CN 201910551632 A CN201910551632 A CN 201910551632A CN 110331155 B CN110331155 B CN 110331155B
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Abstract

本发明涉及生物技术领域，旨在提供一种携带2型BVDV‑Erns基因的高繁殖力猪瘟弱毒标记疫苗的构建方法。本发明利用分子克隆及反向遗传方法，将BVDV2‑890#毒株的Erns基因和CSFV流行毒株QZ14的E2基因VR1区置换CSFV‑C株相应的基因片段，并引入7个特定的突变位点，得到了重组病毒rC‑Marker2。获得的重组病毒带有分子标记(BVDV2 Erns)，猪瘟病毒2型流行毒株的VR1以及特定的突变位点，为开发适应体外细胞培养体系的标记疫苗奠定了基础。应用该技术构建的重组嵌合猪瘟病毒弱毒标记疫苗株，能够通过血清学方法判断猪瘟病毒抗体阳性的猪是由于疫苗接种还是野毒感染引起；对当前流行的基因2型猪瘟病毒有较好的中和效果；在体外细胞培养系统中表现出良好的生长能力，可以降低疫苗的生产成本。

Description

携带2型BVDV-Erns基因的高繁殖力猪瘟弱毒标记疫苗的构建 方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种携带2型牛病毒性腹泻病毒Erns基因的高繁殖力猪瘟弱毒标记疫苗的构建方法。
背景技术
猪瘟是我国规定的必须通报的一类传染病，严重威胁养猪业的健康发展。猪瘟是一种高度接触传染性、致死性疫病。急性猪瘟表现为病程短、高热稽留、全身泛发性点状出血及脾梗死等。慢性猪瘟多表现为仔猪发育迟缓，母猪流产、死胎、产弱子，剖检可见回盲肠袢出现纽扣状溃疡等。猪瘟是由猪瘟病毒(CSFV)引起，CSFV因为疫苗免疫压力下不断演化，导致该病毒仍在东欧、亚洲、拉丁美洲等地区流行。猪瘟病毒呈二十面体结构，直径约40-60nm。由最核心的基因组，包裹基因组的衣壳蛋白及外层的囊膜构成。在囊膜上存在三种囊膜糖蛋白，分别为Erns、E1和E2。其中Erns和E2具有诱导中和抗体的能力，可保护猪只免受致死性强毒的攻击。
猪瘟兔化弱毒C株是我国科学家于上世纪50年代研制出的针对猪瘟病毒的疫苗。该疫苗遗传稳定，免疫效果好且对猪只安全，是国内外公认的安全有效的疫苗。但由于它是由猪瘟强毒在兔体内长期传代获得，其细胞嗜性发生改变，导致其在用猪细胞系培养时不能产生较高的滴度，在一定程度上制约了C株细胞苗的生产效率和效益。浙江大学研究小组在前期试验中发现，向C株基因组引入8个特定的突变位点，可显著提高其在猪细胞系中的繁殖能力。
CSFV只有一个血清型，但由于病毒的不断演化，目前根据E2蛋白的编码序列可将其分为三个基因型，分别为基因1型、2型和3型。猪瘟兔化弱毒C株属于基因1型。近几十年来，在疫苗的免疫压力下，猪瘟流行毒株出现了从引起急性猪瘟的基因1型向温和型的基因2型演化的趋势。C株免疫血清虽对基因2型流行毒株有中和能力，但相比对传统的基因1型毒株，其对2型流行毒株的中和能力已明显减弱。这就导致部分养殖场虽免疫了C株，但猪群中依然存在隐性带毒或出现非典型猪瘟的现象，这也是CSFV难以被净化的一个重要原因。浙江大学研究小组在对E2蛋白抗原表位的分析中发现，E2蛋白的抗原表位存在三个高变区(Hypervariable Antigenic Region)，分别为VR1(aa702-731)、VR2(aa774-799)和VR3(aa841-864)。其中将C株E2的VR1置换为2型毒株的VR1后，嵌合病毒诱导的血清对2型流行毒株的中和能力显著提高。
目前我国对猪瘟的防控是采取C株疫苗免疫。C株虽有良好的免疫效果，但无法通过血清学的方法来判定CSFV抗体阳性血清是由于疫苗免疫还是野毒感染引起，这就对猪瘟的快速诊断及净化造成困扰。因此，改造及开发具有鉴别诊断能力的新型猪瘟弱毒疫苗对猪瘟的防控及净化具有重要意义。牛病毒性腹泻病毒(BVDV)与猪瘟病毒同属黄病毒科瘟病毒属成员，其囊膜糖蛋白与猪瘟病毒的囊膜糖蛋白有较高相似度，但又有所区别。近十几年，欧盟多个实验室联合开发出以BVDV CP7株为骨架嵌合猪瘟病毒Alfort-187株E2蛋白的嵌合病毒疫苗CP7-E2alf，并开发出配套的检测体系。但是，由于该病毒骨架为BVDV，且嵌合的猪瘟病毒片段来自欧洲曾经流行的强毒株Alfort-187，若引入可能会有一定的生物安全隐患。因此，开发适合我国猪瘟防控的新型标记弱毒疫苗势在必行。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种携带2型牛病毒性腹泻病毒Erns基因的高繁殖力猪瘟弱毒标记疫苗构建方法。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：
提供一种携带2型BVDV-Erns基因的高繁殖力猪瘟弱毒标记疫苗的构建方法，包括以下步骤：
(1)将GenBank登录号为NC_039237.1的人工合成的BVDV2型毒株890#Erns基因序列并克隆于pUC57，得到重组质粒pUC57-B1Erns；以该重组质粒为模板，PCR扩增其Erns基因片段；
(2)通过一步定向克隆法，将步骤(1)获得的BVDV2-890#株Erns基因片段克隆至CSFV-C株感染性克隆质粒pA-FL22，置换CSFV基因组的Erns片段，得到携带BVDV2型Erns基因的重组CSFV感染性克隆pCSFV-C-B2Erns；
(3)以CSFV基因2型流行毒株QZ14的基因组cDNA为模板，PCR扩增其E2基因的VR1区7-126nt片段；
(4)通过一步定向克隆法，将步骤(3)所获QZ14株的VR1序列克隆至步骤(2)所获得pCSFV-C-B2Erns中，置换CSFV基因组E2基因的VR1片段，得到携带BVDV2型Erns基因和CSFV流行毒株VR1片段的重组CSFV感染性克隆pCSFV-C-B2Erns-VR1；
(5)用带有突变位点的引物，结合一步定向克隆法，将重组病毒基因组上3310位、3433位、3531位、4085位、8286位、10332位和11836位的核苷酸进行突变，得到携带BVDV2型Erns基因和CSFV流行毒株VR1片段以及7个特定突变位点的重组CSFV感染性克隆pCSFV-Cm7-B2Erns-VR1；所述的突变结果为：T3310G、C3433T、G3531T、A4085G、C8286A、A10332G和A11836C，相对应的氨基酸变化为：M979R、A1020V、V1053L、I1237M、L2638I、S3320G和K3821T；
(6)将步骤(5)得到的pCSFV-Cm7-B2Erns-VR1通过酶切线性化，体外转录得到重组嵌合CSFV病毒基因组RNA；
(7)将步骤(6)得到的基因组RNA通过电转导入猪肾细胞PK-15中，经过连续传代得到携带BVDV2型Erns基因和CSFV流行毒株VR1片段以及7个特定突变位点的重组CSFV病毒Cmut7-B2Erns-VR1(以下简称为rC-Marker2)。
本发明中，步骤(1)中所用的引物序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示；步骤(2)中所用的引物序列如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4所示；步骤(3)中所用CSFV流行毒株E2的VR1序列如SEQ ID NO.5所示，所用的引物序列如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.6所示；步骤(4)中所用的引物序列如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.8所示；步骤(5)中所用的引物序列如SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.22所示。
本发明中，还包括对步骤(7)最终所获重组病毒进行遗传稳定性评价：通过对重组病毒进行连续30次传代，并对第1、10、20和30代毒的结构蛋白基因及7个突变位点进行测序，分析其遗传稳定性。
本发明中，还包括对步骤(7)最终所获重组病毒进行生长特性评价，将重组病毒和亲本C株以相同MOI接种PK-15细胞后，通过病毒生长曲线比较，分析重组病毒与亲本C株增殖能力的差异。
本发明中，本发明中，还包括对步骤(7)最终所获重组病毒进行免疫原性评价：将重组病毒接种断奶且母源抗体消失的仔猪，通过检测不同时间点猪血清中E2抗体水平来判断重组病毒的免疫原性；通过比较重组病毒和亲本C株免疫血清中BVDV2-Erns抗体水平差异，分析重组病毒是否适合于后续建立配套的鉴别检测体系。
本发明中，还包括利用步骤(7)最终所获重组病毒进行免疫断奶仔猪获得的抗血清，用于对CSFV2型流行毒株QZ14的中和效价的测定，并通过与C株血清对QZ14株中和效价的差异比较，分析重组病毒免疫是否可增强对CSFV2型毒株的保护能力。
本发明中，还包括对步骤(7)最终所获重组病毒进行安全性评价：将重组病毒接种断奶后且母源抗体消失的仔猪，观察接种后的猪只是否出现体温升高和猪瘟典型症状；对试验猪安乐死后进行剖检，观察各脏器是否出现病变，综合判断该重组病毒对猪是否安全。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)针对猪瘟疫苗生产和防控中的关键问题：缺乏CSFV标记疫苗毒株，无法建立能够区分猪瘟弱毒苗诱导的抗体和野毒感染诱导的抗体的方法；现有疫苗的抗血清对CSFV 2型流行毒株的中和能力较弱；疫苗C株的细胞适应性较差，病毒滴度较低；本发明提供的重组猪瘟弱毒标记疫苗携带分子标记、在猪细胞系中复制能力强、对CSFV基因2型流行毒株中和能力好。
(2)本发明利用分子克隆及反向遗传方法，将BVDV2-890#毒株的Erns基因和CSFV流行毒株QZ14的E2基因VR1区置换CSFV-C株相应的基因片段，并引入7个特定的突变位点，得到了重组病毒rC-Marker2。获得的重组病毒带有分子标记(BVDV2 Erns)，猪瘟病毒2型流行毒株的VR1以及特定的突变位点，为开发适应体外细胞培养体系的标记疫苗奠定了基础。
(3)本发明构建的重组疫苗rC-Marker2株具有以下优点：(1)良好的遗传稳定性。该重组病毒在PK-15细胞中连续传30代后，经过测序验证，其嵌合的BVDV Erns区、嵌合流行毒株QZ14的VR1区以及引入的7个突变位点均未出现回复突变。(2)良好的细胞适应性。该重组病毒在PK-15细胞中的生长能力明显优于亲本C株。(3)良好的免疫原性。接种该重组疫苗的猪可诱导出较高水平的E2抗体。(4)具有鉴别诊断潜能。该重组病毒血清与C株血清对BVDV Erns蛋白的反应性存在差别，表明该重组病毒具有作为标记疫苗的潜能。(5)提高了对CSFV 2型毒株的中和能力。该重组病毒血清对CSFV 2型QZ14株的中和价显著高于C株血清。
(4)应用该技术构建的重组嵌合猪瘟病毒弱毒标记疫苗株，能够通过血清学方法判断猪瘟病毒抗体阳性的猪是由于疫苗接种还是野毒感染引起；相比猪瘟兔化弱毒C株，该病毒对当前流行的基因2型猪瘟病毒有较好的中和效果；在体外细胞培养系统中表现出良好的生长能力，可以降低疫苗的生产成本。
附图说明
图1.以CSFV-C株为骨架，嵌合基因2型BVDV的Erns基因，猪瘟病毒QZ14株E2基因的VR1区以及携带特定7个突变位点的重组病毒Cm7-B2Erns-VR1(简称rC-Marker2)基因组结构示意图。阴影部分代表嵌合的基因区段，星号代表引入的突变位点。
图2.将重组病毒rC-Marker2的基因组RNA通过电转导入PK-15细胞后，利用免疫荧光试验检测重组病毒中E2蛋白的表达情况。A、B和C分别为电转后第1、5和10代病毒，D为第10代病毒上清感染细胞48h后，E2蛋白的表达情况。
图3.重组病毒rC-Marker2与亲本C株以相同MOI接种PK-15细胞后，在不同时间点收样，测定病毒的滴度，计算并绘制病毒生长曲线。
图4.重组病毒rC-Marker2与亲本C株以相同剂量接种7周龄断奶仔猪后，受试动物的体温变化。
图5.为重组病毒rC-Marker2接种7周龄断奶仔猪剖检后，受试动物主要嗜感器官无肉眼可见的病理变化。
图6.为重组病毒rC-Marker2与亲本C株以相同剂量接种7周龄断奶仔猪后，在不同时间点收获的血清与C株E2蛋白的反应性。
图7.为重组病毒rC-Marker2与亲本C株以相同剂量接种7周龄断奶仔猪后，在不同时间点收获的血清与基因2型BVDV Erns蛋白的反应性。
图8.为重组病毒rC-Marker2与其亲本C株的全病毒血清对猪瘟病毒2型毒株QZ14的中和效价差异比较。
具体实施方式
本发明涉及多种生物材料的使用，如无特别说明，均来自现有公知技术或属于市售商品。例如，人工合成的BVDV2型毒株890#Erns基因序列的GenBank登录号为NC_039237.1，CSFV-C株感染性克隆质粒pA-FL22的构建方法见中国发明专利“携带分子标记的猪瘟病毒C株感染性cDNA载体的构建方法”，专利号ZL200910155475.7。
下面参考附图，对本发明进行详细描述。
实施例1：CSFV-C株基因组Erns基因置换为BVDV基因2型毒株890#的Erns基因
根据BVDV2-890#株Erns基因序列(GenBank登录号：NC_039237.1)，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成，得到含有BVDV2-890#株Ern基因序列的质粒pUC57-B2Erns。以质粒pUC57-B2Erns为模板，B2E0-fwd/B2E0-rev为引物进行PCR扩增，得到含有BVDV2-890#株Erns基因序列的片段A。以CSFV-C株感染性克隆重组质粒pA-FL22为模板，pA-B2E0-fwd/pA-B2E0-rev为引物，PCR扩增pA-FL22中除Erns基因片段以外的所有序列(片段B)。扩增片段A和片段B的两对引物中，A片段的上游引物与B片段的下游引物以及A片段的下游引物与B片段的上游引物分别包含20bp的互补序列(表1中下划线所示即为互补序列)。
将片段A和片段B利用一步定向克隆(Vazyme)的方法进行连接，得到重组质粒pCSFV-C-B2Erns，该质粒中原CSFV-C株的Erns基因被置换为BVDV基因2型890#株的Erns基因。
表1：置换BVDV2-890株Erns及CSFV QZ14株E2基因VR1片段所需引物
Figure GDA0003513820620000051
Figure GDA0003513820620000061
实施例2：CSFV-C株E2基因VR1区置换为CSFV流行毒株QZ14的E2基因VR1片段
为获得CSFV流行毒株QZ14的E2基因VR1片段(VR1为E2基因第7-126位核苷酸序列，如序列表中SEQ ID NO.5所示)，以CSFV 2型毒株QZ14的基因组cDNA为模板，VR1-fwd和VR1-rev为引物进行扩增，获得片段C，所用引物序列如表1所示。以重组质粒pCSFV-C-B2Erns为模板，pA-VR1-fwd和pA-VR1-rev为引物，扩增出感染性克隆pCSFV-C-B2Erns中除CSFV-C株E2基因VR1区以外的所有基因组序列，获得片段D。扩增片段C和片段D的两对引物中，C片段的上游引物与D片段的下游引物以及C片段的下游引物与D片段的上游引物分别包含20bp的互补序列(表1中下划线所示即为互补序列)。
利用一步定向克隆的方法，将片段C和片段D进行连接(Vazyme)，得到新的重组质粒pCSFV-C-B2Erns-VR1。该质粒中原CSFV-C株E2基因的VR1片段被置换为CSFV2型流行毒株QZ14的E2基因VR1片段。
实施例3：CSFV-C株基因组上特定的7个位点突变
以重组感染性克隆pCSFV-C-B2Erns-VR1为模板，通过7对携带突变位点的引物(如表2所示)，利用一步定向克隆的方法，将重组质粒中C株基因组的第3310位、3433位、3531位、4085位、8286位、10332位和11836位的核苷酸进行突变，得到含有7个特定突变位点的感染性克隆pCSFV-Cm7-B2Erns-VR1(图1)。突变结果为T3310G、C3433T、G3531T、A4085G、C8286A、A10332G和A11836C。相对应的氨基酸变化为：M979R、A1020V、V1053L、I1237M、L2638I、S3320G和K3821T。
表2：向C株基因组引入7个突变位点所需引物
Figure GDA0003513820620000071
实施例4：重组病毒rC-Marker2的拯救及鉴定
将500μL含重组质粒pCSFV-Cm7-B2Erns-VR1的大肠杆菌37℃过夜培养菌液接入200mL LB培养基中，同时加入浓度为100mg/mL的Ampicillin 200μL，28℃扩大培养16h。收集菌液后用质粒纯化试剂盒(Promega)提取质粒。测定浓度后，用限制性内切酶XhoI(Takara)将质粒酶切过夜，得到线性化质粒。以纯化后的线性化质粒为模板，利用体外转录试剂盒(Ambion)得到重组病毒基因组RNA。
将长满瓶壁的PK-15细胞消化下来后，用无血清培养基Opti-MEM(Thermo)洗两次。将2μg病毒基因组RNA与2×106个细胞混匀后加入2-mm的电转杯(Bio-rad)中，用电转仪(Gene Pulser Xcell,Bio-rad)进行电转。电转参数：150V，25μF，电阻无穷。电转后用完全培养基将细胞重悬，在37℃5％CO2培养箱中培养48-72h，将细胞进行连续传代，在传代的过程中通过IFA鉴定是否有成熟病毒粒子释放。结果显示，可以检测到荧光信号，且荧光信号随着细胞传代而增多且呈典型的戒指环状(图2，A、B和C)。
为了进一步证明有成熟的子代病毒粒子形成，将带毒传代的细胞进行反复冻融，离心去除细胞碎片后，取上清接种PK-15细胞，72h后进行IFA检测。结果同样可以检测到荧光信号(图2，D)，表明已产生具有感染性的子代病毒粒子，命名为Cm7-B2Erns-VR1(简称rC-Marker2)。
实施例5：重组病毒rC-Marker2遗传稳定性检测。
将rC-Marker2接种PK-15细胞后，将感染重组病毒的细胞带毒连续传30代。期间收集每一代毒液，放于-80℃冰箱保存。将第1、10、20和第30代毒提取RNA(AXYGEN)，反转为cDNA(Vazyme)后，将重组病毒的结构蛋白基因及引入的突变位点进行测序。测序结果显示第1、10、20和第30代毒的结构蛋白区均未出现突变，引入的突变位点也未出现回复突变，表明此重组病毒遗传稳定性良好。
实施例6：重组病毒rC-Marker2生长曲线测定。
PK-15细胞铺24孔板，每孔105个细胞。C株和重组病毒rC-Marker2均以MOI＝0.01接种细胞，每个病毒设置三个重复孔。在接种后的第24h、36h、48h、60h、72h和96h分别收集总的细胞培养物，用以计算各时间点的病毒滴度，绘制病毒生长曲线。结果显示，在接种72h后，rC-Marker2的滴度可达到106.5TCID50/mL，而C株滴度约为105TCID50/mL，表明重组病毒rC-Marker2的生长能力显著强于母本C株(图3)。
实施例7：重组病毒rC-Marker2的免疫原性及安全性评价。
13头猪瘟抗体阴性的猪随机分为三组，A组3头，B组5头，C组5头，分别饲喂在三个独立的房间。A组每头猪颈部肌肉注射DMEM，B组每头猪颈部肌肉注射105TCID50猪瘟兔化弱毒C株，C组每头猪颈部肌肉注射105TCID50 rC-Marker2。期间每天测量体温一次，并对可能出现的症状进行记录评分。在接种后的第0、7、14、21、28和35天对各组猪进行采血，收集全血及血清，用以检测病毒血症及抗体水平。采集鼻拭子及肛拭子，评估重组病毒向环境散毒情况。在第35天试验猪安乐死后进行剖检，观察各主要脏器是否出现病变。
结果：在试验期间各组猪均未出现体温升高(图4)及任何猪瘟典型症状。病毒血症检测结果显示，接种C株及rC-Marker2的猪均未出现明显的病毒血症。每周采集的鼻拭子及肛拭子中未检出猪瘟病毒核酸，表明rC-Marker2没有向环境散毒的风险。接种后第35天的剖检结果显示，各免疫器官及病毒嗜性组织中均未观察到病理变化，表明rC-Marker2的安全性良好(图5)。同时，接种rC-Marker2或C株后收获的血清与C株E2蛋白表现出相似的反应性(图6)，表明rC-Marker2具有良好的免疫原性。而rC-Marker2血清与BVDV 2型Erns蛋白的反应性好于C株血清(图7)，表明rC-Marker2具有血清学鉴别诊断的潜力，可以作为猪瘟标记弱毒疫苗候选株。
实施例8：重组病毒rC-Marker2血清对猪瘟病毒2型毒株的中和能力评价
将rC-Marker2或C株的全病毒血清以4倍梯度稀释后，与等体积的QZ14病毒液(200TCID50)混合，37℃作用1h后，加入已铺好PK-15细胞的96孔板中，每个稀释度6个重复孔。72h后弃去培养基上清，用冷丙酮固定细胞，IFA检测荧光，记录每个血清稀释度的阳性孔数，计算血清中和效价(neutralization titer 50％，NT50)。
结果显示，rC-Marker2组血清对CSFV 2型毒株QZ14的中和效价高于C株血清，表明rC-Marker2可提高针对CSFV基因2型流行毒株的中和能力(图8)。
需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有多种变化形式。本领域的技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变化形式，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 携带2型BVDV-Erns基因的高繁殖力猪瘟弱毒标记疫苗的构建方法
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
tgtaccaacc agttgaagcc gagaatatta cccagtggaa ctt 43
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
acattacagt aaggcgatag tgcatgtgca ccaaaccatg 40
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
ctatcgcctt actgtaatgt aacaagcaag 30
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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ggcttcaact ggttggtaca acataattg 29
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<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
tcctgtaagg aagactacag gtatgcgata tcatcaacca acgagatagg gccgctaggg 60
gctgaaggtc tcaccaccac ttggagagag tatagtcatg gtttgcagct ggatgacggg 120
<210> 6
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
tagtaactgg ggcacaaggc cggctgtcct gtaaggaa 38
<210> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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acgcaactgg ccttgacggt cccgtcatcc agctgcaa 38
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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accgtcaagg ccagttgcgt 20
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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gccttgtgcc ccagttacta gt 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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ggtcctgtaa ggaaaacctc ctgtacattc aactacacaa aaac 44
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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ggaggttttc cttacaggac cagcactaga gacaatct 38
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gacctggatg tgactgaccg ccactcagat tac 33
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gcggtcagtc acatccaggt caaaccagta ctgatact 38
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agtgacctac ttagttttaa cagaacaact cgccgctg 38
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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gttaaaacta agtaggtcac tatcagccac agg 33
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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tgaagggaat gggtgagttg gatttacaca ctccg 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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ccaactcacc cattcccttc agcaccctta ttaaaaagat acc 43
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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tgtataccac atttatggag ttttttataa ggggtgggag g 41
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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actccataaa tgtggtatac aagtctaaga gggttgc 37
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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caagacaata ggctcagtaa tgacagctac tggtatc 37
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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attactgagc ctattgtctt gttatacaca ttgtgtctgt gtcc 44
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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ataggtgtta cagagggcaa ctggctagtc aatg 34
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 23
gttgccctct gtaacaccta tattgacaca gtcttgtagt agtc 44

Claims (2)

1.一种携带2型BVDV-Erns基因的高繁殖力猪瘟弱毒标记疫苗的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将GenBank登录号为NC_039237.1的BVDV2型毒株890#Erns基因序列进行人工合成，并克隆于pUC57，得到重组质粒pUC57-B2Erns；以该重组质粒为模板，PCR扩增其Erns基因片段；
(2)通过一步定向克隆法，将步骤(1)获得的BVDV2-890#株Erns基因片段克隆至CSFV-C株感染性克隆重组质粒pA-FL22，置换CSFV基因组的Erns片段，得到携带BVDV2型Erns基因的重组CSFV感染性克隆pCSFV-C-B2Erns；
(3)以CSFV基因2型流行毒株QZ14的基因组cDNA为模板，PCR扩增其E2基因的VR1区7-126nt片段即VR1片段；所用CSFV流行毒株E2的VR1片段序列如SEQ ID NO.5所示；
(4)通过一步定向克隆法，将步骤(3)所获QZ14株的VR1片段克隆至步骤(2)所获得pCSFV-C-B2Erns中，置换CSFV基因组E2基因的VR1片段，得到携带BVDV2型Erns基因和CSFV流行毒株VR1片段的重组CSFV感染性克隆pCSFV-C-B2Erns-VR1；
(5)用带有突变位点的引物，结合一步定向克隆法，将重组病毒基因组上3310位、3433位、3531位、4085位、8286位、10332位和11836位的核苷酸进行突变，得到携带BVDV2型Erns基因和CSFV流行毒株VR1片段以及7个特定突变位点的重组CSFV感染性克隆pCSFV-Cm7-B2Erns-VR1；所述的突变结果为：T3310G、C3433T、G3531T、A4085G、C8286A、A10332G和A11836C，相对应的氨基酸变化为：M979R、A1020V、V1053L、I1237M、L2638I、S3320G和K3821T；
(6)将步骤(5)得到的pCSFV-Cm7-B2Erns-VR1通过酶切线性化，体外转录得到重组嵌合CSFV病毒基因组RNA；
(7)将步骤(6)得到的基因组RNA通过电转导入猪肾细胞PK-15中，经过连续传代得到携带BVDV2型Erns基因和CSFV流行毒株VR1片段以及7个特定突变位点的重组CSFV病毒Cmut7-B2Erns-VR1。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所用的引物序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示；步骤(2)中所用的引物序列如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4所示；步骤(3)中所用的引物序列如SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.7所示；步骤(4)中所用的引物序列如SEQ ID NO.8～SEQ ID NO.9所示；步骤(5)中所用的引物序列如SEQ ID NO.10～SEQ IDNO.23所示。
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Bovine viral diarrhea virus 2 polyprotein gene, complete cds.;Ridpath,J.F.，等;《Genbank登录号：NC_039237.1》;20180824;参见全文 *

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