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CN111417856A - 抑制靶干扰作用的抗药物抗体测定法 - Google Patents

抑制靶干扰作用的抗药物抗体测定法 Download PDF

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CN111417856A CN201880077471.9A CN201880077471A CN111417856A CN 111417856 A CN111417856 A CN 111417856A CN 201880077471 A CN201880077471 A CN 201880077471A CN 111417856 A CN111417856 A CN 111417856A
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Abstract

本文中报道了对血清或血浆样品中抗药物抗体的量定量的免疫测定法，所述抗药物抗体可以与药物抗体特异性结合，所述药物抗体可以与治疗靶特异性结合，包括步骤a)将血清或血浆样品在是约靶pI值的pH值温育，并且任选地移除温育后形成的沉淀物，b)将步骤a)中获得的血清或血浆样品在约2的pH值温育，并且任选地离心温育的样品以除去形成的沉淀物，c)调节pH值至约7.4，向步骤b)中获得的血清或血浆样品，添加与结合对子的第一成员缀合的捕获抗体和与可检测标记物缀合的示踪抗体，并且温育混合物以形成捕获抗体‑抗药物抗体‑示踪抗体‑复合物，d)对步骤c)中形成的复合物定量并且因而对血清或血浆样品中抗药物抗体的量定量。

Description

抑制靶干扰作用的抗药物抗体测定法
本发明属于抗药物抗体测定法领域。本文中报道了一种来自治疗药物的靶的干扰作用降低的抗药物抗体测定法。
背景技术
Moxness,M.等人(Ann.N.Y.Acad.Sci.USA 1005(2003)265-268)报道了一种针对总Ig类胰岛素抗体(IAB)的放射配体结合测定法。首先酸化供试血清和对照血清以使结合型胰岛素解离，并且加入炭以吸附血清胰岛素。在中和后，通过离心从血清移除含有结合型胰岛素的炭。对于每种测定法，将取过胰岛素提的血清样品与放射标记的胰岛素在高水平未标记的胰岛素存在和不存在下温育，以分别确定非特异性结合和总结合。因此，Moxness等人报道了其中比较温育过夜和酸解离的两种ADA测定法方案的比较。
Patton,A.等人(J.Immunol.Meth.304(2005)189-195)报道了一种桥式ELISA，其使用与酸解组合的共价偶联的高密度抗原表面离步骤，以允许在人血清中的抗原存在下，即在不事先移除过量抗原的情况下，检测抗体。因此，Patton等人报道了一种在分析治疗用抗体前不移除过量抗原的分析方案。这些作者将酸预处理的样品与未预处理的样品比较，但测定程序相同。
Lee,J.W.等人(AAPS J.13(2011)99-110)报道，在支持药物开发中生物分析的主导驱动者是数据预期用途。测量循环中的mAb及其抗原配体(L)的可靠方法体系对支持有效性和安全性评价时评估暴露-反应关系和剂量选择至关重要。配体结合测定法(LBA)广泛用于分析蛋白质生物治疗药和抗原配体(L)以支持药代动力学/药效动力学(PK/PD)和安全性评估。对于尤其与L非共价结合的单克隆抗体药物(mAb)，多种形式的mAb和L可以在体内存在，包括游离mAb、游离L、和mAb和L的单价和/或双价复合物。鉴于给药后身体内出现的动态结合平衡的复杂性和生物分析期间的多个平衡扰动源，显而易见，对目的形式(游离、结合型或总mAb和L)的离体定量可能异于实际体内定量。LBA试剂和分析模式原则上可以设计成测量总或游离形式的mAb和L。但是，确认在指定条件下测量各形式可能在技术有挑战性。
Kelly,M.等人(AAPS J.,15(2013)646-658)报道，一个最近已经日益引起注意的领域是评估“游离”和“总”分析物及分析模式对这些评估的影响。作者们提供了可获得文献的批判性回顾并前瞻性探索了减轻抗药物抗体潜在影响PK分析量值的方法。另外，可以更动用于增加ADA(抗药物抗体)测定法中药物耐受性的方法以评估或增加PK测定法中的ADA耐受性，通常伴随一个破解免疫复合物及提取药物的制备性步骤。必须指出，实施这类有挑战性的操作将不是认定的后期临床生物分析惯例，但将在寻求其解释的药代动力学的方法开发的研究阶段尽早提供宝贵信息。最终，任何用来帮助定量药物的提取过程将多半产生“总体”评估。
Davis,R.A.等人(J.Pharm.Biomed.Anal.48(2008)897-901)报道了一种按捕获/酸洗脱样式使用单一非竞争性MoAb，在高水平治疗用MoAb存在下定量总(游离加结合型)生物标记物浓度。这种测定法有能力在200μ/ml或更多治疗用MoAb存在下准确检测并定量循环型ng/ml生物标记物水平。
Salimi-Moosavi,H.等人(J.Pharm.Biomed.Anal.51(2010)1128-1133)报道了使蛋白质结合解离并且优先地使ThA变性的碱性和酸/胍处理方案。可以通过ELISA测定中和的抗原蛋白。这些方法提供在无ThA干扰情况下总抗原蛋白的可重复量。将含有抗原蛋白和ThA的血清样品、标准品和QCs用含有酪蛋白的碱性缓冲液(pH>13)处理或酸/胍缓冲液(pH<1)。成功地测量了两种不同ThA系统的总抗原蛋白并且通过处理完全消除了干扰作用。这些方法成功地用于临床前血清样品中的分析。
Smith,H.W.等人(Regul.Toxicol.Pharmacol.49(2007)230-237)公开了采用ELISA之前样品酸解离(SPEAD)处理，使用固相提取在残余的治疗性蛋白存在下，检测针对治疗性蛋白的抗体。
在高水平药物存在下检测针对单克隆抗体治疗药的抗药物抗体的亲和捕获洗脱(ACE)测定法由Bourdage,J.S.(J.Immunol.Meth.327(2007)10-17)公开。
Zoghbi,J.等人(J.Immunol.Meth.426(2015)62-69)公开了一种解决免疫原性测定法中药物和靶干扰作用问题的突破性新方法，所述方法包括在药物存在下检测患者样品中总ADA(游离ADA和药物结合型ADA)的四种组分：(1)使用过量药物使游离ADA饱和以形成药物结合型ADA作为药物:ADA复合物，(2)使用试剂如PEG，沉淀复合物，(3)使ADA从药物中酸解离并且在酸性条件下(无中和)，将游离ADA(和游离药物)固定(捕获)到上庞大容量表面上，并且(4)使用特异性抗人Ig检测试剂检测游离ADA(不检测捕获的药物)。
在高水平药物存在下检测针对单克隆抗体治疗药的抗药物抗体的亲和捕获洗脱(ACE)测定法由Bourdage,J.S.(J.Immunol.Meth.327(2007)10-17)公开。
现行的抗药物抗体(ADA)测定法金标准是药物在被检出的已形成复合物的两侧上的桥式测定法。这种方法似乎是检测ADA同种型和ADA特异性的适宜分析模式。
Collet-Brose,J.等人(J.Immunol.Res.,Article ID 5069678(2016))公开了对多个免疫测定法技术平台的评价，以选出显示最适宜药物和靶耐受性的抗药物抗体测定法。这项研究的目的是，在测定法开发阶段并且因此采用适宜的严格程度，为临床ADA测定法选出最适宜的技术平台及样品预处理程序。
WO 2008/031532公开一种特征为不与人IgG结合的与食蟹猴IgG特异性结合的抗体，和一种使用双抗原桥式免疫测定法，免疫测定猴物种样品中药物抗体(DA)的免疫复合物(DA/ADA复合物)和针对所述药物抗体的抗体(抗药物抗体，ADA)的方法。这里，使用不与人IgG交叉结合的特异性抗食蟹猴IgG，因而这种测定法不能用来分析人样品。另外，如WO2008/031532中报道，可溶性(治疗用)靶的存在将不在测定法中产生假阳性信号。
WO 2015/123315公开了用于检测抗药物抗体存在或其量的测定法，所述测定法包括导致免疫复合物(药物兼ADA)沉淀的沉淀步骤，随后使沉淀物酸化，导致ADA从复合物释放，及使ADA酸性吸附至表面以最终建立可度量复合物。
Llinares-Tello,F.等人(BMJ 73(2014)THU0166)公开了在标准ADA测定法中酸解离在抗TNF药物治疗的患者的免疫原性检测中的实用性。
发明简述
本文中报道了其中减少或甚至消除了药物的(治疗)靶掩蔽抗药物抗体的抗药物抗体测定法。
本文中报道了特别可用于包含药物、其靶和抗药物抗体的样品的抗药物抗体测定法，其中药物的(治疗)靶的干扰作用减少或甚至消除。
本发明至少部分地基于以下发现：在检测抗药物抗体之前在靶的pI或在酸性pH值进行的温育步骤可以用来减少抗药物抗体(检测)测定法中来自血清或血浆样品中中存在的治疗用抗体(药物)的靶的干扰作用。若治疗药物的靶倾向于聚集并因而造成非特异性结合或/和若靶是双价/多价的并且因而在测定法中正常情况下产生假阳性信号，则本发明的测定法特别有用。
本发明至少部分地基于以下发现：可以通过测定程序中使用两个或更多个酸解离步骤，降低或甚至消除免疫测定法中待分析样品中存在的药物(治疗用抗体)的可溶性(治疗)靶的干扰作用。
本发明至少部分地基于以下发现：可溶性(治疗)靶的沉淀/聚合特性可以在ADA和药物的存在下用来降低免疫测定法中可溶性(治疗)靶的干扰作用。通常使用的酸化至低pH值仍产生高(背景)信号，导致灵敏度损失(参见，例如图18)。已经发现，为改善可溶性靶失活步骤/减少靶干扰作用，不需要在测定程序中包括免疫复合物沉淀。已经发现，可以在无任何分离和/或重悬沉淀物的情况下，通过酸化和中和，实现在免疫测定法中改善测定灵敏度/减少可溶性(治疗用)靶干扰作用。
本发明至少部分地基于以下发现：酸处理步骤可以用来移除(即沉淀)可溶性靶(例如在/接近于其等电点)。使用移除样品中可溶性(治疗用)靶和在免疫测定法中减少靶干扰作用的所述酸处理步骤使得本发明的方法总体上适用。在不受这种理论约束的情况下，假定本发明的方法更适于分析具有未知免疫应答的临床样品，因为可以假定可溶性(治疗用)靶在不同个体中按可比量存在。
本发明至少部分地基于以下发现：在可溶性靶的pI温育有利于改善免疫测定法的性能，例如，减少靶干扰作用或改善测定灵敏度。
本发明的一个方面是在减少靶干扰作用的情况下，对血清或血浆样品中抗药物抗体的量检测和/或确定和/或定量的免疫测定法，所述抗药物抗体可以与药物抗体特异性结合，所述药物抗体可以与治疗靶特异性结合，包括以下步骤(按以下顺序)：
a)将固定化的捕获抗体与包含药物、靶和抗药物抗体的血清或血浆样品温育，以形成捕获抗体-抗药物抗体复合物，
b)用pH值为约靶的pI的包含糖和去垢剂的缓冲液洗涤步骤a)中形成的复合物，
c)将步骤b)的洗涤的复合物与缀合于(可检测)标记物的示踪抗体温育12至24小时，以形成捕获抗体-抗药物抗体-示踪抗体复合物，(并且)
d)通过确定步骤c)中形成的复合物中的(可检测)标记物，对抗药物抗体的量检测和/或确定和/或定量。
在一个实施方案中，药物是抗体(药物抗体)。
在一个实施方案中，示踪抗体和捕获抗体是药物抗体。
在一个实施方案中，免疫测定法包含捕获抗体、示踪抗体和检测抗体，其中捕获抗体是与结合对子的第一成员缀合的药物，示踪抗体是与可检测标记物缀合的药物抗体并且检测抗体是与可检测标记物特异性结合的抗体，所述检测抗体进一步与酶缀合。
在一个实施方案中，捕获抗体和/或示踪抗体彼此独立地选自完整/全长药物抗体、药物抗体的F(ab’)2、Fab和scFv。在一个实施方案中，捕获抗体和示踪抗体各自是全长药物抗体、或药物抗体的F(ab’)2或药物抗体的Fab。
在一个实施方案中，糖是单糖、二糖或三糖。在一个实施方案中，糖是二糖。在一个实施方案中，糖选自由蔗糖、乳糖、麦芽糖、异麦芽糖和海藻糖组成的二糖。在一个优选的实施方案中，糖是蔗糖。
在一个实施方案中，糖具有约6.5wt-％的浓度。
在一个实施方案中，糖是浓度约6.5wt-％的蔗糖。
在一个实施方案中，去垢剂是非离子型去垢剂。在一个实施方案中，去垢剂选自由聚烷二醇醚(商标Brij)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单酯(商标Tween)、辛基酚乙氧基化物(商标Trion或Nonident)、辛基-β-糖苷、n-脂肪酸-N-甲基-D-葡糖胺(商标MEGA)和N,N’-双-(3-D-葡糖酰胺丙基)胆酰胺(商品名称CHAP)组成的去垢剂。在一个优选的实施方案中，去垢剂是聚乙二醇十二烷基醚。
在一个实施方案中，糖是蔗糖并且去垢剂是聚乙二醇十二烷基醚。
在一个实施方案中，温育持续14至20小时。在一个实施方案中，温育持续15至17小时。在一个实施方案中，温育持续约16小时。
在一个实施方案中，糖是蔗糖，去垢剂是聚乙二醇十二烷基醚并且温育持续15至17小时。
在一个实施方案中，结合对子的第一成员选自半抗原、抗原和激素。在一个实施方案中，结合对子是抗原/抗体对子或半抗原/抗半抗原抗体对子。
在一个实施方案中，结合对子选自生物素/(链霉)亲和素、茶碱/抗茶碱抗体、5-溴-脱氧-尿苷/抗5-溴-脱氧-尿苷抗体、异羟基洋地黄毒甙/抗异羟基洋地黄毒甙抗体和helicar/抗螺旋抗体。在一个实施方案中，结合对子是生物素和(链霉)亲和素。
在一个实施方案中，药物是抗C5抗体和靶是人C5。
在一个实施方案中，糖是蔗糖，去垢剂是聚乙二醇十二烷基醚，药物是抗C5抗体，并且靶是人C5。
在一个实施方案中，糖是蔗糖，去垢剂是聚乙二醇十二烷基醚，药物是抗C5抗体，靶是人C5并且缓冲液具有约5.5或约5.0的pH值。
在一个实施方案中，样品是人样品(人血清样品或血浆样品)。
如本文中报告的一个方面是在减少靶干扰作用的情况下，对血清或血浆样品中抗药物抗体的量检测和/或确定和/或定量的免疫测定法，所述抗药物抗体可以与药物抗体特异性结合，所述药物抗体可以与治疗靶特异性结合，包括以下步骤：
a)将血清或血浆样品在是约靶pI值的pH值温育，并且任选地移除温育后形成的沉淀物，
b)将步骤a)中获得的血清或血浆样品在约2的pH值温育，并且任选地离心温育的样品以除去形成的沉淀物，
c)调节pH值至约7.4，向步骤b)中获得的血清或血浆样品，添加与结合对子的第一成员缀合的捕获抗体和与可检测标记物缀合的示踪抗体，并且温育混合物以形成捕获抗体-抗药物抗体-示踪抗体-复合物，(并且)
d)对步骤c)中形成的复合物测量和/或确定和/或定量并且因而对血清或血浆样品中抗药物抗体的量检测和/或确定和/或定量。
在一个实施方案中，对捕获抗体-抗药物抗体-示踪抗体-复合物测量和/或确定和/或定量的步骤(步骤d))包括步骤
d1)将步骤c)中获得的血清或血浆样品与缀合于固体表面的结合对子的第二成员温育，以捕获捕获抗体-抗药物抗体-示踪抗体-复合物，并且任选地洗涤表面，
d2)通过确定步骤d1)中形成的复合物中的可检测标记物，对抗药物抗体的量检测和/或确定和/或定量。
在一个实施方案中，在约靶的pI值温育是在靶的pI以下0.5个pH单位至靶的pI以上0.5个pH单位范围内的pH值。
在一个实施方案中，步骤a)中的温育伴随搅拌。
在一个实施方案中，步骤a)中的温育持续1.5至2.5小时。在一个优选的实施方案中，步骤a)中的温育持续约2小时。
在一个实施方案中，步骤b)中的温育持续约5分钟。
在一个实施方案中，步骤d)中的温育持续约60分钟。
在一个实施方案中，示踪抗体和捕获抗体是药物抗体。
在一个实施方案中，免疫测定法包含捕获抗体、示踪抗体和检测抗体，其中捕获抗体是与结合对子的第一成员缀合的药物，示踪抗体是与可检测标记物缀合的药物抗体并且检测抗体是与可检测标记物特异性结合的抗体，所述检测抗体与酶缀合。
在一个实施方案中，捕获抗体和/或示踪抗体彼此独立地选自完整/全长药物抗体、药物抗体的F(ab’)2、Fab和scFv。在一个实施方案中，捕获抗体和示踪抗体各自是全长药物抗体、或药物抗体的F(ab’)2或药物抗体的Fab。
在一个实施方案中，结合对子的第一成员选自半抗原、抗原和激素。在一个实施方案中，结合对子是抗原/抗体对子或半抗原/抗半抗原抗体对子。
在一个实施方案中，结合对子选自生物素/(链霉)亲和素、茶碱/抗茶碱抗体、5-溴-脱氧-尿苷/抗5-溴-脱氧-尿苷抗体、异羟基洋地黄毒甙/抗异羟基洋地黄毒甙抗体和helicar/抗螺旋抗体。在一个实施方案中，结合对子是生物素和(链霉)亲和素。
在一个实施方案中，药物是抗C5抗体和靶是人C5。在一个实施方案中，步骤(a)中的pH值处于pH 4.7至pH 5.5的范围内。在一个优选的实施方案中，步骤(a)中的pH值是约pH5.0或约pH 5.5。
在一个实施方案中，在减少靶干扰作用的情况下，对血清或血浆样品中抗药物抗体的量检测和/或确定和/或定量的免疫测定包括以下步骤，所述抗药物抗体可以与药物抗体特异性结合，所述药物抗体是与人C5特异性结合的抗C5抗体：
a)将血清或血浆样品在范围4.7至5.5的pH值温育1.5至2.5小时，并且任选地移除温育后形成的沉淀物，
b)将步骤a)中获得的血清或血浆样品在约2的pH值温育约5分钟，并且任选地离心温育的样品以移除形成的沉淀物，
c)调节pH值至约7.4，向步骤b)中获得的血清或血浆样品，添加与生物素缀合的捕获药物抗体和与异羟基洋地黄毒甙缀合的示踪药物抗体，并且温育混合物以形成捕获抗体-抗药物抗体-示踪抗体-复合物，
d)将步骤c)中获得的血清或血浆样品与缀合于固体表面的(链霉)亲和素温育，以捕获捕获抗体-抗药物抗体-示踪抗体-复合物，并且任选地洗涤表面，(并且)
e)通过以下方式确定步骤d)中形成的复合物中的异羟基洋地黄毒甙，检测和/或确定和/或定量抗药物抗体的量：与缀合于辣根过氧化物酶的抗异羟基洋地黄毒甙抗体温育并且此后与HPPA或TMB温育，并且因而检测和/或确定和/或定量血清或血浆样品中抗药物抗体的量(使形成的复合物与样品中ADA的量相关)。
在全部方面的一个实施方案中，样品来自动物。在一个实施方案中，动物选自人类和实验动物。在一个实施方案中，样品来自已经在获得样品之前施用过药物的动物。在一个实施方案中，样品来自需要用药物治疗的已经在获得样品之前施用过药物的患者。任何情况下，在已经对活体进行如本文所报道的方法后，不向其再施加样品。
在全部方面的一个实施方案中，样品是人样品(人血清或血浆样品)。
在全部方面的一个实施方案中，复合物是非共价复合物。
通常，免疫测定法包括以下步骤：
a)在固体表面上固定捕获抗体，任选地在固定步骤后洗涤表面以移除未结合和非特异性结合的捕获抗体，
b)将步骤a)的固定化的捕获抗体与含有血清或血浆的样品温育，所述样品任选地已经稀释成具有在免疫测定法检测范围内的抗药物抗体浓度，以形成捕获抗体-抗药物抗体-复合物，并且任选地在温育步骤后洗涤表面以移除未结合和非特异性结合的样品，
c)将步骤b)的捕获抗体-抗药物抗体-复合物与标记的示踪抗体温育，以形成捕获抗体-抗药物抗体-示踪抗体复合物，并且任选地在温育步骤后洗涤表面以移除未结合和非特异性结合的示踪抗体，
d)将步骤c)的捕获抗体-抗药物抗体-示踪抗体复合物与特异性结合于示踪抗体的标记物的抗体温育，所述示踪抗体与酶缀合，以形成捕获抗体-抗药物抗体-示踪抗体-检测抗体复合物，并且任选地在温育步骤后洗涤表面以移除未结合和非特异性结合的检测抗体，
e)将步骤d)的捕获抗体-抗药物抗体-示踪抗体-检测抗体复合物与酶的无色底物温育，所述无色底物在酶作用于其上之时转化成有色反应产物，并且在预定的时间段后测定光密度，(并且)
f)使步骤e)中测定的光密度与校准曲线相关联并且因而确定样品中抗药物抗体的量。
发明详述
为了分析体外来源或体内来源样品中的治疗用抗体(药物或简化为D)以及相应的针对治疗用抗体(抗药物抗体或简化为ADA)的抗体，需要相应的测定法。
ADA与其抗原即治疗用抗体/药物(在体外和体内)结合，并且在游离ADA和游离药物之间以及单一和双重复合的药物(假定双价单特异性药物)之间分别形成平衡。这种平衡是动态的，即参与这种平衡的一种组分的浓度的变化还改变参与这种平衡的全部其他组分的浓度。
尽管游离(即非结合)ADA的分数与用于结合药物的可用性和ADA与其抗原(即药物)的体内结合容量相关，测定总ADA可以用来表征ADA和药物之间的相互作用。
例如，为了对药物进行全面药代动力学评价，重要的是了解全身循环中的(游离(即能够结合药物的)或与药物复合的)ADA浓度。可以将游离ADA作为潜在生物标记物评价。
如果药物的抗原存在于样品中，则确定样品中ADA的测定法可能受到干扰。为了药代动力学评价，可以结合或与药物结合的ADA分数进行是重要的。
术语“治疗用抗体”和“药物”在本文中互换地使用。这些术语以最广意义使用并且涵盖多种抗体结构物，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。
在某些实施方案中，药物是单特异性抗体。在一个实施方案中，药物是单特异性双价抗体。在一个优选的实施方案中，药物是单克隆、单特异性双价抗体。
在某些实施方案中，药物是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，一种结合特异性针对第一抗原并且另一种结合特异性针对不同的第二抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以与相同抗原的两个不同表位结合。双特异性抗体可以作为全长抗体或抗体片段制备。在一个实施方案中，抗体是与第一和第二抗原特异性结合的双特异性抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体具有i)与第一抗原或抗原上的第一表位特异性结合的第一结合特异性，和ii)与第二抗原或该(相同)抗原上的第二表位特异性结合的第二结合特异性。在一个实施方案中，相同抗原上的第二表位是非重叠表位。在一个实施方案中，抗体是双特异性双价抗体。在一个优选的实施方案中，抗体是单克隆、双特异性双价抗体。
在WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254、WO2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792或WO 2010/145793中描述了多特异性抗体。
术语“抗C5抗体”和“与C5(特异性)结合的抗体”指这样的抗体，所述抗体能够以足够亲和力结合C5，从而抗体可用作靶向C5的诊断剂和/或治疗剂。在一个实施方案中，抗C5抗体与不相关的非C5蛋白结合的程度小于该抗体与C5结合的程度约10％。在某些实施方案中，抗C5抗体与来自不同物种的C5之间保守的C5表位结合。在一个优选的实施方案中，C5是人C5。
如本文所用，术语“C5”涵盖来自任何脊椎动物来源的任何天然C5，其中所述脊椎动物来源包括哺乳动物如灵长类(例如，人和猴)和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。除非另外说明，术语“C5”指具有SEQ ID NO:30中所示氨基酸序列并含有SEQ ID NO:31中所示β链序列的人C5蛋白。该术语涵盖“全长”、未加工的C5以及因细胞中加工而产生的任何形式的C5。该术语还涵盖天然存在的C5变体，例如，剪接变体或等位变体。SEQ ID NO:30(“野生型”或“wt”C5)中显示示例性人C5的氨基酸序列。SEQ ID NO:31中显示人C5的示例性β链的氨基酸序列。SEQ ID NO:32、33和34中分别显示人C5的示例性β链的MG1、MG2和MG1-MG2结构域的氨基酸序列。SEQ ID NO:35和96中分别显示了示例性食蟹猴和鼠C5的氨基酸序列。SEQ IDNO:30、31、34、35和96的氨基酸残基1-19对应于细胞中加工期间移除并且因此从相应的示例性氨基酸序列丢失的信号序列。
如本文中所用的术语“单克隆抗体”指从基本上均一的抗体群体获得的抗体，即，构成该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体之外(例如，含有天然存在突变或在产生单克隆抗体制备物期间出现)，这类变体通常以微小的量存在。与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆的”指示该抗体的特征为从基本上均一的抗体群体获得，并且不得解释为要求通过任何特定方法产生该抗体。例如，可以通过多种技术产生待根据本发明使用的单克隆抗体，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于产生单克隆抗体的这类方法和其他示例性方法。
不同免疫测定法的原理例如由Hage,D.S.(Anal.Chem.71(1999)294R-304R)描述。Lu，B.等人(Analyst 121(1996)29R-32R)报道了用于免疫测定法中的抗体的定向固定化。抗生物素蛋白-生物素介导的免疫测定法例如由Wilchek,M.和Bayer,E.A.在MethodsEnzymol.184(1990)467-469中报道。
单克隆抗体及其恒定结构域含有多个与结合对子的成员，如多肽/蛋白质、聚合物(例如PEG、纤维素或聚苯乙烯)或酶缀合的反应性氨基酸侧链。氨基酸的化学反应基例如是氨基(赖氨酸、α-氨基)、巯基(胱氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸)、羧酸基(天冬氨酸、谷氨酸)和糖醇基团。这类方法例如由Aslam M.和Dent,A.在“Bioconjugation”,MacMillanRef.Ltd.1999,第50-100页描述。
最常见的蛋白质抗体反应基团之一是氨基酸赖氨酸的脂肪族ε-胺。一般而言，几乎所有的抗体都含有丰富的赖氨酸。在pH 8.0(pKa＝9.18)以上赖氨酸胺是相当强的亲核物质，因此易与多种试剂彻底反应形成稳定的键。胺反应性试剂主要与赖氨酸和蛋白质的α-氨基反应。反应性酯类，特别是N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)酯是最为常用的胺基修饰试剂之一。在水环境中反应的最适pH值是pH8.0至pH9.0。异硫氰酸盐是胺修饰试剂，并与蛋白质形成硫脲键。它们与蛋白质胺在水溶液中发生反应(最佳pH为9.0至9.5)。在温和水溶液中醛与脂肪族和芳香族胺、肼和酰肼形成亚胺中间物(希夫碱)。用弱或强还原剂(例如硼氢化钠或氰基硼氢钠)可将希夫碱选择性还原衍生出稳定的烷基胺键。已用于修饰胺的其它试剂是酸酐。例如，二亚乙基三胺五乙酸酐(DTPA)是包含两个胺反应性酐基团的双功能螯合剂。它能与氨基酸的N-末端和ε-胺基团反应形成酰胺键。酐环打开产生多价的金属螯合臂，在配位化合物中它能与金属紧密结合。
抗体中的另一种常见反应基团是来自含硫氨基酸胱氨酸及其还原产物半胱氨酸(或半个胱氨酸)的巯基残基。半胱氨酸包含游离巯基，它比胺更亲核，并且一般是蛋白质中活性最高的功能基团。在中性pH下巯基一般具有反应性，因此在有胺存在时能与其它分子选择性偶联。由于游离巯基相对反应活跃，具有这些基团的蛋白质常以其氧化形式如二硫基或二硫键存在。在这样的蛋白质中，需要用如二硫苏糖醇(DTT)的试剂将二硫键还原以产生有反应活性的游离巯基。巯基反应性试剂是那些将与多肽上巯基偶联的试剂，其形成硫酯偶联的产物。这些试剂在微酸至中性pH下迅速反应，因此在有胺基存在时可进行选择性反应。已有文献报道了多种硫醇盐交联试剂的用途，例如Traut's试剂(2-亚氨硫醇)、琥珀酰亚氨基(乙酰硫基)乙酸盐(SATA)和硫代琥珀酰亚氨基6-[3-(2-吡啶二硫代)-丙酰胺基]己酸盐(硫代-LC-SPDP)，提供了经由反应氨基引入多个巯基的有效方法。卤代乙酰基衍生物(例如碘乙酰胺)形成硫酯键并且也是可用于巯基修饰的试剂。另外的有用试剂是马来酰亚胺，马来酰亚胺与巯基反应性试剂的反应基本上与碘乙酰胺一样。在弱酸至中性pH下马来酰亚胺迅速发生反应。
抗体中的另一个常见反应基团是羧酸。抗体在C-末端位置以及在天冬氨酸和谷氨酸的侧链内含有羧酸基。羧酸在水中具有相对较低的反应性，使得难以利用这些基团对多肽和抗体进行选择性修饰。当此种修饰完成时，通过使用水溶性碳二亚胺通常将该羧酸基转换为反应性的酯，并与亲核试剂例如胺、酰肼或肼反应。含胺试剂应当是弱碱性的，以便在碱性更高的赖氨酸ε-胺存在下与活化的羧酸选择性反应以形成稳定的酰胺键。当pH值升至8.0以上时，可能发生蛋白质交联。
高碘酸钠可用于将与抗体结合的糖部分内的糖的醇部分氧化为醛。如同已对羧酸进行的描述，每个醛基可与胺、酰肼或肼发生反应。由于糖部分主要见之于抗体的易结晶化片段区(Fc区)，通过对远离抗原结合位点的糖进行定点修饰可以完成缀合。形成西夫碱中间体，后者可以通过用氰基硼氢化钠(轻微和选择性)或硼氢化钠(强烈)水溶性还原剂还原中间体，还原成烷基胺。
可以通过不同方法实施示踪和/或捕获和/或检测抗体与其缀合配偶体的缀合，如化学结合，或借助结合对子结合。如本文所用的术语“缀合配偶体”指例如固相支持物、多肽、可检测标记物、特异性结合对子的成员。在一个实施方案中，借助N末端和/或ε-氨基(赖氨酸)、不同赖氨酸的ε-氨基、抗体的氨基酸主链的羧基、硫氢基、羟基和/或酚官能团和/或抗体的糖结构的糖醇基，通过化学结合作用，进行捕获和/或示踪和/或检测抗体与其缀合配偶体的缀合。在一个实施方案中，捕获抗体借助结合对子与其缀合配偶体缀合。在一个优选的实施方案中，捕获抗体与生物素缀合，并且借助固相支持物固定的抗生物素蛋白或链霉亲和素，进行固定化至固相支持物。在一个实施方案中，捕获抗体借助结合对子与其缀合配偶体缀合。在一个优选的实施方案中，示踪抗体通过共价键缀合至作为可检测标记物的异羟基洋地黄毒甙。
“样品”包括但不限于任何量的来自活体或先前活体的物质。这类活体包括但不限人、小鼠、猴、大鼠、兔和其他动物。在一个实施方案中，样品从猴、尤其食蟹猴、或兔、或小鼠、或大鼠、或人获得。在一个优选的实施方案中，样品是人样品。在一个实施方案中，这类物质包括但不限于来自个体的全血、血浆或血清，它们是临床日常工作中最广泛使用的样品来源。
术语“固相”是指非流体物质，并且包括颗粒物(包括微粒和珠子)，它们是用例如多聚物、金属(顺磁的，铁磁性颗粒)、玻璃和陶瓷材料制成；用凝胶物质例如二氧化硅、铝和聚合物凝胶制成；用多聚物、金属、玻璃和/或陶瓷制的毛细管制成；用沸石和其它的多孔物质制成；用电极、微量滴定板、固相胶条(solid strip)，以及比色杯、试管或其它的分光光度计样品容器制成。固相的成分不同于惰性固体表面，因为“固相”在其表面至少包含倾向于与样品中物质发生作用的部分。固相可能是固定不动的成分，例如试管、胶条(strip)、比色杯或微量滴定板，或可能是非固定的成分，例如珠子和微粒。多种微粒允许蛋白质和其它可能使用的物质以非共价或共价形式附着其上。这样的颗粒包括多聚物颗粒例如聚苯乙烯和聚(异丁烯酸甲酯)；金颗粒，例如金纳米粒和胶体金，以及陶瓷颗粒，例如二氧化硅、玻璃和金属氧化物颗粒。例如参见Martin,C.R.,等人,Analytical Chemistry-News&Features,70(1998)322A-327A或Butler,J.E.,Methods 22(2000)4-23。
色原(荧光的或发光的基团和染料)、酶、NMR-活性基团或金属颗粒、半抗原，例如地高辛，是可检测标记的实例。可检测的标记也可以是光敏化的交联基，例如叠氮基或azirine基。能被电化学发光仪检测到的金属螯合物也是优选的信号发射基团；特别优选的是钌螯合物，例如钌(双吡啶基)3 2+螯合物。合适的钌标记基团在例如EP 0 580979、WO 90/05301、WO 90/11511和WO 92/14138中已有描述。为了直接检测，标记基团可以选自任何已知的可检测标记物基团，如染料，发光标记基团如化学发光基团，例如吖啶酯或二噁二酮，或荧光染料，例如荧光素、香豆素、罗丹明、噁嗪、试卤灵、花青及其衍生物。标记基团的其他实例是发光金属络合物，如钌络合物或铕络合物、酶，例如，如用于ELISA或CEDIA(克隆型酶供体免疫测定法，例如EP-A-0 061 888)，和放射性同位素。
间接检测体系例如包括，将检测试剂(例如，检测抗体)用结合对子的第一配偶体标记。合适的结合对子的实例是抗原/抗体、生物素或生物素类似物如氨基生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素/抗生物素蛋白或链霉亲和素、糖/凝集素、核酸或核酸类似物/互补性核酸，和受体/配体，例如，类固醇激素受体/类固醇激素。在一个优选的实施方案中，第一结合对子成员包含半抗原、抗原和激素。在一个优选的实施方案中，半抗原选自地高辛、异羟基洋地黄毒甙和生物素及其类似物。通常标记这类结合对子的第二部分，例如抗体、链霉亲和素等，以允许直接检测，例如，借助如上文提到的标记物进行。
术语“免疫测定法”指利用特异性结合分子(如抗体)捕获和/或检测特定靶以进行定性或定量分析的任何技术。通常，免疫测定法由以下步骤表征：1)固定或捕获分析物和2)检测并测量分析物。可以将分析物捕获(即，结合)在任何固体表面(如例如膜、塑料板或某些其他固体表面)上。
免疫测定法可以总体上按三个不同样式进行。一种样式是采用直接检测，一个样式是采用间接检测，或借助夹心测定法。直接检测免疫测定法使用可以直接测量的检测(或示踪)抗体。酶或其他分子允许信号生成，这将产生允许可视化或测量信号的颜色、荧光或发光(也可以使用放射性同位素，不过如今它不常用)。在间接测定法中，与分析物结合的第一抗体用来为第二抗体(示踪抗体)提供限定的靶，所述第二抗体与第一抗体(称作检测或示踪抗体)提供的靶特异性结合。第二抗体产生可度量信号。夹心测定法利用两种抗体，捕获抗体和示踪(检测)抗体。捕获抗体用来结合(固定)来自溶液的分析物或在溶液中与之结合。这允许从样品特异性取出分析物。示踪(检测)抗体在第二步骤中用于(如上文所述直接或间接地)生成信号。夹心样式需要各自在靶分子上具有不同表位的两种抗体。此外，它们不得彼此干扰，因为两种抗体必须与靶同时结合。
-本发明方法的实施方案
ADA测定法中的药物干扰作用是公知的现象，但是ADA测定法中药物的靶的干扰作用并非如此。
通常，在酸解离后，中和步骤跟随酸或碱解离，以允许结合配偶体重新桥接，从而造成溶液中的干扰因子(如果仍有)还重新结合，仍然是问题。
许多方案已经用来缓解这个问题，如酸或碱解离、使用特异性抗体的干扰作用竞争性抑制、移除干扰因素、采用酸解离的固相提取(SPEAD)、亲和捕获洗脱(ACE)和许多其他方案。桥式测定法中酸解离的使用已经显示某种程度上改善对ADA检测的药物耐受性(参见，例如Moxness,M.等人,Clin.Chem.51(10),1983；Patton,A.等人,J.Immunol.Methods304(2005)189)。
靶分子或免疫复合物的PEG沉淀以大小(或分子量，MW)为基础并且呈PEG浓度依赖性。PEG浓度越高，它将沉淀的靶的MW越低。为了减少非特异性血清蛋白如白蛋白和免疫球蛋白的沉淀，低浓度的PEG是用来沉淀大MW的药物:ADA免疫复合物。使用沉淀原理，配合酸性条件下酸解离和大容量表面上捕获(防止结合配偶体再结合)，允许使用特异性检测试剂，特异性检测ADA或药物或药物靶。
酸解离常见地用来破坏药物-ADA-复合物，并且因此用来从所述免疫复合物释放ADA。释放的(游离)ADA可以在后续步骤中与检测抗体形成复合物。与经典ADA测定法(无酸解离步骤)相比，酸解离步骤可以缩短总体测定时间。通常，重点在可比灵敏度上。
通常，标准ADA测定法具有缺点：在残余药物存在下ADA和试剂之间形成新平衡的温育时间长。如果施加短的温育时间，则仅可以获得低药物耐受性(＝伴随残余药物的低灵敏度)。
可度量复合物的形成过程耗时并且依赖于ADA与试剂的结合速率常数。对于标准ADA测定法，免疫复合物的解离速率常数是时限步骤。出于这个原因，较长的温育时间(常见地过夜)用于温育样品和试剂。
因此，酸解离优势地是复杂的解离程序。
本发明的一个方面是对血清或血浆样品中抗药物抗体的量检测和/或确定和/或定量的免疫测定法，所述抗药物抗体可以与药物抗体特异性结合，所述药物抗体可以与治疗靶特异性结合，包括以下步骤：
a)将固定化的捕获抗体与包含药物、靶和抗药物抗体的血清或血浆样品温育，以形成捕获抗体-抗药物抗体复合物，
b)用pH值为约靶的pI的包含糖和去垢剂的缓冲液洗涤步骤a)中形成的复合物，
c)将步骤b)的洗涤的复合物与标记的示踪抗体温育12至24小时，以形成捕获抗体-抗药物抗体-示踪抗体复合物，(并且)
d)通过确定步骤c)中形成的复合物中的可检测标记物，对抗药物抗体的量检测和/或确定和/或定量。
在一个实施方案中，糖是蔗糖，去垢剂是聚乙二醇十二烷基醚，药物是抗C5抗体，靶是人C5并且缓冲液具有约5.5的pH值。
本发明的一个方面是对血清或血浆样品中抗药物抗体的量检测和/或确定和/或定量的免疫测定法，所述抗药物抗体可以与药物抗体特异性结合，所述药物抗体可以与治疗靶特异性结合，包括以下步骤：
a)将血清或血浆样品在是约靶pI值的pH值温育，并且任选地移除温育后形成的沉淀物，
b)将步骤a)中获得的血清或血浆样品在约2的pH值温育，并且任选地离心温育的样品以除去形成的沉淀物，
c)调节pH值至约7.4，向步骤b)中获得的血清或血浆样品，添加与结合对子的第一成员缀合的捕获抗体和与可检测标记物缀合的示踪抗体，并且温育混合物以形成捕获抗体-抗药物抗体-示踪抗体-复合物，(并且)
d)对步骤c)中形成的复合物测量和/或确定和/或定量并且因而对血清或血浆样品中抗药物抗体的量检测和/或确定和/或定量。
在一个实施方案中，对捕获抗体-抗药物抗体-示踪抗体-复合物测量和/或确定和/或定量的步骤(步骤d))包括步骤
d1)将步骤c)中获得的血清或血浆样品与缀合于固体表面的结合对子的第二成员温育，以捕获捕获抗体-抗药物抗体-示踪抗体-复合物，并且任选地洗涤表面，(并且)
d2)通过确定步骤d1)中形成的复合物中的(可检测)标记物，对抗药物抗体的量检测和/或确定和/或定量。
在一个实施方案中，对血清或血浆样品中抗药物抗体的量检测和/或确定和/或定量的免疫测定法，所述抗药物抗体可以与药物抗体特异性结合，所述药物抗体是可以与人C5特异性结合的抗C5抗体，包括以下步骤：
a)将血清或血浆样品在范围4.7至5.5的pH值温育1.5至2.5小时，并且任选地移除温育后形成的沉淀物，
b)将步骤a)中获得的血清或血浆样品在约2的pH值温育约5分钟，并且任选地离心温育的样品以移除形成的沉淀物，
c)调节pH值至约7.4，向步骤b)中获得的血清或血浆样品，添加与生物素缀合的捕获药物抗体和与异羟基洋地黄毒甙缀合的示踪药物抗体，并且温育混合物以形成捕获抗体-抗药物抗体-示踪抗体-复合物，
d)将步骤c)中获得的血清或血浆样品与缀合于固体表面的(链霉)亲和素温育，以捕获捕获抗体-抗药物抗体-示踪抗体-复合物，并且任选地洗涤表面，(并且)
e)通过以下方式确定步骤d)中形成的复合物中的异羟基洋地黄毒甙，检测和/或确定和/或定量抗药物抗体的量：与缀合于辣根过氧化物酶的抗异羟基洋地黄毒甙抗体温育并且此后与HPPA或TMB温育，并且因而检测和/或确定和/或定量血清或血浆样品中抗药物抗体的量。
如本文报告的测定法解决了对血清或血浆样品中抗药物抗体测量和/或确定和/或定量时治疗药物的靶的干扰作用。
正常情况下，必须解决对血清或血浆样品中抗药物抗体(ADA)确定和/或测量和/或定量时，来自药物的干扰作用。各措施因此可以对抗药物抗体具有高特异灵敏度，从而影响样品中向游离抗药物抗体的平衡、通过样品预处理而解离ADA-药物复合物、检测ADA-药物复合物或富集ADA。
但是，样品中药物的靶的干扰作用并未因此而解决。
如本文报告的免疫测定法在下文用治疗用抗C5抗体例举。这仅作为当前报道的免疫测定法的范例呈现并且不得解释为限制本发明。
人C5具有大约70μg/ml(大约368nM)的血清浓度。
评价不同的样品稀释度(1:100，1:1000)、不同捕获抗体以及示踪抗体浓度(各自500ng/ml、各自1000ng/ml、各自1500ng/ml、各自2000ng/ml)、不同的过氧化物酶浓度(1000ng/ml捕获抗体浓度和示踪抗体浓度时5mU、10mU、25mU、50mU)(参见图1和图2)。对于全部实验，将样品与试剂过夜温育。
本发明至少部分地基于以下发现：捕获抗体和示踪抗体浓度应当是至少500ng/ml，而在1500ng/ml或更高时，不能实现进一步信号增益。
而是存在相当高的背景。
在1％(v/v)人血清存在下，可以观察到非特异性结合。用BSA封闭平板不解决非特异性结合问题。
不含BSA：
Figure BDA0002515383970000171
Figure BDA0002515383970000181
含BSA：
Figure BDA0002515383970000182
可以见到，甚至在Bi/Dig试剂不存在的情况下，获得高信号(列“-/-”)。此外，仍可以见到检测试剂的其他非特异性结合(列“-/Dig”)。
通过添加去垢剂(Brij35)，可以见到非特异性结合作用减少(参见“-/-”列、“Bi/-”列和“-/Dig”列)。在去垢剂不存在时，截断点(CP)是10240(大约2562ng/ml)(参见“Bi/Dig”列)，而在去垢剂存在时，CP是4708(大约817ng/ml)(参见“Bi/Dig”列)。但个体的变异系数(CV)高。
不含去垢剂：
Figure BDA0002515383970000183
含去垢剂：
Figure BDA0002515383970000184
Figure BDA0002515383970000191
交换检测用酶的底物可以降低信噪比(S/N)。
含去垢剂和HPPA(3-(4-羟苯基)丙酸)：
Figure BDA0002515383970000192
含去垢剂和TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)：
Figure BDA0002515383970000193
当使用HPPA时，截断点(cut-point，CP)是4708(大约817ng/ml)，而使用TMB时，CP是0.162(大约845ng/ml)。
Figure BDA0002515383970000194
Figure BDA0002515383970000201
为了避免长期温育(过夜温育)，引入酸解离步骤。该方法随后包括在pH 2温育30分钟，随后调节pH至pH 7.4，添加生物素化的捕获抗体和异羟基洋地黄毒甙化示踪抗体并温育一小时。
基于8份独立样品，确定平均值为4410荧光单位，变异系数为9％。截断点是5059个荧光单位(1915ng/ml)。因此，引入酸解离步骤未导致灵敏度改进。
血浆或血清的存在并未显著地改变测定特征。人血清和NHP血清提供相似的分析结果(参见图3)。
马血清和兔血清提供与缓冲剂相似的结果。马C5和兔C5无交叉反应性。耗尽C5的人血清的空白信号与缓冲液可相当并且稀释度4时的信号低于含人汇集血清的信号(参见图4)。
测定性能因增加马血清及因而样品中的马C5含量受损(参见图5)。
同样地，添加人C5造成信号增加，证实测定干扰作用源自样品中治疗用抗体的靶(参见图6)。
已经发现，可能用C5和对照pAb二者校准桥式测定法，即C5是在测定法中的归因性信号(参见图7)。在不受这种理论约束的情况下，假定粘性C5聚集物造成问题(参见图8(洗涤缓冲液pH 7.4)和图9(洗涤缓冲液pH 5.5))。
已经发现C5和pAb二者均与治疗药物结合。较高的药物对C5比导致较低的应答，提示没有非特异性结合(参见图10中的BIAcore数据)。
使用治疗药物预包被的表面，已经发现C5和pAb二者均与治疗药物结合。在捕获C5后，该表面够结合治疗药物，表明仍存在游离表位，这对聚集的C5而言就是如此(参见图11)。
基于这些发现，已经通过使用增强性洗涤步骤：用pH值5.5的缓冲液洗涤6次，进一步改变该方法。在不受这种理论约束的情况下，这减少捕获的聚集物的数量/量。
1％血清中的结果；S/N＝7；截断点＝2429个FU(0.82ng/ml)
个体 平均OD 浓度
2199 2005 >空白<104ng/ml
2198 1364 >空白<104ng/ml
2201 374 <空白
2195 1050 >空白<104ng/ml
2205 970 >空白<104ng/ml
2202 1881 >空白<104ng/ml
2194 1593 >空白<104ng/ml
2196 2188 >空白<104ng/ml
0.1％血清中的结果；S/N＝2；截断点＝2660个FU(0.84ng/ml)
个体 平均OD 浓度
2199 2670 >空白<104ng/ml
2198 1822 >空白<104ng/ml
2201 1187 <空白
2195 1507 >空白<104ng/ml
2205 1403 >空白<104ng/ml
2202 2148 >空白<104ng/ml
2194 1840 >空白<104ng/ml
2196 2262 >空白<104ng/ml
S/N比随稀释降低。在含1％和0.1％血清的样品中，截断点值和最低校准物是相似的。血清中阳性对照的截断点接近100ng/ml。
通过在4℃温育约16小时(过夜)、通过测定缓冲液中添加6.5wt-％蔗糖、和通过添加非离子型去垢剂Brij35，针对如本文报告的发现改变该测定法，以减少聚集物形成。
通过使用pH值5.5的洗涤缓冲液，进一步改变该测定法以减少治疗药物与靶(即C5)相互作用。
基于如上文概述的发现，建立一种新测定模式，其中在确定和/或测量和/或定量样品中抗药物抗体之前移除样品中存在的C5聚集物。
如本文报告的新测定模式包括专用沉淀步骤，其中治疗用抗体的靶在约其pI值的pH值沉淀。在抗C5抗体作为治疗药物的情况下，靶是人C5并且通过在4.7至5.5范围内的pH值温育，实现沉淀。在一个实施方案中，在约5的pH值温育。在一个优选的实施方案中，在约5的pH值温育约2小时，任选地伴随搅拌。
如本文报告的新测定模式包括在专用沉淀步骤后的酸解离步骤。在这个步骤中，不受这种理论约束的情况下，ADA(抗-抗C5抗体-抗体；抗药物抗体)从沉淀物解离。在一个优选的实施方案中，酸解离通过在约2的pH值温育约5分钟进行。
如本文报告的新测定模式任选地包括在酸解离步骤后的离心步骤。
如本文报告的新测定模式包括在酸解离步骤后的以下步骤：调节样品的pH值至约7.4，随后添加捕获抗体和示踪抗体，后续温育。在一个实施方案中，捕获抗体和示踪抗体是药物抗体。在一个实施方案中，捕获抗体与结合对子的第一成员缀合。在一个实施方案中，结合对子选自生物素/(链霉)亲和素、半抗原/抗半抗原抗体、核酸/互补性核酸和配体/配体受体。在一个优选的实施方案中，结合对子是生物素/(链霉)亲和素。在一个优选的实施方案中，捕获抗体与生物素缀合。在一个实施方案中，示踪抗体与可检测标记物缀合。
如本文报告的新测定模式包括与捕获和示踪抗体温育步骤后，使捕获抗体-抗药物抗体-示踪抗体复合物固定在经结合对子的第二成员衍生化的固相上。在一个优选的实施方案中，结合对子的第二成员是(链霉)亲和素。
如本文报告的新测定模式包括在固定步骤后，通过以下方式对固定化复合物的量测量和/或确定和/或定量步骤：将固定化复合物与特异性结合可检测标记物的抗体温育，所述可检测标记物缀合于催化无色底物转化成有色产物的酶，随后与酶的无色底物温育，确定形成的有色产物的量并且使形成的有色产物的量与校准曲线相关并且因而确定样品中抗药物抗体的量。在一个实施方案中，可检测标记物是半抗原。在一个实施方案中，半抗原选自生物素、异羟基洋地黄毒甙(digoxigenin)、茶碱和溴脱氧尿苷。在一个优选的实施方案中，可检测标记物是异羟基洋地黄毒甙(digoxygenin)。在一个优选的实施方案中，酶是辣根过氧化物酶。在一个实施方案中，无色底物是ABTS或HPPA或TMB。在一个优选的实施方案中，无色底物是TMB。
下表中展示基于30名个体，用一种如本文报告的方法(C5沉淀方案)获得的结果。
校准曲线的数据：
Figure BDA0002515383970000221
Figure BDA0002515383970000231
30份独立样品的FU信号：
Figure BDA0002515383970000232
Figure DA00025153839754991
如本文报告的新测定法具有合适至高的动态范围，它灵敏并解决了来自待分析样品中存在的各个靶水平的干扰作用。
对于样品加工，不需要在分析之前移除温育步骤中在约靶的pI处形成的沉淀物。无酸温育步骤情况下，存在干扰(参见图12)：
Figure BDA0002515383970000233
Figure DA00025153839755051
图13中显示采用阳性对照、长温育时间和pH 5.5洗涤的校准。15名个体的平均数是119，空白汇集物值是123，并且截断点是135。
图14中显示采用多克隆抗体、长温育时间和pH 7.4洗涤的校准。15名个体的平均数是145，空白汇集物值是157，并且截断点是193。
图15中显示采用多克隆抗体、短温育时间和pH 5.5洗涤的校准。15名个体的平均数是124，空白汇集物值是115，并且截断点是247。
图16中显示在C5存在、pH 5.5处2小时温育和pH 5洗涤时采用多克隆抗体的校准。
图17中显示在C5存在、pH 5处2小时温育和pH 7.5洗涤时采用多克隆抗体的校准。
图18中显示在C5存在、pH 2处30分钟温育和pH 5.5洗涤时采用多克隆抗体的校准(使用根据现有技术的酸解离的ADA测定法)。
本发明具体实施方案的示例性药物抗体
US 2016/0167054公开了抗C5抗体及其使用方法。在一些实施方案中，公开的分离的抗C5抗体在中性pH以高于酸性pH时的亲和力与C5的β链内部的表位结合。
C5是一种在正常血清中按大约71μg/ml(0.4μM)存在的181kDa蛋白质。C5为糖基化的，其约1.5-3％的质量归因于糖。成熟的C5是与66kDaβ链二硫键连接106kDaα链的异二聚体。C5作为1577个氨基酸的单链前体蛋白(原C5前体)合成(参见，例如，US 6,355,245和US7,432,356)。原C5前体经剪切以产生β链作为氨基端片段和a链作为α羧基末端片段。α链和β链多肽片段彼此由二硫键连接并且构成成熟的C5蛋白。
在补体途径活化期间，成熟C5剪切成C5a和C5b片段。作为包含α链前65氨基酸的氨基端片段，C5a由C5转化酶从C5的α链切下。成熟C5的剩余部分是片段C5b，其含有通过二硫键与β链结合的α链的其余部分。C5a的11kDa质量的大约20％归因于糖。
C5a是过敏毒素。C5b与C6、C7、C8和C9组合，以在靶细胞表面形成膜攻击复合物(MAC、C5b-9、终末补体复合物(TCC))。当足够数目的MACS插入靶细胞膜时，形成MAC孔以介导靶细胞的快速渗透性裂解。
过敏毒素可以触发肥大细胞脱颗粒，其释放组胺和其他炎症介质，导致平滑肌收缩、血管通透性升高、白细胞活化和其他炎性现象，包括导致过度细胞化的细胞增殖。C5a还作为趋化肽发挥作用，所述趋化肽起到吸引粒细胞如中性粒细胞、嗜酸粒细胞、嗜碱性粒细胞和单核细胞至补体激活部位。
C5a的活性受血浆酶羧肽酶N调节，所述酶从C5a移除羧基端精氨酸，形成C5a-des-Arg衍生物。C5a-des-Arg仅显示出未修饰的C5a的1％过敏活性及多形趋化活性。
尽管恰当发挥功能的补体系统提供了对抗微生物感染的稳健防御，但对补体的不恰当调节或激活已经涉及多种疾病的发病机制，所述疾病例如包括类风湿性关节炎(RA)；狼疮性肾炎；缺血-再灌注损伤；阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)；非典型溶血尿毒症综合征(aHUS)；致密沉积物病(DDD)；黄斑变性(例如，年龄相关性黄斑变性(AMD))；溶血、肝酶升高和低血小板(HELLP)综合征；血栓性血小板减少性紫癜(TTP)；自发性胎儿丢失；Pauci-免疫血管炎；大疱性表皮松解症；反复胎儿丢失；多发性硬化(MS)；外伤性脑损伤；和因心肌梗死、心肺分流术和血液透析产生的损伤(参见，例如Holers等人,Immunol.Rev.223(2008)300-316)。因此，抑制过多或失控的补体级联反应激活可以向这类疾病的患者、尤其阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)患者提供临床获益。
依库珠单抗是针对补体蛋白C5的人源化单克隆抗体，并且是首个经批准用于治疗阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)和非典型溶血尿毒症综合征(aHUS)的疗法(参见，例如Dmytrijuk等人,The Oncologist 13(2008)894-910)。依库珠单抗抑制C5被C5转化酶剪切成C5a和C5b，这防止终末补体复合物C5b-9生成。C5a和C5b-9均引起终末补体介导的事件，所述事件的特征是PNH和aHUS(还参见WO 2005/065607、WO 2007/96586、WO 2008/060790和WO 2010/054403)。几份报告已经描述了其他抗C5抗体。例如，WO 86/28707描述了与C5的α链结合、但不与C5a结合并阻断C5激活的抗C5抗体，而WO 2002/30886描述了抑制C5a形成的抗C5单克隆抗体。在另一方面，WO 2004/006653描述了识别C5的α链上C5转化酶的蛋白酶解性位点并抑制C5转化成C5a和C5b的抗C5抗体。WO 2010/015608描述了具有至少1x10E7 M-1的亲和力常数抗C5抗体。在一个实施方案中，药物是依库珠单抗。
在一些实施方案中，该方法检测针对与C5的β链内部的表位结合的抗C5抗体的ADA。在一些实施方案中，抗C5抗体与C5的β链的MG1-MG2结构域内部的表位结合。在一些实施方案中，抗C5抗体与C5的β链(SEQ ID NO:31)的氨基酸27-115组成的片段内部的表位结合。在一些实施方案中，抗C5抗体与C5的β链(SEQ ID NO:31)内部的表位结合，所述表位包含至少一个选自氨基酸38-48、61-67和98-101的片段。在一些实施方案中，抗C5抗体与C5的β链(SEQ ID NO:31)的片段内部的表位结合，所述片段包含至少一个选自SEQ ID NO:31的Glu48、Asp51、His61、His63、Lys100和His101的氨基酸残基。在其他实施方案中，抗体在中性pH以高于酸性pH时的亲和力与C5结合。在其他实施方案中，抗体在pH 7.4以高于pH 5.8时的亲和力与C5结合。在另一个实施方案中，抗C5抗体结合至与表1中所述抗体相同的表位。在其他实施方案中，抗体在pH 7.4以高于pH 5.8时的亲和力结合至与表1中所描述的抗体相同的表位。在又一个实施方案中，抗C5抗体结合至与表2或表3中所描述的抗体相同的表位。在其他实施方案中，抗体在pH 7.4以高于pH 5.8时的亲和力结合至与表2或表3中所描述的抗体相同的表位。
表1
Figure BDA0002515383970000261
表2
Figure BDA0002515383970000262
Figure BDA0002515383970000271
表3
Figure BDA0002515383970000272
在某些实施方案中，抗C5抗体与下述抗体竞争结合于C5，所述抗体包含选自以下的VH和VL对子：(a)SEQ ID NO:01的VH和SEQ ID NO:11的VL；(b)SEQ ID NO:05的VH和SEQID NO:15的VL；(c)SEQ ID NO:04的VH和SEQ ID NO:14的VL；(d)SEQ ID NO:06的VH和SEQID NO:16的VL；(e)SEQ ID NO:02的VH和SEQ ID NO:12的VL；(f)SEQ ID NO:03的VH和SEQID NO:13的VL；(g)SEQ ID NO:09的VH和SEQ ID NO:19的VL；(h)SEQ ID NO:07的VH和SEQID NO:17的VL；(i)SEQ ID NO:08的VH和SEQ ID NO:18的VL；和(j)SEQ ID NO:10的VH和SEQID NO:20的VL。
在某些实施方案中，抗C5抗体用作药物。在一个实施方案中，抗C5抗体用于治疗补体介导的疾病或病状，所述疾病或病状涉及C5的过多或失控激活。在额外的实施方案中，抗C5抗体用于治疗疾病或病状，所述疾病或病状包括但不限于阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、年龄相关性黄斑变性、心肌梗死、类风湿性关节炎、骨质疏松症、骨关节炎和炎症。抗C5抗体用来增强从血浆清除C5。
在某些实施方案中，该方法用于检测针对抗C5抗体的ADA，所述抗C5抗体包含如上文提供的任一个实施方案中的VH和包含SEQ ID NOs:27、28、29、105、106和107中任一者的氨基酸序列的重链恒定区。在某些实施方案中，该方法用于检测抗C5抗体，所述抗C5抗体包含如上文提供的任一个实施方案中的VL和包含SEQ ID NOs:36、37和38中任一者的氨基酸序列的轻链恒定区。
在某些实施方案中，该方法用于检测针对抗C5抗体的ADA，所述抗C5抗体与下述抗体竞争结合于C5，所述抗体包含选自以下的VH和VL对子：(a)SEQ ID NO:01的VH和SEQ IDNO:11的VL；(b)SEQ ID NO:22的VH和SEQ ID NO:25的VL；(c)SEQ ID NO:21的VH和SEQ IDNO:24的VL；(d)SEQ ID NO:05的VH和SEQ ID NO:15的VL；(e)SEQ ID NO:04的VH和SEQ IDNO:14的VL；(f)SEQ ID NO:06的VH和SEQ ID NO:16的VL；(g)SEQ ID NO:02的VH和SEQ IDNO:12的VL；(h)SEQ ID NO:03的VH和SEQ ID NO:13的VL；(i)SEQ ID NO:09的VH和SEQ IDNO:19的VL；(j)SEQ ID NO:7的VH和SEQ ID NO:17的VL；(k)SEQ ID NO:8的VH和SEQ ID NO:18的VL；(l)SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:26的VL；和(m)SEQ ID NO:10的VH和SEQ IDNO:20的VL。
在某些实施方案中，该方法用于检测针对抗C5抗体的ADA，所述抗C5抗体与下述抗体竞争结合于C5，所述抗体包含选自以下的VH和VL对子：(a)SEQ ID NO:22的VH和SEQ IDNO:25的VL；(b)SEQ ID NO:21的VH和SEQ ID NO:24的VL；(c)SEQ ID NO:05的VH和SEQ IDNO:15的VL；(d)SEQ ID NO:04的VH和SEQ ID NO:14的VL；(e)SEQ ID NO:06的VH和SEQ IDNO:16的VL；(f)SEQ ID NO:02的VH和SEQ ID NO:12的VL；(g)SEQ ID NO:03的VH和SEQ IDNO:13的VL；(h)SEQ ID NO:09的VH和SEQ ID NO:19的VL；(i)SEQ ID NO:07的VH和SEQ IDNO:17的VL；(j)SEQ ID NO:8的VH和SEQ ID NO:18的VL；(k)SEQ ID NO:23的VH和SEQ IDNO:26的VL。
提供以下实施例、序列和附图以辅助理解本发明，所附权利要求书中阐述本发明的真实范围。可以理解，可以对所述方法作修改而不脱离本发明的精神。
附图简述
图1：不同捕获抗体以及示踪抗体浓度((1)：各自500ng/ml，(2)：各自1000ng/ml，(3)：各自1500ng/ml，(4)：各自2000ng/ml)的影响。
图2：不同过氧化物酶浓度(在1000ng/ml捕获抗体和示踪抗体浓度时(1)：5mU，(2)：10mU，(3)：25mU，(4)：50mU)的影响。
图3：人血清和NHP血清((1)：人血清，(2)：人血浆，(3)：食蟹猴血清)的影响。
图4：马血浆(1)、兔血浆(2)、耗尽C5的人血浆(3)和缓冲液(4)的影响。
图5：测定性能因增加马血清及因而样品中的马C5含量受损(参见图5)(0％(1)、1％(2)、5％(3)或10％(4)马血清中的1％人血清)。
图6：人C5对测定法的影响(pAb+(1)：人血清，(2)：缓冲液+brij，(3)：人血清中的500ng/ml C5，(4)：缓冲液+brij中的500ng/ml C5)。
图7：用C5((1)：pH 7.4，(2)：pH 5.5，(3)：pH 8.0)和对照pAb(抗独特型抗体)((4)：pH 7.4，(5)：pH 5.5，(6)：pH 8.0)校准桥式测定法。
图8：桥式测定法中pH 7.4洗涤缓冲液的用途(用(1)pAb抗独特型抗体和捕获抗体与示踪抗体，(2)无捕获抗体且无示踪抗体情况下的C5，(3)有捕获抗体且无示踪抗体情况下的C5，(4)无捕获抗体但有示踪抗体情况下的C5，(5)有捕获抗体且有示踪抗体情况下的C5校准)。
图9：桥式测定法中pH 5.5洗涤缓冲液的用途(用(1)pAb抗独特型抗体和捕获抗体与示踪抗体，(2)无捕获抗体且无示踪抗体情况下的C5，(3)有捕获抗体且无示踪抗体情况下的C5，(4)无捕获抗体但有示踪抗体情况下的C5，(5)有捕获抗体且有示踪抗体情况下的C5校准)。
图10：药物对C5比的影响；修正的SPR传感图；(1)：C5，(2)：C5+pAb 100/100nM，(3)：C5+pAb 100/10nM，(4)：C5+pAb 100/250nM，(5)：C5+pAb 100/500nM，(6)：C5+pAb 100/50nM，(7)：mAb-C5，(8)：pAb-抗独特型-mAb C5，(9)缓冲液。
图11：pAb(绿色)和C5(红色)与生物素化药物包被的表面结合，随后在如依据箭头所示的时间添加缓冲液或示踪剂(1、2)/异羟基洋地黄毒甙化药物(3、4)。
图12：与不施加酸温育步骤(3)情况下的校准相比，(1)无离心、(2)有离心情况下桥式测定法中pAb的校准。
图13：采用阳性对照、长温育时间和pH 5.5洗涤的校准。
图14：采用多克隆抗体、长温育时间和pH 7.4洗涤的校准。
图15：采用多克隆抗体、短温育时间和pH 5.5Confidential洗涤的校准。
图16：在血清(1)、缓冲液(2)、pH 5处2小时温育和pH 5.5洗涤存在时采用多克隆抗体的校准，在血清(3)、缓冲液(4)、pH 5处2小时温育和pH 5.5洗涤存在时采用C5的校准。
图17：在血清(1)、缓冲液(2)、pH 5处2小时温育和pH 7.4洗涤存在时采用多克隆抗体的校准，在血清(3)、缓冲液(4)、pH 5处2小时温育和pH 7.4洗涤存在时采用C5的校准。
图18：在血清(1)、缓冲液(2)、pH 2处0.5小时温育和pH 5.5洗涤存在时采用多克隆抗体的校准，在血清(3)、缓冲液(4)、pH 2处0.5小时温育和pH 5.5洗涤存在时采用C5的校准。
实施例
实施例1
采用蔗糖和Brij的测定法
将生物素化的和异羟基洋地黄毒甙化的药物与30份独立血清样品温育。为了功能性检验所用试剂(对照)，用不同浓度的人工阳性对照标准制备血清样品(汇集的血清)，温育并作为独立血清样品处理。标记的药物浓度各自保持恒定在1000ng/mL。测定法中血清终浓度是1％。将形成的免疫复合物转移入链霉亲和素(SA)包被的白色微量滴定板并温育1小时，以借助生物素标记的捕获试剂固定复合物。在抽吸上清液后，通过反复洗涤移除未结合的物质。将固定化的复合物与缀合于辣根过氧化物酶的抗异羟基洋地黄毒甙抗体(抗异羟基洋地黄毒甙-POD(聚))温育。通过使用含6.5％蔗糖的PBS缓冲液或以0.5％浓度含Brij35的ELISA用Roche通用缓冲液，用相同的缓冲液进行每个步骤。最后，通过添加氧化型HPPA溶液、荧光POD底物，可视化形成的固定化的免疫复合物。将发射以光度测定方式测定(在320nm波长激发，在405nm波长发射)并且设定与样品中的阳性对照浓度相关。独立血清样品的CV是29％(蔗糖缓冲液测定法)和181％(含Brij的Roche通用缓冲液)。
实施例2
采用酸温育步骤的测定法
将独立血清样品(N＝30)和人工阳性对照样品与10mM乙酸盐缓冲液pH 5.0温育2小时。此后，将样品与0.1M甘氨酸盐酸盐pH 2.0温育5分钟。将酸化的样品与生物素化的捕获抗体和异羟基洋地黄毒甙化的检测抗体混合，用0.5M TRIS缓冲液pH 8.5中和并且在室温和450转/分钟，于微量滴定板摇床上温育30分钟。测定法血清终浓度是1％。将形成的免疫复合物转移入链霉亲和素(SA)包被的微量滴定板并温育1小时，以借助生物素标记的捕获抗体固定免疫复合物。在抽吸上清液后，通过反复洗涤移除未结合的物质。将固定化的免疫复合物与缀合于辣根过氧化物酶的抗异羟基洋地黄毒甙Fab片段(抗Dig-POD)温育。通过添加氧化型HPPA溶液、荧光POD底物，可视化形成的固定化的免疫复合物。将发射以光度测定方式测定(在320nm波长激发，在405nm波长发射)并且设定与血清样品中的人工阳性对照浓度相关。人工阳性对照提供100ng/mL时100％血清中>3的空白对噪声比。独立血清样品的CV(N＝30)是7％。
实施例3
采用低血清含量且无酸解离的测定法
将生物素化的和异羟基洋地黄毒甙化的药物按血清终浓度1％和0.1％与32份独立血清温育。为了功能性检验所用试剂(对照)，用不同浓度的人工阳性对照标准制备血清样品(汇集的血清)，温育并作为独立血清样品处理。标记的药物浓度各自保持恒定在1000ng/mL。将形成的免疫复合物转移入链霉亲和素(SA)包被的白色微量滴定板并温育1小时，以借助生物素标记的捕获试剂固定复合物。在抽吸上清液后，通过反复洗涤移除未结合的物质。将固定化的复合物与缀合于辣根过氧化物酶的抗异羟基洋地黄毒甙抗体(抗异羟基洋地黄毒甙-POD(聚))温育。最后，通过添加氧化型HPPA溶液、荧光POD底物，可视化形成的固定化的免疫复合物。将发射以光度测定方式测定(在320nm波长激发，在405nm波长发射)并且与样品中的阳性对照浓度成正比。对于1％和0.1％测定法，人工阳性对照提示100％血清中约100ng/mL的测定灵敏度。独立血清样品的CV是74％(0.1％血清测定法)和65％(1％血清测定法)。
Figure IDA0002515386020000011
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Claims (31)

1.一种在减少靶干扰作用的情况下，对血清或血浆样品中抗药物抗体的量定量的免疫测定法，所述抗药物抗体可以与药物抗体特异性结合，所述药物抗体可以与治疗靶特异性结合，包括以下步骤：
a)将固定化的捕获抗体与包含药物、靶和抗药物抗体的血清或血浆样品温育，以形成捕获抗体-抗药物抗体复合物，
b)用pH值为约靶的pI的包含糖和去垢剂的缓冲液洗涤步骤a)中形成的复合物，
c)将步骤b)的洗涤的复合物与缀合于标记物的示踪抗体温育12至24小时，以形成捕获抗体-抗药物抗体-示踪抗体复合物，
d)通过确定步骤c)中形成的复合物中的标记物，对抗药物抗体的量定量。
2.根据权利要求1所述的免疫测定法，其中示踪抗体和捕获抗体是药物抗体。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的免疫测定法，其中免疫测定法包含捕获抗体、示踪抗体和检测抗体，其中捕获抗体是与结合对子的第一成员缀合的药物，示踪抗体是与可检测标记物缀合的药物抗体并且检测抗体是与缀合于酶的可检测标记物特异性结合的抗体。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的免疫测定法，其中捕获抗体和/或示踪抗体彼此独立地选自完整/全长药物抗体、F(ab’)2、Fab和scFv。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的免疫测定法，其中糖是单糖、二糖或三糖。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的免疫测定法，其中糖选自由蔗糖、乳糖、麦芽糖、异麦芽糖和海藻糖组成的二糖的组。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的免疫测定法，其中糖具有约6.5wt-％的浓度。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的免疫测定法，其中去垢剂是非离子型去垢剂。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的免疫测定法，其中去垢剂选自由聚烷二醇醚(商标Brij)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单酯(商标Tween)、辛基酚乙氧基化物(商标Trion或Nonident)、辛基-β-糖苷、n-脂肪酸-N-甲基-D-葡糖胺(商标MEGA)和N,N’-双-(3-D-葡糖酰胺丙基)胆酰胺(商品名称CHAP)组成的去垢剂的组。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的免疫测定法，温育持续14至20小时，在一个实施方案中，温育持续15至17小时。
11.根据权利要求3至10中任一项所述的免疫测定法，其中结合对子的第一成员选自半抗原、抗原和激素。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的免疫测定法，其中结合对子选自生物素/(链霉)亲和素、茶碱/抗茶碱抗体、5-溴-脱氧-尿苷/抗5-溴-脱氧-尿苷抗体、异羟基洋地黄毒甙毒苷/抗异羟基洋地黄毒甙抗体和helicar/抗螺旋抗体。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的免疫测定法，其中药物是抗C5抗体并且靶是人C5。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的免疫测定法，其中糖是蔗糖，去垢剂是聚乙二醇十二烷基醚，药物是抗C5抗体，靶是人C5并且缓冲液具有约5.5的pH值。
15.在减少靶干扰作用的情况下，对血清或血浆样品中抗药物抗体的量定量的免疫测定法，所述抗药物抗体可以与药物抗体特异性结合，所述药物抗体可以与治疗靶特异性结合，包括以下步骤：
a)将血清或血浆样品在是约靶pI值的pH值下温育，并且任选地移除温育后形成的沉淀物，
b)将步骤a)中获得的血清或血浆样品在约2的pH值温育，并且任选地离心温育的样品以除去形成的沉淀物，
c)调节pH值至约7.4，向步骤b)中获得的血清或血浆样品，添加与结合对子的第一成员缀合的捕获抗体和与可检测标记物缀合的示踪抗体，并且温育混合物以形成捕获抗体-抗药物抗体-示踪抗体-复合物，
d)对步骤c)中形成的复合物定量并且因而对血清或血浆样品中抗药物抗体的量定量。
16.根据权利要求15所述的免疫测定法，其中对捕获抗体-抗药物抗体-示踪抗体-复合物定量的步骤(步骤d))包括步骤
d1)将步骤c)中获得的血清或血浆样品与缀合于固体表面的结合对子的第二成员温育，以捕获捕获抗体-抗药物抗体-示踪抗体-复合物，并且任选地洗涤表面，
d2)通过确定步骤d1)中形成的复合物中的可检测标记物，对抗药物抗体的量定量。
17.根据权利要求15至16中任一项所述的免疫测定法，其中在约靶的pI值温育是在靶的pI以下0.5个pH单位至靶的pI以上0.5个pH单位范围内的pH值。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的免疫测定法，其中步骤a)中的温育伴随搅拌。
19.根据权利要求15至18中任一项所述的免疫测定法，其中步骤a)中的温育持续1.5至2.5小时。
20.根据权利要求15至19中任一项所述的免疫测定法，其中步骤b)中的温育持续约5分钟。
21.根据权利要求15至20中任一项所述的免疫测定法，其中步骤d)中的温育持续约60分钟。
22.根据权利要求15至21中任一项所述的免疫测定法，其中示踪抗体和捕获抗体是药物抗体。
23.根据权利要求15至22中任一项所述的免疫测定法，其中免疫测定法包含捕获抗体、示踪抗体和检测抗体，其中捕获抗体是与结合对子的第一成员缀合的药物，示踪抗体是与可检测标记物缀合的药物抗体并且检测抗体是与缀合于酶的可检测标记物特异性结合的抗体。
24.根据权利要求15至23中任一项所述的免疫测定法，其中捕获抗体和/或示踪抗体彼此独立地选自完整/全长药物抗体、F(ab’)2、Fab和scFv。
25.根据权利要求15至24中任一项所述的免疫测定法，其中结合对子的第一成员选自半抗原、抗原和激素。
26.根据权利要求15至25中任一项所述的免疫测定法，其中结合对子选自生物素/(链霉)亲和素、茶碱/抗茶碱抗体、5-溴-脱氧-尿苷/抗5-溴-脱氧-尿苷抗体、异羟基洋地黄毒甙/抗异羟基洋地黄毒甙抗体和helicar/抗螺旋抗体。
27.根据权利要求15至26中任一项所述的免疫测定法，其中药物是抗C5抗体并且靶是人C5。在一个实施方案中，步骤(a)中的pH值处于pH 4.7至pH 5.5的范围内。
28.根据权利要求15至27中任一项所述的免疫测定法，其中对血清或血浆样品中抗药物抗体的量定量的免疫测定法包括以下步骤，所述抗药物抗体可以与药物抗体特异性结合，所述药物抗体是与人C5特异性结合的抗C5抗体，
a)将血清或血浆样品在范围4.7至5.5的pH值温育1.5至2.5小时，并且任选地移除温育后形成的沉淀物，
b)将步骤a)中获得的血清或血浆样品在约2的pH值温育约5分钟，并且任选地离心温育的样品以移除形成的沉淀物，
c)调节pH值至约7.4，向步骤b)中获得的血清或血浆样品，添加与生物素缀合的捕获药物抗体和与异羟基洋地黄毒甙缀合的示踪药物抗体，并且温育混合物以形成捕获抗体-抗药物抗体-示踪抗体-复合物，
d)将步骤c)中获得的血清或血浆样品与缀合于固体表面的(链霉)亲和素温育，以捕获捕获抗体-抗药物抗体-示踪抗体-复合物，并且任选地洗涤表面，
e)通过以下方式确定步骤d)中形成的复合物中的异羟基洋地黄毒甙，检测抗药物抗体：与缀合于辣根过氧化物酶的抗异羟基洋地黄毒甙抗体温育并且此后与HPPA或TMB温育，并且因而检测血清或血浆样品中的抗药物抗体(使形成的复合物与样品中ADA的量相关)。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的免疫测定法，其中样品来自需要用药物治疗的已经在获得样品之前施用过药物的患者。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的免疫测定法，其中复合物是非共价复合物。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的免疫测定法，其中免疫测定法包括以下步骤：
a)在固体表面上固定捕获抗体，任选地在固定步骤后洗涤表面以移除未结合和非特异性结合的捕获抗体，
b)将步骤a)的固定化的捕获抗体与含有血清或血浆的样品温育，所述样品任选地已经稀释成具有在免疫测定法检测范围内的抗药物抗体浓度，以形成捕获抗体-抗药物抗体-复合物，并且任选地在温育步骤后洗涤表面以移除未结合和非特异性结合的样品，
c)将步骤b)的捕获抗体-抗药物抗体-复合物与标记的示踪抗体温育，以形成捕获抗体-抗药物抗体-示踪抗体复合物，并且任选地在温育步骤后洗涤表面以移除未结合和非特异性结合的示踪抗体，
d)将步骤c)的捕获抗体-抗药物抗体-示踪抗体复合物与特异性结合于示踪抗体的标记物的抗体温育，所述示踪抗体与酶缀合，以形成捕获抗体-抗药物抗体-示踪抗体-检测抗体复合物，并且任选地在温育步骤后洗涤表面以移除未结合和非特异性结合的检测抗体，
e)将步骤d)的捕获抗体-抗药物抗体-示踪抗体-检测抗体复合物与酶的无色底物温育，所述无色底物在酶作用于其上之时转化成有色反应产物，并且在预定的时间段后测定光密度，
f)使步骤e)中测定的光密度与校准曲线相关联并且因而确定样品中抗药物抗体的量。
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