CN111257476A - 一种高效液相色谱串联质谱检测血清中17种胆汁酸的方法 - Google Patents
一种高效液相色谱串联质谱检测血清中17种胆汁酸的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种高效液相色谱串联质谱检测血清中17种胆汁酸的方法，所述方法包括样品制备、样品处理、液相色谱分离以及串联质谱检测等步骤，标准品采用在牛血清白蛋白中加入17种胆汁酸标准品进行制备，蛋白沉淀，处理后的样品进行高效液相色谱串联质谱检测，其中的高效液相色谱采用梯度洗脱反相色谱法，流动相A为0.01％甲酸‑5mM乙酸铵水溶液，流动相B为甲醇溶液，进行梯度洗脱，17种胆汁酸的总洗脱时间为10min，确保互为同分异构体的胆汁酸在梯度洗脱程序中实现完全分离。本发明检测方法具有前处理过程简单，可同时检测17种胆汁酸，灵敏度高，特异性好，受基质影响低，洗脱和检测时间短，检测成本低等优点。
Description
技术领域
本发明涉及疾病分析技术领域，具体而言，涉及一种血清中17种胆汁酸高效液相色谱串联质谱检测方法。
背景技术
胆汁酸是在肝脏中由胆固醇合成的一类两性甾醇类化合物，是胆汁的重要成分，在促进日粮中脂质的硝化吸收，调节机体脂肪代谢上发挥重要作用。根据结构上的差异，胆汁酸可分为游离型和结合型两种。根据合成来源的差异，胆汁酸还可分为初级胆汁酸和次级胆汁酸。初级胆汁酸是在肝脏中以胆固醇为底物直接合成的胆汁酸，通过胆小管分泌并储存于胆囊，包括胆酸(CA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)、猪胆酸(HCA)等，以及与甘氨酸和牛黄酸形成的结合型胆汁酸，包括甘氨胆酸(GCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)、牛黄胆酸(TCA)及牛黄鹅脱氧胆酸(TCDCA)。在肠道中受细菌作用，初级胆汁酸经过水解、氧化和核羟基的差向异构生成的胆汁酸，称为次级胆汁酸，包括脱氧胆酸(DCA)、石胆酸(LCA)、熊脱氧胆酸(UDCA)和猪脱氧胆酸(HDCA)。胆汁酸在分泌入肠道之前，在肝脏中可以与氨基酸以酰胺键连接，形成甘氨酸或牛黄酸结合型胆汁酸，包括牛黄石胆酸(TLCA)、甘氨石胆酸(GLCA)、牛黄脱氧胆酸(TDCA)、甘氨脱氧胆酸(GDCA)、牛黄熊脱氧胆酸(TUDCA)、甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)等。
正常情况下，大部分的胆汁酸都参与肠肝循环，只有极少数的胆汁酸脱离该循环。肝胆疾病引起胆汁酸的肝肠循环障碍，是血清胆汁酸异常的主要因素，血清胆汁酸谱的变化亦会影响肝脏对胆汁酸的合成和分泌，故血清胆汁酸是衡量肝胆功能正常与否的重要标志物。胆汁酸在人体中除了作为乳糜微粒的主要成分外，它还是体内胆固醇消除的一个重要途径，肝脏中新陈代谢的产物可随胆汁排出。胆汁酸参与脂肪循环，胆汁酸和磷脂形成微粒，并形成乳化液帮助脂肪酸和脂溶性维生素的肠道吸收。尽管胆汁酸在于肠肝循环，体循环和尿液中含量很低，然而当出现肝胆疾病而致使胆汁酸排泄障碍时，肝内、血液以及尿液中胆汁酸水平显著升高，尿液以及血液中胆汁酸水平常被作为胆汁阻塞性疾病的生物标志物。胆汁酸在作为内分泌和旁分泌功能的分子信号，不仅调控其自身的体内水平，还参与能量消耗、葡萄糖和脂质代谢、甲状腺激素的信号传递以及细胞免疫。因此，检测每一种胆汁酸的体内水平而非简单地定量总胆汁酸含量，对于肝胆和肠道疾病的筛查、诊断和鉴别诊断具有重要价值。
人血清中含有40多种胆汁酸，如何分离和定量血清中的胆汁酸是一项挑战，因为这类化合物的生化特征各异，且它们在人体中含量较低。气相色谱和气质联用在检测胆汁酸时需要复杂的样品制备，衍生化，需将结合型胆汁酸水解成非结合型才能进行分析；高效液相色谱串联紫外检测器在检测复杂生物基质中的胆汁酸会导致灵敏度和特异性不足；荧光检测法则需要复杂的衍生化技术而不能推广。
采用高效液相色谱串联质谱的检测方法为目前分离和定量检测胆汁酸的较为先进的方法。公开号为CN109030676A的中国专利文献公开了一种同时测定16种胆汁酸的串联质谱检测试剂盒及其应用，包括：标准品、质控品、内标品、沉淀剂、稀释剂和流动相；其中配置标准品所用的空白基质为经活性炭多次吸附分离的血清或血浆，制备过程复杂，并存在活性炭吸附不充分的风险，影响标准曲线可靠性；待测样品前处理过程复杂，需要先经冷冻干燥或冷冻离心进行富集操作；流动相A为甲酸铵或乙酸铵-甲酸或乙酸的水溶液，优选为0-20mmol/L的甲酸铵或乙酸铵，0.1-1％的甲酸，流动相B为甲醇和/或乙腈，16种胆汁酸的洗脱时间共需12min，优选的流动相A中尤其是甲酸浓度较高，洗脱时间偏长，检测成本高，而且仅仅只能一次性检测16种胆汁酸。
另外，由于存在较多互为同分异构体的胆汁酸，在采用高效液相色谱串联质谱进行胆汁酸检测时，容易出现因梯度洗脱程序未能完全分离同分异构体，从而在质谱检测过程中难以实现有效检测。
因此现有高效液相色谱串联质谱的检测方法存在基质制备过程复杂，影响标准曲线可靠性；待测样品前处理过程复杂，需要先经冷冻干燥或冷冻离心进行富集操作；洗脱时间长；检测成本高；难以同时检测血清中多种胆汁酸等问题。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种高效液相色谱串联质谱检测血清中17种胆汁酸的方法，包括如下步骤：
(1)样品制备：
标准品制备：以牛血清白蛋白作为空白基质，加入17种胆汁酸标准溶液，配制系列已知浓度的17种胆汁酸标准品；
质控品制备：以血清作为基质，加入17种胆汁酸标准溶液，配制低(L1)、低(L2)、中(M)、高(H)四个浓度的17种胆汁酸质控样品；
(2)样品处理：样品包括待测人血清样品、标准品、质控品，处理方法均如下：
A)预处理：取50μL样品，加入到1.5mL离心管中；
B)蛋白沉淀：加入150μL内标溶液涡旋混匀，1000rpm震荡10min，离心分离后，取上清液150μL于干净96孔板中；
C)样品稀释：分别加入50μL稀释液，600rpm震荡10min后待测；
(3)样品检测：取步骤(2)处理后得到的样品10μL，自动进样，进行高效液相色谱串联质谱检测。采用梯度洗脱反相色谱法，流动相A为0.01％甲酸-5mM乙酸铵水溶液，流动相B为甲醇溶液，进行梯度洗脱；串联质谱，采用电喷雾离子源(ESI)和多反应监测扫描模式(MRM)。
(4)数据处理及分析：建立标准曲线并计算待测人血清样品中17种胆汁酸浓度。
本发明所述17种胆汁酸为胆酸、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、熊脱氧胆酸、石胆酸、猪胆酸、猪脱氧胆酸、甘氨胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨熊脱氧胆酸、甘氨石胆酸、牛黄胆酸、牛黄鹅脱氧胆酸、牛黄熊脱氧胆酸、牛黄石胆酸和牛黄脱氧胆酸。其中胆酸、脱氧胆酸、猪脱氧胆酸、猪胆酸、鹅脱氧胆酸、熊脱氧胆酸、甘氨胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨熊脱氧胆酸的内标采用氘代甘氨胆酸；石胆酸、甘氨石胆酸、牛黄石胆酸的内标采用氘代石胆酸；牛黄胆酸内标采用氘代牛黄胆酸；牛黄熊脱氧胆酸的内标采用氘代牛黄熊脱氧胆酸；牛黄鹅脱氧胆酸和牛黄脱氧胆酸内标采用氘代牛黄脱氧胆酸。
本发明的高效液相色谱采用梯度洗脱反相色谱法，流动相A为0.01％甲酸-5mM乙酸铵水溶液，流动相B为甲醇溶液，进行梯度洗脱，梯度洗脱时间需10min。由于本发明的17种胆汁酸生化特征各异，进行梯度洗脱时，对流动相条件要求较高，流动相A若为5mM乙酸铵，不含0.01％甲酸，检测灵敏度将降低60％以上；流动相若为0.01％甲酸，不含5mM乙酸铵，将使待测物峰形变异，无法正常检测。
另外，由于17种胆汁酸中存在较多互为同分异构体的胆汁酸，共有四组，第一组为鹅脱氧胆酸(CDCA)、熊脱氧胆酸(UDCA)、猪脱氧胆酸(HDCA)和脱氧胆酸(DCA)，第二组为猪胆酸(HCA)和胆酸(CA)，第三组为甘氨脱氧胆酸(GDCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)和甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)，第四组为牛黄脱氧胆酸(TDCA)、牛黄鹅脱氧胆酸(TCDCA)和牛黄熊脱氧胆酸(TUDCA)，每一组都为同分异构体。在质谱检测过程中由于同分异构体的离子对是一致的，难以通过离子对实现有效分离检测，因此互为同分异构体的胆汁酸必须在梯度洗脱过程中保证完全分离，从而才能在质谱检测过程中精准检测含量。作为优选，本发明所述梯度洗脱程序为：
| 时间(min) | 流动相A％ | 流动相B％ | 流速(ml/min) | 梯度曲线curve |
| 0 | 50 | 50 | 0.6 | 0 |
| 1 | 50 | 50 | 0.6 | 0 |
| 1.1 | 43 | 57 | 0.6 | 0 |
| 4.5 | 35 | 65 | 0.6 | 0 |
| 4.6 | 30 | 70 | 0.6 | 0 |
| 6.5 | 30 | 70 | 0.6 | 0 |
| 6.6 | 20 | 80 | 0.6 | 0 |
| 7.5 | 20 | 80 | 0.6 | 0 |
| 7.6 | 0 | 100 | 0.6 | 0 |
| 8.5 | 0 | 100 | 0.6 | 0 |
| 8.6 | 80 | 20 | 0.6 | 0 |
| 8.9 | 80 | 20 | 0.6 | 0 |
| 9.0 | 50 | 50 | 0.6 | 0 |
| 10.0 | 50 | 50 | 0.6 | 0 |
采用以上洗脱条件，可以实现同分异构体的完全分离，保证了检测的准确性。
进一步地，高效液相色谱条件为：色谱柱为C18色谱柱，流动相流速为0.6mL/min，柱温在50℃。
进一步地，17种胆汁酸在标准品中具有7个系列浓度(S1～S7)，如下表所示：
进一步地，17种胆汁酸在质控品中具有低(L1)、低(L2)、中(M)、高(H)四个系列浓度，如下表所示：
| ng/ml | 低浓度质控(L1) | 低浓度质控(L2) | 中浓度质控(M) | 高浓度质控(H) |
| 胆酸 | 100.0 | 400.0 | 2000.0 | 4000.0 |
| 脱氧胆酸 | 100.0 | 400.0 | 2000.0 | 4000.0 |
| 鹅脱氧胆酸 | 100.0 | 400.0 | 2000.0 | 4000.0 |
| 熊脱氧胆酸 | 100.0 | 400.0 | 2000.0 | 4000.0 |
| 石胆酸 | 20.0 | 80.0 | 400.0 | 800.0 |
| 甘氨胆酸 | 200.0 | 800.0 | 4000.0 | 8000.0 |
| 甘氨脱氧胆酸 | 200.0 | 800.0 | 4000.0 | 8000.0 |
| 甘氨鹅脱氧胆酸 | 200.0 | 800.0 | 4000.0 | 8000.0 |
| 甘氨熊脱氧胆酸 | 100.0 | 400.0 | 2000.0 | 4000.0 |
| 甘氨石胆酸 | 20.0 | 80.0 | 400.0 | 800.0 |
| 牛黄胆酸 | 200.0 | 800.0 | 4000.0 | 8000.0 |
| 牛黄脱氧胆酸 | 200.0 | 800.0 | 4000.0 | 8000.0 |
| 牛黄鹅脱氧胆酸 | 200.0 | 800.0 | 4000.0 | 8000.0 |
| 牛黄熊脱氧胆酸 | 20.0 | 80.0 | 400.0 | 800.0 |
| 牛黄石胆酸 | 20.0 | 80.0 | 400.0 | 800.0 |
| 猪脱氧胆酸 | 20.0 | 80.0 | 400.0 | 800.0 |
| 猪胆酸 | 20.0 | 80.0 | 400.0 | 800.0 |
进一步地，所述的内标溶液为50％甲醇乙腈溶液。
进一步地，步骤(2)所述的离心分离条件为14,000rpm，离心10min。
进一步地，步骤(2)所述的稀释液为超纯水。
进一步地，所述的质谱条件为：采用电喷雾离子源(ESI)和多反应监测扫描模式(MRM)。
进一步地，所述的质谱条件为：
进一步地，所述的质谱条件为：用于检测的17种胆汁酸及其内标的母离子/子离子对质荷比(m/z)如下表所示：
进一步地，步骤(4)所述的数据处理及分析数据处理及分析：绘制标准曲线，计算回收率、基质效应、精密度，及计算待测人血清样品中17种胆汁酸的浓度。
本发明具有以下有益效果：
(1)采用牛血清白蛋白配制标准品及血清配制质控品，降低了人血清样品检测时的基质效应，提高了标准曲线的准确性及可靠性；
(2)采用流动相A为0.01％甲酸-5mM乙酸铵水溶液，流动相B为甲醇溶液，按照特定梯度洗脱程序进行梯度洗脱，洗脱时间共计10min，保证了样品分离效果以及互为同分异构体的胆汁酸的完全分离，通过质谱实现17种胆汁酸的同时精准检测；
(3)前处理过程较简单，由于液相和质谱条件经过优化，灵敏度高，所以样品前处理过程不需要冷冻干燥或冷冻离线等富集过程，可以直接进样，而且所用试剂为常规化学试剂且成本较低，便于操作；
(4)样品用量少，仅50uL，有利于多种物质的检测；
(5)检测时间短，整个检测时间10min左右，大大缩短了单个样本的检测时间，有效降低了分析成本；
(6)灵敏度高，使用50uL血清时，17种胆汁酸的S1浓度完全满足最低定量的要求；
(7)可报告范围更广，可准确分析17种胆汁酸异常的血清样本。
附图说明
图1是对按照标样S7系列浓度，以牛血清蛋白为基质配制的待测样品进行检测获得的检测图谱，对图1中的每一行进行编号“1-6”，其中“1”为总离子流图，“2、3、4”为“1”的提取图，和“5、6”为“2”的提取图，由图中可知，按照本发明的方法，可以同时准确检测17种胆汁酸，其中UDCA和HCA、HDCA和CA重合，但互相不是同分异构体，依然可以通过质谱实现精准检测。
图2是取健康人血清样本进行检测获得的检测谱图。
图3流动相A为5mM乙酸铵-0.01％甲酸时，标样S1中的石胆酸(LCA)、甘氨石胆酸(GLCA)和牛黄石胆酸(TLCA)的检测结果(实施例2)
图4流动相A为5mM乙酸铵时，标样S1中的石胆酸(LCA)、甘氨石胆酸(GLCA)和牛黄石胆酸(TLCA)的检测结果(实施例2)
图5是流动相A分别为5mM乙酸铵-0.01％甲酸时的检测图谱，整体峰宽较窄，对称性好(实施例3)
图6是流动相A为0.01％甲酸时的检测图谱，整体峰宽较宽，有明显拖尾(实施例3)
图7是采用不同梯度洗脱时的检测结果(实施例4)
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。
实施例1：样品制备、处理和检测
一、样品制备
以下配制基于使用固态标准品，如使用商业化购买的标准贮备溶液则需根据实际使用标准贮备液浓度调整配制方法。
1、混合储备液的配制
按照下表配制各待测物的混合储备液(-30～-15℃保存)：首先按照W-STD7储备液为标准品浓度S7的20万倍配置储备液，使用时再进行逐级稀释，配置成混合储备液。
2、标准及质控工作液的配制
(1)按下表配制分别配置标准工作液的储备液(W-STD1～W-STD7)和质控工作液的储备液(W-L1QC、W-L2QC、W-MQC、W-HQC)：
(2)根据标准工作液和质控工作液的储备液，分别使用牛血清蛋白和阴性血清，按下表配制标准曲线和质控样品工作液：
3、内标溶液的配制
(1)二级贮备液的配制
按照下表配制各待测物的二级内标储备液(-30～-15℃保存)：
(2)内标工作液的配制
按照下表配制内标工作液(-30～-15℃保存)：
二、样品处理
样品包括待测人血清、标准品、质控品，都采用如下方法处理：
(1)取50μL标准品/质控品/待测人血清，加入到1.5mL离心管中；
(2)加入150μL内标溶液(50％甲醇-乙腈)涡旋混匀，1000rpm震荡10min；
(3)在14,000rpm离心10min，取上清液150μL于干净96孔板中；
(4)分别加入50μL超纯水作为稀释液，600rpm震荡10min，样品待测。
三、样品检测
取10μL样品进液相色谱质谱联用系统分析，具体分析条件如下：
液相色谱串联质谱系统：AB SCIEX Triple Quad 4500MD；色谱柱：PhenomenexKinetex C18 2.6μm,50×3.0mm；流动相A：5mM乙酸铵-0.01％甲酸水溶液；流动相B：甲醇；流速：0.6mL/min；柱温：50℃；进样器温度：室温；进样量：10μL。
洗脱梯度如下所示：
17中胆汁酸的保留时间如下：胆酸保留时间为5.61min，脱氧胆酸的保留时间为7.25min，鹅脱氧胆酸保留时间为7.02min，熊脱氧胆酸保留时间为5.14min，石胆酸保留时间为7.97min，甘氨胆酸保留时间为3.51min，甘氨脱氧胆酸保留时间为5.39min，甘氨鹅脱氧胆酸保留时间为5.07min，甘氨熊脱氧胆酸保留时间为2.72min，甘氨石胆酸保留时间为6.23min，牛黄胆酸保留时间为3.28min，牛黄脱氧胆酸保留时间为5.10min，牛黄鹅脱氧胆酸保留时间为4.78min，牛黄熊脱氧胆酸保留时间为2.08min，牛黄石胆酸保留时间为5.97min，猪胆酸保留时间为5.17min，猪脱氧胆酸保留时间为5.53min。如图1所示，样品通过超高压液相色谱分离后，不同的胆汁酸在不同洗脱时间出峰，并且被质谱选择反应监控模式检测到，从而检测其含量。
液相色谱上分离出的17种胆汁酸进入到质谱进行检测，利用采用电喷雾离子源(ESI)和多反应监测扫描模式(MRM)检测17种胆汁酸的含量，并绘制标准曲线图。
质谱检测条件如下表所示：
每个待测物的母离子/子离子对质荷比、正离子模式优化去簇电压、碰撞电压、碰撞室射出电压、驻留时间等如下表所示：
可以通过选择反应监控检测到的离子对，以及对应的保留时间，来确定胆汁酸的检测，再利用添加已知量的氘代石胆酸内标、氘代甘氨胆酸内标、氘代牛黄熊脱氧胆酸、氘代牛黄胆酸和氘代牛黄脱氧胆酸内标进行定量。
样品通过液相色谱分离后，不同的胆汁酸在不同洗脱时间出峰，并且被质谱多反应监测模式检测到，从而检测其含量。按照标样S7系列浓度，以牛血清蛋白为基质配置待测样品进行检测，检测图谱如图1所示。对图1中的每一行进行编号“1-6”，其中“1”为总离子流图，“2、3、4”为“1”的提取图，和“5、6”为“2”的提取图，其中UDCA和HCA、HDCA和CA重合，但互相不是同分异构体，因此可以通过质谱顺利检测。图2是取健康人血清样本进行检测获得的检测谱图。
四、数据处理及分析
1、绘制标准曲线
标准曲线图以17种胆汁酸标准品浓度为横坐标，以与17种胆汁酸其各自内标峰面积比为纵坐标，进行线性回归，获得标准曲线，标准曲线及相关系数如下表所示。
表1标准曲线回归方程及相关系数
| 物质 | 线性及线性相关系数 |
| UDCA | y＝0.01057x+0.04758(r＝0.99703) |
| CA | y＝0.01471x+0.26398(r＝0.99741) |
| CDCA | y＝0.00622x+0.05536(r＝0.99858) |
| DCA | y＝0.00742x+0.02901(r＝0.99606) |
| LCA | y＝0.01313x+0.00817(r＝0.99699) |
| GUDCA | y＝0.00494x+3.41096e-4(r＝0.99628) |
| GCA | y＝0.00940x+0.08580(r＝0.99848) |
| GCDCA | y＝0.00153x+0.01315(r＝0.99617) |
| GDCA | y＝0.00180x+0.01970(r＝0.99646) |
| GLCA | y＝0.00179x+0.06521(r＝0.99541) |
| TUDCA | y＝0.00165x+0.00800(r＝0.99857) |
| TCA | y＝0.00266x+0.00299(r＝0.99694) |
| TCDCA | y＝0.00220x+0.00657(r＝0.99932) |
| TDCA | y＝0.00576x+0.00414(r＝0.99858) |
| TLCA | y＝0.00389x+0.03190(r＝0.99571) |
| HDCA | y＝0.00756x+0.00801(r＝0.99402) |
| HCA | y＝0.00541x+-0.00605(r＝0.99878) |
2、计算精密度、基质效应、
(1)准确度&精密度
使用低、中、高浓度质控样品(L1、L2、M、H)中待测物与其内标峰面积比，代入建立的17种各自的胆汁酸标准曲线中，计算得到质控样品中17种胆汁酸的浓度，再计算出至少3个分析批的每种质控样品的准确度和精密度结果，其接受标准为测定值均值和理论值间的相对偏差(RE)在±15％之间，且精密度(CV)≤15％。三次精密度测试，四个浓度(L1、L2、M、H)，准确度在88.3-114.9％之间，批间精密度在1.1％-7.7％之间，符合要求。
(2)基质效应
基质效应通过比较各浓度质控水平的纯溶液样品与其对应添加入基质空白和血清空白后待测物的响应得到(基质和血清样品需减去本底响应)，基质效应在85％-115％之间时表明该基质对待测物测定的影响可忽略。如存在基质效应，各浓度质控水平的基质效应应接近。内标归一化的基质因子在92.14％-107.59％之间，CV在3.8～14.6％之间，符合要求。
3、计算待测人血清样品中17种胆汁酸的浓度
质谱检测得到胆汁酸与内标的比值，将比值代入到定量校正方程，计算得到血清中胆汁酸的含量。
按上述步骤进行样品制备和处理后，根据不同液相色谱串联条件，安排如下液相色谱串联质谱检测实施例。
实施例2：流动相A分别为5mM乙酸铵-0.01％甲酸或5mM乙酸铵时的检测结果对比
按上述步骤完成样品制备和处理后，取10μL标准品S1进液相色谱质谱联用系统分析，具体分析条件分两组，如下所示：
第一组：液相色谱串联质谱系统：AB SCIEX Triple Quad 4500MD；色谱柱：PhenomenexKinetex C18 2.6μm,50×3.0mm；流动相A：5mM乙酸铵-0.01％甲酸水溶液；流动相B：甲醇；流速：0.6mL/min；柱温：50℃；进样器温度：室温；进样量：10μL。
洗脱梯度如下所示：
| 时间(min) | 流动相A％ | 流动相B％ | 流速(ml/min) | 梯度曲线curve |
| 0 | 50 | 50 | 0.6 | 0 |
| 1 | 50 | 50 | 0.6 | 0 |
| 1.1 | 43 | 57 | 0.6 | 0 |
| 4.5 | 35 | 65 | 0.6 | 0 |
| 4.6 | 30 | 70 | 0.6 | 0 |
| 6.5 | 30 | 70 | 0.6 | 0 |
| 6.6 | 20 | 80 | 0.6 | 0 |
| 7.5 | 20 | 80 | 0.6 | 0 |
| 7.6 | 0 | 100 | 0.6 | 0 |
| 8.5 | 0 | 100 | 0.6 | 0 |
| 8.6 | 80 | 20 | 0.6 | 0 |
| 8.9 | 80 | 20 | 0.6 | 0 |
| 9.0 | 50 | 50 | 0.6 | 0 |
| 10.0 | 50 | 50 | 0.6 | 0 |
分离出的17种胆汁酸再进入质谱进行检测。
第二组：液相色谱串联质谱系统：AB SCIEX Triple Quad 4500MD；色谱柱：PhenomenexKinetex C18 2.6μm,50×3.0mm；流动相A：5mM乙酸铵水溶液；流动相B：甲醇；流速：0.6mL/min；柱温：50℃；进样器温度：室温；进样量：10μL。梯度洗脱程序与第一组一致，进行梯度洗脱，分离出的17种胆汁酸再进入质谱进行检测。
检测结果如下表，以待测样品中的石胆酸(LCA)、甘氨石胆酸(GLCA)和牛黄石胆酸(TLCA)作为检测指标，检测图谱如图3和图4所示，以图谱中的峰高进行结果比对，当流动相A为5mM乙酸铵-0.01％甲酸时(图3)，石胆酸(LCA)峰高为15000，甘氨石胆酸(GLCA)峰高为4000，牛黄石胆酸(TLCA)峰高为6000；当流动相A为5mM乙酸铵时(图4)，石胆酸(LCA)峰高为6000，甘氨石胆酸(GLCA)峰高为1500，牛黄石胆酸(TLCA)峰高为6000。对比结果见下表，可见流动相A中添加0.01％甲酸会显著提高LCA类物质的灵敏度，灵敏度提高60％以上。
但是，如果甲酸含量为0.1％以上的时候，并不能提高这三种物质的灵敏度，这似乎说明，A相的甲酸含量比较关键。
实施例3：流动相A分别为5mM乙酸铵-0.01％甲酸或0.01％甲酸时的检测结果对比
按上述步骤完成样品制备和处理后，取10μL标准品S7进液相色谱质谱联用系统分析，具体分析条件分两组，如下所示：
第一组：液相色谱串联质谱系统：AB SCIEX Triple Quad 4500MD；色谱柱：PhenomenexKinetex C18 2.6μm,50×3.0mm；流动相A：5mM乙酸铵-0.01％甲酸水溶液；流动相B：甲醇；流速：0.6mL/min；柱温：50℃；进样器温度：室温；进样量：10μL。
洗脱梯度如下所示：
分离出的17种胆汁酸再进入质谱进行检测。
第二组：液相色谱串联质谱系统：AB SCIEX Triple Quad 4500MD；色谱柱：PhenomenexKinetex C18 2.6μm,50×3.0mm；流动相A：0.01％甲酸水溶液；流动相B：甲醇；流速：0.6mL/min；柱温：50℃；进样器温度：室温；进样量：10μL。梯度洗脱程序与第一组一致，进行梯度洗脱，分离出的17种胆汁酸再进入质谱进行检测。
检测图谱如图4和5所示，当流动相A为5mM乙酸铵-0.01％甲酸时(图5)，检测图谱中待测物的峰形对称，峰宽较窄(0.1-0.2min)，无前延和拖尾现象，检测灵敏度高；当流动相A为0.01％甲酸(图6)而不含乙酸铵时，待测物峰形较宽，峰高较低，尤其是T类物质(牛黄类胆汁酸)最为明显，峰宽很宽(大于0.3min)，拖尾严重。可见流动相A为5mM乙酸铵-0.01％甲酸更合适，检测效果更好。
实施例4：采用不同梯度洗脱时的检测结果
按上述步骤完成样品制备和处理后，取10μL标准品S7进液相色谱质谱联用系统分析，具体分析条件为：液相色谱串联质谱系统：AB SCIEX Triple Quad 4500MD；色谱柱：PhenomenexKinetex C18 2.6μm,50×3.0mm；流动相A：5mM乙酸铵-0.01％甲酸水溶液；流动相B：甲醇；流速：0.6mL/min；柱温：50℃；进样器温度：室温；进样量：10μL。
洗脱梯度如下所示：
由于17种胆汁酸中存在同分异构体，根据同分异构体的特性，在质谱检测过程中由于其离子对是一致的，难以有效分离检测，因此互为同分异构体的胆汁酸必须在梯度洗脱过程中保证完全分离，这样可以更准确地进行检测。
本实施例检测图谱如图7所示(与图5相比)，由于鹅脱氧胆酸(CDCA)和脱氧胆酸(DCA)为同分异构体，改变梯度洗脱程序后，CDCA和DCA分离度差，导致无法积分。可见本发明对于洗脱梯度的选择非常重要，优选的洗脱梯度才能适用于本发明技术方案的实施。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。
Claims (10)
1.一种高效液相色谱串联质谱检测血清中胆汁酸的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：样品制备；样品处理；样品检测；其中，标准品采用牛血清白蛋白作为空白基质配制；样品检测包括串联质谱和液相色谱检测,其中,采用梯度洗脱反相色谱法，流动相A为0.01％甲酸-5mM乙酸铵水溶液，流动相B为甲醇溶液，进行梯度洗脱；串联质谱，采用电喷雾离子源(ESI)和负离子多反应监测扫描模式(MRM)，同时测定血清中的17种胆汁酸浓度。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱程序为：
。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，液相色谱条件为：色谱柱为C18色谱柱，流动相流速为0.6mL/min，柱温在50℃。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的质谱条件为：
5.如权利要求1任一项所述的方法，其特征在于，所述17种胆汁酸为胆酸、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、熊脱氧胆酸、石胆酸、猪胆酸、猪脱氧胆酸、甘氨胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨熊脱氧胆酸、甘氨石胆酸、牛黄胆酸、牛黄鹅脱氧胆酸、牛黄熊脱氧胆酸、牛黄石胆酸和牛黄脱氧胆酸。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，胆酸、脱氧胆酸、猪脱氧胆酸、猪胆酸、鹅脱氧胆酸、熊脱氧胆酸、甘氨胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨熊脱氧胆酸的内标采用氘代甘氨胆酸；石胆酸、甘氨石胆酸、牛黄石胆酸的内标采用氘代石胆酸；牛黄胆酸内标采用氘代牛黄胆酸；牛黄熊脱氧胆酸的内标采用氘代牛黄熊脱氧胆酸；牛黄鹅脱氧胆酸、牛黄脱氧胆酸内标采用氘代牛黄脱氧胆酸。
7.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述的质谱条件为：用于检测的17种胆汁酸及其内标的母离子/子离子对质荷比(m/z)如下表所示：
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，17种胆汁酸在标准品中具有7个系列浓度(S1～S7)，分别如下表所示：
。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，17种胆汁酸在质控品中具有低(L1)、低(L2)、中(M)、高(H)四个系列浓度，分别如下表所示：
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品处理包括如下步骤：取50μL样品至离心管，加入150μL内标溶液涡旋混匀，1000rpm震荡10min，离心分离，取上清液150μL于96孔板中，加入50μL稀释液，600rpm震荡10min后待测。
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