ES2564635T3

ES2564635T3 - Anticuerpos anti-IL-6/IL-6R y métodos de uso de los mismos

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Publication number: ES2564635T3
Application number: ES09747432.4T
Authority: ES
Inventors: Walter Ferlin; Marie Kosco-Vilbois; Greg Elson; Olivier Leger; Florence Guilhot
Original assignee: Novimmune SA
Current assignee: Novimmune SA
Priority date: 2008-05-13
Filing date: 2009-05-13
Publication date: 2016-03-28
Anticipated expiration: 2029-05-13
Also published as: CA2724279C; MX2010012031A; EP2297202B1; JP2021176897A; US11613582B2; US8034344B2; US9234034B2; US20160130351A1; US20180086839A1; JP6923709B2; IL209277A; JP2015127335A; DK2297202T3; US20110002936A1; IL209277A0; CN102089326B; US20130122012A1; WO2009140348A2; US20120020981A1; WO2009140348A3

Abstract

Un anticuerpo monoclonal totalmente humano aislado, o fragmento del mismo, que se une al complejo IL-6/IL-6R (IL-6Rc), en el que dicho anticuerpo comprende una región 1 determinante de la complementariedad de cadena pesada variable (CDR1 VH), una región 2 determinante de la complementariedad de cadena pesada variable (CDR2 VH), una región 3 determinante de la complementariedad de cadena pesada variable (CDR3 VH), una región 1 determinante de la complementariedad de cadena ligera variable (CDR1 VL), una región 2 determinante de la complementariedad de cadena ligera variable (CDR2 VL), una región 3 determinante de la complementariedad de cadena ligera variable (CDR3 VL) seleccionado entre el grupo que consiste en: (a) una región CDR1 VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 15, una región CDR2 VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 33, una región CDR3 VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 36, una región CDR1 VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 24, una región CDR2 VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 25, y una región CDR3 VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 26; (b) una región CDR1 VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 15, una región CDR2 VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 16, una región CDR3 VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 17, una región CDR1 VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 24, una región CDR2 VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 25, y una región CDR3 VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 26; (c) una región CDR1 VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 18, una región CDR2 VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 19, una región CDR3 VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 20, una región CDR1 VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 28, una región CDR2 VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 25, y una región CDR3 VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 29; y (d) una región CDR1 VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 21, una región CDR2 VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 22, una región CDR3 VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 23, una región CDR1 VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 30, una región CDR2 VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 25, y una región CDR3 VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 31.

Description

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especie diferente, o (4) no se produce en la naturaleza.

El término "polipéptido" se usa en el presente documento como un término genérico para hacer referencia a proteína nativa, fragmentos, o análogos de una secuencia de polipéptidos. Por lo tanto, algunos fragmentos y análogos de

5 proteína nativa, son especies del género de polipéptido. Los polipéptidos de acuerdo con la invención comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada representadas en las SEC ID Nºs: 2, 8, y 12, y las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera representadas en las SEC ID Nºs: 4, 6, 10, y 14 así como moléculas de anticuerpo formadas por combinaciones que comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada con moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera, tales como moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera kappa, y viceversa, así como fragmentos y análogos de las mismas.

La expresión "de origen natural" como se usa en el presente documento tal como se aplica a un objeto se refiere al hecho de que un objeto se puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptidos o de polinucleótidos que está presente en un organismo (incluyendo virus) que se pueden aislar de una fuente en la

15 naturaleza y que el ser humano no ha modificado de forma intencionada en el laboratorio o de otro modo es de origen natural.

La expresión "unida de forma operativa", como se usa en el presente documento, se refiere a posiciones de componentes de modo que se describen en una relación que les permite funcionar de su manera pretendida. Una secuencia de control "unidad de forma operativa" a una secuencia de codificación se liga de un modo tal que la expresión de la secuencia de codificación se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de control.

La expresión "secuencia de control", como se usa en el presente documento, se refiere a secuencias de polinucleótidos que son necesarias para realizar la expresión y procesamiento de secuencias de codificación a las

25 que se ligan. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo hospedador en procariotas, por lo general tales secuencias de control incluyen secuencia promotora, de sitio de unión a ribosoma, y de terminación de la transcripción en eucariotas, por lo general, tales de secuencias de control incluyen secuencia de promotores y de terminación de la transcripción. La expresión "secuencias de control" pretende incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y procesamiento, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias directoras y secuencias de asociados de fusión. El término "polinucleótido" como se denomina en el presente documento se refiere a una forma polimérica de polinucleótidos con una longitud de al menos 10 bases, ya sean ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas de ADN monocatenario y bicatenario.

35 El término "oligonucleótido" mencionado en el presente documento incluye nucleótidos de origen natural y modificados unidos en conjunto mediante uniones de oligonucleótidos de origen natural y de origen no natural. Los oligonucleótidos son un subconjunto de polinucleótidos que por lo general comprenden una longitud de 200 bases o menos. Preferentemente, los oligonucleótidos tienen una longitud de 10 a 60 bases y lo más preferentemente una longitud de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 a 40 bases. Normalmente los oligonucleótidos son monocatenarios, por ejemplo, para las ondas, aunque algunos oligonucleótidos pueden ser bicatenarias, por ejemplo, para uso en la construcción de un mutante genético. Los oligonucleótidos de la invención son cualquier oligonucleótidos sentido o antisentido.

45 La expresión "nucleótidos de origen natural" mencionada en el presente documento incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. La expresión "nucleótidos modificados" mencionada en el presente documento incluye nucleótidos con grupos de azúcar modificado o sustituido y similares. La expresión "uniones de oligonucleótido" mencionada en el presente documento incluye uniones de oligonucleótidos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato, y similares. Véase por ejemplo La Planche et al., Nucl. Acids Res. 14: 9081 (1986); Stec et al., J. Am. Chem. Soc. 106: 6077 (1984), Stein et al., Nucl. Acids Res. 16: 3209 (1988), Zon et al., Anti Cancer Drug Design 6: 539 (1991); Zon et al., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al., documento de Patente de Estados Unidos Nº 5.151.510; Uhlmann y Peyman Chemical Reviews 90: 543 (1990). Si se desea, un oligonucleótido puede incluir una etiqueta para detección.

55 La expresión "hibridar de forma selectiva" mencionada en el presente documento se refiere a unir de forma detectable y de forma específica. Los polinucleótidos, oligonucleótidos y fragmentos de los mismos de acuerdo con la invención se hibridan selectivamente a hebras de ácidos nucleicos en condiciones de hibridación y de lavado que minimizan algunas cantidades apreciables de unión detectable a ácidos nucleicos no específicos. Se pueden usar condiciones de alta rigurosidad para conseguir condiciones de hibridación selectivas como se conoce en la técnica y se analiza en el presente documento. Por lo general, la homología de secuencias de ácidos nucleicos entre los polinucleótidos, oligonucleótidos, y fragmentos de la invención y una secuencia de ácidos nucleicos de interés tendrá un 80 %, y más habitualmente con tendrá preferentemente aumentos de homologías de al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 99 %, y un 100 %. Dos secuencias de aminoácidos son homólogas si existe una identidad parcial o completa

65 entre sus secuencias. Por ejemplo, homología de un 85 % se refiere a que un 85 % de los aminoácidos son idénticos cuando las dos secuencias se alinean para emparejamiento máximo. En la maximización de las longitudes de hueco

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proteínas que se pliegan en una estructura tridimensional conocida. Bowie et al., Science 253: 164 (1991). Por lo tanto, los ejemplos mencionados anteriormente demuestran que los expertos en la materia pueden reconocer motivos de secuencias y conformaciones estructurales que se pueden usar para definir dominios estructurales y funcionales de acuerdo con la invención.

5 Algunas sustituciones de aminoácidos preferentes son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteólisis,

(2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de proteínas, (4) alteran afinidades de unión, y (4) proporcionan o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de tales análogos. Algunos análogos pueden incluir diversas muteínas de una secuencia distinta de la secuencia peptídica de origen natural. Por ejemplo, se pueden realizar sustituciones de aminoácidos individuales o múltiples (preferentemente sustituciones de aminoácidos conservativas) en la secuencia de origen natural (preferentemente en la porción del polipéptido fuera del dominio o dominios que forman contactos intermoleculares. Una sustitución de aminoácidos conservativas no debería cambiar básicamente las características estructurales de la secuencia precursora (por ejemplo, una sustitución de aminoácido no debería tener una tendencia a romper una hélice que se

15 produce en la secuencia precursora, ni alterar otros tipos de estructura secundaria que caracterice a la secuencia precursora). Algunos ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidos en la técnica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman y Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); y Thornton et al., Nature 354: 105(1991).

La expresión "fragmento de polipéptido", como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido que tiene una supresión amino terminal y/o carboxi terminal, pero en el que la secuencia de aminoácidos restante es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia de origen natural deducida, por ejemplo, a partir de una secuencia de ADNc de longitud completa. Por lo general los fragmentos tienen una longitud al menos 5, 6, 8 o 10

25 aminoácidos, preferentemente una longitud de al menos 14 aminoácidos, más preferentemente una longitud de al menos 20 aminoácidos, normalmente una longitud de al menos 50 aminoácidos, e incluso más preferentemente una longitud de al menos 70 aminoácidos. El término "análogo", como se usa en el presente documento, se refiere a polipéptidos que están formados por un segmento de al menos 25 aminoácidos que tiene una identidad sustancial con una porción de una secuencia de aminoácidos deducida y que tiene una unión específica para IL-6Rc y/o tanto para IL-6Rc como para IL-6R, en condiciones de unión adecuadas. Por lo general, algunos análogos de polipéptidos comprenden una sustitución (o adición o supresión) de aminoácido conservativa con respecto a la secuencia de origen natural. Por lo general, los análogos tienen una longitud de al menos 20 aminoácidos, preferentemente una longitud de al menos 50 aminoácidos o superior, y a menudo pueden ser tan largos como un polipéptido de origen natural de longitud completa.

35 Algunos análogos de péptidos se usan normalmente en la industria farmacéutica como fármacos no peptídicos con propiedades análogas a las del péptido usado como molde. Estos tipos de compuestos no peptídicos se denominan "miméticos de péptido" o "peptidomiméticos". Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15: 29 (1986), Veber y Freidinger TINS p. 392 (1985); y Evans et al., J. Med. Chem. 30: 1229 (1987). A menudo, descompuestos se desarrollan con la ayuda de formación de modelos moleculares por ordenador. Los miméticos de péptido que son estructuralmente similares a los péptidos terapéuticamente útiles se pueden usar para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente. Por lo general, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido de paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o actividad farmacológica), tal como anticuerpo humano, pero tienen uno o más enlaces peptídicos opcionalmente sustituidos con un enlace sustituido entre el grupo que consiste en: -

45 CH2NH--, -CH2S-, -CH2-CH2--, --CH=CH-(cis y trans), --COCH2--, CH(OH)CH2--y -CH2SO--, con métodos bien conocidos en la técnica. La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia consenso con un Daminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) se puede usar para generar estilos más estables. Además, se pueden generar péptidos limitados que comprenden una secuencia consenso o una variación de secuencia consenso básicamente idéntica con métodos conocidos en la técnica (Rizo y Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61: 387 (1992)); por ejemplo, mediante la adición de restos internos de cisteína capaces de formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclan el péptido.

El término "agente" se usa en el presente documento para indicar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica, o un extracto preparado a partir de materiales biológicos.

55 Como se usa en el presente documento, los términos "etiqueta" o "etiquetado" se refiere a incorporación de un marcador detectable, por ejemplo, mediante incorporación de un aminoácido radiomarcado o unión a un polipéptido de restos de biotinilo que se pueden detectar con una avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que se puede detectar con métodos ópticos o calorimétricos). En ciertas situaciones, la etiqueta o marcador también puede ser terapéutico. En la técnica se conocen y se pueden usar diversos métodos de etiquetado de polipéptidos y glicoproteínas. Algunos ejemplos de etiquetas para polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), etiquetas fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, lantánidos fósforos), etiquetas enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina),

65 quimioluminiscentes, grupos biotinilo, epítopos de polipéptido determinados previamente reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias de padres de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos

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secundarios, dominios de unión o metal, etiquetas de epítopo). En algunas realizaciones, las etiquetas se unen con brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el impedimento estérico potencial. La expresión "agente o fármaco farmacéutico", como se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto químico o composición capaces de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administran de forma adecuada a un paciente.

5 En el presente documento se usan otros términos químicos de acuerdo con uso convencional en la técnica, como se hacia modo de ejemplo con The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)).

La expresión "agente antineoplásico" se usa en el presente documento para hacer referencia a agentes que tienen la propiedad funcional de inhibir un desarrollo o evolución de una neoplasia en un ser humano, en particular una lesión maligna (cancerosa), tal como un carcinoma, sarcoma, linfoma, o leucemia. La inhibición de la metástasis es frecuentemente una propiedad de los agentes antineoplásicos.

15 Como se usa en el presente documento, "básicamente puro" se refiere a una especie de objeto que es la especie predominante presente (es decir, en una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición), y preferentemente una fracción básicamente purificada es una composición en la que la especie de objeto comprende al menos aproximadamente un 50 por ciento (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes.

Por lo general, una composición básicamente pura comprenderá más de aproximadamente un 80 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la composición, más preferentemente más de aproximadamente un 85 %, 90 %, 95 %, y un 99 %. Más preferentemente, la especie de objeto se purifica hasta una homogeneidad esencial (las especies contaminantes no se pueden detectar en la composición con métodos de detección

25 convencionales) en la que la composición consiste básicamente en una sola especie macromolecular.

Algunas enfermedades autoinmunitarias incluyen, por ejemplo, Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA, que es una enfermedad vírica con un componente autoinmunitario), alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolipídico, enfermedad de Addison autoinmunitaria, anemia hemolítica autoinmunitaria, hepatitis autoinmunitaria, enfermedades autoinmunitarias del oído interno (AIED), síndrome linfoproliferativo autoinmunitario (ALPS), púrpura trombocitopénica autoinmunitaria (ATP), enfermedad de Behcet, cardiomiopatía, enfermedad celiaca, dermatitis hepetiforme; síndrome de disfunción inmunitaria y fatiga crónica (CFIDS), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIPD), pénfigo cicatricial, enfermedad de aglutinina fría, síndrome de CREST, enfermedad de Crohn, enfermedad de Degos, dermatomiositis juvenil, lupus discoide, crioglobulinemia mixta

35 esencial, fibromialgia, fibromiositis, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barré, tiroiditis de Hashimoto, fibrosis pulmonar idiopática, púrpura trombocitopénico idiopática (ITP), nefropatía de IgA, diabetes mellitus dependiente de insulina, artritis crónica juvenil (enfermedad de Still), artritis reumatoide juvenil, enfermedad de Ménière, enfermedad mixta de tejido conector, esclerosis múltiple, miastenia gravis, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, policondritis, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiositis y dermatomiositis, agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, psoriasis, artritis psoriática, fenómenos de Raynaud, síndrome de Reiter, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia (esclerosis sistémica progresiva (PSS), también conocida como esclerosis sistémica (SS)), síndrome de Sjögren, síndrome de la persona rígida, lupus sistémico eritematoso, arteritis de Takayasu, arteritis temporal/arteritis de células gigantes, colitis ulcerosa, uveítis, vitíligo y granulomatosis de Wegener.

45 Algunos trastornos inflamatorios incluyen, por ejemplo, trastornos inflamatorios crónicos y agudos. Algunos ejemplos de trastornos inflamatorios incluyen enfermedad de Alzheimer, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, alergia atópica, alergia, aterosclerosis, asma bronquial, eccema, glomerulonefritis, enfermedad de injerto frente a hospedador, anemias hemolíticas, osteoartritis, septicemia, ictus, trasplante de tejidos y órganos, vasculitis, retinopatía diabética y lesión pulmonar inducida por ventilador.

Algunos cánceres incluyen, por ejemplo, enfermedad de mieloma múltiple (MM), carcinoma de células renales (RCC), leucemia de células plasmáticas, linfoma, trastorno B-linfoproliferativo (BLPD), y cáncer de próstata.

55 Anticuerpos huIL-6Rc

Los anticuerpos monoclonales de la invención (por ejemplo, anticuerpos monoclonales totalmente humanos) tienen la capacidad de inhibir la señalización celular mediada por IL-6Rc. La inhibición se determina, por ejemplo, usando el ensayo celular que se describe en el presente documento en el Ejemplo 1 y 2.

Los anticuerpos de la invención incluyen, por ejemplo, el anticuerpo 39B9 VL1, el anticuerpo 12A, y el anticuerpo 5C. Estos anticuerpos muestran especificidad hacia la IL-6Rc humana y/o tanto hacia IL-6Rc como hacia IL-6R y se ha mostrado que inhiben la actividad funcional de IL-6Rc (es decir, la unión a gp130 para inducir la cascada de señalización) in vitro.

65 Cada uno de los anticuerpos monoclonales huIL-6Rc descritos en el presente documento incluye una región variable

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(por ejemplo, Nº de Referencia P08887 en GenBank). Los anticuerpos de invención se unen de forma específica a IL-6Rc, en la que el anticuerpo se une a un epítopo que incluye uno o más restos de aminoácidos en la IL-6 humana (por ejemplo, Nº de Referencia NP_000591 en GenBank), IL-6R (por ejemplo, Nº de Referencia P08887 en GenBank), o ambos.

5 Los expertos en la materia reconocerán que es posible determinar, sin experimentación excesiva, si un anticuerpo monoclonal (por ejemplo, anticuerpo monoclonal totalmente humano) tiene la misma especificidad que un anticuerpo monoclonal de la invención (por ejemplo, los clones 39B9 VL1, 39B9 VL5, 12A y 5C) determinando si el primero evita que el último se una a gp130. Si el anticuerpo monoclonal que se está sometiendo a ensayo compite con el anticuerpo monoclonal de la invención, como se muestra con una disminución en la unión con el anticuerpo monoclonal de la invención, entonces los dos anticuerpos monoclonales se unen al mismo epítopo, o a uno muy relacionado.

Un método alternativo para determinar si un anticuerpo monoclonal tiene la especificidad de anticuerpo monoclonal

15 de la invención es incubar previamente el anticuerpo monoclonal de la invención con proteína IL-6Rc o IL-6R solubles (que normalmente es muy reactiva), y a continuación añadir el anticuerpo monoclonal que se está sometiendo a ensayo para determinar si se inhibe la capacidad del anticuerpo monoclonal que se está sometiendo a ensayo para unirse a IL-6Rc y/o tanto a IL-6Rc como a IL-6R. Si el anticuerpo monoclonal que se está sometiendo a ensayos se inhibe entonces, con toda probabilidad, tienen la misma especificidad epitópica, o funcionalmente equivalente que el anticuerpo monoclonal de la invención.

La identificación sistemática de anticuerpos monoclonales también se puede realizar, por ejemplo midiendo la activación mediada por el receptor de IL-6 receptor de las rutas de JAK/STAT y/o cascada de señalización de MAPK, y determinando si el anticuerpo monoclonal de ensayo es capaz de modular, bloquear, inhibir, reducir, antagonizar,

25 neutralizar o de otro modo interferir con la señalización de IL-6.

Diversos procedimientos conocidos dentro de la técnica se pueden usar para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos frente a IL-6Rc y/o tanto a IL-6Rc como a IL-6R, o frente a derivados, fragmentos, análogos, homólogos u ortólogos de los mismos (Véase, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, y Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Los anticuerpos totalmente humanos son moléculas de anticuerpo en las que toda la secuencia tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada, incluyendo las CDR, surgen a partir de genes humanos. En el presente documento, tales anticuerpos se denominan "anticuerpos humanos", o "anticuerpos totalmente humanos". Los anticuerpos monoclonales humanos se preparan, por ejemplo, usando los procedimientos que se describen en los Ejemplos que se proporcionan a continuación. Los

35 anticuerpos monoclonales humanos también se pueden preparar usando la técnica de trioma; la técnica de hibridoma de linfocitos B humanos (véase Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72); y la técnica de hibridoma de EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (véase Cole, et al., 1985 En: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Los anticuerpos monoclonales humanos se pueden usar y se pueden producir usando hibridomas humanos (véase Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030) o mediante transformación de linfocitos B humanos con Virus de Epstein Barr in vitro (véase Cole, et al., 1985 En: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96).

Los anticuerpos se purifican con técnicas bien conocidas, tales como cromatografía por afinidad usando proteína A o proteína G, que proporcionan principalmente la fracción de IgG de suero inmunitario. Posteriormente, o como

45 alternativa, el antígeno específico que es la diana de la inmunoglobulina buscada, o un epítopo de la misma, se puede inmovilizar en una columna para purificar el anticuerpo específico inmunitario mediante cromatografía de inmunoafinidad. La purificación de inmunoglobulinas se analiza, por ejemplo, en D. Wilkinson (The Scientist, publicado por The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol. 14, Nº 8 (17 de abril de 2000), pp. 25-28).

Los anticuerpos de la invención (por ejemplo, 39B9 VL1, 12A y 5C) son anticuerpos monoclonales totalmente humanos. Los anticuerpos monoclonales que bloquean, inhiben, reducen, antagonizan, neutralizan o de otro modo interfieren con la señalización celular mediada por IL-6Rc se generan, por ejemplo, mediante inmunización de un animal con IL-6Rc unida a membrana y/o soluble, tal como, por ejemplo, IL-6Rc de murino, rata o ser humano o un fragmento inmunogénico, derivado o variante del mismo. Como alternativa, el animal se inmuniza con células

55 transfectadas con un vector que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica IL-6Rc de modo que IL-6Rc se expresa y se asocia con la superficie de las células transfectadas. Como alternativa, los anticuerpos se obtienen mediante identificación sistemática de una biblioteca que contiene secuencias de dominio de unión a anticuerpo o a antígeno para unión a IL-6Rc. Esta biblioteca se prepara, por ejemplo, en bacteriófago como fusiones de proteína o péptido a una proteína de revestimiento de bacteriófago que se expresa en la superficie de las partículas de fago ensambladas y la codificación de secuencias de ADN contenidas dentro de las partículas del fago (es decir, "biblioteca de presentación de fagos"). A continuación, los hibridomas que resultan de las fusiones células de mieloma/linfocitos B se identifican sistemáticamente para reactividad hacia IL-6Rc y/o tanto hacia IL-6Rc como hacia IL-6R.

65 Los anticuerpos monoclonales se preparan, por ejemplo, usando métodos de hibridoma, tales como los que se describen en Kohler y Milstein, Nature, 256: 495 (1975). En un método de hibridoma, un ratón, hámster, u otro

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la inmunoglobulina administrada.

Se genera un anticuerpo huIL-6Rc, por ejemplo, usando los procedimientos que se describen en los Ejemplos que se proporcionan a continuación.

5 En otros métodos alternativos, se desarrolla un anticuerpo huIL-6Rc, por ejemplo, usando métodos de presentación de fagos usando anticuerpos que contienen solamente secuencias humanas. Tales enfoques se conocen bien en la técnica, por ejemplo, en el documento WO92/0104 en el documento de Patente de Estados Unidos Nº 6.521.404. En este enfoque, una biblioteca combinatoria de fagos que portan padres aleatorios de cadenas ligeras y pesadas se identifica sistemáticamente usando fuentes naturales o recombinantes de IL-6Rc o fragmentos de las mismas. En otro enfoque, se puede producir un anticuerpo huIL-6Rc con un proceso en el que al menos una etapa del proceso incluye inmunización de un animal no humanos, transgénico con proteína IL-6Rc humana. En este enfoque, algunos de los sitios de cadena pesada y/o ligera kappa endógenos de este animal no humano xenogénico sean discapacitado y son incapaces del reordenamiento necesario para generar genes que codifican inmunoglobulinas

15 como respuesta a un antígeno. Además, al menos un sitio de cadena pesada humana y al menos un sitio de cadena ligera humana sean transfectados de forma estable en el animal. Por lo tanto, como respuesta a un antígeno administrado, los sitios humanos se reordenan para proporcionar genes que codifican regiones variables humanas inmunoespecíficas para el antígeno. Por lo tanto, después de la inmunización, el xenorratón produce linfocitos B que secretan inmunoglobulinas totalmente humanas.

En la técnica se conoce bien una diversidad de técnicas para producir animales no humanos xenogénicos. Por ejemplo, véanse los documentos de Patente de Estados Unidos Nº 6.075.181 y Nº 6.150.584. Esta estrategia general se demostró en conexión con la generación de las primeras cepas de XenoMouse™ como se publicó en 1994. Véase Green et al., Nature Genetics 7: 13-21 (1994), Véanse también, los documentos de Patente de Estados

25 Unidos Nºs 6.162.963, 6.150.584, 6.114.598, 6.075.181, y 5.939.598 y los documentos de patentes japonesa Nºs 3 068 180 B2, 3 068 506 B2, y 3 068 507 B2 y el documento de patente europea Nº EP 0 463 151 B1 y las Solicitudes de Patente Internacional Nºs WO 94/02602, WO 96/34096, WO 98/24893, WO 00/76310 y miembros relacionados de la familia.

En un enfoque alternativo, otros han usado un enfoque de "minisitio" en el que se imita un sitio de Ig exógeno a través de la inclusión de piezas (genes individuales) del sitio de Ig. Por lo tanto, se forma uno o más genes de VH, uno o más genes de DH, uno o más genes de JH, una región constante mu, y una secundar región constante (preferentemente una región constante gamma) en una construcción para inserción en un animal. Véanse, por ejemplo, los documentos de Patente de Estados Unidos Nºs 5.545.806; 5.545.807; 5.591.669; 5.612.205; 5.625.825;

35 5.625.126; 5.633.425; 5.643.763; 5.661.016; 5.721.367; 5.770.429; 5.789.215; 5.789.650; 5.814.318; 5,877.397; 5.874.299; 6.023.010; y 6.255.458; y documento de patente europea Nº 0 546 073 B1; y Solicitudes de Patente Internacional Nºs WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, y WO 98/24884 y miembros relacionados de la familia.

También se ha demostrado la generación de anticuerpos humanos a partir de ratones en los que se han introducido, a través de fusión microcelular, grandes partes de cromosomas, o cromosomas enteros. Véanse las Solicitudes de Patente Internacional Nºs 773 288 y 843 961.

Algunas respuestas de anticuerpo anti-ratón humano (HAMA) han llevado a la industria a preparar anticuerpos

45 quiméricos o de otro modo humanizados. Aunque los anticuerpos quiméricos tienen una región constante humana y una región variable inmunitaria, se espera observar ciertas respuestas del anticuerpo anti-quimérico humano (HACA), en particular usos crónicos o de múltiples dosis del anticuerpo. Por lo tanto, sería deseable proporcionar anticuerpos totalmente humanos frente a IL-6Rc y/o tanto frente a IL-6Rc como a IL-6R para aliviar o de otro modo aliviar las preocupaciones y/o efectos de las respuestas de HAMA o HACA.

La producción de anticuerpos con inmunogenicidad reducida también se consigue mediante técnicas de humanización, quimerización y presentación usando bibliotecas apropiadas. Se observará que algunos anticuerpos murinos o anticuerpos de otras especies se pueden humanizar o primatizar usando técnicas bien conocidas en la técnica. Véase por ejemplo, Winter y Harris Immunol Today 14: 43 46 (1993) y Wright et al., Crit, Reviews in 55 Immunol. 12125-168 (1992). El anticuerpo de interés se puede someter a ingeniería mediante técnicas de ADN recombinante para sustituir los dominios CH1, CH2, CH3, dominios bisagra, y/o el dominio marco con la secuencia humana correspondiente (véase el documento WO 92102190 y los documentos de Patente de Estados Unidos Nºs 5.530.101; 5.585.089; 5.693.761; 5.693.792;, 5.714.350; y 5.777.085). Además, en la técnica se conoce el uso de ADNc de Ig para construcción de genes quiméricos de inmunoglobulina quimérica (Liu et al., P.N.A.S. 84: 3439 (1987) y J. Immunol. 139: 3521 (1987)). El ARNm se aísla de un hibridoma u otra célula que produce el anticuerpo y se usa para producir ADNc. El ADNc de interés se puede amplificar con la reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores específicos (documentos de Patente de Estados Unidos Nºs 4.683.195 y 4.683.202). Como alternativa, una biblioteca se prepara y se identifica sistemáticamente para aislar la secuencia de interés. La secuencia de ADN que codifica la región variable del anticuerpo a continuación se fusiona con secuencias de región 65 constante humana. Las secuencias de genes de regiones constantes humanas genes se pueden encontrar en Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of immunological Interest, publicación de N.I.H. nº 91-3242. Los genes de la

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adecuado. Para detalles adicionales de generación de anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).

De acuerdo con otro enfoque que se describe en el documento WO 96/27011, la superficie de contacto entre un par

5 de moléculas de anticuerpos se puede modificar por ingeniería para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan a partir del cultivo de células recombinantes. La superficie de contacto preferente comprende al menos una parte de la región CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácido pequeño de la superficie de contacto de la primera molécula de anticuerpos se sustituyen con cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). En la superficie de contacto de la segunda molécula de anticuerpo se crean "cavidades" de compensación de tamaño idéntico o similar con respecto a la cadena o cadenas laterales grandes mediante la sustitución de cadenas laterales de aminoácidos grandes con otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento de heterodímero con respecto a otros productos finales no deseados tales como homodímeros.

15 Algunos anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos de F(ab’)2). En la bibliografía se han descrito algunas técnicas para la generación de anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpo. Por ejemplo, algunos anticuerpos biespecíficos se pueden preparar usando unión química. Brennan et al., Science 229: 81 (1985) describen un procedimiento en el que algunos anticuerpos intactos se escinden de forma proteolítica para generar fragmentos de F(ab’)2. Estos fragmentos se reducen en presencia de del agente de formación de complejos de ditiol, arsenito sódico, para estabilizar los ditioles vecinos y para evitar la formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos de Fab’ generados a continuación se convierten en derivados de tionitrobenzoato (TNB). A continuación, uno de los derivados de Fab’-TNB se reconvierte en el Fab’-tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab’-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los

25 anticuerpos biespecíficos producidos se pueden usar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.

Además, algunos fragmentos de Fab’ se pueden recuperar directamente de E. coli se pueden acoplar químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992) describen la producción de una molécula de F(ab’)2 de anticuerpo biespecífico totalmente humanizado. Cada fragmento de Fab’ se secreto por separado de E. coli y se sometió a acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico formado de este modo era capaz de unirse a células que sobreexpresaban el receptor ErbB2 y linfocitos T humanos normales, así como de desencadenar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos con respecto a dianas de tumor de mama humano.

35 También se han descrito diversas técnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpo biespecífico directamente a partir de cultivo de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos usando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol. 148 (5): 1547-1553 (1992). Los péptidos de cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las porciones de Fab’ de dos anticuerpos diferentes mediante fusión genética. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y a continuación para volver a oxidarlos para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este método también se puede usar para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpo" que se describe en Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993) a proporcionar un mecanismo alternativo para la preparación de fragmentos de anticuerpo biespecífico. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) con un conector que es demasiado corta como para permitir

45 el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios VH y VL de un fragmento se ven forzados a emparejarse con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, formando de este motor dos sitios de unión al antígeno. También se ha informado de otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico mediante el uso de dímeros de Fv de una sola cadena (sFv). Véase, Gruber et al., J. Immunol. 152: 5368 (1994).

Se contemplan algunos anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991).

Algunos anticuerpos biespecíficos a modo de ejemplo se pueden unir a dos epítopos diferentes, al menos uno de los

55 cuales se origina en el antígeno de proteína de la invención. Como alternativa, un brazo anti-antigénico de una molécula de inmunoglobulina se puede combinar con un brazo que se une a una molécula de estimulación en un leucocito tal como una molécula receptora de linfocitos T (por ejemplo, CD2, CD3, CD28, o B7), o receptores de Fc para IgG (FcγR), tales como FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) y FcγRIII (CD16) con el fin de centrarse en mecanismos de defensa celular para la célula que expresan el antígeno en particular. Algunos anticuerpos biespecíficos también se pueden usar para dirigir agentes citotóxicos a células que expresan un antígeno en particular. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión al antígeno y un brazo que une a un agente citotóxico o un agente quelante de radionúclido, tal como EOTUBE, DPTA, DOTA, o TETA. Otro anticuerpo biespecífico de interés se une al antígeno de proteína que se describe en el presente documento y adicionalmente se une al factor tisular (TF).

65 Dentro del alcance de la presente invención también se encuentran algunos anticuerpos de heteroconjugado. Los anticuerpos de heteroconjugado están formados por dos anticuerpos unidos de forma covalente. Tales anticuerpos

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en el bloqueo de la fosforilación de STAT-3 inducida por la señalización cis.

EJEMPLO 6: NI-1201 bloquea la trans-señalización de IL-6 mediada por shuIL-6Rc

5 Las células PEAK se transfectar un de forma transitoria con el plásmido indicador de Luciferasa (dependiente de STAT3 promotor). Se sembraron 2,5 x 104 células por pocillo en placas de fondo plano de 96 pocillos en DMEM que contenía suero de ternero fetal al 0,5 %. Después de 4-6 h de adhesión celular, las células PEAK se activaron con 30 ng/ml de shuIL-6Rc con dosis crecientes de los mAb indicados. 18 h después, el medio se retiró y el ensayo de Luciferasa se realizó usando el sistema de Ensayo de Luciferasa Steady-Glo® (Promega) en un analizador de

10 quimioluminiscencia. Todas las variantes de NI-1201 neutralizaron, de una manera dependiente de la dosis, la actividad de shuIL-6Rc mientras que el mAb de control fallo en el bloqueo de la actividad del complejo formado previamente (Fig 4).

EJEMPLO 7: Afinidad y cinética de unión de anticuerpos huIL-6Rc

15 La capacidad de NI-1201 para unirse a huIL-6R unido a la membrana nativa se evaluó usando análisis de citometría de flujo en la línea de células de hepatoma HepG2. La tinción de la superficie celular se realiza en células HepG2 con diferentes dosis de los mAb. La unión de los mAb primarios sin conjugar (mAb de Control, huIgGl y mAb de NI1201) se detectó con IgG de cabra anti-humana con Alexa Fluor 647 (H+L) (Invitrogen). Cada experimento se realizó

20 por triplicado. La media de la intensidad de fluorescencia (MFI) se representa y demuestra un aumento de la afinidad aparente de NI-1201 para la IL-6R de membrana en comparación con el mAb de control (Fig. 5).

La afinidad y la cinética de unión de candidatos de NI-1201 (A-D), NI-1201 WT (de tipo silvestre, Wild Type) y mAb de control se caracterizaron en un instrumento Biacore 2000 (Biacore AB, Uppsala, Suecia). Se usó un chip CM5 de 25 Biacore y 1640 RU (unidades de respuesta) de un Fc de IgG anti-humana (Biacore AB, Uppsala, Suecia) se inmovilizó mediante química de EDC/NHS. Esta superficie se usó para capturar candidatos de NI-1201, NI-1201 WT y el mAb de control. La superficie se regeneró después de cada ciclo por inyección de cloruro de magnesio 3 M a 20 µl/min, durante 30 s seguido de 1 min de tiempo de estabilización en tampón HBS-EP (Biacore AB, Uppsala, Suecia). La unión se midió pasando IL-6R humana soluble sin vehículo de analitos (shuIL6-R; R&D), IL-6Rc humana 30 soluble (shuIL-6Rc) e IL-6R de mono cinomolgo soluble (scyIL-6R) por duplicado en las siguientes concentraciones: 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,25 nM y 0 nM. Todas las soluciones se diluyeron en tampón HBS-EP. La inyección se realizó a 50 µl/min durante 3 min seguido de 12 min de tiempo de disociación y la temperatura se ajustó a 25 ºC. Los datos se ajustaron de acuerdo con un modelo de Langmuir a 1:1 y se determinaron los valores de Kactivada, Kdesactivada y KD. Las afinidades y las constantes cinéticas de las variantes A-D de NI-1201, NI-1201 WT y

35 mAb de control se resumen en the Tabla 4. Mediante la confirmación de los ensayos funcionales usando cualquiera de IL-6Rc nativo o formado previamente, NI-1201 demostraba una afinidad subnanomolar para el complejo mientras que el mAb de control no presentaba unión mensurable.

Tabla 2. Constantes cinéticas y de afinidad medidas con Biacore

Analito: Muestra Kactivada (1/Ms) Kdesactivada (1/s) KD (M)

shuIL-6R: NI-1201 A 8,29E+05 1,10E-04 1,21E-10

NI-1201 B: 8,75E+05 9,40E-05 1,07E-10

NI-1201 C: 9,92E+05 1,10E-04 1,10E-10

NI-1201 D: 7,61E+05 1,02E-04 1,34E-10

NI-1201 WT: 1,33E+06 7,53E-05 5,67E-11

mAb de Control: 4,14E+05 3,99E-04 9,65E-10

shuIL-6Rc: NI-1201 A 5,01E+04 2,46E-04 4,92E-09

NI-1201 B: 5,34E+04 2,37E-04 4,43E-09

NI-1201 C: 4,77E+04 2,40E-04 5,03E-09

NI-1201 D: 4,53E+04 2,22E-04 4,89E-09

NI-1201 WT: 4,31E+04 2,43E-04 5,64E-09

mAb de Control: N.D. N.D. N.D.

scyIL-6R: NI-1201 A 1,04E+05 2,13E-04 2,05E-09

NI-1201 B: 1,15E+05 2,07E-04 1,81E-09

NI-1201 C: 1,11E+05 2,25E-04 2,03E-09

NI-1201 D: 1,12E+05 2,00E-04 1,79E-09

NI-1201 WT: 1,06E+05 2,15E-04 2,04E-09

mAb de Control: 2,68E+04 4,63E-04 1,73E-08

shuIL-6R = Receptor de IL-6 humana soluble; shuIL-6Rc = complejo de Receptor de IL-6/IL-6 humano soluble; scyIL-6R = Receptor de IL-6 de mono cinomolgo soluble; N.D. = unión no detectada.

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Claims

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