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CN112243381B - 抗bcma car抗体、缀合物和使用方法 - Google Patents

抗bcma car抗体、缀合物和使用方法 Download PDF

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CN112243381B
CN112243381B CN201980038615.4A CN201980038615A CN112243381B CN 112243381 B CN112243381 B CN 112243381B CN 201980038615 A CN201980038615 A CN 201980038615A CN 112243381 B CN112243381 B CN 112243381B
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bcma car
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2 Savinti Biology
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Abstract

本发明提供了用于检测T细胞上的抗BCMA CAR表达的经过改进的方法。

Description

抗BCMA CAR抗体、缀合物和使用方法
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2018年6月14日提交的美国临时申请第62/685,043号的权益，所述美国临时申请以全文引用的方式并入本文中。
关于序列表的声明
与本申请相关的序列表以文本格式提供以代替纸质副本，并且在此通过引用并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称是BLBD_099_01WO_ST25.txt。所述文本文件为19KB，于2019年6月14日创建并且在提交本说明书的同时通过EFS-Web以电子方式提交。
技术领域
本发明涉及抗体组合物。更具体地，本发明涉及与抗BCMA CAR结合的抗体和抗原结合片段和其缀合物以及使用其检测抗BCMA CAR T细胞的方法。
背景技术
遗传方法提供了增强免疫识别和消除癌细胞的潜在手段。一种有希望的策略是对免疫效应细胞进行基因工程化，以表达将细胞毒性朝肿瘤细胞重新定向的嵌合抗原受体(CAR)。然而，精确地测量一个或多个过继转移的CAR T细胞上的CAR表达和体内CAR T细胞的持久性很困难，这使测量CAR T细胞活性的尝试变得混乱。评估CAR T细胞最常用的方法是使用CAR特异性引物的定量PCR。然而，这种技术存在不足并且无法对CAR T细胞进行多参数分析。
发明内容
本发明通常提供抗体和其抗原结合片段、其缀合物以及使用其来检测、确定或测量一个或多个T细胞上的CAR+T细胞和/或CAR表达的方法。
在各个实施例中，一种抗体或其抗原结合片段包括一个或多个结合抗BCMA嵌合抗原受体(CAR)的CDR。
在特定实施例中，所述一个或多个CDR结合所述抗BCMA CAR的抗BCMA scFv结构域。
在一些实施例中，三个轻链CDR结合所述抗BCMA CAR的抗BCMA scFv结构域。
在某些实施例中，三个重链CDR结合所述抗BCMA CAR的抗BCMA scFv结构域。
在特定实施例中，三个轻链CDR和三个重链CDR结合所述抗BCMA CAR的抗BCMAscFv结构域。
在某些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段结合SEQ ID NO:25中所示的抗BCMAscFv序列的一个或多个表位。
在特定实施例中，所述抗体或其抗原结合片段是人的。
在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段是人源化的。
在某些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段是鼠类的。
在特定实施例中，所述抗体或其抗原结合片段是嵌合的。
在某些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段是单克隆的。
在某些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段是抗原结合片段。
在特定实施例中，所述抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：Fab'片段、F(ab')2片段、双特异性Fab二聚体(Fab2)、三特异性Fab三聚体(Fab3)、Fv、单链Fv蛋白(“scFv”)、双-scFv、(scFv)2、微抗体、双抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)和单结构域抗体(sdAb，纳米抗体)。
在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段是scFv。
在各个实施例中，一种抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:1-3中所示的CDRL1-CDRL3序列的可变轻链和包含SEQ ID NO:4-6中所示的CDRH1-CDRH3序列的可变重链。
在另外的实施例中，抗体或其抗原结合片段包括SEQ ID NO:7中所示的可变轻链序列。
在特定实施例中，抗体或其抗原结合片段包括SEQ ID NO:8中所示的可变重链序列。
在另外的实施例中，抗体或其抗原结合片段包括SEQ ID NO:7中所示的可变轻链序列和SEQ ID NO:8中所示的可变重链序列。
在各个实施例中，一种抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:9-11中所示的CDRL1-CDRL3序列的可变轻链和包含SEQ ID NO:12-14中所示的CDRH1-CDRH3序列的可变重链。
在某些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括SEQ ID NO:15中所示的可变轻链序列。
在特定实施例中，抗体或其抗原结合片段包括SEQ ID NO:16中所示的可变重链序列。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括SEQ ID NO:15中所示的可变轻链序列和SEQ ID NO:16中所示的可变重链序列。
在各个实施例中，一种抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:17-19中所示的CDRL1-CDRL3序列的可变轻链和包含SEQ ID NO:20-22中所示的CDRH1-CDRH3序列的可变重链。
在特定实施例中，抗体或其抗原结合片段包括SEQ ID NO:23中所示的可变轻链序列。
在某些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括SEQ ID NO:24中所示的可变重链序列。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括SEQ ID NO:23中所示的可变轻链序列和SEQ ID NO:24中所示的可变重链序列。
在特定实施例中，抗体或其抗原结合片段是人的。
在某些实施例中，抗体或其抗原结合片段是人源化的。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段是鼠类的。
在某些实施例中，抗体或其抗原结合片段是嵌合的。
在特定实施例中，抗体或其抗原结合片段是单克隆的。
在某些实施例中，抗体或其抗原结合片段是抗原结合片段。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：Fab'片段、F(ab')2片段、双特异性Fab二聚体(Fab2)、三特异性Fab三聚体(Fab3)、Fv、单链Fv蛋白(“scFv”)、双-scFv、(scFv)2、微抗体、双抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)和单结构域抗体(sdAb，纳米抗体)。
在某些实施例中，抗体或其抗原结合片段是scFv。
在某些实施例中，抗体或其抗原结合片段结合SEQ ID NO:25中所示的抗BCMAscFv序列的一个或多个表位。
在各个实施例中，一种缀合物包括本文所设想的抗体或其抗原结合片段以及用于检测的装置。
在各个实施例中，一种缀合物包括本文所设想的抗体或其抗原结合片段以及检测装置。
在各个实施例中，一种缀合物包括本文所设想的抗体或其抗原结合片段以及可检测标记。
在一些实施例中，所述可检测标记选自由以下组成的组：半抗原、荧光染料、荧光蛋白、发色团、金属离子、金颗粒、银颗粒、磁性颗粒、多肽、酶、发光化合物或寡核苷酸。
在特定实施例中，所述可检测标记是选自由以下组成的组的荧光染料：OregonPacific BlueTM、Pacific OrangeTM、Pacific GreenTM、Cascade BlueTM、CascadeYellowTM、Lucifer YellowTM、Marina BlueTM和Texas (TxRed)。
在某些实施例中，所述可检测标记是选自由以下组成的组的(AF)染料：AF350、AF405、AF488、AF500、AF514、AF532、AF546、AF555、AF568、AF594、AF610、AF633、AF635、AF647、AF680、AF700、AF710、AF750、AF790和AF800。
在一些实施例中，所述可检测标记是选自由以下组成的组的 525、565、585、605、655、705和800。
在特定实施例中，所述可检测标记是选自由以下组成的组的DyLightTM染料(DL)：DL549、DL649、DL680和DL800。
在某些实施例中，所述可检测标记是选自由以下组成的组的半抗原：荧光素或其衍生物、异硫氰酸荧光素、羧基荧光素、二氯三嗪基胺荧光素、地高辛、二硝基苯酚(DNP)、三硝基苯酚(TNP)和生物素。
在特定实施例中，所述可检测标记是选自由以下组成的组的Cy染料：Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7和Cy7.5。
在一些实施例中，所述可检测标记是选自由以下组成的组的荧光分子：藻红蛋白(PE，R-藻红蛋白(RPE))、B-藻红蛋白(BPE)、多甲藻素叶绿素(PerCP)、别藻蓝蛋白(APC)和C-藻蓝蛋白。
在特定实施例中，所述可检测标记是选自由以下组成的组的荧光染料：Atto 390、Atto 425、Atto 465、Atto 488、Atto 495、Atto 514Atto 520、Atto 532、Atto 550、Atto565、Atto 590、Atto 594、Atto 610、Atto 620、Atto 633、Atto 647、Atto 655、Atto 665、Atto680、Atto 700、Atto 725、Atto 740、Super BrightTM436、Super BrightTM600、SuperBrightTM645、Super BrightTM702、Super BrightTM780、BrilliantTMViolet 421、BrilliantTMViolet 480、BrilliantTMViolet 510、BrilliantTMViolet 605、BrilliantVioletTM650、Brilliant VioletTM711、Brilliant VioletTM786、BrilliantTMUltraviolet395(BUV395)、BrilliantTMUltraviolet 496(BUV496)、BrilliantTMUltraviolet 563(BUV563)、BrilliantTMUltraviolet 661(BUV661)、BrilliantTMUltraviolet 737(BUV737)、BrilliantTMUltraviolet 805(BUV805)、BrilliantTMBlue 515(BB515)、BrilliantTMBlue 700(BB700)以及IR染料680、IR染料680LT、IR染料700、IR染料700DX、IR染料800、IR染料800RS和IR染料800CW。
在某些实施例中，所述可检测标记是选自由以下组成的组的串联荧光染料：RPE-Cy5、RPE-Cy5.5、RPE-Cy7、RPE-CF594、串联缀合物；RPE-Alexa610、RPE-TxRed、APC-H7、APC-R700、APC-Alexa600、APC-Alexa610、APC-Alexa750、APC-Cy5、APC-Cy5.5和APC-Cy7。
在某些实施例中，所述可检测标记是选自由以下组成的组的荧光蛋白：GFP、eGFP、BFP、CFP、YFP、DsRed、DsRed2、mRFP、mBanana、mOrange、dTomato、tdTomato、mTangerine、mStrawberry、mCherry、mPlum和mRaspberry。
在特定实施例中，所述可检测标记是选自由以下组成的组的酶：碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、萤光素酶和β-半乳糖苷酶。
在某些实施例中，所述可检测标记是选自由以下组成的组的放射性核素：碳(14C)、铬(51Cr)、钴(57Co)、氟(18F)、钆(153Gd，159Gd)、锗(68Ge)、钬(166Ho)、铟(115In，113In，112In，mIn)、碘(125I，123I，121I)、镧(140La)、镥(177Lu)、锰(54Mn)、钼(99Mo)、钯(103Pd)、磷(32P)、镨(142Pr)、钷(149Pm)、铼(186Re，188Re)、铑(105Rh)、钌(97Ru)、钐(153Sm)、钪(47Sc)、硒(75Se)、(85Sr)、硫(35S)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、锡(113Sn，117Sn)、氚(3H)、氙(133Xe)、镱(169Yb，175Yb)和钇(90Y)。
在各个实施例中，一种多核苷酸对所设想的抗体或其抗原结合片段进行编码。
在某些实施例中，一种宿主细胞包括本文所设想的抗体或其抗原结合片段或多核苷酸。
在一些实施例中，一种组合物包括本文所设想的抗体或其抗原结合片段、缀合物、多核苷酸或宿主细胞。
在各个实施例中，一种产生抗体或其抗原结合片段的方法包括：在宿主细胞中表达本文所设想的抗体或其抗原结合片段；以及回收或分离所述抗体。
在某些实施例中，一种试剂盒包括本文所设想的抗体或其抗原结合片段或缀合物以及使用说明。
在特定实施例中，一种检测T细胞上的抗BCMA CAR的表达的方法包括：使T细胞与本文所设想的抗体或其抗原结合片段或缀合物接触；以及检测抗体:抗BCMA CAR复合物的形成。
在各个实施例中，一种检测T细胞群体中的抗BCMA CAR的表达的方法包括：使T细胞群体与本文所设想的抗体或其抗原结合片段或缀合物接触；以及检测所述一个或多个T细胞上的抗体:抗BCMA CAR复合物的形成。
在某些实施例中，一种确定T细胞上的抗BCMA CAR的表达的方法包括：使T细胞与本文所设想的抗体或其抗原结合片段或缀合物接触；检测抗体:抗BCMA CAR复合物的形成；以及测量所述复合物的量以确定所述T细胞上的所述抗BCMA CAR的表达。
在特定实施例中，一种确定T细胞群体中的抗BCMA CAR的表达的方法包括：使T细胞群体与本文所设想的抗体或其抗原结合片段或缀合物接触；检测一个或多个T细胞上的抗体:抗BCMA CAR复合物的形成；以及测量所述复合物的量以确定所述一个或多个T细胞上的所述抗BCMA CAR的表达。
在各个实施例中，一种确定T细胞群体中的抗BCMA CAR+T细胞的数量的方法包括：使T细胞群体与本文所设想的抗体或其抗原结合片段、缀合物接触；检测一个或多个T细胞上的抗体:抗BCMA CAR复合物的形成；以及枚举表达所述抗BCMA CAR的所述T细胞。
在一些实施例中，免疫组织化学、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫吸附测定、化学发光测定、电化学发光测定、基于表面等离子体共振(SPR)的生物传感器(例如，BIAcore)、荧光显微法或流式细胞术、荧光活化细胞分选(FACS)用于检测所述抗体:抗BCMA CAR复合物的形成。
在某些实施例中，免疫组织化学、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫吸附测定、化学发光测定、电化学发光测定、基于表面等离子体共振(SPR)的生物传感器(例如，BIAcore)、荧光显微法或流式细胞术、荧光活化细胞分选(FACS)用于测量所述抗体:抗BCMA CAR复合物的量。
在特定实施例中，免疫组织化学、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫吸附测定、化学发光测定、电化学发光测定、基于表面等离子体共振(SPR)的生物传感器(例如，BIAcore)、荧光显微法或流式细胞术、荧光活化细胞分选(FACS)用于枚举表达所述抗BCMA CAR的所述T细胞。
附图说明
图1示出了与包括抗BCMA CAR(SEQ ID NO:25)的T细胞群体结合的抗BCMA CAR抗体的代表性FACs图。
序列标识符简要说明
SEQ ID NO:1-3示出了结合抗BCMA CAR的抗体的示例性轻链CDR序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4-6示出了结合抗BCMA CAR的抗体的示例性重链CDR序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7示出了结合抗BCMA CAR的抗体的示例性轻链序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8示出了结合抗BCMA CAR的抗体的示例性重链序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9-11示出了结合抗BCMA CAR的抗体的示例性轻链CDR序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:12-14示出了结合抗BCMA CAR的抗体的示例性重链CDR序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:15示出了结合抗BCMA CAR的抗体的示例性轻链序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:16示出了结合抗BCMA CAR的抗体的示例性重链序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:17-19示出了结合抗BCMA CAR的抗体的示例性轻链CDR序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:20-22示出了结合抗BCMA CAR的抗体的示例性重链CDR序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:23示出了结合抗BCMA CAR的抗体的示例性轻链序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:24示出了结合抗BCMA CAR的抗体的示例性重链序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:25示出了被包括SEQ ID NO:1-24中所示的序列的抗体结合的抗BCMACAR的氨基酸序列。
SEQ ID NO:26-36示出了各种接头的氨基酸序列。
具体实施方式
A.概述
本发明总体上涉及结合抗BCMA嵌合抗原受体(CAR)的抗体和抗原结合片段和其缀合物、组合物和使用其的方法。在特别优选的实施例中，本发明涉及结合SEQ ID NO:25中所示的抗BCMA CAR的抗体、片段和缀合物、组合物和其用途。
BCMA是肿瘤坏死因子受体超家族的成员(参见例如Thompson等人,《实验医学杂志(J.Exp.Medicine)》,192(1):129-135,2000；以及Mackay等人,《免疫学年度评论(Annu.Rev.Immunol)》,21:231-264,2003)。BCMA结合B细胞活化因子(BAFF)和增殖诱导配体(APRIL)(参见例如Mackay等人,2003；以及Kalled等人,《免疫学评论(ImmunologicalReviews)》,204:43-54,2005)。在非恶性细胞中，据报告BCMA大部分表达在浆细胞和成熟B细胞的子集中(参见例如Laabi等人,《欧洲分子生物学组织杂志(EMBO J.)》,77(1):3897-3904,1992；Laabi等人,《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》,22(7):1147-1154,1994；Kalled等人,2005；O'Connor等人,《实验医学杂志》，199(1):91-97,2004；以及Ng等人,《免疫学杂志(J.Immunol.)》,73(2):807-817,2004。缺乏BCMA的小鼠是健康的并且具有正常数量的B细胞，但长寿命浆细胞的存活受损(参见例如O'Connor等人,2004；Xu等人,《分子与细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》,21(12):4067-4074,2001；以及Schiemann等人,《科学(Science)》,293(5537):2111-2114,2001)。已经在多发性骨髓瘤细胞和其它淋巴瘤中普遍检测到BCMA RNA，并且已经由多名研究者在多发性骨髓瘤患者的浆细胞表面上检测到BCMA蛋白(参见例如Novak等人,《血液(Blood)》,103(2):689-694,2004；Neri等人,《临床癌症研究(Clinical Cancer Research)》,73(19):5903-5909,2007；Bellucci等人,《血液》,105(10):3945-3950,2005；以及Moreaux等人,《血液》,703(8):3148-3157,2004。
抗BCMA CAR为患有多发性骨髓瘤或B细胞淋巴瘤的受试者提供潜在治愈性的一次性疗法。用于关联抗BCMA CAR表达和活性的现有方法是次优的并且需要改进。使用现有方法，难以精确地关联体内和体外的抗BCMA CAR表达和活性两者和追踪患者中抗BCMA CAR T细胞存活率和持久性。本文所设想的结合抗BCMA CAR的抗体、片段和缀合物、组合物和相关的使用方法为这些和其它问题提供了解决方案。
在各个实施例中，提供了结合抗BCMA抗体或其部分的抗体或其抗原结合片段。在特定实施例中，抗体或其抗原结合片段可以进一步包括一种或多种可检测标记。
本文还公开了使用抗体和其抗原结合片段、其缀合物和相关组合物的方法。
重组(即，工程化)DNA、肽和寡核苷酸合成、免疫测定、组织培养、转化(例如，电穿孔、脂质转染)、酶促反应、纯化及相关技术和程序的技术通常可以如在本说明书全文中引用和讨论的如在微生物学、分子生物学、生物化学、分子遗传学、细胞生物学、病毒学和免疫学中的各种一般性和更具体参考文献中所描述的那样进行。参见例如Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,第3版,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),冷泉港(Cold Spring Harbor),纽约；《当代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》(约翰·威利父子出版公司(Wiley and Sons),2008年7月更新)；《精编分子生物学实验指南：当代分子生物学实验指南的方法概要(Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium ofMethods from Current Protocols in Molecular Biology)》,格林出版协会和威利跨学科出版社(Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience)；Glover,《DNA克隆：实用方法(DNA Cloning:A Practical Approach)》,第I卷和第II卷(IRL出版社(IRL Press),美国牛津大学出版社(Oxford Univ.Press USA),1985)；《当前免疫学方案(CurrentProtocolsin Immunology)》(由纽约州纽约市约翰·威立父子公司的John E.Coligan、AdaM.Kruisbeek、David H.Margulies、Ethan M.Shevach、Warren Strober 2001编辑)；《实时PCR：当前技术和应用(Real-Time PCR:Current Technology and Applications)》,由Julie Logan、Kirstin Edwards和Nick Saunders编辑,2009,英国诺福克凯斯特学术出版社(Caister Academic Press,Norfolk,UK)；Anand,《复杂基因组分析技术(Techniquesfor the Analysis of Complex Genomes)》,(学术出版社公司(Academic Press),纽约,1992)；Guthrie和Fink,《酵母遗传学和分子生物学指南(Guide to Yeast Genetics andMolecular Biology)》,(学术出版社公司,纽约,1991)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(N.Gait编辑,1984)；《核酸杂交(Nucleic Acid The Hybridization)》(B.Hames和S.Higgins编辑,1985)；《转录和转译(Transcription and Translation)》(B.Hames和S.Higgins编辑,1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.Freshney编辑,1986)；Perbal,《分子克隆实用指南(A Practical Guide to Molecular Cloning)》(1984)；《下一代基因组测序(Next-Generation Genome Sequencing)》(Janitz,2008Wiley-VCH)；《PCR方案(分子生物学方法)(PCR Protocols(Methods in MolecularBiology))》(Park编辑,第3版,2010,胡马纳出版社(Humana Press))；《固定化细胞和酶(Immobilized Cells And Enzymes)》(IRL出版社,1986)；论文《酶学方法(Methods InEnzymology)》(学术出版社公司,纽约)；《哺乳动物细胞基因转移载体(Gene TransferVectors For Mammalian Cells)》(J.H.Miller和M.P.Calos编辑,1987,冷泉港实验室出版社)；Harlow和Lane,《抗体(Antibodies)》,(冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约,1998)；《细胞和分子生物学中的免疫化学方法(Immunochemical Methods In Cell And MolecularBiology)》(Mayer和Walker编辑,学术出版社公司,伦敦,1987)；《实验免疫学手册(Handbook Of Experimental Immunology)》,第I卷到第IV卷(D.M.Weir和CC Blackwell编辑,1986)；Roitt,《基础免疫学(Essential Immunology)》,第6版,(布莱克韦尔科学出版社(Blackwell Scientific Publications,),牛津,1988)；《当代免疫学方案》(Q.E.Coligan、A.M.Kruisbeek、D.H.Margulies、E.M.Shevach和W.Strober编辑,1991)；《免疫学年度评论(Annual Review of Immunology)》；以及《免疫学进展(Advances in Immunology)》等期刊上的专著。
B.定义
在更详细地阐述本公开之前，对本发明的理解可能有助于提供本文所使用的某些术语的定义。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管类似于或等效于本文所描述的方法和材料的任何方法和材料可以用于实践或测试特定实施例，但本文描述了组合物、方法和材料的优选实施例。出于本公开的目的，以下术语定义如下。贯穿本公开阐述了额外定义。
本文中使用冠词“一个/种(a/an)”和“所述(the)”是指一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种或一个/种或多个/种)所述冠词的语法宾语。举例来说，“要素”意指一个要素或者一个或多个要素。
替代方案(例如，“或”)的使用应该理解为意指替代方案中的一个、两个或其任何组合。
术语“和/或”应该理解为意指替代方案中的一种或两种。
如本文所使用的，术语“约(about)”或“大约(approximately)”是指与参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相比，变化幅度高达15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。在一个实施例中，术语“约”或“大约”指代参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的±15％、±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。
贯穿本说明书，除非上下文另有要求，否则词语“包括(comprise)”、“包括(comprises)”和“包括(comprising)”将被理解为暗示包含所陈述的步骤或元件或步骤或元件组，但不排除任何其它步骤或元件或步骤或元件组。“由……组成”意指包含并且限于，无论在短语“由……组成”之后是什么。因此，短语“由……组成”指示所列出的要素是必需的或强制性的，并且可以不存在其它要素。“基本上由……组成”意指包含在所述短语之后所列出的任何要素，并且限于不干扰或促进本公开中针对所列元素指定的活动或行为的其它要素。因此，短语“基本上由……组成”指示所列要素是必需的或强制性的，但不存在实质上影响所列要素的活动或动作的其它要素。
贯穿本说明书对“一个实施例(one embodiment)”、“一个实施例(anembodiment)”、“特定实施例”、“相关实施例”、“某个实施例”、“另外的实施例”或“进一步实施例”或其组合的引用意味着与实施例组合地描述的特定特征、结构或特性包含在本发明的至少一个实施例中。因此，上述短语在贯穿本说明书的各个地方的出现不一定全部是指同一个实施例。此外，在一个或多个实施例中，可以以任何适合的方式组合特定特征、结构或特性。还应理解的是，在一个实施例中对特征的肯定叙述充当在特定实施例中排除所述特征的基础。
C.抗体
在特定实施例中，提供了结合抗BCMA CAR的抗体或其抗原结合片段。
术语“抗体”是指属于包括至少轻链或重链免疫珠蛋白可变区或其片段的多肽的结合剂，所述轻链或重链免疫珠蛋白可变区或其片段特异性地识别和结合抗原的一个或多个表位，如肽、脂质、多糖或含有抗原决定簇的核酸，如通过免疫细胞识别的那些。
“表位”或“抗原决定簇”是指结合剂结合的抗原的区。表位可以由连续氨基酸或通过蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸两者形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。在独特的空间构象中，表位通常包含至少3个并且更常见地至少5个、约9个或约8-10个氨基酸。
“分离的抗体或其抗原结合片段”是指已经从其天然环境的组分中鉴定和分离和/或回收的抗体或其抗原结合片段。
如本文所使用的，术语“特异性结合亲和力”或“特异性地结合”或“特异性地结合的”或“特异性结合”或“特异性靶向”描述了抗体或其抗原结合片段以比背景结合更大的结合亲和力与抗BCMA CAR结合。如果抗体或其抗原结合片段以例如大于或等于约105M-1的亲和力或Ka(即，特定结合相互作用的以1/M为单位的平衡缔合常数)与抗BCMA CAR结合或缔合，则所述抗体或其抗原结合片段与抗BCMA CAR“特异性地结合”。在某些实施例中，抗体或其抗原结合片段以大于或等于约106M-1、107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1、1012M-1或1013M-1的Ka与抗BCMA CAR结合。“高亲和力”抗体或其抗原结合片段的Ka为至少107M-1、至少108M-1、至少109M-1、至少1010M-1、至少1011M-1、至少1012M-1、至少1013M-1或更大。
可替代地，亲和力可以被定义为特定结合相互作用的以M为单位的平衡解离常数(Kd)(例如，10-5M到10-13M或更小)。本文所设想的抗体或其抗原结合片段的亲和力可以使用常规技术容易地确定，例如通过竞争性ELISA(酶联免疫吸附测定)、或通过结合缔合、或使用经过标记的配体的置换测定、或使用如可从新泽西州皮斯卡塔韦Biacore公司(Biacore,Inc.,Piscataway,NJ)获得的Biacore T100等表面等离子体共振装置、或如分别可从康宁(Corning)和珀金埃尔默(Perkin Elmer)获得的EPIC系统或EnSpire等光学生物传感器技术(还参见例如Scatchard等人,(1949)《纽约科学学术年报(Ann.N.Y.Acad.Sci)》51:660；以及美国专利第5,283,173号；第5,468,614号或等效物)。
在一个实施例中，特异性结合的亲和力是背景结合的约2倍、背景结合的约5倍、背景结合的约10倍、背景结合的约20倍、背景结合的约50倍、背景结合的约100倍、或者背景结合的约1000倍或更多倍。
“抗原(Ag)”是指可以在动物中刺激抗体产生或T细胞应答的化合物、组合物或物质，包含注射或吸收到动物内的组合物(如包含癌症特异性蛋白的组合物)。抗原与具有特定体液或细胞免疫的产物反应，包含由如公开的抗原等异源抗原诱导的产物。在特定实施例中，靶抗原包括抗BCMA CAR。
抗体包含其抗原结合片段，如骆驼Ig、Ig NAR、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、双特异性Fab二聚体(Fab2)、三特异性Fab三聚体(Fab3)、Fv、单链Fv蛋白(“scFv”)、双-scFv、(scFv)2、微抗体、双抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)和单结构域抗体(sdAb，纳米抗体)以及全长抗体的负责抗原结合的部分。所述术语还包含基因工程化形式，如嵌合抗体(例如，人源化鼠类抗体)、异源缀合抗体(如双特异性抗体)及其抗原结合片段。还参见《皮尔斯目录和手册(Pierce Catalog and Handbook)》,1994-1995(伊利诺伊州罗克福德市皮尔斯化学公司(Pierce Chemical Co.,Rockford,IL))；Kuby,《免疫学期刊(J.,Immunology)》,第3版,W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman&Co.),纽约,1997。
如本领域的技术人员所理解的并且如本文中其它地方所描述的，完全抗体包括两条重链和两条轻链。每条重链由可变区以及第一、第二和第三恒定区组成，而每条轻链由可变区和恒定区组成。哺乳动物重链被分类为α、δ、ε、γ和μ。哺乳动物轻链被分类为λ或κ。包括α、δ、ε、γ和μ重链的免疫珠蛋白被分类为免疫珠蛋白(Ig)A、IgD、IgE、IgG和IgM。完全抗体形成“Y”形状。Y的主干(stem)由结合在一起的两条重链的第二恒定区和第三恒定区(和对于IgE和IgM，第四恒定区)组成，并且(链间)二硫键在铰链中形成。重链γ、α和δ具有由三个串联的(在一条线上)Ig结构域构成的恒定区和用于增加柔性的铰链区；重链μ和ε具有由四个免疫珠蛋白结构域构成的恒定区。第二恒定区和第三恒定区分别被称为“CH2结构域”和“CH3结构域”。Y的每个臂包含单条重链的与单个轻链的可变区和恒定区结合的可变区和第一恒定区。轻链和重链的可变区负责抗原结合。
轻链和重链可变区包含被三个高变区中断的“框架”区，也被称为“互补决定区”或“CDR”。CDR可以通过常规方法定义或鉴别，如根据Kabat等人通过序列(Wu,TT和Kabat,E.A.,《实验医学杂志》132(2):211-50,(1970)；Borden,P.和Kabat E.A.,《美国国家科学院院刊(PNAS)》,84:2440-2443(1987)；(参见Kabat等人,《免疫学关注的蛋白序列(Sequencesof Proteins of Immunological Interest)》,美国卫生与公共事业部(U.S.Departmentof Health and Human Services),1991，其通过引用在此并入)或根据Chothia等人通过结构(Chothia,C.和Lesk,A.M.,《分子生物学杂志(J Mol.Biol.)》,196(4):901-917(1987)；Chothia,C.等人,《自然(Nature)》,342:877-883(1989))。
用于预测轻链CDR的规则的说明性实例包含：CDR-L1在约第24个残基处开始，在Cys之后，是约10-17个残基并且随后是Trp(通常是Trp-Tyr-Gln，还可以是Trp-Leu-Gln、Trp-Phe-Gln、Trp-Tyr-Leu)；CDR-L2在CDR-L1结束后约16个残基处开始，通常在Ile-Tyr还有Val-Tyr、Ile-Lys、Ile-Phe之后并且是7个残基；并且CDR-L3在CDR-L2结束后约33个残基处开始，在Cys之后，是7-11个残基并且随后是Phe-Gly-XXX-Gly(SEQ ID NO:37)(XXX是任何氨基酸)。
用于预测重链CDR的规则的说明性实例包含：CDR-H1在约第26个残基处开始，在Cys-XXX-XXX-XXX(SEQ ID NO:38)之后，是10-12个残基并且随后是Trp(通常是Trp-Val，也可以说Trp-Ile、Trp-Ala)；CDR-H2在CDR-H1结束后约15个残基处开始，通常在Leu-Glu-Trp-Ile-Gly(SEQ ID NO:39)或多个变型之后，是16-19个残基并且随后是Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala；并且CDR-H3在CDR-H2结束后约33个残基处开始，在Cys-XXX-XXX(通常是Cys-Ala-Arg)之后，是3到25个残基并且随后是Trp-Gly-XXX-Gly(SEQ ID NO:40)。
在一个实施例中，轻链CDR和重链CDR根据Kabat法确定。
在一个实施例中，轻链CDR以及重链CDR2和CDR3根据Kabat法确定，并且重链CDR1根据AbM法确定，所述AbM法是Kabat法与Clothia方法之间的折衷方案，参见例如WhiteleggN.和Rees AR,《蛋白质工程(Protein Eng)》2000年12月,13(12):819-24以及《分子生物学方法(Methods Mol Biol.)》2004；248:51-91。用于预测CDR的程序是公开可获得的，例如，AbYsis(www.bioinf.org.uk/abysis/)。
不同轻链或重链的框架区的序列在物种如人内是相对保守的。抗体的属于构成性轻链和重链的组合框架区的框架区用于在三维空间中定位和排列CDR。CDR主要负责与抗原的一个或多个表位结合。每条链的CDR通常被称为从N末端开始顺序地编号的CDR1、CDR2和CDR3并且通常还通过特定CDR所在的链来鉴定。因此，位于抗体的重链的可变结构域中的CDR被称为CDRH1、CDRH2和CDRH3，而位于抗体的轻链的可变结构域中的CDR被称为CDRL1、CDRL2和CDRL3。具有不同特异性的抗体(即，针对不同抗原具有不同组合位点)具有不同的CDR。尽管正是CDR因抗体的不同而有所不同，但是CDR内仅有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。CDR内的这些位置被称为特异性决定残基(SDR)。轻链CDR的说明性实例包含SEQID NO:1-3、9-11和17-19中所示的CDR序列。重链CDR的说明性实例包含SEQ ID NO:4-6、12-14和20-22中所示的CDR序列。
如本文所公开的，提及“VL”或“VL”是指免疫珠蛋白轻链的可变区，包含抗体、Fv、scFv、dsFv、Fab或其它抗体片段的可变区。轻链可变区的说明性实例包含SEQ ID NO:7、15和23中所示的轻链可变区序列。
如本文所公开的，提及“VH”或“VH”是指免疫珠蛋白重链的可变区，包含抗体、Fv、scFv、dsFv、Fab或其它抗体片段的可变区。重链可变区的说明性实例包含SEQ ID NO:8、16和24中所示的重链可变区序列。
“单克隆抗体”是通过B淋巴细胞的单个克隆或通过单个抗体的轻链和重链基因已经转染到的细胞产生的抗体。单克隆抗体通过本领域技术人员已知的方法产生，例如通过根据骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合制造杂合抗体形成细胞。单克隆抗体包含人源化单克隆抗体。
“嵌合抗体”具有来自一个物种如人的框架残基和来自另一个物种如小鼠的CDR(所述CDR通常赋予了抗原结合)。在特定的优选实施例中，抗体包括是嵌合抗体或其抗原结合片段的抗原特异性结合结构域。
在特定实施例中，抗体是人抗体(如人单克隆抗体)或其片段。如上所述，人抗体可以通过将选自人源性噬菌体展示文库的一个或多个Fv克隆可变结构域序列与一个或多个已知的人恒定结构域序列组合来构建。可替代地，可以通过杂交瘤方法制备人单克隆抗体。用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系已经例如通过以下进行了描述：Kozbor,《免疫学期刊》,133:3001(1984)；Brodeur等人,《单克隆抗体生产技术与应用(Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications)》,第51-63页(马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker,Inc),纽约,1987)；以及Boerner等人,《免疫学期刊》,147:86(1991)。另外，转基因动物(例如，小鼠)可以用于在不存在内源免疫珠蛋白产生的情况下产生完整人抗体库。参见例如Jakobovits等人,《美国国家科学院院刊》,90:2551(1993)；Jakobovits等人,《自然》,362:255(1993)；Bruggermann等人,《免疫学年度(Yearin Immunol.)》,7:33(1993)。基因改组也可以用于从非人例如啮齿动物抗体获得人抗体，其中所述人抗体具有与起始非人抗体类似的亲和力和特异性。(参见1993年4月1日公开的PCT WO 93/06213)。与通过CDR接枝使非人抗体常规人源化不同，这一技术提供了不具有非人源FR或CDR残基的完全人抗体。
在一个实施例中，抗体是“人源化”抗体。人源化抗体是包含人框架区和来自非人(例如，小鼠、大鼠或合成)免疫珠蛋白的一个或多个CDR的免疫珠蛋白。提供CDR的非人免疫珠蛋白被称为“供体”，并且提供框架的人免疫珠蛋白被称为“受体”。在一个实施例中，所有CDR均来自人源化免疫珠蛋白中的供体免疫珠蛋白。不需要存在恒定区，但如果存在的话，则恒定区必须与人免疫珠蛋白恒定区基本上相同，即，至少约85-90％如约95％或更多相同。因此，除了可能的CDR之外，人源化免疫珠蛋白的所有部分均与天然人免疫珠蛋白序列的对应部分基本上相同。人源化或其它单克隆抗体可以具有另外的保守氨基酸取代，所述保守氨基酸取代对抗原结合或其它免疫珠蛋白功能基本上没有影响。人源化抗体可以通过基因工程构建(参见例如美国专利第5,585,089号)。
在特定实施例中，结合抗BCMA CAR的抗体或其抗原结合片段包含但不限于骆驼Ig(骆驼科抗体(VHH))、Ig NAR、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、双特异性Fab二聚体(Fab2)、三特异性Fab三聚体(Fab3)、Fv、单链Fv抗体(“scFv”)、双-scFv、(scFv)2、微抗体、双抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)以及单结构域抗体(sdAb，纳米抗体)。
如本文所使用的，“骆驼Ig”或“骆驼科动物VHH”是指重链抗体的最小已知抗原结合单位(Koch-Nolte等人,《FASEB期刊(FASEB J.)》,21:3490-3498(2007))。“重链抗体”或“骆驼科动物抗体”指代包含两个VH结构域并且不含轻链的抗体(Riechmann L.等人,《免疫学方法期刊(J.Immunol.Methods)》231:25-38(1999)；WO 94/04678；WO 94/25591；美国专利号6,005,079。
“免疫珠蛋白新抗原受体”的“IgNAR”是指来自鲨鱼免疫库的抗体类别，其由一个可变新抗原受体(VNAR)结构域和五个恒定新抗原受体(CNAR)结构域的同源二聚体组成。IgNAR表示已知的最小的基于免疫珠蛋白的蛋白质支架中的一些并且高度稳定并且具有高效结合特性。固有的稳定性可以归因于以下两者：(i)基础Ig支架，所述基础Ig支架与鼠类抗体中发现的常规抗体VH和VL结构域相比呈现出相当数量的带电和亲水表面暴露残基；以及(ii)使互补决定区(CDR)环路中的结构特征稳定，所述结构特征包含环间二硫键和环内氢键模式。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生了两个相同的抗原结合片段，被称为“Fab”片段和残留的“Fc”片段，所述Fab片段各自具有单个抗原结合位点，所述Fc片段的名称反映了其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理得到具有两个抗原组合位点并且仍然能够交联抗原的F(ab')2片段。
“Fv”是包含完全抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施例中，双链Fv物种由呈紧密非共价缔合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在单链Fv(scFv)物种中，一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域可以通过柔性肽接头共价连接，从而使得轻链和重链可以缔合成与双链Fv物种中二聚体结构类似的“二聚体”结构。正是在这种构造中，每个可变结构域的三个高变区(HVR)相互作用以限定VH-VL二聚体的表面上的抗原结合位点。六个HVR共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单可变结构域(或仅包括对抗原具有特异性的三个HVR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管以比完整结合位点更低的亲和力进行。
Fab片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域并且还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸的重链CH1结构域的羧基末端加入几个残基。Fab'-SH是本文中对Fab'的命名，其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基携带游离硫醇基。F(ab')2抗体片段最初是作为其间具有铰链半胱氨酸的Fab'片段对产生的。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。双特异性Fab二聚体(Fab2)具有两个Fab'片段，每个片段结合不同的抗原。三特异性Fab三聚体(Fab3)具有三个Fab'片段，每个片段结合不同的抗原。
术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的抗体片段，所述片段包括与同一条多肽链(VH-VL)中的轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短以至于不允许在同一条链上的两个结构域之间配对的接头，结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合位点。双抗体可以是二价的或双特异性的。双抗体更全面地描述于例如以下中：EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人,《自然医学(Nat.Med.)》,9:129-134(2003)；以及Hollinger等人,《美国国家科学院院刊》90:6444-6448(1993)。三抗体和四抗体还被描述于Hudson等人,《自然医学》,9:129-134(2003)中。
“单结构域抗体”或“sdAb”或“纳米抗体”是指由抗体重链的可变区(VH结构域)或抗体轻链的可变区(VL结构域)组成的抗体片段(Holt,L.等人,《生物技术趋势(Trends inBiotechnology)》,21(11):484-490)。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包括抗体的VH结构域和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中并且处于任何朝向(例如，VL-VH或VH-VL)。通常，scFv多肽进一步包括使scFv能够形成用于抗原结合的期望结构的在VH结构域与VL结构域之间的多肽接头。关于scFv的综述，参见Pluckthün,《单克隆抗体药理学(The Pharmacology of MonoclonalAntibodies)》,第113卷,Rosenburg和Moore编,(施普林格出版社(Springer Verlag),纽约,1994),第269-315页。
在特定实施例中，抗原结合片段是scFv。在特定实施例中，scFv是鼠类、人或人源化scFv。单链抗体可以克隆自针对期望靶标具有特异性的杂交瘤的V区基因。这种杂交瘤的产生已经变得常规。可以用于克隆可变区重链(VH)和可变区轻链(VL)的技术已经描述于例如Orlandi等人,《美国国家科学院院刊》,1989；86:3833-3837。
在各个实施例中，与抗BCMA CAR结合的抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ IDNO:1-3、9-11或17-19中所示的CDRL1-CDRL3序列的可变轻链序列和/或包含SEQ ID NO:4-6、12-14或20-22中所示的CDRH1-CDRH3序列的可变重链序列。
在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:7、15或23中的任何一个所示的可变轻链序列和/或如SEQ ID NO:8、16或24中的任何一个所示的可变重链序列。在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括与SEQ ID NO:7、15或23中的任何一个所示的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸同一性的可变轻链序列和/或与SEQ ID NO:8、16或24中的任何一个所示的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸同一性的可变重链序列。
在一个实施例中，与抗BCMA CAR结合的抗体或其抗原结合片段包括SEQ ID NO:1-3、9-11或17-19中所示的轻链CDR序列。在特定实施例中，与抗BCMA CAR的抗BCMA抗体或抗体片段或抗BCMA scFv部分结合的抗体或其抗原结合片段包括与SEQ ID NO:1-3、9-11或17-19中所示的轻链CDR序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸同一性的轻链CDR序列。
在一个实施例中，与抗BCMA CAR结合的抗体或其抗原结合片段包括SEQ ID NO:4-6、12-14或20-22中所示的重链CDR序列。在特定实施例中，与抗BCMA CAR结合的抗体或其抗原结合片段包括与SEQ ID NO:4-6、12-14或20-22中所示的重链CDR序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸同一性的重链CDR序列。
在特定实施例中，与抗BCMA CAR结合的抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:1-3中的任一个所示的一个或多个轻链CDR和/或如SEQ ID NO:4-6中的任一个所示的一个或多个重链CDR。在某些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:7中所示的可变轻链序列和/或如SEQ ID NO:8中所示的可变重链序列。
在一些实施例中，与抗BCMA CAR结合的抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:9-11中的任一个所示的一个或多个轻链CDR和/或如SEQ ID NO:12-14中的任一个所示的一个或多个重链CDR。在另外的实施例中，抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:15中所示的可变轻链序列和/或如SEQ ID NO:16中所示的可变重链序列。
在另外的实施例中，与抗BCMA CAR结合的抗体或其抗原结合片段包括如SEQ IDNO:17-19中的任一个所示的一个或多个轻链CDR和/或如SEQ ID NO:20-22中的任一个所示的一个或多个重链CDR。在特定实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:23中所示的可变轻链序列和/或如SEQ ID NO:24中所示的可变重链序列。
在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括结合SEQ ID NO:25中所示的抗BCMA CAR的可变轻链序列和/或可变重链序列。
D.缀合物
在各个实施例中，提供了一种缀合物，其包括抗体或其抗原结合片段以及标记。在优选的实施例中，一种缀合物包括结合抗BCMA CAR的抗体或其抗原结合片段以及可检测标记或能够产生可检测信号的标记。在更优选的实施例中，一种缀合物包括结合抗BCMA CAR、与可检测标记偶联的抗体或其抗原结合片段。在甚至更优选的实施例中，一种缀合物包括结合抗BCMA CAR、与可检测标记共价结合或与可检测标记化学偶联的抗体或其抗原结合片段。
如本文所使用的，术语“标记”是指可检测标记或能够产生可检测信号的标记。在特定实施例中，标记包括放射性核素、核酸、小分子或多肽。在一些实施例中，标记是直接可检测的。在一些实施例中，标记是间接可检测的。
适合于在特定实施例中设想的缀合物中使用的可检测标记的说明性实例包含但不限于：半抗原、荧光分子、荧光染料、荧光蛋白、发色团、金属离子、金颗粒、银颗粒、磁性颗粒、放射性核素、多肽、酶、发光化合物或寡核苷酸。
适合于在特定实施例中作为可检测标记使用的分子的说明性实例包含但不限于：OregonPacific BlueTM；Pacific OrangeTM；Pacific GreenTM；Cascade BlueTM；Cascade YellowTM；Lucifer YellowTM；Marina BlueTM；Texas(TxRed)；(AF)染料，例如AF350、AF405、AF488、AF500、AF514、AF532、AF546、AF555、AF568、AF594、AF610、AF633、AF635、AF647、AF680、AF700、AF710、AF750、AF790和AF800；纳米晶体，例如525、565、585、605、655、705和800；DyLightTM染料(DL)，例如DL549、DL649、DL680和DL800；荧光素或其衍生物，例如异硫氰酸荧光素、羧基荧光素和二氯三嗪基胺荧光素；地高辛；二硝基苯酚(DNP)；三硝基苯酚(TNP)；生物素；Cy染料，例如Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7和Cy7.5；藻红蛋白(PE，R-藻红蛋白(RPE))；B-藻红蛋白(BPE)；多甲藻素叶绿素(PerCP)；别藻蓝蛋白(APC)；以及C-藻蓝蛋白；染料，例如Atto 390、Atto 425、Atto 465、Atto 488、Atto 495、Atto 514、Atto520、Atto532、Atto 550、Atto 565、Atto 590、Atto 594、Atto 610、Atto 620、Atto 633、Atto 647、Atto 655、Atto 665、Atto 680、Atto 700、Atto 725和Atto 740；Super BrightTM染料，例如Super BrightTM436、Super BrightTM600、Super BrightTM645、Super BrightTM702和Super BrightTM780；BrilliantTM染料，例如BrilliantTMViolet 421、BrilliantTMViolet480、BrilliantTMViolet 510、BrilliantTMViolet 605、Brilliant VioletTM650、BrilliantVioletTM711、Brilliant VioletTM786、BrilliantTMUltraviolet 395(BUV395)、BrilliantTMUltraviolet 496(BUV496)、BrilliantTMUltraviolet 563(BUV563)、BrilliantTMUltraviolet 661(BUV661)、BrilliantTMUltraviolet 737(BUV737)、BrilliantTMUltraviolet 805(BUV805)、BrilliantTMBlue 515(BB515)和BrilliantTMBlue700(BB700)；以及IR染料，例如IR染料680、IR染料680LT、IR染料700、IR染料700DX、IR染料800、IR染料800RS和IR染料800CW。
适合于作为可检测标记使用的串联荧光染料分子的说明性实例包含但不限于：RPE-Cy5、RPE-Cy5.5、RPE-Cy7、RPE-CF594、串联缀合物；RPE-Alexa610、RPE-TxRed、APC-H7、APC-R700、APC-Alexa600、APC-Alexa610、APC-Alexa750、APC-Cy5、APC-Cy5.5和APC-Cy7。
适合于作为可检测标记使用的荧光蛋白的说明性实例包含但不限于：GFP、eGFP、BFP、CFP、YFP、DsRed、DsRed2、mRFP、mBanana、mOrange、dTomato、tdTomato、mTangerine、mStrawberry、mCherry、mPlum和mRaspberry。
适合于作为可检测标记使用的酶的说明性实例包含但不限于：碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、萤光素酶和β-半乳糖苷酶。
适合于作为可检测标记使用的放射性核素的说明性实例包含但不限于：碳(14C)、铬(51Cr)、钴(57Co)、氟(18F)、钆(153Gd，159Gd)、锗(68Ge)、钬(166Ho)、铟(115In，113In，112In，mIn)、碘(125I，123I，121I)、镧(140La)、镥(177Lu)、锰(54Mn)、钼(99Mo)、钯(103Pd)、磷(32P)、镨(142Pr)、钷(149Pm)、铼(186Re，188Re)、铑(105Rh)、钌(97Ru)、钐(153Sm)、钪(47Sc)、硒(75Se)、(85Sr)、硫(35S)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、锡(113Sn，117Sn)、氚(3H)、氙(133Xe)、镱(169Yb，175Yb)和钇(90Y)。
在特定实施例中，一种缀合物包括与一个或多个标记缀合、偶联或连接(例如，共价结合)的抗体或抗体片段。在某些实施例中，标记可以直接或间接(例如，通过接头基团)与抗体或片段缀合、偶联或连接。当抗体和标记各自具有能够彼此反应的取代基时，抗体可以直接共价结合到一个或多个标记。例如，一个多肽上的亲核基团(如氨基或巯基)可以能够与另一个多肽上的含羰基的基团(如酸酐或酰卤)或含有良好离去基团的烷基(例如，卤化物)反应。
在特定实施例中，可以期望通过单价接头或多价接头或间隔子将抗体或抗体片段与一个或多个标记偶联、缀合或连接。可以使用接头或间隔子在抗体与标记之间提供足够的距离，以避免空间位阻或干扰抗体结合能力。本领域的技术人员将显而易见的是，可以采用多种双功能或多功能试剂，包括同功能和异功能试剂(如在伊利诺伊州罗克福德市皮尔斯化学公司(Pierce Chemical Co.,Rockford,IL)的目录中描述的试剂)作为接头基团。偶联可以例如通过氨基、羧基、巯基或氧化的碳水化合物残基而受到影响。有许多参考文献描述了这种方法，例如，Rodwell等人的美国专利第4,671,958号。
在某些实施例中，接头可以具有约1到100个原子、1到80个原子、1到60个原子、1到40个原子、1到30个原子、1到20个原子、或1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个原子的总链长，其中链中的原子包括C、S、N、P和O。
可用于本发明的特定实施例中的接头或连接的说明性实例包含但不限于以下中的一个或多个：-C(O)-、-NH-C(O)-、-C(O)-NH-、-C(O)-NH-(CH2)2-6-NH-C(O)-、-NH-(CH2)2-6-NH-C(O)-、-三唑-(CH2)2-6-NH-C(O)-、-S-(CH2)2-6-NH-C(O)-、-S-(CH2)0-6-CH(CONH2)-(CH2)0-6-NH-C(O)-、-S-(CH2)0-6-CH(CONH-PEG)-(CH2)0-6-NH-C(O)-、-S-S-(CH2)2-6-NH-C(O)-、-S-S-(CH2)0-6-CH(CONH2)-(CH2)0-6-NH-C(O)-、-S-S-(CH2)0-6-CH(CONH-PEG)-(CH2)0-6-NH-C(O)-、-NH-(CH2)0-6-CH(CONH-PEG)-(CH2)0-6-NH-C(O)-、-NH-(CH2)0-6-CH(CONH2)-(CH2)0-6-NH-C(O)-、-C＝N-O-(CH2)2-6-NH-C(O)-、-C＝N-NH-(CO)-(CH2)2-6-NH-C(O)-、-琥珀酰亚胺-(CH2)2-6-NH-C(O)-、-二偶氮二甲酰胺-(苯基)-J-(CH2)2-6-NH-C(O)-(J是O、CH2、NH、S、NH(CO)、(CO)NH、-NH-(CH2)2-6-、(CH2)1-6-NH-C(O)-NH-(CH2)2-6-、-C(S)-(CH2)0-6-、-(CH2)1-6-C(O)-NH-(CH2)2-6-、-(CH2)1-6-NH-C(O)-(CH2)2-6-、-(CH2)1-6-O-C(O)-NH-(CH2)2-6-、-(CH2)1-6-NH-C(O)-O-(CH2)2-6-、(CH2)1-6-NH-(CH2)2-6、(CH2)1-6-C(O-(CH2)2-6-、支链或非支链-C1-C16-烷基、支链或非支链-C1-C16-烷基，其中碳原子中的一个碳原子可以任选地被杂原子取代)、R2-NH-(CH2)2-6-NH-C(O)-、R2-S-(CH2)2-6-NH-C(O)-、R2-三唑-(CH2)2-6-NH-C(O)-、R2-NH-O-(CH2)2-6-NH-C(O)-，R2＝N-NH-(CO)-(CH2)2-6-NH-C(O)-，R2是选自由以下组成的组的一个到三个双官能或三官能的经过取代的交联有机基团：烷基、经过取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、聚乙二醇(PEG)[即，-(CH2CH2O)1-20]。
在特定实施例中，一种缀合物包括通过下文中本文其它地方所设想的多肽接头与基于多肽的标记(例如，荧光蛋白或酶)共价结合的抗体或抗体片段。
在优选的实施例中，一种缀合物包括与抗BCMA CAR结合、与PE标记共价结合的抗体或其抗原结合片段。
E.多肽
本文设想了各种多肽、融合多肽和多肽变体，包含但不限于抗体及其抗原结合片段。在优选的实施例中，一种多肽包括结合抗BCMA CAR的抗体或其抗原结合片段。
除非相反地规定，否则“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，并且根据常规含义(即作为氨基酸序列)使用。多肽不限于特定长度，例如，多肽可以包括全长多肽或多肽片段，并且可以包含多肽的一个或多个转译后修饰(例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等)以及本领域已知的天然存在的和非天然存在的其它修饰。
如本文所使用的，“分离的蛋白质”、“分离的肽”或“分离的多肽”等是指从细胞环境中并且根据与细胞的其它组分的关联进行体外合成、分离和/或纯化而来的肽或多肽分子，即与体内物质没有显著关联。
多肽包含“多肽变体”。多肽变体与天然存在的多肽的不同之处可以在于一个或多个取代、缺失、添加和/或插入。这种变体可以是天然存在的或可以通过合成产生，例如通过修饰上述多肽序列中的一个或多个。例如，在特定实施例中，可以期望通过引入一个或多个氨基酸取代、缺失、添加和/或插入来改进抗体或其抗原结合片段的结合亲和力和/或其它生物性质。在特定实施例中，多肽包含与本文所设想的参考序列中的任何一个有至少约65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、86％、97％、98％或99％氨基酸一致性的多肽，通常其中变体维持参考序列的至少一种生物活性。
多肽包含“多肽片段”。多肽片段指代多肽，所述多肽可以是单体的或多体的、具有天然存在的或重组产生的多肽的氨基末端缺失、羧基末端缺失和/或内部缺失或取代。具有生物活性的多肽片段的说明性实例包含抗体片段。如本文所使用的，术语“生物活性片段”或“最小生物活性片段”是指保留天然存在的多肽活性的至少100％、至少90％、至少80％、至少70％、至少60％、至少50％、至少40％、至少30％、至少20％、至少10％或至少5％的多肽片段。在优选实施例中，生物学活性是对表位的结合亲和力。在某些实施例中，多肽片段可以包括长度为至少5个到约500个氨基酸的氨基酸链。应当理解的是，在某些实施例中，片段长度为至少5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、110个、150个、200个、250个、300个、350个、400个或450个氨基酸。特别有用的多肽片段包含功能性结构域，所述功能性结构域包含抗原结合结构域或抗体片段。在抗体的情况下，有用的片段包含但不限于：重链或轻链的一个或多个CDR区、CDR3区；重链或轻链的可变区；抗体链的一部分或包含两个CDR的可变区；等等。
如上文中指出的，可以以各种方式来改变多肽，包含氨基酸取代、缺失、截短和插入。用于此类操纵的方法在本领域中是熟知的。例如，可以通过DNA的突变来制备参考多肽的氨基酸序列变体。用于诱变和核苷酸序列改变的方法在本领域中是熟知的。参见例如Kunkel(1985,《美国国家科学院院刊》82:488-492)；Kunkel等人,(1987,《酶学方法(Methods in Enzymol)》,154:367-382)；美国专利第4,873,192号；Watson,J.D.等人,(《基因的分子生物学(Molecular Biology of the Gene)》,第四版,本杰明/卡明斯出版公司(Benjamin/Cummings),加利福尼亚州门洛帕克市,1987)以及其中引用的参考文献。关于不影响所关注蛋白质的生物活性的适当氨基酸取代的指导可以在Dayhoff等人,(1978)《蛋白序列和结构图谱学(Atlas of Protein Sequence and Structure)》(美国国家生物医学研究基金会(Natl.Biomed.Res.Found.),华盛顿特区)的模型中找到。
在某些实施例中，多肽变体包括一个或多个保守取代。“保守取代”是其中氨基酸被具有类似性质的另一个氨基酸取代从而使得肽化学领域的技术人员预期多肽的二级结构和亲水性基本上未改变的取代。优选地，本文所公开的蛋白质变体的氨基酸改变是保守氨基酸改变，即带类似电荷或不带电荷的氨基酸的取代。保守氨基酸改变涉及在侧链方面相关的氨基酸的家族中的一个氨基酸的取代。天然存在的氨基酸通常分为四个家族：酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和极性不带电氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被共同分类为芳香族氨基酸。在肽或蛋白质中，适当的氨基酸保守取代对于本领域的技术人员来说是已知的，并且通常可以在不改变所得分子的生物活性的情况下进行。本领域技术人员认识到，一般而言，在多肽的非必要区中的单氨基酸取代基本上不改变生物活性(参见例如Watson等人,《基因分子生物学(Molecular Biology of the Gene)》,第4版,1987,本杰明/卡明斯出版公司,第224页)。
多肽变体进一步包含糖基化形式、与其它分子的聚集缀合物和与不相关化学部分(例如，聚乙二醇化分子)的共价缀合物。如本领域中已知的，可以通过将功能与在氨基酸链中或在N末端或C末端残基处发现的基团连接来制备共价变体。变体还包含等位基因变体、物种变体和突变蛋白。不影响蛋白质的功能活性的区截短或缺失也是变体。
在特定实施例中，多肽包括多肽接头。“接头”是指为了分子的适当间隔、构象和功能而添加的两个或更多个多肽结构域之间的多个氨基酸残基。
在特定实施例中，多肽接头是可变区连接序列。“可变区连接序列”是氨基酸序列，所述氨基酸序列连接VH结构域和VL结构域并且提供与两个子结合结构域的相互作用兼容的间隔子功能，使得所得多肽对与包括相同轻链可变区和重链可变区的抗体相同的靶分子保留特异性结合亲和力。
在特定实施例中，缀合物包括多肽接头，所述多肽接头将抗体或抗体片段与一个或多个基于蛋白质的标记物(例如，荧光蛋白或酶)共价结合。
适于在本文所设想的特定实施例中使用的接头的说明性实例包含但不限于以下氨基酸序列：GGG；DGGGS(SEQ ID NO:26)；TGEKP(SEQ ID NO:27)(参见例如，Liu等人,《美国国家科学院院刊》5525-5530(1997))；GGRR(SEQ ID NO:28)(Pomerantz等人,1995,同上)；(GGGGS)n，其中n＝1、2、3、4或5(SEQ ID NO:29)(Kim等人,《美国国家科学院院刊》93,1156-1160(1996))；EGKSSGSGSESKVD(SEQ ID NO:30)(Chaudhary等人,1990,《美国国家科学院院刊》87:1066-1070)；KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQ ID NO:31)(Bird等人,1988,《科学》242:423-426)；GGRRGGGS(SEQ ID NO:32)；LRQRDGERP(SEQ ID NO:33)；LRQKDGGGSERP(SEQ IDNO:34)；LRQKD(GGGS)2ERP(SEQ ID NO:35)。可替代地，可以使用能够对DNA结合位点和肽本身两者进行建模的计算机程序(Desjarlais和Berg,《美国国家科学院院刊》90:2256-2260(1993),《美国国家科学院院刊》91:11099-11103(1994))或通过噬菌体展示方法合理地设计柔性接头。在一个实施例中，接头包括以下氨基酸序列：GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ IDNO:36)(Cooper等人,《血液》,101(4):1637-1644(2003))。
在优选实施例中，多肽包括SEQ ID NO:1-24中所示的氨基酸序列。
F.多核苷酸
在优选的实施例中，提供了一种对结合抗BCMA CAR的抗体或其抗原结合片段进行编码的多核苷酸。如本文所使用的，术语“多核苷酸”或“核酸”是指信使RNA(mRNA)、RNA、基因组DNA(gDNA)、互补DNA(cDNA)或重组DNA。多核苷酸包含单链多核苷酸和双链多核苷酸。在特定实施例中，多核苷酸包含与本文所设想的参考序列中的任何一个具有至少约50％、55％、60％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、86％、97％、98％或99％序列同一性的多核苷酸或变体。在各个说明性实施例中，本文所设想的对多肽进行编码的多核苷酸包含但不限于SEQ ID NO:1-24。
在特定实施例中，提供了对多肽的至少约5个、10个、25个、50个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、500个、1000个、1250个、1500个、1750个或2000个或更多个以及所有中间长度的连续氨基酸残基进行编码的多核苷酸。容易理解的是，在此上下文中，“中间长度”意指所引用值之间的任何长度，如6、7、8、9等，101、102、103等；151、152、153等；201、202、203等。
在特定实施例中，多核苷酸可以是密码子优化的。如本文所使用的，术语“密码子优化的”指代取代对多肽进行编码的多核苷酸中的密码子以增加多肽的表达、稳定性和/或活性。影响密码子优化的因素包含但不限于以下中的一种或多种：(i)两个或更多个生物体或基因之间的密码子偏倚或者合成地构成的偏倚表格的变化；(ii)生物体、基因或一组基因内的密码子偏倚度的变化；(iii)包含背景在内的密码子的系统变化；(iv)密码子根据其解码tRNA的变化；(v)密码子根据GC％在总体上或在三联体中的一个位置处的变化；(vi)与参考序列，例如天然存在的序列的相似度的变化；(vii)密码子频率截止的变化；(viii)从DNA序列转录的mRNA的结构性质；(ix)关于设计密码子取代组所基于的DNA序列的功能的先验知识；(x)每个氨基酸的密码子组的系统变化；和/或(xi)假性转译起始位点的经过分离的移除。
如本文所使用的，术语“多核苷酸变体”和“变体”等是指显示出与参考多核苷酸序列或在下文中定义的严格条件下与参考序列杂交的多核苷酸具有实质性序列同一性的多核苷酸。这些术语包含与参考多核苷酸相比其中已添加或缺失、或用不同核苷酸替代一个或多个核苷酸的多核苷酸。在此方面，本领域中充分理解的是，可以对参考多核苷酸作出包括突变、添加、缺失以及取代在内的某些改变，由此所改变的多核苷酸保留所述参考多核苷酸的生物功能或活性。
多核苷酸变体包含对生物活性多肽片段或变体进行编码的多核苷酸片段。如本文所使用的，术语“多核苷酸片段”是指长度为至少5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、110个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、550个、600个、650个、700个、750个、800个、850个、900个、950个、1000个、1100个、1200个、1300个、1400个、1500个、1600个、1700个或更多个核苷酸的多核苷酸片段，其对保留至少100％、至少90％、至少80％、至少70％、至少60％、至少50％、至少40％、至少30％、至少20％、至少10％或至少5％天然存在的多肽活性的多肽变体进行编码。多核苷酸片段是指多核苷酸，所述多核苷酸对具有氨基末端缺失、羧基末端缺失和/或天然存在的或重组产生的多肽的一个或多个氨基酸的内部缺失或取代的多肽进行编码。
如本文所使用的，陈述“序列同一性”或例如包括“与……50％相同的序列”是指序列在一个比较窗口内在逐核苷酸的基础上或在逐氨基酸的基础上相同的程度。因此，“序列同一性百分比”可以通过以下来计算：在比较窗口内比较两个经过最佳比对的序列，确定相同的核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同的氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)出现在这两个序列中的位置的数目以产生匹配位置的数目，用匹配位置的数目除以比较窗口中的位置的总数(即，窗口大小)，以及将结果乘以100以产生序列同一性百分比。包含与本文所描述的参考序列中的任何一个具有至少约50％、55％、60％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、86％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸和多肽，通常其中多肽变体维持参考多肽的至少一种生物活性。
用于描述两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列关系的术语包含“参考序列”、“比较窗口”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”和“实质性同一性”。“参考序列”的长度为至少12个、但通常为15个到18个并且经常为至少25个单体单元，包含核苷酸和氨基酸残基。因为两个多核苷酸可以各自包括(1)在这两个多核苷酸之间类似的序列(即，完整多核苷酸序列的仅一部分)和(2)在这两个多核苷酸之间存在差异的序列，两个(或更多个)多核苷酸之间的序列比较通常通过以下执行：在“比较窗口”内比较这两个多核苷酸的序列以识别和比较具有序列相似性的局部区。“比较窗口”是指具有至少6个连续位置的概念性区段，通常为约50个到约100个，更通常为约100个到约150个，其中序列与具有相同数目的连续位置的参考序列在这两个序列进行最佳比对后进行比较。比较窗口可以包括与参考序列(所述参考序列不包括添加或缺失)相比约20％或更少的添加或缺失(即，缺口)以用于这两个序列的最佳比对。用于比对比较窗口的序列的最佳比对可以通过算法的计算机化实施方案(美国威斯康星州麦迪逊科学大道575号遗传学电脑集团(Genetics Computer Group,575Science Drive Madison,WI,USA)的威斯康星遗传学软件包7.0版本(WisconsinGenetics Software Package Release 7.0)的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或者通过检查和由所选择的各种方法中的任何一种生成的最佳比对(即，导致比较窗口内的最高百分比同源性)来进行。还可以参考如例如通过Altschul等人,1997,《核酸研究》25:3389中公开的BLAST程序家族。序列分析的详细讨论可以见于Ausubel等人,《当代分子生物学实验手册》,约翰威立父子公司(John Wiley&Sons,Inc.),1994-1998,第15章,第19.3单元。
如本文所使用的，“分离的多核苷酸”是指已经从其两侧的处于天然存在状态的序列纯化的多核苷酸，例如，已经从通常与其相邻的序列移除的DNA片段。“分离的多核苷酸”还指互补DNA(cDNA)、重组DNA或自然中不存在且已经通过人手制造的其它多核苷酸。
此外，本领域的普通技术人员应理解，由于遗传密码的简并性，存在许多对多肽或其变体片段进行编码的核苷酸序列，如本文所描述的。这些多核苷酸中的一些与任何天然序列的核苷酸序列具有最小的同源性。尽管如此，在特定实施例中具体地设想了由于密码子使用的差异而变化的多核苷酸，例如针对人和/或灵长类动物密码子选择而优化的多核苷酸。
可以使用本领域中熟知且可获得的各种既定技术来制备、操纵和/或表达多核苷酸。为了表达所期望的多肽，可以将对多肽进行编码的核苷酸序列插入到适当的载体中。
G.组合物
本文所设想的组合物可以包括一种或多种抗体或抗体片段及其抗原结合片段、缀合物、多肽和多核苷酸。组合物包含但不限于药物组合物。实际上对也可以包含在组合物中的其它组分没有限制，条件是另外的药剂不会不利地影响组合物的活性成分的功能或活性。
在特定实施例中，本发明的组合物包括一定量的抗体或其抗原结合片段或缀合物。如本文所使用的，术语“量”是指结合靶多肽的抗体的“有效量(an amount effective/an effective amount)”。
组合物可以进一步包括一种或多种载剂或赋形剂。
适合并入本文所设想的组合物中的载剂的说明性实例包含但不限于：缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包含抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)的多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白络合物)；和/或非离子型表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。
可接受的载剂还包含但不限于：缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包含抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)的多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白络合物)；和/或非离子型表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。
H.试剂盒
在各个实施例中，提供了一种试剂盒，其包括一种或多种结合抗BCMA CAR的抗体或其抗原结合片段以及使用所述抗体检测、确定和/或测量一种或多种免疫效应细胞或抗BCMA CAR T细胞上的抗BCMA CAR表达的说明。
在特定实施例中，提供了一种试剂盒，其包括一种或多种结合抗BCMA CAR的抗体或其抗原结合片段以及使用所述抗体检测、确定、测量和/或枚举一种或多种免疫效应细胞或抗BCMA CAR T细胞上的抗BCMA CAR表达的说明。
在各个实施例中，与抗BCMA CAR结合的抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ IDNO:1-3、9-11或17-19中所示的CDRL1-CDRL3序列的可变轻链序列和/或包含SEQ ID NO:4-6、12-14或20-22中所示的CDRH1-CDRH3序列的可变重链序列。
在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:7、15或23中的任何一个所示的可变轻链序列和/或如SEQ ID NO:8、16或24中的任何一个所示的可变重链序列。
在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括结合SEQ ID NO:25中所示的抗BCMA scFv片段的可变轻链序列和/或可变重链序列。
在特定实施例中，试剂盒包括抗体或抗体片段和可检测标记以及缀合说明。在特定实施例中，试剂盒包括与可检测标记偶联的抗体或抗体片段以及使用说明。在优选的实施例中，可检测标记是直接可检测的。在更优选的实施例中，可检测标记是荧光标记。在甚至更优选的实施例中，可检测标记是RPE。
I.方法
抗BCMA CAR T细胞活性部分地与免疫效应细胞上的抗BCMA CAR表达有关。需要准确评估离体或体外和体内抗BCMA CAR表达的能力，以估计药物产品活性并且追踪患者中的抗BCMA CAR T细胞的存活率和持久性。
在特定实施例中，提供了使用一种或多种抗体或其抗原结合片段的方法。抗体用于检测或测量抗BCMA CAR的表达。本文所设想的抗体、片段和缀合物用于结合、检测、确定、鉴定、测量、定量和/或枚举抗BCMA CAR表达的存在或水平和/或群体中的抗BCMA CAR+免疫效应细胞的数量。
在各个实施例中，一种方法包括检测免疫效应细胞上的抗BCMA CAR表达。使免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞、NKT细胞)与抗体或其抗原结合片段接触，所述抗体或其抗原结合片段以足以使抗体结合抗BCMA CAR并且形成抗体:抗BCMA CAR复合物的有效量和时间结合抗BCMA CAR的一个或多个表位。
在特定实施例中，一种方法包括检测免疫效应细胞群体中的一个或多个免疫效应细胞上的抗BCMA CAR表达。使一个或多个免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞、NKT细胞)与抗体或其抗原结合片段接触，所述抗体或其抗原结合片段以足以使抗体结合抗BCMA CAR并且形成抗体:抗BCMA CAR复合物的有效量和时间结合抗BCMA CAR的一个或多个表位。在特定实施例中，至少25％的免疫效应细胞是抗BCMA CAR+。在另一个实施例中，至少至少50％的免疫效应细胞是抗BCMA CAR+。在另一个实施例中，至少至少75％的免疫效应细胞是抗BCMA CAR+。
在某些实施例中，一种方法包括确定免疫效应细胞上的抗BCMA CAR的表达的量。使免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞、NKT细胞)与抗体或其抗原结合片段接触，所述抗体或其抗原结合片段以足以使抗体结合抗BCMA CAR并且形成抗体:抗BCMA CAR复合物的有效量和时间结合抗BCMA CAR的一个或多个表位。测量抗体:抗BCMA CAR复合物的量并且将其与对照进行比较。
在一些实施例中，一种方法包括确定免疫效应细胞群体中的一个或多个免疫效应细胞上的抗BCMA CAR的表达的量。使一个或多个免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞、NKT细胞)与抗体或其抗原结合片段接触，所述抗体或其抗原结合片段以足以使抗体结合抗BCMACAR并且形成抗体:抗BCMA CAR复合物的有效量和时间结合抗BCMA CAR的一个或多个表位。测量抗体:抗BCMA CAR复合物的量并且将其与对照进行比较。
在特定实施例中，一种方法包括确定免疫效应细胞群体中的抗BCMA CAR+免疫效应细胞的数量。使一个或多个免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞、NKT细胞)与抗体或其抗原结合片段接触，所述抗体或其抗原结合片段以足以使抗体结合抗BCMA CAR并且形成抗体:抗BCMA CAR复合物的有效量和时间结合CAR的抗BCMA CAR scFv部分的一个或多个表位。然后，可以枚举包括抗体:抗BCMA CAR复合物的免疫效应细胞。
在特定实施例中，检测、确定或枚举抗BCMA CAR表达或抗BCMA CAR+T细胞的方法包括从施用抗BCMA CAR+T细胞的受试者中分离生物学样品。在特定实施例中，样品含有或怀疑含有抗BCMA CAR+T细胞。在优选的实施例中，样品是单采血液成分术样品、白细胞去除术样品、外周血、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织或肿瘤活检物。
在特定实施例中，结合抗BCMA CAR的本文所设想的抗体和缀合物用于研究通过在一个或多个时间点检测受试者和/或从受试者收集的样品中的抗BCMA CAR+T细胞的量所测量或评估的药物动力学、扩展和/或持久性。在特定实施例中，在向受试者施用抗BCMA CAR+T细胞后约24小时、约48小时、约72小时、约4天、约5天、约6天、约7天、约10天、约14天、约21天、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周、约3个月、约4个月、约6个月、约一年或每周、每个月或每年从受试者收集、分离和/或采集样品。
在各个实施例中，与抗BCMA CAR结合的抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ IDNO:1-3、9-11或17-19中所示的CDRL1-CDRL3序列的可变轻链序列和/或包含SEQ ID NO:4-6、12-14或20-22中所示的CDRH1-CDRH3序列的可变重链序列。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:7、15或23中的任何一个所示的可变轻链序列和/或如SEQ ID NO:8、16或24中的任何一个所示的可变重链序列。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括结合SEQ ID NO:25中所示的抗BCMACAR的可变轻链序列和/或可变重链序列。
在特定实施例中，检测、确定或枚举抗BCMA CAR表达或抗BCMA CAR+T细胞的方法包括使用与可检测标记缀合的抗体或抗体片段。在优选的实施例中，可检测标记是直接可检测的。在更优选的实施例中，可检测标记是荧光标记。在甚至更优选的实施例中，可检测标记是RPE。
在特定实施例中，可以使用以下测定中的一种或多种检测、确定和/或枚举抗体:抗BCMA CAR复合物的存在：免疫组织化学、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫吸附测定、化学发光测定、电化学发光测定、基于表面等离子体共振(SPR)的生物传感器(例如，BIAcore)、荧光显微法、流式细胞术、荧光活化细胞分选(FACS)或蛋白质印迹。
在优选的实施例中，使用流式细胞术检测、确定和/或枚举抗体:抗BCMA CAR复合物的存在。在更优选的实施例中，使用FACs检测、确定和/或枚举抗体:抗BCMA CAR复合物的存在。
在特定实施例中，确定一种或多种免疫效应细胞上的抗BCMA CAR的背景表达水平，并且从在一种或多种免疫效应细胞上测量的或用于使测量结果归一化的抗体:抗BCMACAR复合物的量中减去所述背景表达水平。
本说明书中引用的所有出版物、专利申请和经发布专利通过引用并入本文，如同每个单独的出版物、专利申请或经发布专利具体地且单独地指示通过引用并入一样。
尽管以上发明已经出于清楚理解的目的通过说明和举例的方式进行了一些详细的描述，对于本领域普通技术人员而言在本发明的传授内容的启发下应该容易清楚的是，在不偏离随附权利要求的精神或范围下可以对其进行某些改变和变更。仅通过说明的方式而不是通过限制的方式提供以下实例。本领域技术人员将容易认识到可以被改变或修改以产生本质上类似的结果的各种非关键参数。
实例
实例1
针对抗BCMA CAR的抗体评估
产生针对SEQ ID NO:25中所示的抗BCMA CAR序列的小鼠单克隆抗体。
在含有IL-2(CellGenix)和对CD3和CD28具有特异性的抗体(美天旎生物科技公司(Miltenyi Biotec))的培养基中，在静态烧瓶中培养外周血单核细胞(PBMC)。在培养开始后一天，添加对抗BCMA CAR进行编码的慢病毒的2×108个转导单位。通过添加含有IL-2的新鲜培养基将抗BCMA CAR T细胞维持在对数期，持续总共十天的培养。用抗BCMA CAR(BCMA-02)、人源化抗BCMA CAR(BCMA-03)或抗EGFR CAR转导T细胞并且使其扩增10天。使用针对SEQ ID NO:25中所示的抗BCMA scFv序列的三种抗体，在培养结束时评估CAR T细胞的CAR表达。
将抗体克隆7G2.A1.B2、11E6.G2.B5和11E6.G7.F2与藻红蛋白(PE)缀合。在4℃下将1×106个抗BCMA CAR T细胞或未经转导的对照T细胞与1μg抗体缀合物在100μL总体积中温育20分钟，并且然后洗涤并固定在1％多聚甲醛中。对样品进行FACS分析，以检测、确定和枚举抗BCMA CAR+T细胞。所有抗体缀合物检测约70％的细胞上的抗BCMA CAR表达，图1。
总之，在以下权利要求中，所使用的术语不应当被解释为将权利要求限制于本说明书和权利要求中所公开的特定实施例，而是应当被解释为包含所有可能的实施例，连同这种权利要求有权获得的等效物的整个范围。因此，权利要求不受本公开的限制。
序列表
<110> 蓝鸟生物公司（bluebird bio, Inc.）
凯文·弗里德曼(Friedman, Kevin)
莫莉·里德·帕金斯(Perkins, Molly Reed)
<120> 抗BCMA CAR抗体、缀合物和使用方法
<130> BLBD-099/01WO 315698-2946
<150> US 62/685,043
<151> 2018-06-04
<160> 40
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 实验室中制备-轻链CDR1
<400> 1
Lys Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr Thr Val Ala
1 5 10
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 实验室中制备-轻链CDR2
<400> 2
Trp Ala Ser Thr Arg His Thr
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 实验室中制备-轻链CDR3
<400> 3
Gln Gln Tyr Thr Phe Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 实验室中制备-重链CDR1
<400> 4
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His
1 5 10
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 实验室中制备-重链CDR2
<400> 5
Glu Ile Asn Pro Arg Asn Gly Arg Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Thr
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 实验室中制备-重链CDR6
<400> 6
Glu Val His Tyr Tyr Gly Ser Asp Tyr Asp Ala Met Asp Phe
1 5 10
<210> 7
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 实验室中制备-可变轻链
<400> 7
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr Thr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Thr Phe Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 8
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 实验室中制备-可变重链
<400> 8
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Arg Asn Gly Arg Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Thr Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Ser Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Val His Tyr Tyr Gly Ser Asp Tyr Asp Ala Met Asp Phe
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 实验室中制备-轻链CDR1
<400> 9
Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 实验室中制备-轻链CDR2
<400> 10
Trp Ala Ser Thr Arg His Thr
1 5
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 实验室中制备-轻链CDR3
<400> 11
Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 实验室中制备-重链CDR1
<400> 12
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His
1 5 10
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 实验室中制备-重链CDR2
<400> 13
Glu Ile Asn Pro Arg Asn Gly Arg Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Thr
<210> 14
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 实验室中制备-重链CDR6
<400> 14
Glu Val His Tyr Tyr Gly Ser Asp Tyr Asp Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 15
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 实验室中制备-可变轻链
<400> 15
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 16
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 实验室中制备-可变重链
<400> 16
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Arg Asn Gly Arg Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Thr Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Ser Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Val His Tyr Tyr Gly Ser Asp Tyr Asp Ala Met Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 实验室中制备-轻链CDR1
<400> 17
Lys Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr Thr Val Ala
1 5 10
<210> 18
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 实验室中制备-轻链CDR2
<400> 18
Trp Ala Ser Thr Arg His Thr
1 5
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 实验室中制备-轻链CDR3
<400> 19
Gln Gln Tyr Thr Phe Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 实验室中制备-重链CDR1
<400> 20
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His
1 5 10
<210> 21
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 实验室中制备-重链CDR2
<400> 21
Glu Ile Asn Pro Arg Asn Gly Arg Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Thr
<210> 22
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 实验室中制备-重链CDR6
<400> 22
Glu Val His Tyr Tyr Gly Ser Asp Tyr Asp Ala Met Asp Phe
1 5 10
<210> 23
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 实验室中制备-可变轻链
<400> 23
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr Thr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Thr Phe Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 24
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 实验室中制备-可变重链
<400> 24
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Arg Asn Gly Arg Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Thr Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Ser Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Val His Tyr Tyr Gly Ser Asp Tyr Asp Ala Met Asp Phe
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Pro
115 120
<210> 25
<211> 493
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 实验室中制备-抗BCMA CAR
<400> 25
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu
20 25 30
Ala Met Ser Leu Gly Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu
35 40 45
Ser Val Thr Ile Leu Gly Ser His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys
50 55 60
Pro Gly Gln Pro Pro Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln
65 70 75 80
Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe
85 90 95
Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr
100 105 110
Cys Leu Gln Ser Arg Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
115 120 125
Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly
130 135 140
Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu
145 150 155 160
Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly
165 170 175
Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly
180 185 190
Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro
195 200 205
Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr
210 215 220
Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp
225 230 235 240
Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Thr Thr
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
275 280 285
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
290 295 300
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
305 310 315 320
Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
325 330 335
Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
340 345 350
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
355 360 365
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
370 375 380
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
385 390 395 400
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
405 410 415
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
420 425 430
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
435 440 445
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
450 455 460
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
465 470 475 480
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490
<210> 26
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 示例性接头序列
<400> 26
Asp Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 27
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 示例性接头序列
<400> 27
Thr Gly Glu Lys Pro
1 5
<210> 28
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 示例性接头序列
<400> 28
Gly Gly Arg Arg
1
<210> 29
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 示例性接头序列
<400> 29
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 30
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 示例性接头序列
<400> 30
Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp
1 5 10
<210> 31
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 示例性接头序列
<400> 31
Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser
1 5 10 15
Leu Asp
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 示例性接头序列
<400> 32
Gly Gly Arg Arg Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 示例性接头序列
<400> 33
Leu Arg Gln Arg Asp Gly Glu Arg Pro
1 5
<210> 34
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 示例性接头序列
<400> 34
Leu Arg Gln Lys Asp Gly Gly Gly Ser Glu Arg Pro
1 5 10
<210> 35
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 示例性接头序列
<400> 35
Leu Arg Gln Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Arg Pro
1 5 10 15
<210> 36
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 示例性接头序列
<400> 36
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 37
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 用于确定轻链CDR-L3基序的示例性规则
<220>
<221> SITE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是任何氨基酸
<400> 37
Phe Gly Xaa Gly
1
<210> 38
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 用于确定重链CDR-H1基序的示例性规则
<220>
<221> SITE
<222> (2)..(4)
<223> Xaa是任何氨基酸
<400> 38
Cys Xaa Xaa Xaa
1
<210> 39
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 用于确定重链CDR-H2基序的示例性规则
<400> 39
Leu Glu Trp Ile Gly
1 5
<210> 40
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 用于确定重链CDR-H3基序的示例性规则
<220>
<221> SITE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是任何氨基酸
<400> 40
Trp Gly Xaa Gly
1

Claims (48)

1.一种结合抗BCMA嵌合抗原受体（CAR）的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括：
a) 包含如SEQ ID NO: 1-3中所示的CDRL1-CDRL3序列的可变轻链，和包含如SEQ IDNO:4-6中所示的CDRH1-CDRH3序列的可变重链；或
b) 包含如SEQ ID NO: 9、2和11中所示的CDRL1-CDRL3序列的可变轻链，和包含如SEQID NO:4-5和14中所示的CDRH1-CDRH3序列的可变重链，
其中所述抗BCMA CAR包含SEQ ID NO: 25中所示的scFv序列。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是人的、人源化的、鼠类的或嵌合的。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：Fab'片段、F(ab')2片段、双特异性Fab二聚体（Fab2）、三特异性Fab三聚体（Fab3）、Fv、单链Fv蛋白（“scFv”）、双-scFv、(scFv)2、微抗体、双抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定的Fv蛋白（“dsFv”）和单结构域抗体（sdAb，纳米抗体）。
4.根据权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是scFv。
5.一种结合抗BCMA CAR的抗体或其抗原结合片段，其包括包含如SEQ ID NO: 1-3中所示的CDRL1-CDRL3序列的可变轻链和包含如SEQ ID NO: 4-6中所示的CDRH1-CDRH3序列的可变重链，其中所述抗BCMA CAR包含SEQ ID NO: 25中所示的scFv序列。
6. 根据权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述可变轻链包含与SEQ IDNO:7所示的氨基酸具有至少90%同一性的氨基酸序列。
7. 根据权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述可变轻链包含与SEQ IDNO:7所示的氨基酸具有至少95%同一性的氨基酸序列。
8.根据权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述可变轻链包含与SEQ IDNO: 7所示的氨基酸序列具有至少96%、97%、98 %或99 %同一性的氨基酸序列。
9.根据权利要求5-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是scFv。
10.根据权利要求5-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述可变重链包含与SEQ ID NO:8所示的氨基酸具有至少90%同一性的氨基酸序列。
11. 根据权利要求5-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述可变重链包含与SEQ ID NO:8所示的氨基酸具有至少95%同一性的氨基酸序列。
12. 根据权利要求5-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述可变重链包含与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有至少96%、97%、98 %或99 %同一性的氨基酸序列。
13.根据权利要求10所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是scFv。
14. 根据权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述可变轻链序列包含与SEQID NO:7所示的氨基酸具有至少90%同一性的氨基酸序列，所述可变重链序列包含与SEQ IDNO:8所示的氨基酸具有至少90%同一性的氨基酸序列。
15.根据权利要求14所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是scFv。
16.根据权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其包括SEQ ID NO: 7中所示的可变轻链序列。
17.根据权利要求5或权利要求16所述的抗体或其抗原结合片段，其包括SEQ ID NO: 8中所示的可变重链序列。
18.根据权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其包括SEQ ID NO: 7中所示的可变轻链序列和SEQ ID NO: 8中所示的可变重链序列。
19.一种结合抗BCMA CAR的抗体或其抗原结合片段，其包括包含如SEQ ID NO: 9、2和11中所示的CDRL1-CDRL3序列的可变轻链和包含如SEQ ID NO: 4-5和14中所示的CDRH1-CDRH3序列的可变重链，其中所述抗BCMA CAR包含SEQ ID NO: 25中所示的scFv序列。
20. 根据权利要求19所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述可变轻链包含与SEQ IDNO:15所示的氨基酸具有至少90%同一性的氨基酸序列。
21. 根据权利要求19所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述可变轻链包含与SEQ IDNO:15所示的氨基酸具有至少95%同一性的氨基酸序列。
22.根据权利要求19所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述可变轻链包含与SEQ IDNO: 15所示的氨基酸序列具有至少96%、97%、98 %或99 %同一性的氨基酸序列。
23.根据权利要求19-22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是scFv。
24. 根据权利要求19-22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述可变重链包含与SEQ ID NO:16所示的氨基酸具有至少90%同一性的氨基酸序列。
25. 根据权利要求19-22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述可变重链包含与SEQ ID NO:16所示的氨基酸具有至少95%同一性的氨基酸序列。
26. 根据权利要求19-22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述可变重链包含与SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列具有至少96%、97%、98 %或99 %同一性的氨基酸序列。
27. 根据权利要求19所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述可变轻链包含与SEQ IDNO:15所示的氨基酸具有至少90%同一性的氨基酸序列，所述可变重链包含与SEQ ID NO:16所示的氨基酸具有至少90%同一性的氨基酸序列。
28.根据权利要求27所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是scFv。
29.根据权利要求19所述的抗体或其抗原结合片段，其包括SEQ ID NO: 15中所示的可变轻链序列。
30.根据权利要求19或权利要求29所述的抗体或其抗原结合片段，其包括SEQ ID NO:16中所示的可变重链序列。
31.根据权利要求19所述的抗体或其抗原结合片段，其包括SEQ ID NO: 15中所示的可变轻链序列和SEQ ID NO: 16中所示的可变重链序列。
32.根据权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其包括SEQ ID NO: 24中所示的可变重链序列。
33.根据权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其包括SEQ ID NO: 7中所示的可变轻链序列和SEQ ID NO: 24中所示的可变重链序列。
34.一种缀合物，其包括根据权利要求1到33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段；以及可检测标记。
35.根据权利要求34所述的缀合物，其中所述可检测标记选自由以下组成的组：
a) 半抗原、荧光染料、荧光蛋白、发色团、金属离子、金颗粒、银颗粒、磁性颗粒、多肽、酶、发光化合物或寡核苷酸；
b) 选自由以下组成的组的AlexaFluor®（AF）染料：AF350、AF405、AF488、AF500、AF514、AF532、AF546、AF555、AF568、AF594、AF610、AF633、AF635、AF647、AF680、AF700、AF710、AF750、AF790和AF800；
c) 选自由以下组成的组的QDot®：Qdot®525、Qdot®565、Qdot®585、Qdot®605、Qdot®655、Qdot®705和Qdot®800；
d) 选自由以下组成的组的半抗原：荧光素或其衍生物、异硫氰酸荧光素、羧基荧光素、二氯三嗪基胺荧光素、地高辛、二硝基苯酚（DNP）、三硝基苯酚（TNP）和生物素；
e) 选自由以下组成的组的Cy染料：Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7和Cy7.5；
f) 选自由以下组成的组的荧光分子：藻红蛋白（PE，R-藻红蛋白（RPE））、B-藻红蛋白（BPE）、多甲藻素叶绿素（PerCP）、别藻蓝蛋白（APC）和C-藻蓝蛋白；
g) 选自由以下组成的组的荧光染料：Atto 390、Atto 425、Atto 465、Atto 488、Atto495、Atto 514Atto 520、Atto 532、Atto 550、Atto 565、Atto 590、Atto 594、Atto 610、Atto 620、Atto 633、Atto 647、Atto 655、Atto 665、Atto 680、Atto 700、Atto 725、Atto740以及IR染料680、IR染料680LT、IR染料700、IR染料700DX、IR染料800、IR染料800RS和IR染料800CW；
h) 选自由以下组成的组的串联荧光染料：RPE-Cy5、RPE-Cy5.5、RPE-Cy7、RPE-CF594、RPE-AlexaFluor®串联缀合物；RPE-Alexa610、RPE-TxRed、APC-H7、APC-R700、APC-Alexa600、APC-Alexa610、APC-Alexa750、APC-Cy5、APC-Cy5.5和APC-Cy7；
i) 选自由以下组成的组的荧光蛋白：GFP、eGFP、BFP、CFP、YFP、DsRed、DsRed2、mRFP、mBanana、mOrange、dTomato、tdTomato、mTangerine、mStrawberry、mCherry、mPlum和mRaspberry；
j) 选自由以下组成的组的酶：碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、萤光素酶和β-半乳糖苷酶；和
k) 选自由以下组成的组的放射性核素：碳、铬、钴、氟、钆、锗、钬、铟、碘、镧、镥、锰、钼、钯、磷、镨、钷、铼、铑、钌、钐、钪、硒、硫、锝、铊、锡、氚、氙、镱和钇。
36.一种多核苷酸，其对根据权利要求1到33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段进行编码。
37.一种宿主细胞，其包括根据权利要求1到33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求36所述的多核苷酸，所述宿主细胞为非动植物品种。
38.一种组合物，其包括根据权利要求1到33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求34或35所述的缀合物、根据权利要求36所述的多核苷酸或根据权利要求37所述的宿主细胞。
39.一种产生抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达根据权利要求1到33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及回收或分离所述抗体。
40.一种试剂盒，其包括根据权利要求1到33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求34或35所述的缀合物以及使用说明。
41.一种检测T细胞上的抗BCMA CAR的表达的非疾病诊断和治疗目的的方法，所述方法包括：使T细胞与根据权利要求1到33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求34或35所述的缀合物接触；以及检测抗体:抗BCMA CAR复合物的形成。
42.一种检测T细胞群体中的抗BCMA CAR的表达的非疾病诊断和治疗目的的方法，所述方法包括：使T细胞群体与根据权利要求1到33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求34或35所述的缀合物接触；以及检测所述一个或多个T细胞上的抗体:抗BCMACAR复合物的形成。
43.一种确定T细胞上的抗BCMA CAR的表达的非疾病诊断和治疗目的的方法，所述方法包括：使T细胞与根据权利要求1到33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求34或35所述的缀合物接触；检测抗体:抗BCMA CAR复合物的形成；以及测量所述复合物的量以确定所述T细胞上的所述抗BCMA CAR的表达。
44.一种确定T细胞群体中的抗BCMA CAR的表达的非疾病诊断和治疗目的的方法，所述方法包括：使T细胞群体与根据权利要求1到33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求34或35所述的缀合物接触；检测一个或多个T细胞上的抗体:抗BCMA CAR复合物的形成；以及测量所述复合物的量以确定所述一个或多个T细胞上的所述抗BCMA CAR的表达。
45.一种确定T细胞群体中的抗BCMA CAR+ T细胞的数量的非疾病诊断和治疗目的的方法，所述方法包括：使T细胞群体与根据权利要求1到33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求34或35所述的缀合物接触；检测一个或多个T细胞上的抗体:抗BCMACAR复合物的形成；以及枚举表达所述抗BCMA CAR的所述T细胞。
46.根据权利要求41到45中任一项所述的方法，其中免疫组织化学、酶联免疫吸附测定、免疫吸附测定、化学发光测定、电化学发光测定、基于表面等离子体共振的生物传感器、荧光显微法、流式细胞术或荧光活化细胞分选用于检测所述抗体:抗BCMA CAR复合物的形成。
47.根据权利要求43或权利要求44所述的方法，其中免疫组织化学、酶联免疫吸附测定、免疫吸附测定、化学发光测定、电化学发光测定、基于表面等离子体共振的生物传感器、荧光显微法、流式细胞术或荧光活化细胞分选用于测量所述抗体:抗BCMA CAR复合物的量。
48.根据权利要求45所述的方法，其中免疫组织化学、酶联免疫吸附测定、免疫吸附测定、化学发光测定、电化学发光测定、基于表面等离子体共振的生物传感器、荧光显微法或流式细胞术、荧光活化细胞分选用于枚举表达所述抗BCMA CAR的所述T细胞。
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