CN111295189A - 修饰的胱天蛋白酶-9多肽及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本文提供了修饰的胱天蛋白酶‑9多肽和含有修饰的胱天蛋白酶‑9多肽的嵌合胱天蛋白酶‑9蛋白。本公开进一步提供了编码这些蛋白质的多核苷酸、包含这些多核苷酸和蛋白质的工程化宿主细胞、包括共表达嵌合抗原受体的宿主细胞、以及制备和使用它们的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年11月1日提交的美国临时申请序列号62/580,276和2017年11月30日提交的美国临时申请序列号62/592,447的优先权，其每一个通过引用全部并入本文用于所有目的。
参考序列表
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技术领域
本公开涉及修饰的胱天蛋白酶-9多肽及其用途。与野生型人胱天蛋白酶-9蛋白相比，本文提供的修饰的胱天蛋白酶-9多肽含有至少1个氨基酸突变。
背景技术
胱天蛋白酶9是一种蛋白质，其参与哺乳动物细胞凋亡的启动(程序性细胞死亡)。包含胱天蛋白酶-9部分的嵌合蛋白可以用作系统的一部分，该系统允许在被工程化成表达该嵌合蛋白的宿主细胞中诱导凋亡。例如，可以制备包含与配体介导的二聚化结构域连接的胱天蛋白酶-9多肽的嵌合蛋白。含有介导二聚化结构域二聚的配体的含有该嵌合蛋白的宿主细胞暴露导致宿主细胞中胱天蛋白酶-9信号传导的活化，导致凋亡和细胞死亡。该系统例如可以用作细胞疗法的安全机制。在该系统中，首先对要给予受试者的宿主细胞进行工程化以表达含有胱天蛋白酶-9的嵌合蛋白。然后，在将工程化宿主细胞引入受试者后，如果需要的话，可以向受试者施用诱导二聚化的配体(例如在宿主细胞对受试者造成严重的不期望影响的情况下)。配体对受试者的施用导致包含嵌合蛋白的宿主细胞中胱天蛋白酶-9信号传导的活化以及此类宿主细胞的随后死亡，从而减少了宿主细胞在受试者中的不期望作用(参见，例如Gargett T和Brown，Front Pharmacol.2014；5：235)。
在某些情况下，含有胱天蛋白酶-9多肽和二聚化结构域的嵌合蛋白在表达该嵌合蛋白的宿主细胞中可具有不希望的高水平的基础胱天蛋白酶-9活性(即该嵌合蛋白可能在不存在介导嵌合蛋白二聚化的配体的情况下具有活性)。在不存在配体的情况下，基础胱天蛋白酶-9活性可导致例如不希望的细胞死亡水平。
降低嵌合胱天蛋白酶-9蛋白中的基础胱天蛋白酶-9活性的一种可能的方法是在嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的胱天蛋白酶-9部分中引入一种或多种修饰。例如，可将一种或多种突变引入嵌合胱天蛋白酶-9蛋白中的胱天蛋白酶-9多肽的氨基酸序列中。理想地，此类修饰将降低嵌合蛋白中的基础胱天蛋白酶-9活性，但不会降低或只会略微降低嵌合蛋白的胱天蛋白酶-9活性，以响应二聚化诱导的配体。降低胱天蛋白酶-9多肽的基础活性的一些突变的实例在例如美国专利号9,434,935中描述。
然而，仍然需要替代的和改良的修饰的胱天蛋白酶-9多肽。替代的和改良的修饰的胱天蛋白酶-9多肽可以提供例如替代的和改良的细胞疗法组合物和方法。
发明内容
本文提供了修饰的胱天蛋白酶-9多肽及其用途。与相应的未修饰的胱天蛋白酶-9多肽相比，修饰的胱天蛋白酶-9多肽可以具有一种或多种有用的特性。
例如，在本文提供的一些实施方案中，提供了修饰的胱天蛋白酶-9多肽，其中与相应的未修饰的胱天蛋白酶-9多肽相比，修饰的胱天蛋白酶-9多肽具有降低的基础活性，但是其中修饰的胱天蛋白酶-9多肽也可以仍然有效地介导胱天蛋白酶-9信号传导。
在本文提供的一些实施方案中，提供了修饰的胱天蛋白酶-9多肽，其中当将修饰的胱天蛋白酶-9多肽掺入含有胱天蛋白酶-9多肽和配体诱导性二聚化结构域的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白中。与包含野生型胱天蛋白酶-9多肽的相应嵌合胱天蛋白酶-9蛋白相比，包含本文提供的修饰的胱天蛋白酶-9多肽的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的基础活性可降低。
在一些实施方案中，本文提供了一种修饰的胱天蛋白酶-9多肽，其包含与SEQ ID NO：2具有至少90％的序列同一性和至少一个氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述氨基酸取代是在选自S271、S274、D330、F342、I370、D379、V387、A390、F406和K409的氨基酸位置处。任选地，所述氨基酸取代选自S271Y、S274E、D330L、D330M、F342H、I370E、D379E、V387A、A390N、F406W和K409N。任选地，所述多肽包含至少两个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代在选自Q221-V387、D330-I370、D330-D379、D330-S271、D330-S274、D330-F342、D330-D379、D330-V387、D330-A390和D330-K409的氨基酸位置。任选地，该多肽包含至少两个选自Q221R-V387A、D330L-I370E、D330L-D379E、D330M-S271Y、D330M-S274E、D330M-F342H、D330M-I370E、D330M-D379E、D330M-V387A、D330M-A390N和D330M-K409N的氨基酸取代。
在一些实施方案中，本文提供了修饰的胱天蛋白酶-9多肽，其包含与SEQ ID NO：2具有至少90％序列同一性和至少氨基酸取代D330M-D379E(即D330M和D379E)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文提供了修饰的胱天蛋白酶-9多肽，其包含与SEQ ID NO：2具有至少70％、80％、90％、95％、97％、98％或99％的序列同一性和至少一个选自S271Y、S274E、D330L、D330M、F342H、I370E、D379E、V387A、A390N、F406W和K409N的氨基酸取代的氨基酸序列。任选地，修饰的胱天蛋白酶-9多肽包含至少两个选自Q221R-V387A、D330L-I370E、D330L-D379E、D330M-S271Y、D330M-S274E、D330M-F342H、D330M-I370E、D330M-D379E、D330M-V387A、D330M-A390N和D330M-K409N的氨基酸取代。任选地，修饰的胱天蛋白酶-9多肽包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。
任选地，本文提供的修饰的胱天蛋白酶-9多肽的基础活性小于包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的野生型胱天蛋白酶-9多肽的50％。
在一些实施方案中，本文提供了包含编码本文提供的修饰的胱天蛋白酶-9多肽的核酸序列的多核苷酸。任选地，多核苷酸包含SEQ ID NO：11所示的核酸序列。
本文还提供了表达载体，其包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码本文提供的修饰的胱天蛋白酶-9多肽的核酸序列。
本文还提供了一种宿主细胞，其包含任何修饰的胱天蛋白酶-9多肽或编码本文提供的修饰的胱天蛋白酶-9多肽的多核苷酸。任选地，宿主细胞是免疫细胞。任选地，免疫细胞是T细胞。
在一些实施方案中，本文提供了包含二聚化结构域和修饰的胱天蛋白酶-9多肽的嵌合蛋白，其中所述修饰的胱天蛋白酶-9多肽包含与SEQ ID NO：2具有至少90％的序列同一性和至少一个氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述氨基酸取代是在选自S271、S274、D330、F342、I370、D379、V387、A390、F406和K409的氨基酸位置处。任选地，所述至少一个氨基酸取代选自S271Y、S274E、D330L、D330M、F342H、I370E、D379E、V387A、A390N、F406W和K409N。任选地，嵌合蛋白的修饰的胱天蛋白酶-9多肽包含至少两个氨基酸取代，其中该至少两个氨基酸取代在选自Q221-V387、D330-I370、D330-D379、D330-S271、D330-S274、D330-F342、D330-D379、D330-V387、D330-A390和D330-K409的氨基酸位置。任选地，嵌合蛋白的修饰的胱天蛋白酶-9多肽包含至少两个选自Q221R-V387A、D330L-I370E、D330L-D379E、D330M-S271Y、D330M-S274E、D330M-F342H、D330M-I370E、D330M-D379E、D330M-V387A、D330M-A390N和D330M-K409N的氨基酸取代。
在一些实施方案中，本文提供了包含二聚化结构域和修饰的胱天蛋白酶-9多肽的嵌合蛋白，其中所述修饰的胱天蛋白酶-9多肽包含与SEQ ID NO：2具有至少70％、80％、90％、95％、97％、98％或99％的序列同一性和至少一个选自S271Y、S274E、D330L、D330M、F342H、I370E、D379E、V387A、A390N、F406W和K409N的氨基酸取代的氨基酸序列。任选地，修饰的胱天蛋白酶-9多肽包含至少两个选自Q221R-V387A、D330L-I370E、D330L-D379E、D330M-S271Y、D330M-S274E、D330M-F342H、D330M-I370E、D330M-D379E、D330M-V387A、D330M-A390N和D330M-K409N的氨基酸取代。任选地，二聚化结构域包含选自FKBP多肽和亲环蛋白多肽的多肽。任选地，二聚化结构域包含FKBP12多肽。任选地，FKBP12多肽含有氨基酸取代F36V。任选地，嵌合蛋白包含如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。任选地，二聚化结构域结合二聚配体AP1903、AP20187、二聚体FK506或二聚体FK506样类似物。
在一些实施方案中，本文提供了包含二聚化结构域和修饰的胱天蛋白酶-9多肽的嵌合蛋白，其中所述修饰的胱天蛋白酶-9多肽包含与SEQ ID NO：2具有至少90％序列同一性和至少氨基酸取代D330M-D379E(即D330M和D379E)的氨基酸序列。
任选地，本文提供的嵌合胱天蛋白酶9蛋白的基础活性小于包含FKBP12配体结合区和缺乏胱天蛋白酶活化和募集结构域(“CARD”)的胱天蛋白酶-9多肽的嵌合蛋白的基础活性的50％，和具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文提供了包含编码本文提供的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的核酸序列的多核苷酸。任选地，多核苷酸包含SEQ ID NO：8所示的核酸序列。
本文还提供了表达载体，其包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码本文提供的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的核酸序列。
本文还提供了一种宿主细胞，其包含任何本文提供的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白或编码嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的多核苷酸。任选地，宿主细胞是免疫细胞。任选地，免疫细胞是T细胞。
在一些实施方案中，包含本文提供的修饰的胱天蛋白酶-9多肽、嵌合胱天蛋白酶-9蛋白或编码修饰的胱天蛋白酶-9多肽或嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的多核苷酸的免疫细胞可以进一步包含嵌合抗原受体(CAR)或编码CAR的多核苷酸。
在一些实施方案中，本文提供了在受试者中调节工程化免疫细胞的方法，该方法包括将二聚配体施用于受试者，该受试者先前已经被给予了包含本文提供的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白或编码嵌合胱天蛋白酶9蛋白的多核苷酸的免疫细胞，其中二聚配体结合至嵌合蛋白的二聚化结构域，并且其中胱天蛋白酶-9活性在配体与二聚化结构域结合时被诱导。任选地，配体是AP1903。
在一些实施方案中，本文提供了一种制备工程化免疫细胞的方法，该方法包括将编码本文提供的修饰胱天蛋白酶-9多肽或嵌合胱天蛋白酶9蛋白的多核苷酸或包含该多核苷酸的表达载体引入免疫细胞。
在一些实施方案中，本文提供的是工程化免疫细胞，其表达如本文所述的嵌合胱天蛋白酶9蛋白以用作药物。在一些实施方案中，从健康供体获得免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞获自患者。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括：提供免疫细胞；将至少一种编码本文提供的修饰的胱天蛋白酶9多肽的多核苷酸引入细胞中；和将所述多核苷酸表达到细胞中。
在一些实施方案中，本文提供的是治疗受试者的方法，所述方法包括：提供表达如本文所述的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的免疫细胞；和对所述患者施用所述免疫细胞。
在一些实施方案中，与本文提供的组合物和方法一起使用的免疫细胞可以源自T细胞或天然杀伤细胞。
在一些实施方案中，本文提供了包含宿主细胞的药物组合物，所述宿主细胞包含本文所述的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白。
在一些实施方案中，宿主细胞是免疫细胞并且免疫细胞可以包括在一个或多个内源基因中的中断，其中所述内源基因编码TCRα、TCRβ、CD52、糖皮质激素受体(GR)、脱氧胞苷激酶(dCK)或免疫检查点蛋白，例如程序性死亡-1(PD-1)。
附图说明
图1A-1C是描绘本文提供的一些构建体的一系列示意图；在这些构建体中，使用P2A(图1A)或IRES(图1B)核糖体跳跃位点与CAR共表达包含胱天蛋白酶-9突变形式和二聚化结构域的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白，以及还提供了用于评估细胞凋亡程度的对照的示意图(图1C)。
图2是柱状图，其显示了在来自供体#1的宿主细胞中不同的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白响应AP1903诱导细胞凋亡。
图3是柱状图，其显示了在来自供体#2的宿主细胞中不同的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白响应AP1903诱导细胞凋亡。
图4是柱状图，其显示了在转导原代T细胞(该对的左手条)或Jurkat细胞(该对的右手条)后四天，包含一个或多个突变的不同嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的表达水平。
图5是表示CAR阳性原代T细胞(该对的左手条)或Jurkat细胞(该对的右手条)的表达水平的柱状图。
图6是柱状图，其显示了不同的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的凋亡活性，该蛋白包括在存在或不存在AP1903、AP1903后1天后在供体#8的原代T细胞上表达的一种或多种突变。
图7是柱状图，其显示了不同的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的凋亡活性，该蛋白包括在存在或不存在AP1903、AP1903后2天后在供体#8的原代T细胞上表达的一种或多种突变。
图8是柱状图，其显示了不同的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的凋亡活性，该蛋白包括在存在或不存在AP1903、AP1903后3天后在供体#8的原代T细胞上表达的一种或多种突变。
图9是柱状图，其显示了不同的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的凋亡活性，该蛋白包括在存在或不存在AP1903、AP1903后4天后在供体#8的原代T细胞上表达的一种或多种突变与CAR结合。
具体实施方式
本文公开的内容涉及修饰的胱天蛋白酶-9多肽和包含修饰的胱天蛋白酶-9多肽的嵌合蛋白。本公开还提供了编码这些胱天蛋白酶-9多肽和嵌合蛋白的多核苷酸，以及相关的组合物和制造和使用方法，例如在工程化宿主细胞中用于向受试者施用。
通用技术
除非另有说明，否则本公开的实践将采用分子生物学的常规技术(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学、免疫学、病毒学、单克隆抗体产生和工程化，其在本领域技术范围内。此类技术在诸如以下的的文献中有充分的解释：Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第二版(Sambrook et al.,1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,ed.,1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis,ed.,1998)AcademicPress；Animal Cell Culture(R.I.Freshney,ed.,1987)；Introduction to Cell andTissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and TissueCulture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,和D.G.Newell,eds.,1993-1998)J.Wiley and Sons；Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；Handbook ofExperimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell,eds.)；Gene Transfer Vectorsfor Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos,eds.,1987)；Current Protocols inMolecular Biology(F.M.Ausubel et al.,eds.,1987)；PCR:The Polymerase ChainReaction,(Mullis et al.,eds.,1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan et al.,eds.,1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley andSons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:a practical approach(D.Catty.,ed.,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal antibodies:a practical approach(P.Shepherd和C.Dean,eds.,OxfordUniversity Press,2000)；Using antibodies:a laboratory manual(E.Harlow和D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra,eds.,Harwood Academic Publishers,1995)。
定义
术语“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，是指任何长度的氨基酸链。例如，该链可以相对较短(例如10-100个氨基酸)或更长。该链可以是直链或支链的，它可以包含修饰的氨基酸，和/或可以被非氨基酸中断。该术语还涵盖已经天然修饰或通过干预修饰的氨基酸链；例如，二硫键的形成，糖基化，脂质化，乙酰化，磷酸化或任何其他操作或修饰，例如与标记组分的缀合。该定义中还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)的多肽，以及本领域已知的其他修饰。应当理解，多肽可以单链或相关链的形式存在。
如本领域中已知的，本文可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸链，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物，或可以通过DNA或RNA
聚合酶掺入链中的任何底物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸及其类似物。如果存在，可以在链组装之前或之后赋予核苷酸结构修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸成分中断。多核苷酸可在聚合后进一步修饰，例如通过与标记组分缀合。其他类型的修饰包括例如“帽”，用类似物取代一个或多个天然存在核苷酸，核苷酸间修饰例如具有不带电荷的键(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)和具有电荷的键(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些，含有侧基部分例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)的那些，具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的那些，含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的那些，含有烷基化剂的那些，具有修饰的键的那些(例如α异头异构体核酸等)，以及未修饰形式的多核苷酸。此外，糖中通常存在的任何羟基可以被例如膦酸酯基、磷酸酯基取代，被标准保护基保护，或者被活化以制备与另外的核苷酸的另外的键，或者可以与固体支持物缀合。5'和3'末端OH可被磷酸化或被胺或1至20个碳原子的有机封端基部分取代。其他羟基也可以被衍生为标准保护基。多核苷酸还可以包含本领域通常已知的核糖或脱氧核糖的类似形式，包括例如2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟-或2'-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-或β-异头糖、差向异构糖(例如阿拉伯糖)、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物和无碱基核苷类似物(如甲基核糖苷)。一个或多个磷酸二酯键可以被替代的连接基团取代。这些替代的连接基团包括但不限于磷酸被P(O)S(“硫代酸酯”)、P(S)S(“二硫代酸酯”)、(O)NR2(“酰胺基”)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(“甲缩醛”)取代的实施方案，其中每个R或R'独立地为H或取代或未取代的烷基(1-20C)，其可选地包含醚(-O-)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烃基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有键都需要相同。先前的描述适用于本文所指的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
“宿主细胞”包括单个细胞或细胞培养物，其可以是或已经是用于掺入多核苷酸插入物的载体的接受者。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且由于自然、偶然或故意的突变，该后代不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态或基因组DNA补体上)。宿主细胞包括体内用本公开的多核苷酸转染的细胞。
如本文所用，“免疫细胞”是指功能上参与先天和/或适应性免疫应答的起始和/或执行的造血来源的细胞。
如本文所用，“自体”是指用于治疗患者的细胞、细胞系或细胞群源自所述患者或源自人白细胞抗原(HLA)相容的供体。
如本文所用，“异源”是指用于治疗患者的细胞或细胞群不是源自所述患者而是源自供体。
“个体”或“受试者”是哺乳动物，例如人。哺乳动物还包括但不限于灵长类、马、狗、猫、小鼠和大鼠。
如本文所用，“载体”是指能够在宿主细胞中递送并且通常表达一个或多个感兴趣基因或序列的构建体。载体的实例包括但不限于病毒载体，裸露的DNA或RNA表达载体，质粒，粘粒或噬菌体载体，与阳离子缩合剂相关的DNA或RNA表达载体，包裹在脂质体中的DNA或RNA表达载体，以及某些真核细胞，例如生产细胞。
如本文所用，“表达控制序列”是指指导核酸转录的核酸序列。表达控制序列可以是启动子，例如组成型或诱导型启动子，或增强子。表达控制序列与待转录的核酸序列可操作地连接。
在本文中对“约”值或参数的提及包括(并描述)针对该值或参数本身的实施方案。例如，提及“大约X”的描述包括对“X”的描述。数字范围包括定义范围的数字。一般而言，术语“约”涉及变量的指示值以及在指示值的实验误差范围内(例如，均值的95％置信区间内)或在指示值的10％以内的变量的所有值，以较大者为准。在某个时间段(年、月、周、天等)的上下文中使用术语“约”时，术语“约”是指该时间段加上或减去下一个从属时间段的一个量(例如，大约1年意味着11-13个月；大约6个月意味着6个月加上或减去1周；大约1周意味着6-8天；等等)，或在所示值的10％以内，以较大值为准。
应该理解，无论在何处用语言“包括”来描述实施方案时，也提供了根据“由...组成”和/或“基本上由...组成”描述的类似实施方案。
在根据马库什(Markush)组或其他替代组来描述本公开的方面或实施方案的情况下，本公开不仅涵盖整体列出的整个组，而分别地该组的每个成员以及主要组的所有可能的子组，而且包括没有一个或多个组成员的主要组。本公开还设想在要求保护的发明中明确排除任何一个或多个组成员。
除非另有定义，否则本发明使用的所有技术和科学术语，都具有与本发明所涉及领域中普通技术人员所共同理解的含义相同的含义。在发生冲突的情况下，以本说明书包括定义为准。在本说明书通篇中，词语“包含”或变化型式(诸如“包含(comprises/comprising)”)将被理解为暗示包括所陈述的整数或整数组，但不包括任何其他整数或整数组。除非上下文另有要求，否则单数形式应包括复数，复数形式应包括单数。
尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料也可以用于本公开的实践或测试中，但是本文描述了示例性的方法和材料。材料、方法和实例仅是说明性的，而无意于限制。
修饰的胱天蛋白酶-9多肽
本文提供的公开内容涉及修饰的胱天蛋白酶-9多肽。如本文所用，“胱天蛋白酶-9多肽”是指包含野生型人胱天蛋白酶-9的氨基酸序列(即SEQ ID NO：1)的多肽，包含所述野生型人胱天蛋白酶-9的氨基酸序列的一部分的多肽，其中该部分可以诱导胱天蛋白酶-9介导的信号传导(例如没有胱天蛋白酶激活和募集(“CARD”)结构域的人胱天蛋白酶-9，其具有如SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列)，或与SEQ ID NO：1或2所示的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽。如本文所用，“修饰的胱天蛋白酶-9多肽”是指如上所述的胱天蛋白酶-9多肽，其中与相应的野生型人胱天蛋白酶-9多肽相比，该多肽具有至少1个氨基酸突变。
野生型人的氨基酸序列的胱天蛋白酶9蛋白(UniProt的ID#P55211)是：MDEADRRLLRRCRLRLVEELQVDQLWDALLSRELFRPHMIEDIQRAGSGSRRDQARQLIIDLETRGSQALPLFISCLEDTGQDMLASFLRTNRQAAKLSKPTLENLTPVVLRPEIRKPEVLRPETPRPVDIGSGGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS(SEQ ID NO:1)。因此，在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列相比，本文提供的修饰的胱天蛋白酶-9多肽包含至少1个氨基酸修饰。
无CARD结构域的人胱天蛋白酶9蛋白的氨基酸序列是：GFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS(SEQ ID NO:2)。因此，在一些实施方案中，与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列相比，本文提供的修饰的胱天蛋白酶-9多肽包含至少1个氨基酸修饰。
SEQ ID NO：2的多肽与SEQ ID NO：1的多肽相同，不同之处在于SEQ ID NO：2的多肽不含SEQ ID NO：1的氨基酸1-134(即野生型胱天蛋白酶9的CARD结构域)。因此，SEQ ID NO：2的第一个氨基酸与SEQ ID NO：1的氨基酸#135相同。
在一些实施方案中，本文提供了修饰的胱天蛋白酶9多肽，其含有至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是在选自S271、S274、D330、F342、I370、D379、V387、A390、F406和K409的氨基酸位置处。所列位置的氨基酸取代可以是保守的或非保守的。所述修饰的胱天蛋白酶9多肽可与SEQ ID NO：1或2所示的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
在一些实施方案中，本文提供了修饰的胱天蛋白酶9多肽，其含有至少1个下述氨基酸取代：S271Y，S274E，D330L，D330M，F342H，I370E，D379E，V387A，A390N，F406W，或K409N。在一些实施方案中，本文提供了修饰的胱天蛋白酶9多肽，其含有至少1个下述氨基酸取代：S271Y，S274E，D330L，D330M，F342H，I370E，D379E，V387A，A390N，F406W，或K409N，其中所述修饰的胱天蛋白酶9多肽与SEQ ID NO：1或2所示的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
在一些实施方案中，本文提供了修饰的胱天蛋白酶9多肽，其含有至少两个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代在选自Q221-V387、D330-I370、D330-D379、D330-S271、D330-S274、D330-F342、D330-I370、D330-D379、D330-V387、D330-A390和D330-K409的氨基酸位置。所列位置的氨基酸取代可以是保守的或非保守的。所述修饰的胱天蛋白酶9多肽可与SEQ IDNO：1或2所示的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
在一些实施方案中，本文提供的修饰的胱天蛋白酶-9多肽包含至少2个氨基酸取代。在一些实施方案中，本文提供了改性胱天蛋白酶9多肽，其含有至少两个氨基酸取代，其中所述两个氨基酸取代选自：Q221R-V387A、D330L-I370E、D330L-D379E、D330M-S271Y、D330M-S274E、D330M-F342H、D330M-I370E、D330M-D379E、D330M-V387A、D330M-A390N或D330M-K409N。
在一些实施方案中，本文提供了包含至少两个氨基酸取代的修饰的胱天蛋白酶-9多肽，其中两个氨基酸取代选自：Q221R-V387A，D330L-I370E，D330L-D379E，D330M-S271Y，D330M-S274E，D330M-F342H，D330M-I370E，D330M-D379E，D330M-V387A，D330M-A390N，或D330M-K409N，其中所述修饰的胱天蛋白酶9多肽与SEQ ID NO：1或2所示的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
在一些实施方案中，含有至少两个氨基酸取代的修饰的胱天蛋白酶9多肽包含氨基酸序列：
GFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLMAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEELQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS(SEQ ID NO:3)。SEQID NO：3是具有D330M和D379E取代的SEQ ID NO：2的序列；这些取代在上面的SEQ ID NO：3中有下划线。
在一些实施方案中，本文提供了修饰的胱天蛋白酶-9多肽，其含有本文实施例1中所述的任何氨基酸取代。在一些实施方案中，本文提供了在本文实施例1中所述的取代位置的任何1、2、3、4或5处具有氨基酸取代的修饰的胱天蛋白酶-9多肽。在一些实施方案中，本文提供了修饰的胱天蛋白酶-9多肽，其包含实施例1中所述的任何氨基酸取代或实施例1中所述的任何1、2、3、4或5个取代位置处的氨基酸取代，其中所述修饰的胱天蛋白酶9多肽与SEQID NO：1或2所示的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
为了清楚起见，本文所指的氨基酸取代如下所备注。在描述为例如“D379E”的取代中，“D”是指野生型胱天蛋白酶-9蛋白中氨基酸位置379的氨基酸(即，在N端至C端方向，野生型胱天蛋白酶-9氨基酸序列中的第379个氨基酸)，并且“E”是指取代“D”的氨基酸。同样，本文所指的所有胱天蛋白酶-9氨基酸取代都是参照全长野生型胱天蛋白酶9多肽中相应氨基酸的位置(即SEQ ID NO：1中的氨基酸位置)来描述的。因此，例如，取代“D379E”是指在SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2中相同的氨基酸取代(即使SEQ ID NO：2的序列比SEQ ID NO：1的序列短)。
如本文所用，“胱天蛋白酶-9活性”是指细胞中由胱天蛋白酶-9介导的一种或多种作用(例如，胱天蛋白酶-9依赖性细胞信号转导事件、诱导凋亡、细胞死亡等)。可以直接测定胱天蛋白酶-9活性(例如，通过直接测定胱天蛋白酶-9介导的胱天蛋白酶-9靶标如胱天蛋白酶前体-3或胱天蛋白酶前体-7的裂解)，或者可以通过细胞中进一步下游胱天蛋白酶-9介导的事件(例如凋亡或细胞死亡)测定胱天蛋白酶-9活性。例如，在一些实施方案中，可以如本文实施例1中所述测定胱天蛋白酶-9活性。也可以例如通过本领域已知的用于测定胱天蛋白酶活性的方法来测定胱天蛋白酶-9活性，例如胱天蛋白酶-
测定法(Promega)，膜联蛋白V测定法或分泌性碱性磷酸酶(SEAP)测定法(参见例如MacCorkle,R.A.,K.W.Freeman,and D.M.Spencer,Synthetic activation of caspases:artificial deathswitches.Proc Natl Acad Sci USA,1998.95(7):p.3655-60)。还参见例如美国专利号US9434935的实施例8。
在一些实施方案中，与相应的野生型胱天蛋白酶-9多肽相比，本文提供的修饰的胱天蛋白酶-9多肽可具有更少的基础胱天蛋白酶9活性。如本文所用，“基础胱天蛋白酶-9活性”、“基础活性”等是指在不存在特定胱天蛋白酶-9诱导因子的情况下胱天蛋白酶-9多肽的活性(例如对于本文提供的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白，基础活性是指在不存在相应的二聚配体的情况下嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的胱天蛋白酶-9活性)。在一些实施方案中，修饰的胱天蛋白酶-9多肽的基础胱天蛋白酶-9活性可以比相应的野生型胱天蛋白酶9多肽低50％、40％、30％、20％、10％、5％、3％、2％或1％。可以通过本领域已知的用于测定胱天蛋白酶活性的方法，例如上述和本文实施例1中的方法，测定胱天蛋白酶-9多肽的基础活性。
在一些实施方案中，本文提供了具有1个或2个上述氨基酸取代的修饰的胱天蛋白酶-9多肽，并且还包含不显著影响各自的胱天蛋白酶-9多肽特性的一个或多个其他氨基酸取代、添加或缺失。在实施方案中，该改变可以是一个或多个保守氨基酸取代，如表1所示。氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基端融合，长度范围从一个残基至包含上百或更多残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列间插入。在一些实施方案中，本文提供了具有1个或2个上述氨基酸取代，并且进一步包含一个或多个另外的氨基酸取代、添加或缺失的修饰的胱天蛋白酶-9多肽，其中一个或多个另外的氨基酸取代、添加或缺失改善了相应的胱天蛋白酶-9多肽的一种或多种特性。
表1：氨基酸取代
嵌合胱天蛋白酶-9蛋白
在一些实施方案中，本文提供了工程化嵌合蛋白，其包含至少两种组分：1)修饰的胱天蛋白酶-9多肽和2)二聚化结构域。包含这两种组分的嵌合蛋白在本文中也可以称为“嵌合胱天蛋白酶-9蛋白”。
在一些实施方案中，在嵌合胱天蛋白酶-9蛋白中，二聚化结构域在修饰的胱天蛋白酶-9多肽的N末端。任选地，在二聚化结构域和修饰的胱天蛋白酶-9多肽之间的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白中可以存在接头区域。任选地，嵌合的胱天蛋白酶-9蛋白在N端至C端方向上可至少包含以下组分：二聚化结构域-接头区-修饰的胱天蛋白酶-9多肽。
嵌合胱天蛋白酶9蛋白：胱天蛋白酶-9多肽部分
嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的胱天蛋白酶-9多肽部分可以具有以上针对修饰的胱天蛋白酶-9多肽提供的任何特征。
例如，在一些实施方案中，嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的胱天蛋白酶-9多肽可以含有至少1个下述氨基酸取代：S271Y，S274E，D330L，D330M，F342H，I370E，D379E，V387A，A390N，F406W，或K409N，其中所述修饰的胱天蛋白酶9多肽与SEQ ID NO：1或2所示的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在另一个实例中，在一些实施方案中，嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的胱天蛋白酶-9多肽可包含至少两个氨基酸取代，其中两个氨基酸取代选自：Q221R-V387A，D330L-I370E，D330L-D379E，D330M-S271Y，D330M-S274E，D330M-F342H，D330M-I370E，D330M-D379E，D330M-V387A，D330M-A390N，或D330M-K409N，其中所述修饰的胱天蛋白酶9多肽与SEQ ID NO：1或2所示的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在另一实例中，在一些实施方案中，嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的胱天蛋白酶-9多肽可以含有至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代在选自S271、S274、D330、F342、I370、D379、V387、A390、F406和K409的氨基酸位置，其中所述修饰的胱天蛋白酶9多肽与SEQ ID NO：1或2所示的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在另一实例中，在一些实施方案中，嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的胱天蛋白酶-9多肽可以含有至少两个氨基酸，其在选自Q221-V387、D330-I370、D330-D379、D330-S271、D330-S274、D330-F342、D330-I370、D330-D379、D330-V387、D330-A390和D330-K409的氨基酸位置，其中所述修饰的胱天蛋白酶9多肽与SEQ ID NO：1或2所示的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
嵌合胱天蛋白酶9蛋白：二聚化结构域
嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的“二聚化结构域”可以是可以被诱导二聚化的任何氨基酸序列，例如通过可以结合二聚化结构域的二聚配体。例如，二聚化结构域可以包含FK506结合蛋白(“FKBP”)的氨基酸序列。蛋白FKBP蛋白与药物FK506特异性结合。作为FK506的多聚体类似物的配体(即，至少包含两个FK506拷贝的配体或其衍生物)可以通过配体结合至第一蛋白和第二蛋白并从而将它们桥接在一起而诱导各自包含FKBP氨基酸序列的第一蛋白和第二蛋白的二聚化。因此，本文提供的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白可通过使嵌合胱天蛋白酶-9蛋白暴露于与嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的二聚化结构域结合的合适的二聚配体而被诱导二聚化。
在一些实施方案中，本文提供的嵌合胱天蛋白酶-9的蛋白的二聚化结构域可以包含以下蛋白的氨基酸序列或衍生自以下蛋白：例如FKBPs、亲环蛋白、类固醇结合蛋白、雌激素结合蛋白、糖皮质激素结合蛋白、维生素D结合蛋白或四环素结合蛋白。如本文所用，“FKBP多肽”、“亲环蛋白多肽”或类似物是指具有相应蛋白质的氨基酸序列的多肽，或其一部分或其变体，其中该部分或其变体保持以高亲和力结合相应配体(例如，对于FKBP多肽，配体FK506和相关分子)的能力。
在一些实施方案中，二聚化结构域可包含FKBP多肽氨基酸序列。FKBP是一组具有脯氨酰异构酶活性并与药物FK506和其他相关药物结合的蛋白质。
任选地，FKBP可以是人FKBP12(也称为FKBP1A；GenBank：CAG46965.1)。任选地，FKBP12多肽可以包含F36V突变。含有F36V突变的FKBP12与二聚配体AP1903高亲和力结合(Jemal，A.等人，CA Cancer J.Clinic.58,71-96(2008)；Scher,H.I.和Kelly,W.K.,Journal ofClinicalOncology 11,1566-72(1993))。另外，与野生型FKBP12结合AP1903相比，含有F36V突变的FKBP12以高得多的亲和力结合AP1903。
一种示例性的二聚化结构域的氨基酸序列(含有有F36V突变的FKBP12多肽)是：
GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLES(SEQ ID NO:4)。
在一些实施方案中，二聚化结构域可以是亲环蛋白多肽氨基酸序列。亲环蛋白是与环孢菌素(环孢菌素A)结合的蛋白质。亲环蛋白包括例如亲环蛋白A和亲环蛋白D。
在一些实施方案中，二聚化结构域的长度可以是至少约25、50、75或100个，并且不超过约150、200、250、300、350或400个氨基酸。在一些实施方案中，二聚化结构域可具有美国专利9434935中公开的配体结合区的任何特征，该专利通过引用结合于此以用于所有目的。
嵌合胱天蛋白酶9蛋白：接头区域
在一些实施方案中，用于嵌合胱天蛋白酶9蛋白的接头区的长度为约5至100个氨基酸之间。任选地，接头区域的长度可以在约5至20个氨基酸之间。接头区通常是柔性的且富含甘氨酸。在一些实施方案中，接头区可具有以下的氨基酸序列：GGGSGVD(SEQ ID NO:5)，(GGGGS)x(SEQ ID NO:12)，其中x是1至5之间的整数，和(GGGS)x(SEQ ID NO:13)，其中x是1到5之间的整数，GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:14)，GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:15)，其中x是任何氨基酸的xxxGKPGSGExxxGKPGSGExxx(SEQ ID NO：16)，KPGSGE(SEQ ID NO:17)，GKPGSGE(SEQ ID NO:18)，GKPGSGG(SEQ ID NO:19)，GGGSGKPGSGEGGGS(SEQ ID NO:20)，GGGSGKPGSGEGGGGS(SEQ ID NO:21)，GGGGSGKPGSGGGGS(SEQ ID NO:22)，GGGGSGKPGSGEGGS(SEQ ID NO:23)，GGGGSGKPGSGEGGGS(SEQ ID NO:24)，GGGGSGKPGSGEGGGGS(SEQ ID NO:25)，GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:26)，GKPGSGEG(SEQ ID NO:27)，SGKPGSGE(SEQ ID NO:28)，KPGSG(SEQ ID NO:29)，STSGSGKPGSGEGST(SEQ ID NO:30)，GGGGSGGGGSGGGGSG(SEQ ID NO:31)，GGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:32)，和GGGGSGGGGSGGGGGS(SEQ ID NO:33)。
嵌合胱天蛋白酶9蛋白：实例
在一些实施方案中，嵌合胱天蛋白酶-9蛋白可以具有以下氨基酸序列：GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLESGGGSGVDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLMAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEELQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS(SEQ ID NO:6)。在该序列中，在N末端至C末端的方向上存在以下组分：1)二聚化结构域，其包含具有F36V突变的FKBP12多肽；2)接头区域(该接头区域的第一个氨基酸用下划线标出)；和3)修饰的胱天蛋白酶-9多肽，其含有不具有CARD结构域的胱天蛋白酶9多肽，并且含有D330M和D379E取代(修饰的胱天蛋白酶-9多肽的第一个氨基酸用下划线标出)。
在一些实施方案中，嵌合胱天蛋白酶-9蛋白可以是实施例1中本文所述的任何嵌合胱天蛋白酶-9蛋白。
在一些实施方案中，本文提供的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白(即，其包含修饰的胱天蛋白酶-9多肽)可以具有比相应的包含野生型胱天蛋白酶-9多肽的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白更少的基础活性。在一些实施方案中，嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的基础活性可小于包含野生型胱天蛋白酶-9多肽的相应嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的基础活性的50％、40％、30％、20％、10％、5％、3％、2％或1％。在一些实施方案中，本文提供的包含FKBP12二聚化结构域和缺乏CARD结构域的修饰的胱天蛋白酶-9多肽的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白可具有小于含有FKBP12二聚化结构域和缺乏CARD结构域的野生型胱天蛋白酶-9多肽的相应嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的基础活性的50％、40％、30％、20％、10％、5％、3％、2％或1％。
在一些实施方案中，本文提供的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白(即，其包含修饰的胱天蛋白酶-9多肽)可以具有比相应的包含野生型胱天蛋白酶-9多肽的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白更少的基础活性，如通过SEAP测定法、胱天蛋白酶-
测定法、膜联蛋白V测定法或本文实施例1中提供的测定法测量的。在一些实施方案中，本文提供的包含FKBP12二聚化结构域和缺乏CARD结构域的修饰的胱天蛋白酶-9多肽的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白可具有小于含有FKBP12二聚化结构域和缺乏CARD结构域的野生型胱天蛋白酶-9多肽的相应嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的基础活性的50％、40％、30％、20％、10％、5％、3％、2％或1％，如通过SEAP测定法、胱天蛋白酶-
测定法、膜联蛋白V测定法或本文实施例1中提供的测定法测量的。在一些实施方案中，本文提供的包含FKBP12二聚化结构域和缺乏CARD结构域的修饰的胱天蛋白酶-9多肽的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白可具有小于含有FKBP12二聚化结构域和缺乏CARD结构域的野生型胱天蛋白酶-9多肽的相应嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的基础活性的50％、40％、30％、20％、10％、5％、3％、2％或1％，如通过SEAP测定法、胱天蛋白酶-
测定法、膜联蛋白V测定法或本文实施例1中提供的测定法测量的，进一步其中响应于含FKBP12二聚化结构域和缺乏CARD结构域的野生型胱天蛋白酶-9多肽的相应嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的二聚配体，嵌合胱天蛋白酶-9蛋白具有至少100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或5％的胱天蛋白酶活性，其中所述胱天蛋白酶活性通过SEAP测定法、胱天蛋白酶-
测定法、膜联蛋白V测定法或本文实施例1中提供的测定法测量。
在一些实施方案中，与不存在二聚配体的情况相比，在存在相应的二聚配体的情况下，本文提供的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白可以具有更多的胱天蛋白酶-9活性。在一些实施方案中，与不存在二聚配体时相比，在存在例如10nM或10mM的相应二聚配体时，本文提供的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白可具有至少2x(即“2倍”或“2-倍”)、3x、5x、10x、20x、50x或100x更大的胱天蛋白酶-9活性。例如，在本文提供的一些实施方案中，嵌合胱天蛋白酶-9蛋白包含FKBP12二聚化结构域，其中FKBP12蛋白还包含F36V取代。继续该实例，在一些实施方案中，在存在10mM AP1903的情况下，嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的胱天蛋白酶-9活性比在0mM AP1903中高至少2x、3x、5x、10x、20x、50x或100x。
二聚配体
在一些实施方案中，可通过合适的二聚配体诱导本文提供的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白二聚。二聚配体可以结合两个拷贝的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白(通过蛋白质的两个拷贝中的二聚化结构域)，从而诱导嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的二聚化。通常，用于本文提供的实施方案的二聚配体是小于3kDa的小分子，其可以容易地施用于受试者。
在一些实施方案中，二聚化结构域是FKBP12多肽，并且相应的二聚配体是AP1903、AP21087、AP1510、二聚雷帕霉素、二聚FK1012、二聚FK506或二聚FK506样类似物。
二聚配体AP1903、AP21087、AP1510、二聚FK1012、二聚FK506和本文公开的其他配体是本领域技术人员已知的。例如，AP1903(也称为rimiducid)是一种合成分子，具有以下标识信息：CAS索引名称：2-哌啶甲酸，1-[(2S)-1-氧代-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)丁基]-，1,2乙二基双[亚氨基(2-氧代-2,1-乙二基)氧基-3,1-亚苯基[(1R)-3-(3，-4-二甲氧基苯基)亚丙基]]酯，[2S[1(R*),2R*[S*[S*[1(R*),2R*]]]]]-(9Cl)；CAS注册号：195514-63-7；分子式：C78H98N4O20；分子量：1411.65。
与野生型FKBP12相比，AP1903对具有F36V突变的FKBP12多肽具有大得多的亲和力。因此，涉及在受试者中使用含有具有F36V突变的FKBP12和AP1903的重组蛋白的系统允许AP1903在受试者中选择性地靶向重组蛋白。这是有利的，因为由于AP1903对野生型FKBP12的亲和力低，所以将由二聚配体与野生型FKBP12结合而产生的任何可能的副作用减至最小(即，仅靶向具有F36V突变的FKBP12)。AP1903与含有F36V突变的FKBP12多肽一起使用在例如以下描述：Jemal,A.et al.,CA Cancer J.Clinic.58,71-96(2008)；Scher,H.I.和Kelly,W.K.,Journal of Clinical Oncology 11,1566-72(1993)。已经测试了AP1903对人的给药(参见例如Iuliucci JD,et al.,J Clin Pharmacol.41：870-9，2001)。
在一些实施方案中，二聚化结构域包含亲环蛋白多肽，并且相应的二聚配体是二聚环孢菌素A。在一些实施方案中，二聚化结构域是雌激素结合多肽，并且相应的二聚配体是二聚雌激素。在一些实施方案中，二聚化结构域是糖皮质激素结合多肽，并且相应的二聚配体是二聚糖皮质激素。在一些实施方案中，二聚化结构域是四环素结合多肽，并且相应的二聚配体是二聚四环素。在一些实施方案中，二聚化结构域是维生素D结合多肽，并且相应的二聚配体是二聚维生素D。
如本文所用，“二聚”配体可以任选地包含多于2个拷贝的合适的结合分子(即，配体可以是多聚体的)；然而，基于这样的配体使相应的结合分子二聚的能力，仍可以认为这类配体是本文所用的“二聚的”。类似地，在一些实施方案中，本文提供的“二聚化结构域”可能够支持多聚(例如，在同一分子中提供多拷贝的二聚化结构域的情况下)；然而，基于此类结构域二聚化的能力，此类结构域也仍可被视为本文所用的“二聚化结构域”。通常，在胱天蛋白酶-9分子二聚化后可有效诱导胱天蛋白酶-9信号传导(即不需要三聚或其他多聚化)。另外，本文中提及的“配体”是指二聚配体(例如，当提及诱导本文提供的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的二聚化的“配体”时)，除非上下文另外明确指出。
本文提供的嵌合的胱天蛋白酶-9蛋白的配体介导的二聚化导致在包含嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的宿主细胞中诱导胱天蛋白酶-9介导的信号转导事件。这通常会导致细胞凋亡和细胞死亡。
在一些实施方案中，本文提供的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白可以包含一个或多个二聚化特征，并且可以经由系统中提供的用于化学诱导二聚化(CID)的系统或方法被诱导二聚化。CID系统基于表面受体聚集有效激活下游信号传导级联的概念。CID系统使用合成的二价配体来快速交联与配体结合结构域融合的信号传导分子。该系统已被用于触发细胞表面的寡聚化和活化(Spencer,D.M.,et al.,Science,1993.262:p.1019-1024；Spencer D.M.etal.,Curr Biol 1996,6:839-847；Blau,C.A.et al.,Proc Natl Acad.Sci.USA 1997,94:3076-3081)，或胞浆蛋白(Luo,Z.et al.,Nature 1996,383:181-185；MacCorkle,R.A.etal.,Proc Natl Acad Sci USA 1998,95:3655-3660)，将转录因子募集到DNA元件以调节转录(Ho,S.N.et al.,Nature 1996,382:822-826；Rivera,V.M.et al.,Nat.Med.1996,2:1028-1032)或将信号分子募集到质膜上以刺激信号传导(Spencer D.M.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1995,92:9805-9809；Holsinger,L.J.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1995,95:9810-9814)。因此，CID系统产生条件控制的蛋白质或多肽。除了该技术是可诱导的之外，由于不稳定的二聚剂的降解或单体竞争性抑制剂的施用，它也是可逆的。
多核苷酸
在一些实施方案中，本文还提供了包含编码本文所述的修饰的胱天蛋白酶-9多肽或嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的核酸序列的多核苷酸。
例如，在一些实施方案中，本文提供的修饰的胱天蛋白酶-9多肽由下列核酸序列编码：
GGATTTGGCGATGTGGGCGCCCTGGAGTCTCTGAGAGGCAATGCCGATCTGGCCTACATCCTGAGCATGGAGCCTTGCGGCCACTGTCTGATCATCAACAATGTGAACTTCTGCAGGGAGTCCGGCCTGAGAACCAGGACAGGCTCTAATATCGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGCCTGCACTTTATGGTGGAGGTGAAGGGCGATCTGACCGCCAAGAAGATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCCCAGCAGGACCACGGCGCCCTGGATTGCTGCGTGGTGGTCATCCTGTCTCACGGATGCCAGGCCAGCCACCTGCAGTTCCCAGGAGCCGTGTATGGAACCGACGGATGTCCCGTGAGCGTGGAGAAGATCGTGAACATCTTTAATGGCACAAGCTGCCCATCCCTGGGAGGCAAGCCAAAGCTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGCGAGCAGAAGGATCACGGCTTTGAGGTGGCCAGCACCTCCCCAGAGGACGAGTCTCCTGGCAGCAACCCAGAGCCCGATGCCACCCCTTTCCAGGAGGGCCTGCGCACATTTGACCAGCTGATGGCCATCTCCTCTCTGCCTACCCCATCCGACATCTTCGTGTCTTACAGCACATTCCCTGGCTTCGTGAGCTGGCGGGACCCCAAGTCCGGCTCTTGGTACGTGGAGACACTGGACGATATCTTTGAGCAGTGGGCACACAGCGAGGAGCTGCAGTCCCTGCTGCTGAGAGTGGCCAACGCCGTGTCCGTGAAGGGCATCTACAAGCAGATGCCAGGCTGCTTCAATTTTCTGAGGAAAAAACTGTTCTTCAAAACTAGC(SEQ ID NO:7)。SEQ ID NO：7的核酸序列编码不具有CARD结构域并且具有取代D330M和D379E的修饰的胱天蛋白酶-9多肽；编码这些取代的密码子用下划线标出。
在另一实例中，在一些实施方案中，本文提供的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白由下列核酸序列编码：
GGAGTGCAGGTCGAAACAATCTCACCCGGCGATGGACGGACATTCCCCAAAAGAGGACAGACTTGCGTCGTGCATTATACCGGCATGCTGGAGGACGGCAAGAAGGTGGACAGCTCCCGCGATCGGAACAAGCCCTTCAAGTTTATGCTGGGCAAGCAGGAAGTGATCAGGGGATGGGAGGAGGGAGTGGCACAGATGAGCGTGGGACAGAGGGCAAAGCTGACCATCTCCCCAGACTACGCATATGGAGCAACAGGACACCCTGGAATCATCCCACCTCACGCCACACTGGTGTTCGATGTGGAGCTGCTGAAGCTGGAGTCCGGAGGAGGATCTGGAGTGGACGGATTTGGCGATGTGGGCGCCCTGGAGTCTCTGAGAGGCAATGCCGATCTGGCCTACATCCTGAGCATGGAGCCTTGCGGCCACTGTCTGATCATCAACAATGTGAACTTCTGCAGGGAGTCCGGCCTGAGAACCAGGACAGGCTCTAATATCGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGCCTGCACTTTATGGTGGAGGTGAAGGGCGATCTGACCGCCAAGAAGATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCCCAGCAGGACCACGGCGCCCTGGATTGCTGCGTGGTGGTCATCCTGTCTCACGGATGCCAGGCCAGCCACCTGCAGTTCCCAGGAGCCGTGTATGGAACCGACGGATGTCCCGTGAGCGTGGAGAAGATCGTGAACATCTTTAATGGCACAAGCTGCCCATCCCTGGGAGGCAAGCCAAAGCTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGCGAGCAGAAGGATCACGGCTTTGAGGTGGCCAGCACCTCCCCAGAGGACGAGTCTCCTGGCAGCAACCCAGAGCCCGATGCCACCCCTTTCCAGGAGGGCCTGCGCACATTTGACCAGCTGATGGCCATCTCCTCTCTGCCTACCCCATCCGACATCTTCGTGTCTTACAGCACATTCCCTGGCTTCGTGAGCTGGCGGGACCCCAAGTCCGGCTCTTGGTACGTGGAGACACTGGACGATATCTTTGAGCAGTGGGCACACAGCGAGGAGCTGCAGTCCCTGCTGCTGAGAGTGGCCAACGCCGTGTCCGTGAAGGGCATCTACAAGCAGATGCCAGGCTGCTTCAATTTTCTGAGGAAAAAACTGTTCTTCAAAACTAGC(SEQ ID NO:8)。
SEQ ID NO：8的核酸序列编码嵌合胱天蛋白酶-9蛋白，其在N末端至C末端的方向上包含以下组分：1)二聚化结构域，其包含具有F36V突变的FKBP12多肽；2)接头区域；和3)修饰的胱天蛋白酶-9多肽，其包含不具有CARD结构域的胱天蛋白酶9多肽，并且包含D330M和D379E取代。另外，SEQ ID NO：8的核酸序列编码具有如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白。
在另一方面，本公开提供了包含宿主细胞的组合物(例如药物组合物)，所述宿主细胞包含本文提供的修饰的胱天蛋白酶-9多肽或嵌合胱天蛋白酶9蛋白。在一些实施方案中，组合物包含细胞，该细胞包含编码本文所述的修饰的胱天蛋白酶-9多肽或嵌合的胱天蛋白酶9蛋白的任一种的多核苷酸。
在本文中进一步描述表达载体和多核苷酸组合物的施用。
在另一方面，本公开提供了制备本文所述的任何多核苷酸的方法。可以通过本领域已知的方法制备和表达多核苷酸。
与任何此类序列互补的多核苷酸也被本公开内容涵盖。多核苷酸可以是单链(编码或反义)或双链，并且可以是DNA或RNA分子。另外的编码或非编码序列可以但不必须存在于本公开的多核苷酸内，并且多核苷酸可以但不必与其他分子和/或支持材料连接。
如果两个序列中的核苷酸或氨基酸的序列按如下所述进行最大对应比对时相同，则称两个核苷酸或多肽序列是“同一的”。通常通过在比较窗口上比较序列以鉴定和比较序列相似性的局部区域来进行两个序列之间的比较。如本文所用，“比较窗口”是指至少约20个连续位置的片段，通常为30至约75或40至约50个，其中在将两个序列进行最佳比对后可以将序列与相同数目连续位置的参考序列进行比较。
可以使用默认参数，使用Lasergene生物信息学软件套件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)中的Megalign程序对序列进行最佳比对，以进行比较。该程序体现了以下参考文献中描述的几种比对方案：Dayhoff,M.O.,1978,A model of evolutionary change in proteins-Matrices for detecting distant relationships.In Dayhoff,M.O.(ed.)Atlas ofProtein Sequence and Structure,National Biomedical Research Foundation,Washington DC Vol.5,Suppl.3,pp.345-358；Hein J.,1990,Unified Approach toAlignment and Phylogenes pp.626-645Methods in Enzymology vol.183,AcademicPress,Inc.,San Diego,CA；Higgins,D.G.和Sharp,P.M.,1989,CABIOS 5:151-153；Myers,E.W.和Muller W.,1988,CABIOS 4:11-17；Robinson,E.D.,1971,Comb.Theor.11:105；Santou,N.,Nes,M.,1987,Mol.Biol.Evol.4:406-425；Sneath,P.H.A.和Sokal,R.R.,1973,Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy,FreemanPress,San Francisco,CA；Wilbur,W.J.和Lipman,D.J.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:726-730。
通常，通过在至少20个位置的比较窗口中比较两个最佳比对的序列来确定序列同一性百分比，其中比较窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分相比于参考序列(不包含添加或缺失)可以包括百分之20或更少，通常为百分之5到百分之15，或百分之10到百分之12的添加或缺失(即缺口)，以进行两个序列的最佳比对。通过确定两个序列中相同核酸碱基或氨基酸残基出现的位置数以产生匹配位置数，将匹配位置数除以参考序列中的位置总数(窗口大小)，然后将结果乘以100，以得出序列同一性的百分比，计算所述百分比。
可以使用化学合成，重组方法或PCR获得本公开的多核苷酸。化学多核苷酸合成的方法是本领域公知的，在此无需详细描述。本领域技术人员可以使用本文提供的序列和商业DNA合成仪来产生所需的DNA序列。
为了使用重组方法制备多核苷酸，可以将包含所需序列的多核苷酸插入合适的载体中，然后可以将该载体引入合适的宿主细胞中以进行复制和扩增，如本文进一步讨论的。可以通过本领域已知的任何方式将多核苷酸插入宿主细胞。通过直接摄取、内吞、转染、F-配接或电穿孔通过引入外源多核苷酸来转化细胞。一旦引入，外源多核苷酸可以作为非整合载体(例如质粒)维持在细胞内或整合到宿主细胞基因组中。如此扩增的多核苷酸可以通过本领域众所周知的方法从宿主细胞中分离。参见例如Sambrook等，1989。
或者，PCR允许复制DNA序列。PCR技术在本领域中是众所周知的，并且描述在美国专利号4,683,195、4,800,159、4,754,065和4,683,202以及PCR:The Polymerase ChainReaction,Mullis et al.eds.,Birkauswer Press,Boston,1994中。
可以通过在适当的载体中使用分离的DNA并将其插入适当的宿主细胞中来获得RNA。当细胞复制并且DNA被转录成RNA时，然后可以使用本领域技术人员众所周知的方法分离RNA，例如如上文Sambrook等，1989所述。
合适的克隆载体可以根据标准技术构建，或者可以选自本领域中可获得的大量克隆载体。尽管选择的克隆载体可根据打算使用的宿主细胞而有所不同，但有用的克隆载体通常具有自我复制的能力，可具有特定限制性核酸内切酶的单一靶标和/或可携带可用于选择包含该载体的克隆的标记基因。合适的例子包括质粒和细菌病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如pBS SK+)及其衍生物，mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌体DNA以及穿梭载体，例如pSA3和pAT28。这些和许多其他克隆载体可从商业供应商处获得，例如BioRad、Strategene和Invitrogen。
表达载体通常是可复制的多核苷酸构建体，其包含根据本发明的多核苷酸。暗示表达载体必须作为附加体或作为染色体DNA的组成部分在宿主细胞中可复制。合适的表达载体包括但不限于质粒，病毒载体，包括腺病毒，腺伴随病毒，逆转录病毒，粘粒和PCT公开号WO87/04462中公开的表达载体。载体成分通常可以包括但不限于以下一种或多种：信号序列；复制的起源；一种或多种标记基因；合适的转录控制元件(例如启动子、增强子和终止子)，从而可以转录载体中的多核苷酸。例如，包含含有编码本文提供的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白或修饰的胱天蛋白酶-9多肽的核酸的多核苷酸的表达载体可以具有在宿主细胞中诱导核酸转录的启动子。对于表达(即翻译)，通常还需要一个或多个翻译控制元件，例如核糖体结合位点、翻译起始位点和终止密码子。
可以通过许多合适的方式将含有感兴趣多核苷酸的载体引入宿主细胞，包括电穿孔，转染，采用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其他物质；微粒轰击；脂质转染；和感染(例如，载体是诸如痘苗病毒的传染性媒介的情况)。引入载体或多核苷酸的选择通常将取决于宿主细胞的特征。
编码本文公开的修饰的胱天蛋白酶-9多肽或嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的多核苷酸可以存在于表达盒或表达载体(例如，用于导入到细菌宿主细胞中的质粒，或者用于转染昆虫宿主细胞的例如杆状病毒载体的病毒载体，或用于转染哺乳动物宿主细胞的质粒或病毒载体如慢病毒)。在一些实施方案中，多核苷酸或载体可包括编码核糖体跳跃序列的核酸序列，例如但不限于编码2A肽的序列。在小核糖核酸病毒的甲状旁腺病毒亚组中鉴定出的2A肽引起核糖体“跳跃”，从一个密码子到下一个密码子，而在密码子编码的两个氨基酸之间未形成肽键(参加(Donnelly和Elliott 2001；Atkins,Wills et al.2007；Doronina,Wu etal.2008))。“密码子”是指mRNA(或DNA分子的有义链)上的三个核苷酸，它们被核糖体翻译成一个氨基酸残基。因此，当多肽被符合读框的2A寡肽序列分开时，可以从imRNA中的单个连续开放阅读框合成两个多肽。这种核糖体跳跃机制在本领域中是众所周知的，并且已知由几种载体用于表达由单个信使RNA编码的几种蛋白质。
为了将跨膜多肽导入宿主细胞的分泌途径，在一些实施方案中，在多核苷酸序列或载体序列中提供了分泌信号序列(也称为信号肽、前导序列、prepro序列或pre序列)。分泌信号序列与跨膜核酸序列可操作地连接，即，两个序列在正确的阅读框中连接并定位以将新合成的多肽引导至宿主细胞的分泌途径中。分泌信号序列通常位于编码目标多肽的核酸序列的5'端，尽管某些分泌信号序列可以位于目标核酸序列的其他位置(参见，例如，Welchet al.,美国专利5,037,743；Holland et al.,美国专利5,143,830)。本领域技术人员将认识到，鉴于遗传密码的简并性，在这些多核苷酸分子之间可能存在相当大的序列变异。在一些实施方案中，本公开的核酸序列经密码子优化以在哺乳动物细胞中表达，例如在人细胞中表达。密码子优化是指在通常在给定物种的高表达基因中罕见的密码子的感兴趣序列中交换为通常在此类物种的高表达基因中频繁出现的密码子，例如，与正在交换的密码子编码相同的氨基酸的密码子。
工程化宿主细胞的方法
在一些实施方案中，本文提供了制备宿主细胞的方法。
在一些实施方案中，该方法包括将包含编码本文提供的修饰的胱天蛋白酶-9多肽或嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的核酸序列的多核苷酸引入宿主细胞。可选地，该方法可以进一步包括扩增细胞。
在一些实施方案中，宿主细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞可以源自例如但不限于干细胞。干细胞可以是成年干细胞，非人类胚胎干细胞，更特别地是非人类干细胞，脐带血干细胞，祖细胞，骨髓干细胞，诱导多能干细胞，全能干细胞或造血干细胞。代表性的人细胞是CD34+细胞。分离的细胞也可以是树状细胞，杀伤性树突细胞，肥大细胞，NK细胞，B细胞或T细胞，选自炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞、记忆性T淋巴细胞或辅助性T淋巴细胞。在一些实施方案中，细胞可以衍生自CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞。
在一些实施方案中，引入了包含编码嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的核酸序列的多核苷酸的宿主细胞可以另外包含含有编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸的多核苷酸。备选地，在一些实施方案中，在将编码修饰的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的核酸序列引入宿主细胞后，可以将含有编码CAR的核酸的多核苷酸引入细胞。在以上两个实施方案中，均产生了既包含嵌合胱天蛋白酶-9蛋白又包含CAR的宿主细胞。如本文其他地方所述，可能需要工程化包含例如CAR的免疫细胞，使其另外包含本文提供的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白，以在需要时诱导这些细胞的凋亡。
工程化免疫细胞和制备CART细胞的方法被描述在例如PCT专利申请公开WO/2014/039523、WO/2014/184741、WO/2014/191128、WO/2014/184744和WO/2014/184143中，其每一个均通过引用整体并入本文。此外，在一些实施方案中，CAR和含有CAR以及如本文提供的修饰胱天蛋白酶-9多肽或嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的CAR T细胞通常可以根据在例如以下文献中提供的制备：Jackson et al,Nature Reviews Clinical Oncology,13,370-383(2016)；Maus et al,Blood,123,2625-2635(2014)；Dai et al,Journal of the National CancerInstitute,Vol 8,No.7(2016)；Wang&Riviere,Molecular Therapy–Oncolytics,3,16015(2016)；Liechtenstein et al,Cancers(Basel),5(3),815-837(2013)以及其中提供的参考文献。在一些实施方案中，本文提供的修饰的胱天蛋白酶-9多肽或嵌合胱天蛋白酶-9蛋白和免疫细胞可以具有任何的特征，并且可以通过用于CAR和含CAR的免疫细胞的任何方法制备，所述方法提供在2016年3月30日提交的美国专利申请15/085,317中，为了所有目的通过引用将其并入本文。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括：用以下转化免疫细胞：i)至少一种编码如本文提供的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的多核苷酸，至少一种编码CAR的多核苷酸，和ii)在细胞中表达所述多核苷酸。
用于引入含有编码CAR的核酸序列的多核苷酸的方法和技术也可以用于引入含有编码嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的核酸序列的多核苷酸。在一些实施方案中，编码嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的多核苷酸可存在于慢病毒载体中以在细胞中稳定表达。
在一些实施方案中，工程化具有编码修饰的胱天蛋白酶-9多肽或嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的多核苷酸的宿主细胞的方法可以进一步包括通过灭活至少一个基因表达，例如但不限于TCR的成分、免疫抑制剂的靶标、HLA基因和/或免疫检查点蛋白(例如PDCD1或CTLA-4)，遗传修饰宿主细胞的步骤。通过使基因失活，意欲目的基因不以功能蛋白形式表达。在一些实施方案中，从以下选择待灭火的基因，例如但不限于TCRα、TCRβ、dCK、CD52、GR、PD-1和CTLA-4。在一些实施方案中，该方法包括通过将能够通过选择性DNA切割选择性地失活基因的稀切核酸内切酶引入细胞中失活一个或多个基因。在一些实施方案中，稀切核酸内切酶可以是例如转录激活因子样效应子核酸酶(TALE-核酸酶)或Cas9核酸内切酶。
在一些实施方案中，编码根据本发明多肽的多核苷酸可以是mRNA，其例如通过电穿孔直接引入细胞中。在一些实施方案中，可以使用cytoPulse技术瞬时渗透活细胞以将物质递送到细胞中。可以修改参数以确定高转染效率和最低死亡率的条件。
工程化宿主细胞
本公开内容还提供了工程化宿主细胞，其包含编码本文提供的任何修饰胱天蛋白酶-9多肽或嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的多核苷酸。在一些实施方案中，可通过质粒载体将编码本文提供的胱天蛋白酶-9蛋白的多核苷酸作为转基因引入宿主细胞。在一些实施方案中，质粒载体还可以包含例如选择标记，其用于鉴定和/或选择接受所述载体的细胞。通常，本文提供的宿主细胞是免疫细胞，例如原代T细胞(参见例如图4-9)，尽管其他类型的宿主细胞也是可能的。
当本文提供的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白在宿主细胞中表达时，典型地，嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的取向应使二聚化结构域位于细胞外(因此易于与二聚配体相互作用)，并且其中该蛋白的胱天蛋白酶-9多肽的至少一部分在细胞内(因此能够容易地介导细胞内胱天蛋白酶-9信号传导途径)。
在将编码修饰的胱天蛋白酶-9多肽的多核苷酸引入细胞后，可以在细胞中原位合成修饰的胱天蛋白酶-9多肽。或者，可以在细胞外产生修饰的胱天蛋白酶-9多肽，然后将其引入细胞。将多核苷酸构建体引入细胞的方法是本领域已知的。在一些实施方案中，可以使用稳定的转染方法将多核苷酸构建体整合到细胞的基因组中。在其他实施方案中，瞬时转染方法可用于瞬时表达多核苷酸构建体，并且多核苷酸构建体不整合到细胞的基因组中。在其他实施方案中，可以使用病毒介导的方法。可以通过任何合适的方式，例如重组病毒载体(例如，逆转录病毒、腺病毒)，脂质体等，将多核苷酸引入细胞。瞬时转染方法包括例如但不限于显微注射、电穿孔或粒子轰击。多核苷酸可以包含在载体中，例如质粒载体或病毒载体。
本文还提供了通过本文提供的工程化细胞的上述方法获得的分离的细胞和细胞系。在一些实施方案中，分离的细胞包含至少一种本文所述的修饰的胱天蛋白酶-9多肽或嵌合胱天蛋白酶-9蛋白。本文还提供了根据上述任何一种方法获得的分离的免疫细胞。
在扩增和遗传修饰之前，可以通过多种非限制性方法从受试者获得细胞来源。可从许多非限制性来源获得细胞，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。在一些实施方案中，可以使用本领域技术人员已知的任何数量的T细胞系。在一些实施方案中，细胞可以源自健康供体、诊断为患有癌症的患者或诊断为感染的患者。在一些实施方案中，细胞可以是呈现不同表型特征的混合细胞群的一部分。
本文还提供了根据任何上述方法从转染的免疫细胞获得的细胞系。
在一些实施方案中，根据本公开的分离的细胞包含编码本文提供的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的多核苷酸和编码CAR的多核苷酸，例如如图1A-1C中示意性描绘的。
可以使用例如但不限于美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公开20060121005中一般描述的方法，在细胞遗传修饰之前或之后，活化和扩增用于本文提供的组合物和方法的免疫细胞。T细胞可以在体外或体内扩增。通常，T细胞可以例如通过与刺激CD3 TCR复合物的试剂和T细胞表面上的共刺激分子接触以产生T细胞的活化信号而扩增。例如，诸如钙离子载体A23187、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)或促有丝凝集素类植物血凝素(PHA)的化学物质可用于产生T细胞的激活信号。
在一些实施方案中，可通过与组织或细胞共培养来扩增本公开的细胞。将细胞施用于受试者后，还可以在体内例如在受试者的血液中扩增细胞。
在一些实施方式中，通过在宿主细胞中失活TCRα基因和/或TCRβ基因，在本文提供的宿主T细胞中TCR被呈现为非功能的。
治疗应用
在一些实施方案中，本文提供的包含编码嵌合胱天蛋白酶-9蛋白或修饰的胱天蛋白酶-9多肽的多核苷酸的宿主细胞可以被用于引入到受试者中，用于治疗目的。例如，宿主细胞可以是免疫细胞，并且可以将免疫细胞(例如CART细胞)引入受试者中以治疗受试者中的癌症。根据本文提供的系统和方法，在将宿主细胞施用给受试者之前，通过将编码本文提供的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的多核苷酸掺入宿主细胞中，然后可以在受试者中调节宿主细胞(如果需要)。例如，如果在将宿主细胞引入受试者中之后有必要或期望在包含本文提供的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的宿主细胞中诱导凋亡，则可以向受试者施用与在宿主细胞中的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白中的二聚化结构域结合的合适的二聚配体。清除转移的细胞的决定可能是由于患者体内检测到了不良影响，这种不良反应可归因于转移的细胞，例如，当检测到不可接受的毒性水平或细胞以不希望的方式增殖时。例如，在向受试者施用包含本文提供的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的宿主细胞后，在一些实施方案中，可以在向受试者施用宿主细胞的2、4、8、12、16、24、36、48、72、96、120或144小时内向受试者施用相应的二聚配体。
在一些实施方案中，包含编码本文所述的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的多核苷酸的宿主细胞或衍生自此类细胞的细胞系可以用作药物。在一些实施方案中，这种药物可用于治疗癌症，包括实体瘤和液体瘤。
在一些实施方案中，本文提供用于治疗目的的宿主细胞可以含有具有F36V突变二聚体化结构域的FKBP12。为了在受试者中调节此类宿主细胞，可以将AP1903施用于受试者。可以根据各种方案将AP1903施用于受试者。例如，任选地，可以通过在2小时的时间内通过IV输注以0.4mg/kg的量通过注射向受试者施用AP1903。在人中对AP1903进行了研究(例如参见Iuliucci JD,et al.,J Clin Pharmacol.41：870-9，2001)，并且耐受性好，剂量可达至少为1mg/kg。任选地，可以将AP1903施用于受试者以在受试者的血流中达到例如约10-100nM、100-1000nM或1-100mM的范围内的AP1903的浓度。
本公开的治疗方法可以是改善的、治愈的或预防的。本文提供的组合物和方法可以是自体免疫疗法的一部分，也可以是同种异体免疫疗法的一部分，因为可能需要或需要(在某些情况下)在受试者的自体和同种异体宿主细胞中诱导凋亡。
可以在本文提供的方法中使用的细胞例如在上一节中进行了描述。治疗可以用于治疗被诊断出患有例如癌症或期望将治疗性宿主细胞引入受试者的任何其他疾病的患者。宿主细胞可以通过任何方便的方式例如静脉内施用于受试者。
试剂盒
本公开还提供了用于本方法的试剂盒。本公开的试剂盒包括一个或多个容器，所述容器包含：i)编码修饰的胱天蛋白酶-9多肽或嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的多核苷酸，或工程化免疫细胞，其包含编码修饰的胱天蛋白酶-9多肽或嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的多核苷酸，和ii)根据本文描述的本公开的任何方法的使用说明书。通常，这些说明书包括对用于上述治疗方法的工程化免疫细胞的施用的描述。任选地，试剂盒可进一步包括与嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的二聚化结构域结合的合适的二聚配体，例如AP1903，以及包括例如是否以及何时将二聚配体施用于需要其的受试者的说明。
与本文所述的工程化免疫细胞和二聚配体的使用有关的说明通常包括有关预期治疗的剂量、给药方案和给药途径的信息。容器可以是单位剂量、散装包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。在本公开的试剂盒中提供的说明书通常是在标签或包装插页(例如，试剂盒中包括的纸张)上的书面说明，但是机器可读的说明(例如，在磁性或光学存储盘上携带的说明)也是可以接受的。
本公开的试剂盒在合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶子、广口瓶、柔性包装(例如密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。试剂盒可以具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉注射溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。容器也可以具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉注射溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。
试剂盒可以可选地提供其他成分，例如缓冲液和解释性信息。通常，试剂盒包括容器和在容器上或与容器相关的标签或包装插页。
说明性实施方案
可以通过参考以下编号的说明性实施方案限定本文描述的公开和发明。
1.一种修饰的胱天蛋白酶-9多肽，其包含与SEQ ID NO：2具有至少90％的序列同一性和至少一个氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述氨基酸取代是在选自S271、S274、C287、D330、F342、I370、D379、V387、A390、F406和K409的氨基酸位置处。
2.根据权利要求1所述的修饰的胱天蛋白酶-9多肽，其中所述至少一个氨基酸取代选自S271Y、S274E、D330L、D330M、F342H、I370E、D379E、V387A、A390N、F406W和K409N。
3.根据实施方案1所述的修饰的胱天蛋白酶-9多肽，其中所述多肽包含至少两个氨基酸取代，其中该至少两个氨基酸取代在选自Q221-V387、D330-I370、D330-D379、D330-S271、D330-S274、D330-F342、D330-D379、D330-V387、D330-A390和D330-K409的氨基酸位置。
4.根据实施方案1所述的修饰的胱天蛋白酶-9多肽，其中所述多肽包含至少两个选自Q221R-V387A、D330L-I370E、D330L-D379E、D330M-S271Y、D330M-S274E、D330M-F342H、D330M-I370E、D330M-D379E、D330M-V387A、D330M-A390N和D330M-K409N的氨基酸取代。
5.根据实施方案1-4中任一项所述的修饰的胱天蛋白酶-9多肽，其中所述多肽包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。
6.包含编码实施方案1-5中任一项所述的修饰的胱天蛋白酶-9多肽的核酸序列的多核苷酸。
7.根据实施方案5所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO：11所示的核酸序列。
8.一种表达载体，其包含实施方案6或7所述的多核苷酸。
9.一种工程化免疫细胞，其包含实施方案1-5中任一项所述的修饰的胱天蛋白酶-9多肽或实施方案6或7所述的多核苷酸。
10.一种包含二聚化结构域和修饰的胱天蛋白酶-9多肽的嵌合蛋白，其中所述修饰的胱天蛋白酶-9多肽包含与SEQ ID NO：2具有至少90％的序列同一性和至少一个氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述氨基酸取代是在选自S271、S274、D330、F342、I370、D379、V387、A390、F406和K409的氨基酸位置处。
11.根据实施方案10所述的嵌合蛋白，其中所述至少一个氨基酸取代选自S271Y、S274E、D330L、D330M、F342H、I370E、D379E、V387A、A390N、F406W和K409N。
12.根据实施方案10所述的嵌合蛋白，其中所述修饰的胱天蛋白酶-9多肽包含至少两个氨基酸取代，其中该至少两个氨基酸取代在选自Q221-V387、D330-I370、D330-D379、D330-S271、D330-S274、D330-F342、D330-D379、D330-V387、D330-A390和D330-K409的氨基酸位置。
13.根据实施方案10所述的嵌合蛋白，其中所述修饰的胱天蛋白酶-9多肽包含至少两个选自Q221R-V387A、D330L-I370E、D330L-D379E、D330M-S271Y、D330M-S274E、D330M-F342H、D330M-I370E、D330M-D379E、D330M-V387A、D330M-A390N和D330M-K409N的氨基酸取代。
14.根据实施方案10-13中任一项的实施方案的嵌合蛋白，其中所述二聚化结构域包含选自FKBP多肽和亲环蛋白多肽的多肽。
15.根据实施方案10-14中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述二聚化结构域包含FKBP12多肽。
16.根据实施方案15所述的嵌合蛋白，其中所述FKBP12多肽包含氨基酸取代F36V。
17.根据实施方案10-16中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包含如SEQ IDNO：6所示的氨基酸序列。
18.根据实施方案10-17中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述二聚化结构域结合二聚配体AP1903、AP20187、二聚体FK506或二聚体FK506样类似物。
19.包含编码实施方案10-18中任一项所述的嵌合蛋白的核酸序列的多核苷酸。
20.根据实施方案19所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO：8所示的核酸序列。
21.一种表达载体，其包含实施方案19或20所述的多核苷酸。
22.一种工程化免疫细胞，其包含实施方案10-18中任一项所述的嵌合蛋白或实施方案19或20所述的多核苷酸。
23.根据实施方案22所述的工程化免疫细胞，其中所述细胞进一步包含嵌合抗原受体(CAR)或编码CAR的多核苷酸。
24.根据实施方案22或23所述的工程化免疫细胞，其中所述免疫细胞是T细胞。
25.一种在受试者中调节工程化免疫细胞的方法，所述方法包括将二聚配体施用于所述受试者，所述受试者先前已经被施用了实施方案22-24中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述二聚配体结合至所述嵌合蛋白的二聚化结构域，并且其中胱天蛋白酶-9活性在配体与二聚化结构域结合时被诱导。
26.根据实施方案25所述的方法，其中所述配体是AP1903。
27.一种制备工程化免疫细胞的方法，所述方法包括将实施方案6、7、19或20的多核苷酸或实施方案8或21的表达载体引入免疫细胞。
提供以下实施例仅用于说明性目的，并不旨在以任何方式限制本公开的范围。实际上，除了本文中示出和描述的那些之外，根据前面的描述，本公开内容的各种修改对于本领域技术人员将变得显而易见，并且落在所附权利要求的范围内。
实施例
实施例1：测定包含不同的修饰胱天蛋白酶9多肽的嵌合胱天蛋白酶9蛋白的细胞凋亡
诱导活性
该实施例确定了各种不同的嵌合胱天蛋白酶9蛋白诱导T细胞凋亡的能力。每个嵌合胱天蛋白酶9蛋白包含FKBP12-二聚化结构域和修饰的胱天蛋白酶-9多肽。
实施例1，部分A-制备含有不同的嵌合胱天蛋白酶9蛋白的T细胞制备用于转导的T细胞
如下所述从四个不同的人类献血者(“供体1”、“供体2”、“供体3”和“供体8”)中的每一个制备原代T细胞。
使用SepMate-50管(StemCell Technology，目录号15450)和Ficoll-Paque Plus(GE，目录号17-1440-03)从斯坦福血液库的全血中纯化外周血单核细胞(PBMC)。用MiltenyiPan T细胞分离试剂盒(Miltenyi，目录号130-096-535)分离原代T细胞，并在–86C冷冻直至需要。
慢病毒的制备，所述慢病毒包含编码包含FKBP12二聚化结构域和修饰的胱天蛋白酶-9多肽的嵌合胱天蛋白酶9蛋白的多核苷酸
产生了多种不同的慢病毒载体。每个慢病毒载体均包含编码包含FKBP12二聚化结构域和修饰的胱天蛋白酶-9多肽的嵌合胱天蛋白酶9蛋白的多核苷酸。不同的慢病毒载体编码的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白具有相同的氨基酸序列，但胱天蛋白酶-9多肽中的1、2或3个不同的氨基酸突变除外。产生了包含编码在胱天蛋白酶-9多肽中具有以下不同修饰的嵌合胱天蛋白酶9蛋白的多核苷酸的慢病毒载体：
单个取代：R192K、E202K、C239N、G248L、E261S、N265E、S271A、S271Y、C272D、C272M、S274E、L275H、L275I、L275K、K280G、C287A、G288P、G289D、D330L、D330M、D330Q、S334V、P338W、F342H、I370E、D379E、D379V、S382I、L385W、V387A、A388W、A390N、Y397I、K398D、Q399I、P401I、N405Q、F406D、F406W、L407H、K409D、K409N；
两个取代：Q221R-V387A、Q221R-C287A、S242M-G289D、S271Y-D330M、D274E-D330M、S275E-D330M、D330L-I370E、D330L-D379E、D330M-F342H、D330M-I370E、D330M-D379E、D330M-V387A、D330M-A390N、D330M-K409N、G360D-L380V、V387A-K409N；
三重取代：D330M-D379E-K409N。
下面提供了用于该实验的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的示例性氨基酸序列。此序列适用于在胱天蛋白酶-9多肽部分包含D330M-D379E双重突变的嵌合胱天蛋白酶9蛋白：
在上述嵌合蛋白中，标记了以下组分(从N端到C端的顺序)：
下划线部分：具有F36V突变的FKBP12二聚化结构域。FKBP12二聚化结构域的氨基酸序列也可在此处单独提供：GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLES(SEQ ID NO:4)在紧接的前一个序列中，F36V突变的V用下划线标出。
斜体部分：接头区域。接头的氨基酸序列也在此处单独提供：GGGSGVD(SEQ ID NO:5)。
粗体部分：修饰的胱天蛋白酶9多肽。修饰的胱天蛋白酶-9多肽的氨基酸序列在这里也单独提供：
GFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLMAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEELQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS(SEQ ID NO:3)在紧接在前的序列中，D330M突变的M和D379E突变的E有下划线。SEQ ID NO：3的修饰的胱天蛋白酶-9多肽不包含全长野生型胱天蛋白酶-9蛋白的CARD结构域。
与该实施例一起使用的其他嵌合胱天蛋白酶-9蛋白具有与SEQ ID NO：6中所示的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白相同的结构，不同之处在于每个蛋白如所示具有各自的氨基酸取代。
编码上述嵌合胱天蛋白酶-9蛋白(即，包含D330M-D379E双重突变)及其部分的示例性核酸序列在表2中。
表2：
每种不同的慢病毒载体如下产生。用含有基因组质粒pLVX-EF1a-GFP-P2A-FKBP-F36V-Casp9、gag/pol质粒psPAX2和包膜质粒pMD.2G(GenScript)的3种慢病毒质粒转染HEK293T细胞。基因组质粒含有编码具有相应的目标胱天蛋白酶9取代的嵌合胱天蛋白酶9蛋白的多核苷酸。基因组质粒还编码绿色荧光蛋白(GFP)，以促进鉴定被编码嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的多核苷酸转染的细胞。将产生的各个慢病毒载体释放到每种不同的HEK293T细胞转染培养物中的上清液中。
慢病毒介导的编码嵌合胱天蛋白酶-9蛋白构建体的多核苷酸对T细胞的转导，以产生含有嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的T细胞
含有嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的T细胞如下产生。
将先前冷冻的原代T细胞解冻并用ImmunoCult人CD3/CD28 T细胞激活剂(StemCell，目录号10971)激活。48小时后，将包含编码如上所述的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的多核苷酸的慢病毒载体加入到活化的原代T细胞中进行转导。将不同的慢病毒载体添加到原代T细胞的不同样品中，以测试不同嵌合胱天蛋白酶9蛋白的活性。在来自HEK293T细胞的经过滤的上清液中，将相应的慢病毒载体提供给T细胞。用编码嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的多核苷酸转导的T细胞随后表达各自的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白。
如下表3-7所示，将来自供体1、2和3的T细胞用编码多种不同嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的多核苷酸转染。
同样，出于比较目的，尝试制备含有野生型胱天蛋白酶-9多肽的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白。但是，这些努力并不成功，因为用含有野生型胱天蛋白酶-9多肽构建体的质粒转染的HEK293T细胞无法存活并产生用于转染T细胞的慢病毒。不受理论的束缚，据信这是由于野生型胱天蛋白酶-9多肽的相对较高的基础活性(当将质粒引入细胞后其可在HEK293T细胞中表达)，并且这也表明下表3-7中列出的所有胱天蛋白酶-9突变体均比野生型胱天蛋白酶-9具有更低的基础活性。
实施例1，B部分–测定含有不同嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的T细胞凋亡的诱导
对包含如上文A部分所述制备的包含不同的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白的T细胞，测定响应于二聚配体AP1903的凋亡。
对于每个测定，将含有或不含10nM AP1903的约1,000,000个含有特定嵌合胱天蛋白酶9蛋白的细胞温育3或4天。在第3或第4天，将细胞通过流式细胞仪测量，以确定是GFP阳性(+)的活细胞的百分比。(GFP是嵌合胱天蛋白酶9蛋白的标记物)。因此，可以推断出，活的GFP+细胞的百分比越大，在此测定法中各个嵌合胱天蛋白酶9蛋白的凋亡活性越低。
下表3-7列出了所测定的供体细胞和嵌合胱天蛋白酶9蛋白的不同组合，以及测定的结果。
在下面的表3和4中列出的结果也以图的形式分别呈现在图1和图2中。在图1和图2中，不同的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白在X轴上列出，并且％GFP阳性细胞在Y轴上列出。同样，对于每种不同的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白，有两个相邻的条。左侧的条表示没有AP1903温育的细胞，右侧的条表示与AP1903温育的相应细胞。
表3：
表4：
表5：
表6：
表7：
如上述表所示，本文提供的多种不同的修饰的胱天蛋白酶-9多肽具有由AP1903诱导的凋亡活性。例如，对于每种不同的修饰胱天蛋白酶9，通过比较0mM AP1903中的GFP阳性细胞％与10mM AP1903中的GFP阳性细胞％差异，可以看出这一点。同样，一般地，通常期望在不存在AP1903的情况下具有高的GFP+细胞％(这表明嵌合胱天蛋白酶9蛋白的基础活性低)，并且在0mM AP1903中温育的细胞相比，在10mM AP1903中温育的细胞之间GFP+细胞％差异大。这两个群体之间的GFP+细胞％差异大表明可以诱导嵌合胱天蛋白酶9蛋白的活性；如果两个群体之间的差异不大，则表明i)嵌合胱天蛋白酶9蛋白具有相对较高的基础胱天蛋白酶9活性(在缺少配体的情况下，GFP％较低)或ii)具有即使在AP1903存在的情况下(在配体存在的情况下GFP+％高的情况下)胱天蛋白酶-9的活性也相对较低。例如，具有吸引人的活性谱的如上示出的一些嵌合胱天蛋白酶-9蛋白包括，例如：单个突变：S271Y、S274E、D330L、D330M、F342H、I370E、D379E、V387A、A390N、F406W和K409N；双重突变：Q221R-V387A、D330L-I370E、D330L-D379E、D330M-S271Y、D330M-S274E、D330M-F342H、D330M-I370E、D330M-D379E、D330M-V387A、D330M-A390N和D330M-K409N。
实施例2–测定包含不同嵌合胱天蛋白酶-9蛋白和CAR的T细胞中的表达水平和凋亡诱
导
如上文第1A部分所述，制备了来自供体#8的T细胞，该细胞包含多种不同的嵌合胱天蛋白酶9蛋白，其中一些还包含CAR，并检测了嵌合胱天蛋白酶-9的表达和对二聚配体AP1903的诱导凋亡。
对于每个测定，将含有或不含10nM AP1903的约1,000,000个含有特定嵌合胱天蛋白酶9蛋白的细胞温育3或4天。在AP1903后的第1、2和3天(分别为图6、7和8)，通过流式细胞仪测量细胞，以确定GFP阳性(+)的活细胞百分比(GFP是嵌合胱天蛋白酶9蛋白的标记物)。因此，可以推断出，活的GFP+细胞的百分比越大，在此测定法中各个嵌合胱天蛋白酶9蛋白的凋亡活性越低。
结果显示在图4-9中。在图4-9中，在X轴上列出了不同的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白，在Y轴上列出了％GFP阳性或％CAR阳性细胞。在图4中，对于每种不同的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白，有两个相邻的条。左侧的条表示在原代T细胞中的表达，右侧的条表示在Jurkat细胞中的表达。
在图5中条形图指示CAR阳性原代T细胞(该对的左手条)或Jurkat细胞(该对的右手条)的表达水平。
在图6-9中，对于每个有或没有CAR表达的嵌合胱天蛋白酶-9蛋白，都有两个相邻的条。左侧的条表示没有AP1903温育的细胞，右侧的条表示与AP1903温育的相应细胞。图6显示，由D330M-D379E构建体诱导的凋亡在第1天比由N405Q构建体诱导的凋亡快约3倍。该观察结果与D330M-D379E构建体作为CAR-T疗法的快速作用“安全开关”的应用相一致。
尽管已经参考各种应用、方法、试剂盒和组合物描述了所公开的教导，但是应当理解，在不脱离本文的教导和以下要求保护的发明的情况下，可以进行各种改变和修改。提供前述实施例以更好地说明所公开的教导，并且无意于限制本文所呈现的教导的范围。尽管已经根据这些示例性实施方案描述了本教导，但是本领域技术人员将容易理解，可以对这些示例性实施方案进行多种变化和修改而无需过多的实验。所有这些变化和修改都在当前教导的范围内。
本文所引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、论文、教科书等，以及其中所引用的参考文献，就其尚未被引用的程度而言，在此全文引入作为参考。如果一个或多个并入的文献和类似材料与本申请不同或相矛盾，包括但不限于所定义的术语、术语用法、所描述的技术等，则以本申请为准。
前面的描述和实施例详述了本发明的某些特定实施方案，并描述了发明人考虑的最佳方式。然而，应当理解，无论前面的内容多么详细地出现在文本中，都可以以许多方式来实践本发明，并且应当根据所附权利要求及其任何等同物来解释本发明。
Claims (27)
1.一种修饰的胱天蛋白酶-9多肽，其包含与SEQ ID NO：2具有至少90％的序列同一性和至少一个氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述氨基酸取代是在选自S271、S274、C287、D330、F342、I370、D379、V387、A390、F406和K409的氨基酸位置处。
2.根据权利要求1所述的修饰的胱天蛋白酶-9多肽，其中所述至少一个氨基酸取代选自S271Y、S274E、D330L、D330M、F342H、I370E、D379E、V387A、A390N、F406W和K409N。
3.根据权利要求1所述的修饰的胱天蛋白酶-9多肽，其中所述多肽包含至少两个氨基酸取代，其中该至少两个氨基酸取代在选自Q221-V387、D330-I370、D330-D379、D330-S271、D330-S274、D330-F342、D330-D379、D330-V387、D330-A390和D330-K409的氨基酸位置。
4.根据权利要求1所述的修饰的胱天蛋白酶-9多肽，其中所述多肽包含至少两个选自Q221R-V387A、D330L-I370E、D330L-D379E、D330M-S271Y、D330M-S274E、D330M-F342H、D330M-I370E、D330M-D379E、D330M-V387A、D330M-A390N和D330M-K409N的氨基酸取代。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的修饰的胱天蛋白酶-9多肽，其中所述多肽包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。
6.包含编码权利要求1-5中任一项所述的修饰的胱天蛋白酶-9多肽的核酸序列的多核苷酸。
7.根据权利要求5所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO：11所示的核酸序列。
8.一种表达载体，其包含权利要求6或7所述的多核苷酸。
9.一种工程化免疫细胞，其包含权利要求1-5中任一项所述的修饰的胱天蛋白酶-9多肽或权利要求6或7所述的多核苷酸。
10.一种包含二聚化结构域和修饰的胱天蛋白酶-9多肽的嵌合蛋白，其中所述修饰的胱天蛋白酶-9多肽包含与SEQ ID NO：2具有至少90％的序列同一性和至少一个氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述氨基酸取代是在选自S271、S274、D330、F342、I370、D379、V387、A390、F406和K409的氨基酸位置处。
11.根据权利要求10所述的嵌合蛋白，其中所述至少一个氨基酸取代选自S271Y、S274E、D330L、D330M、F342H、I370E、D379E、V387A、A390N、F406W和K409N。
12.根据权利要求10所述的嵌合蛋白，其中所述修饰的胱天蛋白酶-9多肽包含至少两个氨基酸取代，其中该至少两个氨基酸取代在选自Q221-V387、D330-I370、D330-D379、D330-S271、D330-S274、D330-F342、D330-D379、D330-V387、D330-A390和D330-K409的氨基酸位置。
13.根据权利要求10所述的嵌合蛋白，其中所述修饰的胱天蛋白酶-9多肽包含至少两个选自Q221R-V387A、D330L-I370E、D330L-D379E、D330M-S271Y、D330M-S274E、D330M-F342H、D330M-I370E、D330M-D379E、D330M-V387A、D330M-A390N和D330M-K409N的氨基酸取代。
14.根据权利要求10-13中任一项的权利要求的嵌合蛋白，其中所述二聚化结构域包含选自FKBP多肽和亲环蛋白多肽的多肽。
15.根据权利要求10-14中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述二聚化结构域包含FKBP12多肽。
16.根据权利要求15所述的嵌合蛋白，其中所述FKBP12多肽包含氨基酸取代F36V。
17.根据权利要求10-16中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包含如SEQ IDNO：6所示的氨基酸序列。
18.根据权利要求10-17中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述二聚化结构域结合二聚配体AP1903、AP20187、二聚体FK506或二聚体FK506样类似物。
19.包含编码权利要求10-18中任一项所述的嵌合蛋白的核酸序列的多核苷酸。
20.根据权利要求19所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO：8所示的核酸序列。
21.一种表达载体，其包含权利要求19或20所述的多核苷酸。
22.一种工程化免疫细胞，其包含权利要求10-18中任一项所述的嵌合蛋白或权利要求19或20所述的多核苷酸。
23.根据权利要求22所述的工程化免疫细胞，其中所述细胞进一步包含嵌合抗原受体(CAR)或编码CAR的多核苷酸。
24.根据权利要求22或23所述的工程化免疫细胞，其中所述免疫细胞是T细胞。
25.一种在受试者中调节工程化免疫细胞的方法，所述方法包括将二聚配体施用于所述受试者，所述受试者先前已经被施用了权利要求22-24中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述二聚配体结合至所述嵌合蛋白的二聚化结构域，并且其中胱天蛋白酶-9活性在配体与二聚化结构域结合时被诱导。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述配体是AP1903。
27.一种制备工程化免疫细胞的方法，所述方法包括将权利要求6、7、19或20的多核苷酸或权利要求8或21的表达载体引入免疫细胞。
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