CN107621502A - 基于lc‑ms/ms的胆汁和血清中16种胆汁酸的定量 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基于LC‑MS/MS的胆汁和血清中16种胆汁酸的定量。具体地，本发明提供了一种胆汁酸高效液相色谱质谱联用法检测试剂盒，包括质控品、同位素内标提取液、稀释液、转化液、复溶液、流动相添加剂A、流动相添加剂B。本试剂盒可以分别检测16种胆汁酸，用时较短，提高了检测的效率。

Description

基于LC-MS/MS的胆汁和血清中16种胆汁酸的定量

技术领域

本发明涉及质谱检测领域，具体地涉及多种胆汁酸高效液相色谱质谱联用法检测试剂盒。

背景技术

胆汁酸是肝脏中细胞色素氧化胆固醇的产物，在肠道消化吸收脂肪和机体维持胆固醇平衡上起着重要的作用。胆汁酸是胆汁中的主要成分，是人体内环境中重要的生理介质之一，主要有胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸和熊脱氧胆酸，以及这5种游离胆汁酸对应的甘氨和牛磺结合型胆汁酸。健康人的胆汁和外周血液中，胆汁酸谱组分相对恒定；发生胆石症、动脉粥样硬化、高血压等多种疾病时，会引起人体胆汁酸代谢异常，导致血清中相应胆汁酸含量的改变。因此，通过胆汁、血清胆汁酸谱的检测，可以了解机体胆汁酸的代谢，并有助于疾病的临床诊治。

不同的胆汁酸在机体内具有不同的生理作用，例如在十二指肠中胆汁酸主要以氨基酸结合型形式存在，这有利于其在十二指肠中的溶解，促进脂肪的消化，此外熊脱氧胆酸还是治疗原发性胆汁性肝硬化的标准方法。然而目前临床对血清和胆汁中胆汁酸的常规检测仅限于总胆汁酸测定，检测结果对疾病的诊断、治疗的指导作用有限。因此检测每一种胆汁酸在体内的水平而非简单地定量总胆汁酸含量，对于了解胆汁酸相关的生理和病理状态是非常重要的。

胆汁酸从结构上分为非结合性胆汁酸、氨基酸结合型胆汁酸、牛磺结合型胆汁酸等。因胆汁酸与其结合物的结构性质差异很大，例如非结合型胆汁酸水溶性差、pKa值一般在3-5之间，而结合型胆汁酸具有更好的水溶性和更低的pKa，在血清中胆汁酸浓度水平很低以及可能同时存在多个同分异构体等原因，对其进行同时分离和检测时非常困难的。本研究建立和验证了一个基于LC-MS/MS的同时16种胆汁酸的准确定量方法，该方法灵敏度高、适用于包括血清、胆汁酸在内的多种基质样本，具有巨大的临床应用价值。

发明内容

本发明的目的就是提供一种检测灵敏度较高并且能够同时定量检测一种或多种胆汁酸。

在本发明的第一方面，提供了一种基于LC-MS/MS的胆汁和血清中16种胆汁酸的定量检测方法，其特征在于，包括步骤：

(1)样品经过内标化处理，所述内标化处理包括8种同位素内标CA-d5，DCA-d5，LCA-d4，GLCA-d4，TCA-d4，TLCA-d5，TCDCA-d5，TUDCA-d5的内标液处理；

(2)进行色谱，其中色谱条件：色谱柱为Capcell Pak C18MG柱，流动相添加剂A为乙酸铵，流动相添加剂B为乙酸铵乙腈，梯度洗脱，

(3)进行质谱检测。

在另一优选例中，所述乙酸铵浓度为10mM，pH＝9，所述乙酸铵乙腈浓度为10mM，pH＝9。

在另一优选例中，所述色谱柱的温度为40℃

在另一优选例中，所述色谱柱的样品池温度为8℃，进样体积为5uL。

在另一优选例中，所述质谱检测的离子源参数为Curtain Gas(CUR)20、CollisionGas(CAD)8、ion spray voltage-4500V、source temperature 600℃、CUR 20.0、GS1 60.0和GS2 65.0。

在另一优选例中，所述样品与内标液比例为100：500。

在另一优选例中，所述样品为100ul，所述内标液为500ul，两者混匀，经37℃氮气吹干后，加入100u L复溶液(甲醇水溶液(1:1，v:v))复溶。

本发明的第二方面，提供了一种用于胆汁和血清中16种胆汁酸的定量检测方法的试剂盒，所述的试剂盒包括：

(1)内标：所述的内标包括8种同位素内标CA-d5，DCA-d5，LCA-d4，GLCA-d4，TCA-d4，TLCA-d5，TCDCA-d5，TUDCA-d5，优选为内标液；

(2)Capcell Pak C18MG柱；

(3)流动相添加剂，所述的流动相添加剂包括：乙酸铵、乙酸铵乙腈。

在另一优选例中，所述的乙酸铵浓度为10mM，pH＝9。

在另一优选例中，所述乙酸铵乙腈浓度为10mM，pH＝9。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选，首次开发了一种高效液相色谱质谱联用法，所述方法采用特定的流动相以及特定的质谱检测条件，不仅简化操作，并且可以在一次检测中同时定量检测出25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3，且检测结果的灵敏度高，检测结果准确性高。在此基础上完成了本发明。

一.标准品和试剂

16种HPLC级别胆汁酸，其中胆酸cholic acid(CA),鹅脱氧胆酸chenodeoxycholicacid(CDCA),脱氧胆酸deoxycholic acid(DCA),甘氨胆酸glycocholic acid(GCA),甘氨脱氧胆酸glycodeoxycholic acid(GDCA),甘氨石胆酸glycolithocholic acid(GLCA),甘氨熊脱氧胆酸glycoursodeoxycholic acid(GUDCA),石胆酸lithocholic acid(LCA),牛磺鹅脱氧胆酸taurochenodeoxycholic acid(TCDCA),牛磺石胆酸taurolithocholic acids(TLCA),牛磺熊脱氧胆酸tauroursodeoxycholic acid(TUDCA),熊脱氧胆酸ursodeoxycholic acid(UDCA)，猪脱氧胆酸hyode oxycholic acid(HDCA)购买于TorontoResearch Chemicals Inc.(美国)，甘氨鹅脱氧胆酸glycochenodeoxycholic acid(GCDCA),牛磺脱氧胆酸taurodeoxycholic acid(TDCA),牛磺胆酸taurocholicacid(TCA)购买于Sigma-Aldrich(美国).8种同位素内标CA-d5，DCA-d5，LCA-d4，GLCA-d4，TCA-d4，TLCA-d5，TCDCA-d5，TUDCA-d5同样购买于Toronto Research Chemicals Inc.

二.样品准备

取正常人群过夜后空腹血清样本，立即离心取上清，-20℃保存待测。取100ul样品(血清、标准品或者质控品)加入2mL EP管中，再加入500uL内标工作液，漩涡充分混匀，13000rpm,4°离心5min,取400uL上清于96深孔板中，37℃N2吹干后，加入100u L复溶液(甲醇水溶液(1:1，v:v))复溶。漩涡混匀10min。

三.色谱条件

高效液相色谱：LC-20AD,Shimadzu Corporation

色谱柱：Capcell Pak C18MG柱(100*2mm，5u m，日本资生堂)

流动相A：pH＝9的10mM乙酸铵(国药集团化学试剂有限公司，中国，上海)水溶液。

流动相B：pH＝9的10mM乙酸铵乙腈(Sigma-Aldrich，美国)溶液。

洗脱梯度：

表1：液相洗脱梯度

序号	时间(min)	％B	流速(mL/min)
				1	0.01	10	0.5
2	10.00	100	0.5
				3	13.00	10	0.5

柱温：40℃

样品池温度：8℃

进样体积：5uL

四.质谱条件

质谱：API 3200MD，AB Sciex.

离子源参数：Curtain Gas(CUR)20,Collision Gas(CAD)8,ion spray voltage-4500V,source temperature 600℃,CUR 20.0,GS1 60.0,and GS2 65.0.

化合物检测离子和检测条件通过纯净的标准品直接注射进样优化得到，优化结果如下表所示：

表2：化合物质谱检测参数

五.精密度

配制高、低两种质控品。同一天内，对高、低浓度质控参考品经前处理后进样检测，平行做6组，分别计算组内标准偏差，得到批内差。连续测三天，分别计算组间标准偏差，得到批间差。测定结果见表3。

表3批内差和批间差

六.线性

配制线性参考品经前处理后进样检测，平行做6组，得到一条标准曲线，计算不同浓度组内标准偏差，平行做三天，得到三条标准曲线，计算不同浓度组间差，组内差和组间差均不大于15％，同时三条标准曲线相关系数R2大于0.99。表4给出了各个化合物的线性范围和标准曲线，线性范围选择依据文献报道正常人群血清中胆汁酸浓度，线性相关系数符合检测要求。

表4化合物线性

实施例1

采用如本发明所述的方法，对63个正常人血清胆汁酸含量进行了测定，见表5，包括平均值和2.5％-97.5％正常人群的最大值和最小值，这与文献报道参考值范围基本一致，说明该方法测定结果准确。同时该方法除了适用于血清中胆汁酸的检测外，也适用于稀释后的胆汁样品的检测，具有普适性。

表5血清胆汁酸测定结果(n＝63)

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种基于LC-MS/MS的胆汁和血清中16种胆汁酸的定量检测方法，其特征在于，包括步骤：

(1)样品经过内标化处理，所述内标化处理包括8种同位素内标CA-d5，DCA-d5，LCA-d4，GLCA-d4，TCA-d4，TLCA-d5，TCDCA-d5，TUDCA-d5的内标液处理；

(2)进行色谱，其中色谱条件：色谱柱为Capcell Pak C18MG柱，流动相添加剂A为乙酸铵，流动相添加剂B为乙酸铵乙腈，梯度洗脱，

(3)进行质谱检测。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乙酸铵浓度为10mM，pH＝9，所述乙酸铵乙腈浓度为10mM，pH＝9。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱柱的温度为40℃。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱柱的样品池温度为8℃，进样体积为5uL。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质谱检测的离子源参数为Curtain Gas(CUR)20、Collision Gas(CAD)8、ion spray voltage-4500V、source temperature 600℃、CUR 20.0、GS1 60.0和GS2 65.0。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品与内标液比例为100：500。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述样品为100ul，所述内标液为500ul，两者混匀，经37℃氮气吹干后，加入100u L复溶液(甲醇水溶液(1:1，v:v))复溶。

8.一种用于胆汁和血清中16种胆汁酸的定量检测方法的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：

(1)内标：所述的内标包括8种同位素内标CA-d5，DCA-d5，LCA-d4，GLCA-d4，TCA-d4，TLCA-d5，TCDCA-d5，TUDCA-d5，优选为内标液；

(2)Capcell Pak C18MG柱；

(3)流动相添加剂，所述的流动相添加剂包括：乙酸铵、乙酸铵乙腈。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的乙酸铵浓度为10mM，pH＝9。

10.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述乙酸铵乙腈浓度为10mM，pH＝9。