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CN111638332B - 一种新型冠状病毒IgA/IgM/IgG抗体ELISA检测试剂盒 - Google Patents

一种新型冠状病毒IgA/IgM/IgG抗体ELISA检测试剂盒 Download PDF

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CN111638332B CN202010669794.6A CN202010669794A CN111638332B CN 111638332 B CN111638332 B CN 111638332B CN 202010669794 A CN202010669794 A CN 202010669794A CN 111638332 B CN111638332 B CN 111638332B
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Abstract

本发明公开了一种新型冠状病毒IgA/IgM/IgG抗体ELISA检测试剂盒，属于生物检测技术领域，本发明试剂盒包括酶标板、底物液、样品稀释液、阳性对照液、阴性对照液、浓缩洗涤液、酶结合物和终止液，酶标板预包被新型冠状病毒S+N重组蛋白，酶结合物为为辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgA/IgM/IgG‑HRP抗体稀释液，通过抗原抗体的免疫特异性反应进行检测，以定性判定测试样本中是否存在新型冠状病毒抗体，具有高灵敏度和高特异性；本发明试剂盒通过抗原抗体的免疫特异性反应进行检测，具有高特异性、准确性强的特点，步骤简便，设计合理，适合推广。

Description

一种新型冠状病毒IgA/IgM/IgG抗体ELISA检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种新型冠状病毒IgA/IgM/IgG抗体ELISA检测试剂盒。
背景技术
新型冠状病毒(2019-nCoV)常见体征有发热、乏力、干咳、逐渐出现呼吸困难，而部分患者症状轻微，甚至存在无临床症状的患者，具备人传人的特点，一般潜伏期1-14天，且潜伏期具有传染性，而无症状感染者也可能成为传染源，其主要通过呼吸道飞沫和密切接触传染传播，人群普遍易感。
目前，2019-nCoV核酸检测是诊断COVID-19的常规检测方法和确诊依据。然而，受样本采集与存放、病毒感染的部位、RNA提取方法以及核酸检测试剂盒质量问题等多方面因素影响，核酸检测存在假阴性的问题。随着2019-nCoV IgM和IgG抗体免疫检测试剂盒的研发，抗体检测可以非常有效地弥补核酸检测漏检的风险，在COVID-19及时诊治及防控中发挥重大的实验室诊断价值。
目前，用于2019-nCoV IgM/IgG抗体检测的方法和相应的试剂盒，有一定的研究和报道，也有一定的产品上市。现有检测2019-nCoV抗体的方法包括普通ELISA方法、荧光免疫法、放射免疫法及化学发光法等均有一定的缺点。普通ELISA试剂盒多用原核表达的重组蛋白或培养的全病毒做包被抗原，但其灵敏度和特异性较低。因此，由于2019-nCov-SARS的特殊性质，亟需研发一种特异性好、灵敏度高的新型冠状病毒ELISA检测试剂盒。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型冠状病毒IgA/IgM/IgG抗体ELISA检测试剂盒，以解决上述现有技术存在的问题，该试剂盒采用His+N蛋白基因+甘氨酸柔性肽+S蛋白基因插入到PET-28a载体中构建成原核表达载体获取重组蛋白，将其包被微孔板，组成2019-nCoVIgA/IgM/IgG抗体的试剂盒，该试剂盒除了具有普通ELISA检测试剂盒的优点外，还弥补了重组抗原导致的灵敏度低的缺点，提高了检测的灵敏度和特异性。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种新型冠状病毒IgA/IgM/IgG抗体ELISA检测试剂盒，包括酶标板、底物液、样品稀释液、阳性对照液、阴性对照液、浓缩洗涤液、酶结合物和终止液，所述酶标板预包被新型冠状病毒S+N重组蛋白；
所述酶结合物为用酶标稀释液按工作浓度配制的鼠抗人IgA/IgM/IgG工作液。
进一步地，所述酶结合物为辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgA/IgM/IgG-HRP抗体稀释液。
进一步地，所述新型冠状病毒使用质量浓度1-10％的牛血清蛋白封闭后包被。
进一步地，所述新型冠状病毒的包被量为0.1μg/well。
进一步地，所述样品稀释液为含质量分数1-10％牛血清蛋白的pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液。
进一步地，所述浓缩洗涤液为含体积分数0.05％吐温-20的pH 7.2-7.4的磷酸盐缓冲液，所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。
进一步地，所述阳性对照液为在样品稀释液中按1:30～1:100的比例加入阳性血清制成，阳性对照液的吸光度值大于1.0；
所述阴性对照血清为在样品稀释液中，按5wt％的比例加入阴性血清制成，阴性对照液的吸光度值小于0.1。
进一步地，所述新型冠状病毒S+N重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
(1)根据GenBank中报道的SARS-COV-2的N和S蛋白基因序列，设计特异性引物，分别用于N和S蛋白两种基因的扩增；通过目的片段扩增、酶切、连接和转化，将N蛋白基因+甘氨酸柔性肽+S蛋白基因+His基因插入到PET-28a载体中，得到含有N和S蛋白基因序列的质粒，序列如SEQ ID No.1所示，N蛋白基因全长1257bp，编码419个氨基酸，S蛋白基因全长1479bp，编码493个氨基酸；
(2)将含有N和S蛋白基因序列的质粒，使用大肠杆菌进行蛋白表达，将菌体超声后，取沉淀用50mM Tris+2M尿素pH＝12进行过夜溶解后，离心，取上清透析至pH＝9.5的Tris溶液中获取蛋白；
透析步骤如下：将NTA树脂装入层析柱，将目标蛋白加到NTA层析柱中，并用10倍NTA体积的NTA-0Buffer洗涤，流速15mL/h，收集穿透部分，然后分别用5倍NTA体积NTA-20、NTA-40、NTA-60、NTA-100和NTA-500洗脱，流速15mL/h，收集洗脱液；
(3)SDS/PAGE进行分析确定目标蛋白在洗脱液中的分布情况，收集目的蛋白。
本发明公开了以下技术效果：
本发明新型冠状病毒IgA/IgM/IgG抗体ELISA检测试剂盒采用His+N蛋白基因+甘氨酸柔性肽+S蛋白基因插入到PET-28a载体中构建成原核表达载体获取重组蛋白，将其包被微孔板，组成2019-nCoV IgA/IgM/IgG抗体的试剂盒，该试剂盒除了具有普通ELISA检测试剂盒的优点外，还弥补了重组抗原导致的灵敏度低的缺点，提高了检测的灵敏度和特异性。
本发明试剂盒包括酶标板、底物液、样品稀释液、阳性对照液、阴性对照液、浓缩洗涤液、酶结合物和终止液，酶标板预包被新型冠状病毒S+N重组蛋白，酶结合物为为辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgA/IgM/IgG-HRP抗体稀释液，通过抗原抗体的免疫特异性反应进行检测，以定性判定测试样本中是否存在新型冠状病毒抗体，具有高灵敏度和高特异性。
本发明的新型冠状病毒IgA/IgM/IgG抗体ELISA检测试剂盒，通过抗原抗体的免疫特异性反应进行检测，具有高特异性、准确性强的特点，步骤简便，设计合理，适合推广。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1的重组蛋白的SDS/PAGE电泳图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
新型冠状病毒S+N重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
(1)根据GenBank中报道的SARS-COV-2的N和S蛋白基因序列，设计特异性引物，分别用于N和S蛋白两种基因的扩增；通过目的片段扩增、酶切、连接和转化，将N蛋白基因+甘氨酸柔性肽+S蛋白基因+His基因插入到PET-28a载体中，得到含有N和S蛋白基因序列的质粒，序列如SEQ ID No.1所示，N蛋白基因全长1257bp，编码419个氨基酸，S蛋白基因全长1479bp，编码493个氨基酸；
(2)将含有N和S蛋白基因序列的质粒，使用大肠杆菌进行蛋白表达，将菌体超声后，取沉淀用50mM Tris+2M尿素pH＝12进行过夜溶解后，离心，取上清透析至pH＝9.5的Tris溶液中获取蛋白；
透析步骤如下：将NTA树脂装入层析柱，将目标蛋白加到NTA层析柱中，并用10倍NTA体积的NTA-0Buffer洗涤，流速15mL/h，收集穿透部分，然后分别用5倍NTA体积NTA-20、NTA-40、NTA-60、NTA-100和NTA-500洗脱，流速15mL/h，收集洗脱液；
(3)SDS/PAGE进行分析确定目标蛋白在洗脱液中的分布情况，如图1所示，收集目的蛋白。
NAT buffer：20mmol/L Tris-Hcl，PH7.9，0.5mol/L NaCl，10％Glyerol；
NAT buffer-20：20mmol/L Tris-Hcl，PH7.9，0.5mol/L NaCl，10％Glyerol；20mmol/L Imidazole；
NAT buffer-40：20mmol/L Tris-Hcl，PH7.9，0.5mol/L NaCl，10％Glyerol；40mmol/L Imidazole；
NAT buffer-60：20mmol/L Tris-Hcl，PH7.9，0.5mol/L NaCl，10％Glyerol；60mmol/L Imidazole；
NAT buffer-100：20mmol/L Tris-Hcl，PH7.9，0.5mol/L NaCl，10％Glyerol；100mmol/L Imidazole；
NAT buffer-500：20mmol/L Tris-Hcl，PH7.9，0.5mol/L NaCl，10％Glyerol；500mmol/L Imidazole。
实施例2
一种新型冠状病毒IgA/IgM/IgG抗体ELISA检测试剂盒，包括酶标板、底物液、样品稀释液、阳性对照液、阴性对照液、浓缩洗涤液、酶结合物和终止液，所述酶标板预包被新型冠状病毒S+N重组蛋白。
本实施例中，所述酶结合物为辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgA/IgM/IgG-HRP抗体稀释液。
本实施例中，所述新型冠状病毒使用质量浓度5％的牛血清蛋白封闭后包被。
本实施例中，所述新型冠状病毒的包被量为0.1μg/well。
本实施例中，所述样品稀释液为含质量分数5％牛血清蛋白的pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液。
本实施例中，所述浓缩洗涤液为含体积分数0.05％吐温-20的pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液，所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。
本实施例中，所述底物液含有0.06wt％TMB盐酸盐的柠檬酸缓冲液、0.001wt％的硫代硫酸钠和0.02wt％的碳酸钠。
本实施例中，所述阳性对照液为在样品稀释液中按1:70的比例加入阳性血清制成，阳性对照液的吸光度值大于1.0；
所述阴性对照血清为在样品稀释液中，按5wt％的比例加入阴性血清制成，阴性对照液的吸光度值小于0.1。
实施例3
一种新型冠状病毒IgA/IgM/IgG抗体ELISA检测试剂盒，包括酶标板、底物液、样品稀释液、阳性对照液、阴性对照液、浓缩洗涤液、酶结合物和终止液，所述酶标板预包被新型冠状病毒S+N重组蛋白。
本实施例中，所述酶结合物为辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgA/IgM/IgG-HRP抗体稀释液。
本实施例中，所述新型冠状病毒使用质量浓度1％的牛血清蛋白封闭后包被。
本实施例中，所述新型冠状病毒的包被量为0.1μg/well。
本实施例中，所述样品稀释液为含质量分数10％牛血清蛋白的pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液。
本实施例中，所述浓缩洗涤液为含体积分数0.05％吐温-20的pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液，所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。
本实施例中，所述阳性对照液为在样品稀释液中按1:30的比例加入阳性血清制成，阳性对照液的吸光度值大于1.0；
所述阴性对照血清为在样品稀释液中，按5wt％的比例加入阴性血清制成，阴性对照液的吸光度值小于0.1。
试验例1采用实施例1的试剂盒进行检测试验
1.试剂和样本准备：
试剂使用前先复温；
浓缩洗涤液稀释：取25mL浓缩洗涤液加入475mL纯化水稀释，振荡混匀。
酶结合物稀释：取1mL样品稀释液，加入10μL酶结合物，震荡混匀。
待测样本：将待测样本进行100倍预稀释。取2μL待测样本加入198μL样品稀释液，震荡混匀。
2.检测方法
取出所需的酶标板，恢复至室温，每孔加入300μL稀释的洗液，静置30s。加入阴性对照液3孔和阳性对照液2孔，每孔100μL。加入稀释后的待测样本，每孔100μL。
用封板膜封板，37℃孵育30min。弃去液体，使用自动洗板机，每孔加入300μL洗涤液(1×)，重复5次，最后一次于干净的纸巾上拍干。所有孔加入100μL稀释的鼠抗人IgA/IgM/IgG-HRP抗体。用封板膜封板，37℃孵育30min。洗涤3次后，每孔加入100μL底物液，37℃孵育10min。每孔加入100μL终止液。在半小时内，于酶标仪上进行双波长检测，读取OD450，以OD570或OD630作为参考波长。OD450-OD570(或OD630)为校准值。
3.判读
以阴性对照的平均OD值2.1倍作为Cutoff值，如阴性对照的平均OD小于0.05按照0.05计算。大于等于Cutoff值可判断为阳性，小于Cutoff值可判断为阴性。
试验例2不同浓度抗原包被浓度的确定
1.包被
自制的S+N蛋白：1350μl PBS+4μl制成5μg/ml；取400μl+600μlPBS制成2μg/ml；50μl/孔。4℃包被过夜。
2.Blocking
每孔加入300μl Blocking，室温震荡孵育2h。
3.一抗
IgA/IgM/IgG抗体分别为：抗N蛋白和抗S蛋白：225μl AB+12.5μL抗N蛋白+12.5μL抗S蛋白制成10×，取25μl+225μl AB制成100×，取25μl+225μl AB制成1000×，100μl/孔。Negtive加入100μlAB。
4.二抗(HRP小鼠抗人IgA/IgM/IgG)
850μl+0.34μl抗人IgA+0.34μl抗人IgM+0.34μl抗人IgG。
检测，结果如表1所示。
表1不同抗原包被量的对比
试验例3性能测试
共检测临床血清样本182份，其中阴性样本134份，检测结果为130份阴性，符合率97％(130/134)；阳性标本共48份，其中35份确诊患者的阳性标本和13份康复患者的阳性标本，检测结果为46分阳性，符合率95.8％(46/48)，表明本申请产品精密性强、稳定性好。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 浙江省人民医院
<120> 一种新型冠状病毒IgA/IgM/IgG抗体ELISA检测试剂盒
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2826
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgagcgata acggtccgca aaaccagcgt aacgcgccgc gtattacctt cggtggtccg 60
agcgatagca ccggtagcaa ccaaaacggc gaacgtagcg gtgcgcgtag caaacaacgt 120
cgtccgcaag gtctgccgaa caacaccgcg agctggttta ccgcgctgac ccagcacggt 180
aaagaagacc tgaagttccc gcgtggtcag ggcgtgccga ttaacaccaa cagcagcccg 240
gacgatcaaa ttggttatta ccgtcgtgcg acccgtcgta tccgtggcgg tgatggcaaa 300
atgaaagatc tgagcccgcg ttggtacttc tattacctgg gtaccggccc ggaagcgggt 360
ctgccgtacg gtgcgaacaa ggatggcatc atctgggttg cgaccgaagg tgcgctgaac 420
accccgaaag accacattgg tacccgtaac ccggcgaaca acgcggcgat tgttctgcag 480
ctgccgcaag gtaccaccct gccgaaaggt ttctatgcgg agggtagccg tggtggtagc 540
caagcgagca gccgtagcag cagccgtagc cgtaacagca gccgtaacag caccccgggt 600
agcagccgtg gtaccagccc ggcgcgtatg gcgggtaacg gtggcgatgc ggcgctggcg 660
ctgctgctgc tggatcgtct gaaccaactg gagagcaaga tgagcggcaa gggtcagcaa 720
caacagggtc aaaccgttac caaaaagagc gcggcggaag cgagcaagaa accgcgtcag 780
aaacgtaccg cgaccaaggc gtacaacgtg acccaggcgt ttggtcgtcg tggtccggaa 840
caaacccagg gcaactttgg tgaccaagaa ctgatccgtc aaggcaccga ctacaaacac 900
tggccgcaga tcgcgcaatt cgcgccgagc gcgagcgcgt tctttggtat gagccgtatt 960
ggtatggaag tgaccccgag cggtacctgg ctgacctaca ccggtgcgat caaactggac 1020
gataaggacc cgaacttcaa agaccaagtg atcctgctga acaagcacat cgacgcgtac 1080
aaaacctttc cgccgaccga gccgaagaaa gacaagaaga aaaaggcgga tgaaacccag 1140
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gacgatttca gcaaacagct gcagcaaagc atgagcagcg cggatagcac ccaagcgggc 1260
ggtggcggct ctggcggcgg tggttctggc ggcggtggct ccatgttcgt tttcctggtt 1320
ctgctgccgc tggttagcag ccaatgcgtg aatctgacca cccgcaccca actgccgccg 1380
gcgtacacca acagcttcac ccgtggtgtt tactatccgg acaaagtttt tcgtagcagc 1440
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gcgatccacg tgagcggcac caacggcacc aagcgtttcg acaacccggt gctgccgttt 1560
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gttgacctgc cgatcggtat taacatcacc cgttttcaaa ccctgctggc gctgcaccgt 2040
agctacctga cgccgggtga cagcagcagc ggttggaccg ctggtgctgc ggcgtactat 2100
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ctgaacgatc tgtgctttac caacgtttac gcggatagct tcgtgattcg tggcgacgag 2520
gttcgtcaga tcgcgccggg tcaaaccggc aagattgcgg actacaacta taaactgccg 2580
gacgatttca ccggctgcgt tatcgcgtgg aacagcaaca acctggatag caaagtgggt 2640
ggcaactaca actatctgta ccgtctgttt cgtaagagca acctgaaacc gttcgagcgt 2700
gacattagca ccgaaatcta ccaggcgggt agcaccccgt gcaacggtgt tgagggcttt 2760
aactgctatt tcccgctgca aagctacggt ttccaaccga ccaacggtgt tggttaccag 2820
ccgtac 2826

Claims (1)

1.一种新型冠状病毒IgA/IgM/IgG抗体ELISA检测试剂盒，包括酶标板、底物液、样品稀释液、阳性对照液、阴性对照液、浓缩洗涤液、酶结合物和终止液，其特征在于，所述酶标板预包被新型冠状病毒S+N重组蛋白；
所述酶结合物为辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgA/IgM/IgG-HRP抗体稀释液；所述新型冠状病毒使用质量浓度1-10％的牛血清蛋白封闭后包被；所述新型冠状病毒的包被量为0.1μg/well；所述样品稀释液为含质量分数1-10％牛血清蛋白的pH 7.2-7.4的磷酸盐缓冲液；所述浓缩洗涤液为含体积分数0.05％吐温-20的pH 7.2-7.4的磷酸盐缓冲液，所述终止液为2mol/L的硫酸溶液；所述阳性对照液为在样品稀释液中按1:30～1:100的比例加入阳性血清制成，阳性对照液的吸光度值大于1.0；所述阴性对照血清为在样品稀释液中，按5wt％的比例加入阴性血清制成，阴性对照液的吸光度值小于0.1；
所述新型冠状病毒S+N重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
(1)设计特异性引物，分别用于N和S蛋白两种基因的扩增；通过目的片段扩增、酶切、连接和转化，将N蛋白基因+甘氨酸柔性肽+S蛋白基因+His基因插入到PET-28a载体中，得到含有N和S蛋白基因序列的质粒，序列如SEQ IDNo.1所示，N蛋白基因全长1257bp，编码419个氨基酸，S蛋白基因全长1479bp，编码493个氨基酸；
(2)将含有N和S蛋白基因序列的质粒，使用大肠杆菌进行蛋白表达，将菌体超声后，取沉淀用50mM Tris+2M尿素pH＝12进行过夜溶解后，离心，取上清透析至pH＝9.5的Tris溶液中获取蛋白；
透析步骤如下：将NTA树脂装入层析柱，将目标蛋白加到NTA层析柱中，并用10倍NTA体积的NTA-0Buffer洗涤，流速15mL/h，收集穿透部分，然后分别用5倍NTA体积NTA-20、NTA-40、NTA-60、NTA-100和NTA-500洗脱，流速15mL/h，收集洗脱液；
(3)SDS/PAGE进行分析确定目标蛋白在洗脱液中的分布情况，收集目的蛋白。
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