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CN111289745A - 新型冠状病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

新型冠状病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒及其检测方法 Download PDF

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CN111289745A
CN111289745A CN202010218566.7A CN202010218566A CN111289745A CN 111289745 A CN111289745 A CN 111289745A CN 202010218566 A CN202010218566 A CN 202010218566A CN 111289745 A CN111289745 A CN 111289745A
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CN
China
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solution
enzyme
novel coronavirus
absorbance
sample
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Application number
CN202010218566.7A
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吴德
梁丽君
周惠琼
马玉兰
李梅
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Zhongshan Bio Tech Co ltd
Original Assignee
Zhongshan Bio Tech Co ltd
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Abstract

本发明公开了一种新型冠状病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒及其制备方法，涉及生物医药领域，包括酶结合物、样品稀释液、阴性对照液、阳性对照液、底物A液、底物B液、浓缩洗涤液、终止液和预包被新冠病毒抗原的包被板，通过抗原抗体的免疫特异性反应进行检测，以定性判定测试样本中是否存在新型冠状病毒IgM抗体，具有高特异性和抗干扰性强的特点，同时本申请结构简单、检测成本低、准确性好，本发明一种新型冠状病毒IgM抗体酶联免疫检测方法，通过抗原抗体的免疫特异性反应进行检测，具有高特异性、准确性强的特点，步骤简便，设计合理，适合推广。

Description

新型冠状病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及新型冠状病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒及其检测方法，具体地说是一种利用间接法原理的酶联免疫法实现定性检测血清或血浆样本中的新型冠状病毒IgM抗体。
背景技术
新型冠状病毒（2019-nCoV）的常见体征有发热、乏力、干咳、逐渐出现呼吸困难，而部分患者病症状轻微，甚至存在无临床症状的无症状患者。具备人传人的特点，一般潜伏期1-14天，且潜伏期具有传染性，而无症状感染者也可能成为传染源，其主要通过呼吸道飞沫和密切接触传染传播，人群普遍易感。
疫情发展至今，仍有不少疑似病例因为检测效率不足等原因尚未确诊，但现有检测试剂存在灵敏度低、抗干扰能力弱的缺点，时常出现试剂诊断假阴性、假阳性的困扰，这不仅困扰着诊断环节，也存在于康复环节，没有精准的诊断难以有精准的治疗，因此如何精准地批量筛查疑似病例，供临床医生准确判断是否为新型冠状病毒肺炎，以便于快速隔离免于传染给更多的人，是亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种灵敏度高、特异性强、准确性好的新型冠状病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒。
本发明的另一个目的是提供一种新型冠状病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒的测试方法。
本发明提供技术方案如下：包括酶结合物、样品稀释液、阴性对照液、阳性对照液、底物A液、底物B液、终止液、浓缩洗涤液和预包被新冠病毒抗原的包被板；
所述酶结合物为用酶标稀释液按工作浓度配制的羊抗人IgM-HRP工作液；
所述预包被新冠病毒抗原的包被板的制备方法为：
（1）包被：将新冠病毒抗原用包被缓冲液稀释后，按100μL/孔包被到包被板的孔内，在2～8℃吸附21～24小时；
（2）封闭：弃去包被液，用10mM的浓缩洗涤液按300μL/孔洗板，再用封闭液按150μL/孔在2～8℃封闭16～18小时；
（3）干燥及保存：弃去封闭液，经干燥处理后密封，置2～8℃保存。
作为本发明的进一步改进，所述新冠病毒抗原为基因工程重组表达的新冠病毒S2蛋白。
作为本发明的进一步改进，所述包被缓冲液为含0.02%叠氮钠的0.05MpH9.6碳酸盐缓冲液，按1:500～1:1000的比例稀释新冠病毒抗原。
作为本发明的进一步改进，所述封闭液为含5%蔗糖、2%液体明胶、0.25%干酪素钠、0.1%ProClin300的0.07M硼酸-硼砂缓冲液。
作为本发明的进一步改进，所述样品稀释液为含20%山羊血清、0.2%干酪素钠、5%PEG6000、4%蔗糖、0.1%ProClin300的10mMpH7.4PBS。
作为本发明的进一步改进，所述酶标稀释液为含5%蔗糖、2%液体明胶、0.1%氨基比林、1%甘油、20%小牛血清、0.1%ProClin300的0.07M硼酸-硼砂缓冲液。
作为本发明的进一步改进，所述底物A液为含有0.06%pH5.2～5.3的10mM柠檬酸-乙酸钠缓冲液；
所述底物B液含有0.06%TMB盐酸盐的柠檬酸缓冲液、0.001%的硫代硫酸钠和0.02%的碳酸钠。
作为本发明的进一步改进，所述阳性对照液为在样品稀释液中按1:30～1:100的比例加入阳性血清制成，阳性对照液的吸光度值大于1.0；
所述阴性对照血清为在样品稀释液中，按5%的比例加入阴性血清制成，阴性对照液的吸光度值小于0.1。
作为本发明的进一步改进，所述终止液成分为1mol/L的硫酸。
作为本发明的进一步改进，所述浓缩洗涤液成分为含20%NaCl、0.5%KCl、3%Tween-20的0.25M pH6.0~6.5 PB。
一种新型冠状病毒IgM抗体酶联免疫检测方法，包括上述的新型冠状病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒，所述检测方法包括以下步骤：
S1、样本稀释：将待测血液样本用样品稀释液按1:100稀释；
S2、抗原-抗体反应：将已稀释的待测血液样本、阴性对照液、阳性对照以100μL/孔的量分别加入到预包被新冠病毒抗原的包被板的不同孔内，37℃温育60分钟；
S3、抗原抗体复合物与酶标抗体反应：弃去反应液，将包被板用浓缩洗涤液洗涤移去未结合的成分，以100μL/孔的量加入酶结合物，37℃温育30分钟；
S4、显色：弃去反应液，将包被板用浓缩洗涤液洗涤移去未结合的成分，在包被板每孔各加入底物A液、底物B液50μL，37℃避光显色15分钟；
S5、终止反应：在包被板每孔加入50μL的终止液终止反应；
S6、吸光度测定：用酶标仪在450nm/630nm波长依序测量包被板各孔的吸光度值；
S7、结果分析与判定：通过S6吸光度测定结果验证试验有效性，若阳性对照液吸光度平均值/阴性对照液吸光度平均值≥2.1，则试验成立；通过临界值判定检测结果，临界值（cut-off）=0.15+阴性对照液吸光度平均值(当阴性对照液吸光度平均值<0.05时，按0.05计算)，若待测血液样本吸光度值＞临界值，则待测血液样本为阳性结果，若待测血液样本吸光度值＜临界值，则待测血液样本为阴性结果。
本申请的检测原理：先通过将新冠病毒抗原包被在包被板上，形成预包被新冠病毒抗原的包被板，检测时，将待检测血液样本稀释后滴入预包被新冠病毒抗原的包被板上，若待检测血液样本中存在特异性新型冠状病毒IgM抗体，新型冠状病毒IgM抗体将与预包被新冠病毒抗原的包被板上固相新型冠状病毒S2抗原相结合形成抗原-抗体复合物，再加入酶结合物（酶标抗人IgM，组成为羊抗人IgM-HRP工作液）时，抗原-抗体复合物中的IgM成分将于酶标抗人IgM相结合形成固相复合物，然后加入显色剂时，固相复合物中的辣根过氧化物酶（HRP）与底物A、B液反应后产生颜色（蓝色），而后加入终止液终止反应（颜色由蓝色变为黄色），最后通过酶标仪读取吸光度（A）值，再与正常人阴性对照液的吸光度的临界值比对，从而定性判定样本中的新型冠状病毒IgM抗体的存在与否。
同时本申请设置有对照组，将阴性对照液和阳性对照液与待测血液样本一同进行吸光度测定以验证试验的有效性，若阳性对照液吸光度平均值/阴性对照液吸光度平均值≥2.1，则试验成立，进一步提高检测的准确性。
本发明相对于现有技术，有以下优点：
本发明一种新型冠状病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒，包括酶结合物、样品稀释液、阴性对照液、阳性对照液、底物A液、底物B液、终止液、浓缩洗涤液和预包被新冠病毒抗原的包被板，酶结合物为用酶标稀释液按工作浓度配制的羊抗人IgM-HRP工作液,通过抗原抗体的免疫特异性反应进行检测，以定性判定测试样本中是否存在新型冠状病毒IgM抗体，通过抗原抗体的免疫特异性反应进行检测，具有高准确率和高特异性，且测试阳性血清样本CV值均在5%～10%范围内，表明本申请产品精密性强、稳定性好，同时本申请试剂盒对新型甲型H1N1流感病毒、呼吸道合胞病毒、EB病毒、麻疹病毒、人巨细胞病毒、腮腺炎病毒、水痘-带状疱疹病毒等感染者血清均无交叉反应，对于常用内源物质（粘蛋白、胆红素、甘油三酯、血红蛋白、生物素和类风湿因子、IgG/RF吸附剂）及外源物质（庆大霉素、地塞米松）不干扰本产品检测，同时本申请结构简单、检测成本低、准确性好。
本发明一种新型冠状病毒IgM抗体酶联免疫检测方法，通过抗原抗体的免疫特异性反应进行检测，具有高特异性、准确性强的特点，步骤简便，设计合理，适合推广。
具体实施方式
下面结合具体实施方式说明本发明的具体技术方案。
实施例1、一种新型冠状病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒，包括酶结合物、样品稀释液、阴性对照液、阳性对照液、底物A液、底物B液、终止液、浓缩洗涤液和预包被新冠病毒抗原的包被板；所述酶结合物为用酶标稀释液按工作浓度1:10000配制的羊抗人IgM-HRP工作液；
所述预包被新冠病毒抗原的包被板的制备方法为：
（1）包被：将新冠病毒抗原用包被缓冲液（含0.02%叠氮钠的0.05MpH9.6碳酸盐缓冲液）按1:1000稀释后，按100μL/孔包被到包被板的孔内，在6℃吸附24小时；
（2）封闭：弃去包被液，用10mM的浓缩洗涤液按300μL/孔洗板，再用封闭液（含5%蔗糖、2%液体明胶、0.25%干酪素钠、0.1%ProClin300的0.07M硼酸-硼砂缓冲液）按150μL/孔在6℃封闭18小时；
（3）干燥及保存：弃去封闭液，经干燥处理后密封，置6℃保存。
所述样品稀释液为含20%山羊血清、0.2%干酪素钠、5%PEG6000、4%蔗糖、0.1%ProClin300的10mMpH7.4PBS。
所述酶标稀释液为含5%蔗糖、2%液体明胶、0.1%氨基比林、1%甘油、20%小牛血清、0.1%ProClin300的0.07M硼酸-硼砂缓冲液；所述底物A液为含有0.06%pH5.2的10mM柠檬酸-乙酸钠缓冲液；所述底物B液含有0.06%TMB盐酸盐的柠檬酸缓冲液、0.001%的硫代硫酸钠和0.02%的碳酸钠；所述阳性对照液为在样品稀释液中按1:30的比例加入阳性血清制成，阳性对照液的吸光度值大于1.0；所述阴性对照血清为在样品稀释液中，按5%的比例加入阴性血清制成，阴性对照液的吸光度值小于0.1；所述终止液成分为1mol/L的硫酸。浓缩洗涤液成分为含20%NaCl、0.5%KCl、3%Tween-20的0.25M pH6.0 PB。
实施例2、一种新型冠状病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒，包括酶结合物、样品稀释液、阴性对照液、阳性对照液、底物A液、底物B液、终止液、浓缩洗涤液和预包被新冠病毒抗原的包被板；所述酶结合物为用酶标稀释液按工作浓度1:25000配制的羊抗人IgM-HRP工作液；
所述预包被新冠病毒抗原的包被板的制备方法为：
（1）包被：将新冠病毒抗原用包被缓冲液（含0.02%叠氮钠的0.05MpH9.6碳酸盐缓冲液）按1:800稀释后，按100μL/孔包被到包被板的孔内，在8℃吸附24小时；
（2）封闭：弃去包被液，用10mM的浓缩洗涤液按300μL/孔洗板，再用封闭液（含5%蔗糖、2%液体明胶、0.25%干酪素钠、0.1%ProClin300的0.07M硼酸-硼砂缓冲液）按150μL/孔在8℃封闭17小时；
（3）干燥及保存：弃去封闭液，经干燥处理后密封，置8℃保存。
所述样品稀释液为含20%山羊血清、0.2%干酪素钠、5%PEG6000、4%蔗糖、0.1%ProClin300的10mMpH7.4PBS。
所述酶标稀释液为含5%蔗糖、2%液体明胶、0.1%氨基比林、1%甘油、20%小牛血清、0.1%ProClin300的0.07M硼酸-硼砂缓冲液；所述底物A液为含有0.06%pH5.3的10mM柠檬酸-乙酸钠缓冲液；所述底物B液含有0.06%TMB盐酸盐的柠檬酸缓冲液、0.001%的硫代硫酸钠和0.02%的碳酸钠；所述阳性对照液为在样品稀释液中按1:100的比例加入阳性血清制成，阳性对照液的吸光度值大于1.0；所述阴性对照血清为在样品稀释液中，按5%的比例加入阴性血清制成，阴性对照液的吸光度值小于0.1；所述终止液成分为1mol/L的硫酸。浓缩洗涤液成分为含20%NaCl、0.5%KCl、3%Tween-20的0.25M pH6.5 PB。
实施例3、一种新型冠状病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒，包括酶结合物、样品稀释液、阴性对照液、阳性对照液、底物A液、底物B液、终止液、浓缩洗涤液和预包被新冠病毒抗原的包被板；所述酶结合物为用酶标稀释液按工作浓度1:15000配制的羊抗人IgM-HRP工作液；
所述预包被新冠病毒抗原的包被板的制备方法为：
（1）包被：将新冠病毒抗原用包被缓冲液（含0.02%叠氮钠的0.05MpH9.6碳酸盐缓冲液）按1:500稀释后，按100μL/孔包被到包被板的孔内，在2℃吸附21小时；
（2）封闭：弃去包被液，用10mM的浓缩洗涤液按300μL/孔洗板，再用封闭液（含5%蔗糖、2%液体明胶、0.25%干酪素钠、0.1%ProClin300的0.07M硼酸-硼砂缓冲液）按150μL/孔在2℃封闭16小时；
（3）干燥及保存：弃去封闭液，经干燥处理后密封，置2℃保存。
所述样品稀释液为含20%山羊血清、0.2%干酪素钠、5%PEG6000、4%蔗糖、0.1%ProClin300的10mMpH7.4PBS。
所述酶标稀释液为含5%蔗糖、2%液体明胶、0.1%氨基比林、1%甘油、20%小牛血清、0.1%ProClin300的0.07M硼酸-硼砂缓冲液；所述底物A液为含有0.06%pH5.2的10mM柠檬酸-乙酸钠缓冲液；所述底物B液含有0.06%TMB盐酸盐的柠檬酸缓冲液、0.001%的硫代硫酸钠和0.02%的碳酸钠；所述阳性对照液为在样品稀释液中按1:75的比例加入阳性血清制成，阳性对照液的吸光度值大于1.0；所述阴性对照血清为在样品稀释液中，按5%的比例加入阴性血清制成，阴性对照液的吸光度值小于0.1；所述终止液成分为1mol/L的硫酸。浓缩洗涤液成分为含20%NaCl、0.5%KCl、3%Tween-20的0.25M pH6.2 PB。
对上述实施例1-3所制备的试剂盒进行临床测试试验
检测步骤为：
S1、样本稀释：将待测血液样本用样品稀释液按1:100稀释；
S2、抗原-抗体反应：将已稀释的待测血液样本、阴性对照液、阳性对照以100μL/孔的量分别加入到预包被新冠病毒抗原的包被板的不同孔内，37℃温育60分钟；
S3、抗原抗体复合物与酶标抗体反应：弃去反应液，将包被板用浓缩洗涤液洗涤移去未结合的成分，以100μL/孔的量加入酶结合物，37℃温育30分钟；
S4、显色：弃去反应液，将包被板用浓缩洗涤液洗涤移去未结合的成分，在包被板每孔各加入底物A液、底物B液50μL，37℃避光显色15分钟；
S5、终止反应：在包被板每孔加入50μL的终止液终止反应；
S6、吸光度测定：用酶标仪在450nm/630nm波长依序测量包被板各孔的吸光度值；
S7、结果分析与判定：通过S6吸光度测定结果验证试验有效性，若阳性对照液吸光度平均值/阴性对照液吸光度平均值≥2.1，则试验成立；通过临界值判定检测结果，临界值（cut-off）=0.15+阴性对照液吸光度平均值(当阴性对照液吸光度平均值<0.05时，按0.05计算)，若待测血液样本吸光度值＞临界值，则待测血液样本为阳性结果，若待测血液样本吸光度值＜临界值，则待测血液样本为阴性结果。
1、性能测试：9份正常人血清样本，6份弱阳性血清、6份强阳性血清（由由广东省疾病控制中心提供样本，样本信息上分别标注有IgM抗体检测量），分为三组，按上述步骤分别用实施例1～3制备的试剂盒各测试10次，测试结果如表1～3所示：
表1：实施例1测试结果
试剂盒 实施例1 实施例1 实施例1 实施例1 实施例1 实施例1 实施例1 实施例1 实施例1
样本 正常1 正常2 正常3 弱阳1 弱阳2 强阳1 强阳2 阴性对照液1 阳性对照液1
A值 0.01 0.013 0.029 0.495 0.544 1.937 1.989 0.033 1.873
样本 正常1 正常2 正常3 弱阳1 弱阳2 强阳1 强阳2 阴性对照液1 阳性对照液1
A值 0.018 0.021 0.012 0.421 0.484 1.746 1.988 0.028 1.932
样本 正常1 正常2 正常3 弱阳1 弱阳2 强阳1 强阳2 阴性对照液1 阳性对照液1
A值 0.008 0.018 0.019 0.507 0.57 1.633 1.754 0.03 2.058
样本 正常1 正常2 正常3 弱阳1 弱阳2 强阳1 强阳2 阴性对照液1 阳性对照液1
A值 0.017 0.029 0.029 0.487 0.498 1.762 1.757 0.03 1.974
样本 正常1 正常2 正常3 弱阳1 弱阳2 强阳1 强阳2 阴性对照液1 阳性对照液1
A值 0.026 0.025 0.03 0.43 0.411 1.866 2.038 0.004 1.945
样本 正常1 正常2 正常3 弱阳1 弱阳2 强阳1 强阳2 阴性对照液1 阳性对照液1
A值 0.019 0.029 0.033 0.477 0.578 1.871 2.151 0.029 2.032
样本 正常1 正常2 正常3 弱阳1 弱阳2 强阳1 强阳2 阴性对照液1 阳性对照液1
A值 0.012 0.005 0.026 0.384 0.511 2.056 1.926 0.004 1.945
样本 正常1 正常2 正常3 弱阳1 弱阳2 强阳1 强阳2 阴性对照液1 阳性对照液1
A值 0.011 0.013 0.026 0.441 0.546 1.734 2.015 0.033 1.993
样本 正常1 正常2 正常3 弱阳1 弱阳2 强阳1 强阳2 阴性对照液1 阳性对照液1
A值 0.022 0.006 0.009 0.417 0.512 1.882 2.097 0.031 1.932
样本 正常1 正常2 正常3 弱阳1 弱阳2 强阳1 强阳2 阴性对照液1 阳性对照液1
A值 0.031 0.01 0.035 0.431 0.558 2.158 1.783 0.019 1.945
A均值 0.018 0.017 0.025 0.449 0.521 1.864 1.95 0.024 1.963
CV / / / 8.90% 9.60% 8.50% 7.30% / /
由表1数据可得，实施例1测试结果中阳性对照液1吸光度平均值/阴性对照液1吸光度平均值≥2.1，表明实施例1测试数据有效，临界值（cut-off）=0.15+阴性对照液1吸光度平均值=0.175，测试正常人血清样本（正常1、正常2、正常3）的吸光度（A）值均小于0.175，表明并未测得正常人血清样本中存在新型冠状病毒IgM抗体，弱阳性血清样本（弱阳1、弱阳2）、强阳性血清样本（强阳1、强阳2）的吸光度（A）值均大于0.175，表明测得弱阳性血清和强阳性血清样本中存在新型冠状病毒IgM抗体，分组各测试10次结果均正确，表明本申请具有高准确率和高特异性，且测试阳性血清样本CV值均在5%～10%范围内，表明本申请产品精密性强、稳定性好，同时通过A值的大小可以反映样本中抗体的含量多少。
表2：实施例2测试结果
试剂盒 实施例2 实施例2 实施例2 实施例2 实施例2 实施例2 实施例2 实施例2 实施例2
样本 正常4 正常5 正常6 弱阳3 弱阳4 强阳3 强阳4 阴性对照液2 阳性对照液2
A值 0.015 0.017 0.029 0.459 0.41 2.03 1.926 0.011 1.867
样本 正常4 正常5 正常6 弱阳3 弱阳4 强阳3 强阳4 阴性对照液2 阳性对照液2
A值 0.009 0.001 0.007 0.535 0.504 1.95 2.108 0.034 2.037
样本 正常4 正常5 正常6 弱阳3 弱阳4 强阳3 强阳4 阴性对照液2 阳性对照液2
A值 0.02 0.009 0.011 0.556 0.481 2.008 1.956 0.017 2.019
样本 正常4 正常5 正常6 弱阳3 弱阳4 强阳3 强阳4 阴性对照液2 阳性对照液2
A值 0.013 0.021 0.02 0.449 0.489 1.787 1.834 0.007 2.017
样本 正常4 正常5 正常6 弱阳3 弱阳4 强阳3 强阳4 阴性对照液2 阳性对照液2
A值 0.032 0.011 0.017 0.536 0.53 1.708 1.738 0.025 1.974
样本 正常4 正常5 正常6 弱阳3 弱阳4 强阳3 强阳4 阴性对照液2 阳性对照液2
A值 0.009 0.027 0.001 0.521 0.418 1.864 1.993 0.011 1.921
样本 正常4 正常5 正常6 弱阳3 弱阳4 强阳3 强阳4 阴性对照液2 阳性对照液2
A值 0.026 0.023 0.01 0.532 0.423 1.988 1.846 0.029 1.927
样本 正常4 正常5 正常6 弱阳3 弱阳4 强阳3 强阳4 阴性对照液2 阳性对照液2
A值 0.03 0.007 0.024 0.546 0.41 1.852 1.975 0.005 2.004
样本 正常4 正常5 正常6 弱阳3 弱阳4 强阳3 强阳4 阴性对照液2 阳性对照液2
A值 0.011 0.026 0.016 0.563 0.476 2.008 2.021 0.012 2.028
样本 正常4 正常5 正常6 弱阳3 弱阳4 强阳3 强阳4 阴性对照液2 阳性对照液2
A值 0.027 0.014 0.022 0.519 0.451 2.089 1.989 0.029 1.924
A均值 0.019 0.016 0.016 0.522 0.459 1.928 1.939 0.018 1.971
CV / / / 7.40% 9.30% 6.30% 5.50% / /
由表2数据可得，实施例2测试结果中阳性对照液2吸光度平均值/阴性对照液2吸光度平均值≥2.1，表明实施例2测试数据有效，临界值（cut-off）=0.15+阴性对照液2吸光度平均值=0.168，测试正常人血清样本（正常4、正常5、正常6）的吸光度（A）值均小于0.168，表明并未测得正常人血清样本中存在新型冠状病毒IgM抗体，弱阳性血清样本（弱阳3、弱阳4）、强阳性血清样本（强阳3、强阳4）的吸光度（A）值均大于0.168，表明测得弱阳性血清和强阳性血清样本中存在新型冠状病毒IgM抗体，分组各测试10次结果均正确，表明本申请具有高准确率和高特异性，且测试阳性血清样本CV值均在5%～10%范围内，表明本申请产品精密性强、稳定性好，同时通过A值的大小可以反映样本中抗体的含量多少。
表3：实施例3测试结果
试剂盒 实施例3 实施例3 实施例3 实施例3 实施例3 实施例3 实施例3 实施例3 实施例3
样本 正常7 正常8 正常9 弱阳5 弱阳6 强阳5 强阳6 阴性对照液3 阳性对照液3
A值 0.017 0.009 0.013 0.376 0.421 2.102 2.12 0.032 2.012
样本 正常7 正常8 正常9 弱阳5 弱阳6 强阳5 强阳6 阴性对照液3 阳性对照液3
A值 0.034 0.028 0.022 0.485 0.475 1.986 2.051 0.022 1.875
样本 正常7 正常8 正常9 弱阳5 弱阳6 强阳5 强阳6 阴性对照液3 阳性对照液3
A值 0.03 0.017 0.032 0.429 0.434 2.018 2.102 0.025 1.967
样本 正常7 正常8 正常9 弱阳5 弱阳6 强阳5 强阳6 阴性对照液3 阳性对照液3
A值 0.031 0.03 0.014 0.431 0.512 1.898 1.853 0.021 1.923
样本 正常7 正常8 正常9 弱阳5 弱阳6 强阳5 强阳6 阴性对照液3 阳性对照液3
A值 0.012 0.031 0.016 0.488 0.533 1.768 1.845 0.017 2.011
样本 正常7 正常8 正常9 弱阳5 弱阳6 强阳5 强阳6 阴性对照液3 阳性对照液3
A值 0.026 0.027 0.035 0.45 0.432 1.892 1.892 0.007 2.078
样本 正常7 正常8 正常9 弱阳5 弱阳6 强阳5 强阳6 阴性对照液3 阳性对照液3
A值 0.016 0.002 0.011 0.497 0.532 1.956 1.972 0.013 1.982
样本 正常7 正常8 正常9 弱阳5 弱阳6 强阳5 强阳6 阴性对照液3 阳性对照液3
A值 0.027 0.007 0.012 0.476 0.499 1.912 1.893 0.027 1.864
样本 正常7 正常8 正常9 弱阳5 弱阳6 强阳5 强阳6 阴性对照液3 阳性对照液3
A值 0.032 0.008 0.022 0.449 0.487 1.894 2.012 0.023 2.046
样本 正常7 正常8 正常9 弱阳5 弱阳6 强阳5 强阳6 阴性对照液3 阳性对照液3
A值 0.024 0.021 0.015 0.51 0.478 2.011 2.114 0.011 1.852
A均值 0.025 0.018 0.019 0.459 0.48 1.944 1.985 0.02 1.961
CV / / / 8.80% 8.50% 4.70% 5.50% / /
由表3数据可得，实施例3测试结果中阳性对照液3吸光度平均值/阴性对照液3吸光度平均值≥2.1，表明实施例3测试数据有效，临界值（cut-off）=0.15+阴性对照液3吸光度平均值=0.170，测试正常人血清样本（正常4、正常5、正常6）的吸光度（A）值均小于0.170，表明并未测得正常人血清样本中存在新型冠状病毒IgM抗体，弱阳性血清样本（弱阳5、弱阳6）、强阳性血清样本（强阳5、强阳6）的吸光度（A）值均大于0.170，表明测得弱阳性血清和强阳性血清样本中存在新型冠状病毒IgM抗体，分组各测试10次结果均正确，表明本申请具有高准确率和高特异性，且测试阳性血清样本CV值均在5%～10%范围内，表明本申请产品精密性强、稳定性好，同时通过A值的大小可以反映样本中抗体的含量多少。
2、特异性验证：分别用新型甲型H1N1流感病毒、呼吸道合胞病毒、EB病毒、麻疹病毒、人巨细胞病毒、腮腺炎病毒、水痘-带状疱疹病毒的感染者血清，采用实施例1～3所制得试剂盒产品进行检测，检测吸光度平均值，结果如表4所示。
表4：吸光度测试结果
样本 H1N1流感病毒 呼吸道合胞病毒 EB病毒 麻疹病毒 人巨细胞病毒 腮腺炎病毒 水痘-带状疱疹病毒
实施例1 0.012 0.008 0.015 0.016 0.02 0.018 0.006
实施例2 0.009 0.012 0.021 0.009 0.012 0.015 0.012
实施例3 0.014 0.005 0.011 0.012 0.019 0.022 0.009
由表4数据可知，本产品的试剂盒检测新型甲型H1N1流感病毒、呼吸道合胞病毒、EB病毒、麻疹病毒、人巨细胞病毒、腮腺炎病毒、水痘-带状疱疹病毒感染者血清，本申请产品检测结果均呈阴性，并未受上述病毒影响测试结果，具有高特异性的特点，
3、内源/外源物质干扰性能验证：
（1）5份阳性血清经IgG/RF吸附剂处理后用实施例1～3产品复测，检测吸光度平均值结果如表5所示。
表5：吸光度测试结果
样本 处理前后 1 2 3 4 5
实施例1 处理前A均值 2.123 2.105 2.211 1.867 1.978
实施例1 处理后A均值 2.082 2.092 2.004 1.897 1.991
实施例2 处理前A均值 1.931 1.852 2.124 1.897 1.978
实施例2 处理后A均值 1.897 1.932 2.107 1.854 1.927
实施例3 处理前A均值 2.035 2.126 2.205 1.956 1.875
实施例3 处理后A均值 2.102 2.089 2.009 1.836 1.889
由表5数据可知，5份阳性血清经IgG/RF吸附剂处理前后，其测试仍呈阳性，表明本申请产品并未受IgG/RF吸附剂干扰测试结果，具有抗干扰性。
（2）在实施例1～3产品中加入标识浓度的下列内源物质粘蛋白（10 g/L）、胆红素（574 μmol/L）、甘油三酯（30 g/L）、血红蛋白（347 μmol/L）、生物素（123 nmol/L)和类风湿因子（150 IU/ml），检测吸光度平均值，结果如表6所述。
表6：吸光度测试结果
样本 粘蛋白 10 g/L 胆红素 574 μmol/L 甘油三酯 30 g/L 血红蛋白 347 μmol/L 生物素 123 nmol/L 类风湿因子 150 IU/ml
实施例1 0.009 0.012 0.023 0.025 0.014 0.007
实施例2 0.011 0.021 0.018 0.018 0.02 0.011
实施例3 0.021 0.019 0.022 0.021 0.018 0.012
由表6测试数据可知，实施例1～3加入粘蛋白、胆红素、甘油三酯、血红蛋白、生物素和类风湿因子这些内源物质后，测试结果呈阴性，表明本申请的产品并未受到内源物质干扰。
（3）使用浓度庆大霉素为1×107U/L和地塞米松浓度为500mg/L，分别用实施例1～3产品测试，检测结果如表7所示。
表7：吸光度测试结果
样本 庆大霉素为1×107U/L 地塞米松浓度为500mg/L
实施例1 0.013 0.009
实施例2 0.023 0.025
实施例3 0.011 0.012
由表7数据可知，试剂盒加入庆大霉素、地塞米松这类外源物质，检测结果呈阴性，表明本申请的产品并未受到外源物质干扰。
由上测试结果可知，本方法通过抗原抗体的免疫特异性反应进行检测，具有高特异性特点，具有高准确率和高特异性，且测试阳性血清样本CV值均在5%～10%范围内，表明本申请产品精密性强、稳定性好，同时本申请试剂盒对新型甲型H1N1流感病毒、呼吸道合胞病毒、EB病毒、麻疹病毒、人巨细胞病毒、腮腺炎病毒、水痘-带状疱疹病毒等感染者血清均无交叉反应，对于常用内源物质（粘蛋白、胆红素、甘油三酯、血红蛋白、生物素和类风湿因子、IgG/RF吸附剂）及外源物质（庆大霉素、地塞米松）不干扰本产品检测。

Claims (10)

1.一种新型冠状病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，包括酶结合物、样品稀释液、阴性对照液、阳性对照液、底物A液、底物B液、终止液、浓缩洗涤液和预包被新冠病毒抗原的包被板；
所述酶结合物为用酶标稀释液按工作浓度配制的羊抗人IgM-HRP工作液；
所述预包被新冠病毒抗原的包被板的制备方法为：
（1）包被：将新冠病毒抗原用包被缓冲液稀释后，按100μL/孔包被到包被板的孔内，在2～8℃吸附21～24小时；
（2）封闭：弃去包被液，用10mM的浓缩洗涤液按300μL/孔洗板，再用封闭液按150μL/孔在2～8℃封闭16～18小时；
（3）干燥及保存：弃去封闭液，经干燥处理后密封，置2～8℃保存。
2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述新冠病毒抗原为基因工程重组表达的新冠病毒S2蛋白。
3.根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述包被缓冲液为含0.02%叠氮钠的0.05MpH9.6碳酸盐缓冲液，按1:500～1:1000的比例稀释新冠病毒抗原。
4.根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述封闭液为含5%蔗糖、2%液体明胶、0.25%干酪素钠、0.1%ProClin300的0.07M硼酸-硼砂缓冲液。
5.根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述样品稀释液为含20%山羊血清、0.2%干酪素钠、5%PEG6000、4%蔗糖、0.1%ProClin300的10mMpH7.4PBS。
6.根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述：所述酶标稀释液为含5%蔗糖、2%液体明胶、0.1%氨基比林、1%甘油、20%小牛血清、0.1%ProClin300的0.07M硼酸-硼砂缓冲液。
7.根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述底物A液为含有0.06%pH5.2～5.3的10mM柠檬酸-乙酸钠缓冲液；
所述底物B液含有0.06%TMB盐酸盐的柠檬酸缓冲液、0.001%的硫代硫酸钠和0.02%的碳酸钠。
8.根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照液为在样品稀释液中按1:30～1:100的比例加入阳性血清制成，阳性对照液的吸光度值大于1.0；
所述阴性对照血清为在样品稀释液中，按5%的比例加入阴性血清制成，阴性对照液的吸光度值小于0.1。
9.根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述终止液成分为1mol/L的硫酸；
所述浓缩洗涤液成分为含20%NaCl、0.5%KCl、3%Tween-20的0.25M pH6.0~6.5 PB。
10.一种新型冠状病毒IgM抗体酶联免疫检测方法，其特征在于，包括权利要求1～9任一项所述的新型冠状病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒，所述检测方法包括以下步骤：
S1、样本稀释：将待测血液样本用样品稀释液按1:100稀释；
S2、抗原-抗体反应：将已稀释的待测血液样本、阴性对照液、阳性对照以100μL/孔的量分别加入到预包被新冠病毒抗原的包被板的不同孔内，37℃温育60分钟；
S3、抗原抗体复合物与酶标抗体反应：弃去反应液，将包被板用浓缩洗涤液洗涤移去未结合的成分，以100μL/孔的量加入酶结合物，37℃温育30分钟；
S4、显色：弃去反应液，将包被板用浓缩洗涤液洗涤移去未结合的成分，在包被板每孔各加入底物A液、底物B液50μL，37℃避光显色15分钟；
S5、终止反应：在包被板每孔加入50μL的终止液终止反应；
S6、吸光度测定：用酶标仪在450nm/630nm波长依序测量包被板各孔的吸光度值；
S7、结果分析与判定：通过S6吸光度测定结果验证试验有效性，若阳性对照液吸光度平均值/阴性对照液吸光度平均值≥2.1，则试验成立；通过临界值判定检测结果，临界值（cut-off）=0.15+阴性对照液吸光度平均值(当阴性对照液吸光度平均值<0.05时，按0.05计算)，若待测血液样本吸光度值＞临界值，则待测血液样本为阳性结果，若待测血液样本吸光度值＜临界值，则待测血液样本为阴性结果。
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