CN110726799A - 同时检测血液中25羟基-维生素d3和25羟基-维生素d2含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了同时检测血液中25羟基‑维生素D3和25羟基‑维生素D2含量的方法。利用高效液相串联质谱仪分别检测至少三个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图，各标准溶液中均含有浓度已知的25羟基‑维生素D3及D2的标准品和内标物；根据各个标准溶液的色谱图拟合得到标准曲线方程；将混合内标工作液添加到经处理至少2mL待检测血液而得到的50‑200μL血液样本中，并顺次加入蛋白沉淀试剂、萃取剂和复溶液，超声1‑3min后离心取上清液得到待测样本；同样检测待测样本得到其色谱图；根据待测样本的色谱图和各个标准曲线方程，计算血液样本中25羟基‑维生素D3和D2的含量。本方案适用于成人血液的检测。

Description

同时检测血液中25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2含量的 方法

技术领域

本发明涉及临床化学技术领域，特别涉及同时检测血液中25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2含量的方法。

背景技术

维生素D又称抗佝偻病维生素，为固醇类衍生物，其家族成员中最重要的成员是25羟基-维生素D3(胆钙化醇)和25羟基-维生素D2(麦角钙化醇)，皆为脂溶性维生素。当其缺乏时，会产生维生素D缺乏症，主要表现为骨骼病变，同时伴有肌肉松弛，非特异性神经精神症状、生长迟缓，免疫力低下及相应的血浆生化改变；严重缺乏时，会形成抗维生素D佝偻病、软骨营养不良、老年人骨质疏松症等。产生病症的机理是维生素D缺乏时肠道对钙、磷吸收减少，血中钙、磷浓度下降，从而引起全身性钙、磷代谢失常，致使钙盐不能正常的沉着在骨骼的生长部分，最终形成骨骼畸形。

25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2临床上主要用于治疗维生素D缺乏症，预防儿童佝偻病、老年人骨质疏松症、肾性骨病、甲状旁腺素缺少症以及癫痫患者使用苯巴比妥导致的骨症。其作用机理是促进小肠黏膜刷状缘对钙的吸收及肾小管重吸收磷，提高血钙、血磷浓度，协同甲状旁腺激素(PTH)、降钙素(CT)，促进旧骨释放磷酸钙，维持及调节血浆钙、磷正常浓度，促使钙沉着于新骨形成部位，使枸橼酸盐在骨中沉积，促进骨钙化及成骨细胞功能和骨样组织成熟。

目前已有针对婴幼儿血液中25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2含量的检测方法，检测所需血样量较少，末梢采血即可。基于此，有必要提供适用于成人的检测方法。

发明内容

本发明提供了同时检测血液中25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2含量的方法，适用于成人血液的检测。

为了达到上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明提供了同时检测血液中25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2含量的方法，包括：

利用高效液相串联质谱仪，在一定检测条件下，分别检测至少三个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图，其中，任一标准溶液中均含有浓度已知的25羟基-维生素D3的标准品及内标物、25羟基-维生素D2的标准品及内标物，不同标准溶液中同一标准品的浓度不同；

根据各个标准溶液的色谱图，拟合得到25羟基-维生素D3的标准曲线方程和25羟基-维生素D2的标准曲线方程；

将一定量的混合内标工作液添加到50-200μL血液样本中，加入一定量的蛋白沉淀试剂后涡旋混匀，再加入一定量的萃取剂，涡旋混匀后离心取上清液，将上清液吹干后加入一定量的复溶液并涡旋混匀，超声1-3min后离心取上清液得到待测样本；其中，所述血液样本经处理至少2mL待检测血液而得到，所述混合内标工作液中含有浓度已知的25羟基-维生素D3的内标物和25羟基-维生素D2的内标物；

利用高效液相串联质谱仪，在相同检测条件下，检测所述待测样本，得到待测样本的色谱图；

根据待测样本的色谱图和拟合得到的各个标准曲线方程，计算所述血液样本中25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2的含量。

优选地，所述检测条件中的液相条件包括：C8色谱柱。

优选地，所述液相条件包括：ZORBAX Eclipse XDB-C8色谱柱，色谱柱的长度为50mm、内径为2.1mm、填料粒径为5μm，流动相A为含体积比为0.05％-0.25％的甲酸的水，流动相B为含体积比为0.05％-0.25％的甲酸的甲醇，分析时间为3.5-4.5min，柱温为20-35℃，进样量为10-30μL，流速为0.3-0.5mL/min。

优选地，所述液相条件包括：洗脱方式为等度洗脱；

流动相A为含体积比为0.1％的甲酸的水，流动相B为含体积比为0.1％的甲酸的甲醇；

流动相A与流动相B的体积比为13:87。

优选地，所述液相条件包括：柱温为25℃，进样量为20μL，流速为0.35mL/min。

优选地，所述检测条件中的串联质谱条件包括：采用电喷雾离子源ESI，正离子扫描模式，选择反应监测模式，Gas Temp为300-400℃，Gas Flow为3-8L/min，NebμLizer为25-40psi，Capillary为4000-4500V，Delta EMV(+)为300-400V。

优选地，所述串联质谱条件包括：Gas Temp为350℃，Gas Flow为6L/min，NebuLizer为35psi，Capillary为4500V，Delta EMV(+)为300V。

优选地，在所述分别检测至少三个标准溶液之前，进一步包括：

制备至少三个标准工作液，标准工作液中含有浓度已知的25羟基-维生素D3标准品和25羟基-维生素D2标准品，且25羟基-维生素D3标准品的浓度在25-1600ng/mL中，25羟基-维生素D2标准品的浓度在7.8-500ng/mL中；

利用移液器移取10μL标准工作液、10μL所述混合内标工作液置于离心管中，再移取加入80μL稀释液；

将该离心管在1500-2000rpm的转速下涡旋混匀1-2min后，移取上清液以得到标准溶液；

其中，得到的至少三个标准溶液中，25羟基-维生素D3标准品的浓度为2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、160ng/mL中的至少三个，25羟基-维生素D2标准品的浓度为0.78ng/mL、1.56ng/mL、3.12ng/mL、6.25ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL中的至少三个。

优选地，所述混合内标工作液中，含有110ng/mL的维生素D3-d₆和75ng/mL的维生素D2-d₃。

本发明提供了同时检测血液中25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2含量的方法。利用高效液相串联质谱仪分别检测至少三个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图，各标准溶液中均含有浓度已知的25羟基-维生素D3及D2的标准品和内标物；根据各个标准溶液的色谱图拟合得到标准曲线方程；将混合内标工作液添加到经处理至少2mL待检测血液而得到的50-200μL血液样本中，并顺次加入蛋白沉淀试剂、萃取剂和复溶液，超声1-3min后离心取上清液得到待测样本；同样检测待测样本得到其色谱图；根据待测样本的色谱图和各个标准曲线方程，计算血液样本中25羟基-维生素D3和D2的含量。本发明适用于成人血液的检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明一实施例提供的一种同时检测血液中25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2含量的方法的流程图；

图2是本发明一实施例提供的25羟基-维生素D3的化学结构式；

图3是本发明一实施例提供的25羟基-维生素D2的化学结构式；

图4是本发明一实施例提供的一标准溶液中25羟基-维生素D3的色谱图；

图5是本发明一实施例提供的一标准溶液中25羟基-维生素D3的同位素内标的色谱图；

图6是本发明一实施例提供的一待测样本中25羟基-维生素D3的色谱图；

图7是本发明一实施例提供的一待测样本中25羟基-维生素D3的同位素内标的色谱图；

图8是本发明一实施例提供的一标准溶液中25羟基-维生素D2的色谱图；

图9是本发明一实施例提供的一标准溶液中25羟基-维生素D2的同位素内标的色谱图；

图10是本发明一实施例提供的一待测样本中25羟基-维生素D2的色谱图；

图11是本发明一实施例提供的一待测样本中25羟基-维生素D2的同位素内标的色谱图；

图12是本发明一实施例提供的25羟基-维生素D3的线性关系图；

图13是本发明一实施例提供的25羟基-维生素D2的线性关系图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如图1所示，本发明实施例提供了一种同时检测血液中25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2含量的方法，可以包括以下步骤：

步骤101：利用高效液相串联质谱仪，在一定检测条件下，分别检测至少三个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图，其中，任一标准溶液中均含有浓度已知的25羟基-维生素D3的标准品及内标物、25羟基-维生素D2的标准品及内标物，不同标准溶液中同一标准品的浓度不同。

步骤102：根据各个标准溶液的色谱图，拟合得到25羟基-维生素D3的标准曲线方程和25羟基-维生素D2的标准曲线方程。

步骤103：将一定量的混合内标工作液添加到50-200μL血液样本中，加入一定量的蛋白沉淀试剂后涡旋混匀，再加入一定量的萃取剂，涡旋混匀后离心取上清液，将上清液吹干后加入一定量的复溶液并涡旋混匀，超声1-3min后离心取上清液得到待测样本；其中，所述血液样本经处理至少2mL待检测血液而得到，所述混合内标工作液中含有浓度已知的25羟基-维生素D3的内标物和25羟基-维生素D2的内标物。

步骤104：利用高效液相串联质谱仪，在相同检测条件下，检测所述待测样本，得到待测样本的色谱图。

步骤105：根据待测样本的色谱图和拟合得到的各个标准曲线方程，计算所述血液样本中25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2的含量。

本发明实施例主要用于成人血液的检测，故上述待检测血液通常可取自成人的静脉血。此外，综合考虑检测所用仪器的特点，如灵敏度等，待检测血液的用量至少为2mL。

本发明实施例中，为保证检测效果，血液样本的用量优选为50-200μL。比如，血液样本的用量取值可以为50、70、100、150或200。由于血液样本的用量较高，故在复溶后可作超声处理，超声时间优选为1-3min，从而避免出现溶解不完全、平行差的问题，以提高样本批次间检测结果的稳定性，保证检测准确性。举例来说，超声时间的取值可以为1、1.5、2、2.5或3。

此外，本发明实施例中，以液液萃取进行前处理，使干扰因素大大减少。

有研究发现，儿童体内存在VD3(即25羟基-维生素D3)的同型异构体VD3-epi，而成人体内是没有的。通常情况下，同型异构体的分离需要使用特殊填料的色谱柱。考虑到检测成人血液时，不会涉及到这一分离问题，通常使用常规色谱柱并借助质谱的分离特性即可实现检测目的，故可选用一般填料的色谱柱。比如，可以优选使用稳定性和耐用性均较强的C8柱。

基于上述内容，在本发明一个实施例中，所述检测条件中的液相条件包括：C8色谱柱。基于此，本发明实施例所涉及到的检测成本降低，尤其适用于血液样本数量较多的应用场景。

在本发明一个实施例中，所述液相条件包括：ZORBAX Eclipse XDB-C8色谱柱，色谱柱的长度为50mm、内径为2.1mm、填料粒径为5μm，流动相A为含体积比为0.05％-0.25％的甲酸的水，流动相B为含体积比为0.05％-0.25％的甲酸的甲醇，分析时间为3.5-4.5min，柱温为20-35℃，进样量为10-30μL，流速为0.3-0.5mL/min。

比如，流动相A和流动相B中，甲酸的体积比的取值均可以为0.05、0.1、0.15、0.2或0.25；分析时间的取值可以为3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.2或4.5，优选为3.5min；柱温的取值可以为20、25、30或35；进样量的取值可以为10、15、20、25或30；流速的取值可以为0.3、0.35、0.4、0.45或0.5。

本发明实施例中，在可保证检测效果的前提下，通过选用含甲醇的水和含甲醇的甲酸作为流动相，使得流动相的配制简单不繁琐，有益于实际检测的应用。此外，在可保证检测效果的前提下，所用试剂可以为色谱纯，而无需使用质谱纯。

在本发明一个实施例中，所述液相条件包括：洗脱方式为等度洗脱；流动相A为含体积比为0.1％的甲酸的水，流动相B为含体积比为0.1％的甲酸的甲醇；流动相A与流动相B的体积比为13:87。

本发明实施例中，在保证检测效果的基础之上，洗脱方式优选采用等度洗脱，使得检测方法的稳定性更好，更有益于临床样本的检测。

在本发明一个实施例中，所述液相条件包括：柱温为25℃，进样量为20μL，流速为0.35mL/min。

在本发明一个实施例中，所述检测条件中的串联质谱条件包括：采用电喷雾离子源ESI，正离子扫描模式，选择反应监测模式，Gas Temp为300-400℃，Gas Flow为3-8L/min，NebμLizer为25-40psi，Capillary为4000-4500V，Delta EMV(+)为300-400V。

优选地，所述串联质谱条件包括：Gas Temp为350℃，Gas Flow为6L/min，NebuLizer为35psi，Capillary为4500V，Delta EMV(+)为300V。

请参考图2和图3，图2示出了25羟基-维生素D3的化学结构式，图3示出了25羟基-维生素D2的化学结构式。

通常情况下，标准曲线方程的建立至少需要三个坐标点，以保证所建立方程的准确性，故需要预先配制至少三个标准溶液，从而可以根据各个标准溶液检测所得到的色谱图，拟合出25羟基-维生素D3的标准曲线方程和25羟基-维生素D2的标准曲线方程。

详细地，以25羟基-维生素D3为例，拟合得到的25羟基-维生素D3的标准曲线方程通常可以为y＝k×x+b。其中，x、y这两个变量，分别可以为各个标准溶液的色谱图中，25羟基-维生素D3的标准品与相应内标物的峰面积比值，以及，各个标准溶液中，25羟基-维生素D3的标准品与相应内标物的浓度比值。如此，根据待测样本的色谱图中，25羟基-维生素D3与其内标物的峰面积比值，以及待测样本中该内标物的浓度，代入标准曲线方程即可计算出待测样本中25羟基-维生素D3的浓度。据此，可相应获得血液样本中25羟基-维生素D3的浓度。当然，这一实现方式同样适用于25羟基-维生素D2。

通常情况下，取至少2mL待检测血液后，通过对待检测血液进行处理，比如在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液得到血清或血浆，即得到上述血液样本。血清或血浆样本置于-20℃冷冻下保存至分析前备用。得到血液样本后，即可作前处理，以得到相应可直接上样的待测样本。

在本发明一个实施例中，样本前处理的实现过程可以包括：

(1)用移液枪移取10μL混合内标工作液于2mL的离心管中，然后加入50-200μL血液样本；

(2)加入一定量的沉淀蛋白试剂，在1500-2000rpm的转速下涡旋混合2-5min；

(3)加入一定量的萃取剂，在1500-2000rpm的转速下涡旋混合3-10min后，再在10000-15000rpm的转速下高速离心4-6min；

(4)移取一定量的离心后上清液至干净的1.5mL离心管中，将盛有上清液的1.5mL离心管转移至氮气吹干装置上，将上清液吹干；

(5)移取一定量的复溶液至上清吹干的1.5mL离心管中，在1500-2000rpm的转速下涡旋混合1-3min后，超声1-3min，再在10000-15000rpm的转速下高速离心4-6min，移取上清液即为待测样本。

比如，可以移取90μL的上清液作为待测样本。

优选地，样本前处理中，沉淀蛋白试剂为无水乙醇，蛋白沉淀剂的量为100-300μL；萃取试剂为正己烷，萃取试剂的量为1000-1400μL；复溶液为65-75％的甲醇水溶液，且甲醇水溶液中含0.05％-0.15％的甲酸，复溶液的量为50-200μL。

举例来说，无水乙醇的用量取值可以为100、150、200、250或300；正己烷的用量取值可以为1000、1100、1200、1300或1400；复溶液中，甲醇的体积取值可以为65、70或75，甲酸含量的取值可以为0.05、0.1或0.15，复溶液用量的取值可以为50、100、150或200。

在本发明一个实施例中，在所述分别检测至少三个标准溶液之前，进一步包括：

制备至少三个标准工作液，标准工作液中含有浓度已知的25羟基-维生素D3标准品和25羟基-维生素D2标准品，且25羟基-维生素D3标准品的浓度在25-1600ng/mL中，25羟基-维生素D2标准品的浓度在7.8-500ng/mL中；

利用移液器移取10μL标准工作液、10μL所述混合内标工作液置于离心管中，再移取加入80μL稀释液；

将该离心管在1500-2000rpm的转速下涡旋混匀1-2min后，移取上清液以得到标准溶液；

其中，得到的至少三个标准溶液中，25羟基-维生素D3标准品的浓度为2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、160ng/mL中的至少三个，25羟基-维生素D2标准品的浓度为0.78ng/mL、1.56ng/mL、3.12ng/mL、6.25ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL中的至少三个。

详细地，可以结合检测的人群、待检测血液的用量，以及人体内25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2的大致含量范围，来设定线性范围，以保证大部分的临床样本检测结果落在可报告范围内。

本发明实施例利用高效液相质谱联用法来实现检测，考虑到同位素内标物能避免质谱的基质效应，故优选地，上述内标物可以为同位素内标物。因此，在本发明一个实施例中，优选地，所述混合内标工作液中，含有110ng/mL的维生素D3-d₆和75ng/mL的维生素D2-d₃。

综上所述，本发明实施例提供的这一同时检测血液中25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2含量的方法，是将内标法与高效液相色谱质谱联用法相结合，使干扰因素大大减少，且特异性强、灵敏度高、检测结果更为准确，同时分析时间缩短。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述，但本发明并不仅限于下述实施例。

实施例1

本发明实施例用于获取标准曲线方程。

1.1标准储备液的配制

标准储备液A：将购买得到的25羟基-维生素D3标准液(有证参考物质，溶剂为纯甲醇)转移至2mL冻存管，得到标准储备液A(100μg/mL)，并在-80℃条件下保存，有效期为一年。

标准储备液B：将购买得到的25羟基-维生素D2标准液(有证参考物质，溶剂为纯甲醇)转移至2mL冻存管，得到标准储备液B(50μg/mL)，并在-80℃条件下保存，有效期为一年。

1.2内标储备液的配制

内标储备液C：取25羟基-维生素D3-d₆标准品0.5mg置于5mL容量瓶，用甲醇进行溶解，并定容至5mL，得到内标标准储备液C，并在-80℃条件下保存，有效期为1年。

内标储备液D：将购买得到的25羟基-维生素VD2-d₃标准液(溶剂为纯甲醇)转移至2mL冻存管，得到内标标准储备液D(100μg/mL)，并在-80℃条件下保存，有效期为1年。

1.3检测用仪器

安捷伦6410。

1.4质谱条件

采用ESI，正离子扫描模式，选择反应监测模式，Gas Temp为350℃，Gas Flow为6L/min，NebuLizer为35psi，Capillary为4500V，Delta EMV(+)为300V。

基于此，质谱条件的其他参数请参考下述表1。

表1

物质名称	Precursor Ion	Product Ion	Dwell	Fragmentor	CE	CAV
							25-OH-VD3	401.3	365.3	150	110	8	7
25-OH-VD3-d6	407.3	371.3	150	110	8	7
							25-OH-VD2	413.3	395.2	150	100	3	3
25-OH-VD2-d3	416.3	358.2	150	100	3	3

表1中，25-OH-VD3为25羟基-维生素D3，25-OH-VD2为25羟基-维生素D2。

1.5液相条件

1.5.1色谱柱

色谱柱为安捷伦公司的ZORBAX Eclipse XDB-C8色谱柱，色谱柱的长度为50mm、内径为2.1mm、填料粒径为5μm。

1.5.2流动相

流动相A：含体积比为0.1％的甲酸的水；

流动相B：含体积比为0.1％的甲酸的甲醇。

1.5.3洗脱方式

采用梯度洗脱，洗脱过程如下述表2所示：

表2

Time/min	流动相A/％	流动相B/％
			0.00	13	87
3.5	13	87

1.5.4其他

分析时间为3.5min；柱温为25℃；进样量为20μL；流速为0.35mL/min。

1.6标准工作液的配制

标准工作液：取适量标准储备液A、标准储备液B，用70％的甲醇水溶液进行稀释混合，得到含有25-1600ng/mL 25羟基-维生素D3、7.8-500ng/mL25羟基-维生素D2的七个标准工作液，并在-80℃条件下保存，有效期为3个月。

本发明实施例中，七个标准工作液中，25羟基-维生素D3标准品的浓度分别为25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、800ng/mL、1600ng/mL；25羟基-维生素D2标准品的浓度分别为7.8ng/mL、15.6ng/mL、31.2ng/mL、62.5ng/mL、125ng/mL、250ng/mL、500ng/mL。

可见，这七个标准工作液中，各个标准品的浓度不同且依次递增。

1.7混合内标工作液的配制

混合内标工作液：取适量内标储备液C和内标储备液D，用70％的甲醇水溶液进行稀释，得到含110ng/mL的25羟基-维生素D3-d₆、75ng/mL的25羟基-维生素D2-d₃的混合内标工作液，-80℃保存，避光，有效期1年。

1.8标准溶液的配制

对于每一个标准工作液，用移液器移取10μL标准工作液和10μL混合内标工作液分别置于离心管中，再移取加入80μL稀释液(甲醇：水＝7:3)，然后在2000rpm的转速下涡旋混匀1min后，取上清液作为待检测的标准溶液。

如此，针对七个标准工作液，可以得到七个标准溶液。七个标准溶液中，25羟基-维生素D3的浓度分别为2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、160ng/mL，25羟基-维生素D2的浓度分别为0.78ng/mL、1.56ng/mL、3.12ng/mL、6.25ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL。

1.9检测标准溶液，生成标准曲线方程

得到各个标准溶液后，即可利用高效液相串联质谱仪对七个标准溶液分别进行检测，对应得到各个标准溶液的色谱图。

请参考图4、图5、图8和图9，图4示出了一标准溶液中25羟基-维生素D3标准品的色谱图，图5示出了一标准溶液中25羟基-维生素D3的同位素内标物(即上述25羟基-维生素D3-d₆标准品)的色谱图；图8示出了一标准溶液中25羟基-维生素D2标准品的色谱图，图9示出了一标准溶液中25羟基-维生素D2的同位素内标物(即上述25羟基-维生素VD2-d₃标准品)的色谱图。

从标准溶液的色谱图中，可以得到25羟基-维生素D3标准品、25羟基-维生素D2标准品的色谱峰面积和各个内标物的色谱峰面积，然后结合各个标准溶液中标准品和内标物的已知浓度，即可得到25羟基-维生素D3的标准曲线方程和25羟基-维生素D2的标准曲线方程。

请参考图12和图13，图12示出了得到的25羟基-维生素D3线性关系图，图13示出了得到的25羟基-维生素D2线性关系图。根据线性关系图，可以得到下述表3。

表3

检测指标	线性范围	标准曲线方程	相关系数	加权
					25-OH-VD3	2.5-160ng/mL	y＝0.036978×X+0.003258	0.99877844	1/X<sup>2</sup>
25-OH-VD2	0.78-50ng/mL	y＝0.146489×X+0.049395	0.99784967	1/X<sup>2</sup>

由表3可知，25羟基-维生素D3在2.5-160ng/mL的线性范围内，相关系数R2＞0.9900，表示线性关系良好；25羟基-维生素D2在0.78-50ng/mL的线性范围内，相关系数R2＞0.9900，表示线性关系良好。基于这两个标准曲线方程来计算血液中25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2含量时，准确性高，误差小。

得到标准曲线方程后，即可对血液样本作前处理，以得到待测样本，进而在相同检测条件下，对待测样本进行检测，结合得到的标准曲线方程，即可得到血液样本中25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2的含量。

实施例2

本发明实施例用于检测静脉血中25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2的含量。

2.1获取血液样本

血液样本经处理至少2mL待检测血液而得到。得到血液样本后，即可作前处理，以得到相应可直接上样的待测样本。

2.2血液样本前处理

用移液枪移取10μL混合内标工作液于2mL的离心管中，然后加入100μL血液样本，再加入200μL的无水乙醇，在2000rpm的转速下涡旋混合3min后，加入1200μL的正己烷，在2000rpm的转速下涡旋混合5min后，再在12000rpm的转速下高速离心10min，移取1000μL离心后上清液至干净的1.5mL离心管中，将盛有上清液的1.5mL离心管转移至氮气吹干装置上，将上清液吹干，移取100μL的含0.1％甲酸和70％甲醇的水溶液，至上清吹干的1.5mL离心管中，在2000rpm的转速下涡旋混合1min后，超声1min，再在12000rpm的转速下高速离心5min，移取90μL上清液即为待测样本。

2.3待测样本检测

在实施例1的检测条件下，使用同一高效液相串联质谱仪对待测样本进行检测，得到待测样本的色谱图。

请参考图6、图7、图10和图11，图6示出了待测样本中25羟基-维生素D3的色谱图，图7示出了待测样本中25羟基-维生素D3的同位素内标物(即25羟基-维生素D3-d₆标准品)的色谱图，图10示出了待测样本中25羟基-维生素D2的色谱图，图11示出了待测样本中25羟基-维生素D2的同位素内标物(即上述25羟基-维生素VD2-d₃标准品)的色谱图。

请参考图4至图7，待测样本中25羟基-维生素D3的保留时间与标准溶液中25羟基-维生素D3标准品的保留时间相一致，以25羟基-维生素D3的同位素标记物为内标物，使得目标化合物的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜、特异性强、准确度和灵敏度高。

请参考图8至图11，待测样本中25羟基-维生素D2的保留时间与标准溶液中25羟基-维生素D2标准品的保留时间相一致，以25羟基-维生素D2的同位素标记物为内标物，使得目标化合物的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜、特异性强、准确度和灵敏度高。

2.4待测样本中25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2含量的计算

根据待测样本的色谱图中，25羟基-维生素D3、25羟基-维生素D2和各个内标物的色谱峰面积，以及待测样本中各个内标物的已知浓度，对应代入上述2个标准曲线方程，即可计算出待测样本中25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2的含量。

实施例3

本发明实施例用于测定定量限和检测限。

选择低浓度的质控样本，用生理盐水做不同程度的稀释，从而制备得到不同浓度的血液样本稀释液，并按实施例2中的血液样本前处理方式及测定条件，对这些血液样本稀释液进行测定。经检测发现，25羟基-维生素D3、25羟基-维生素D2的检测限和定量限如下所示：

25羟基-维生素D3

(1)检测限(LOD)：0.5ng/mL。

(2)定量限(LOQ)：1.5ng/mL。

25羟基-维生素D2

(1)检测限(LOD)：0.16ng/mL。

(2)定量限(LOQ)：0.5ng/mL。

由本实施例可知，25羟基-维生素D3的检测限可低至0.5ng/mL，定量限可低至1.5ng/mL，25羟基-维生素D2的检测限可低至0.16ng/mL，定量限可低至0.5ng/mL，灵敏度很高，可以提高低浓度样本的平行性，增强准确度。

因此，本发明实施例对25羟基-维生素D3或25羟基-维生素D2含量很低的生物样本也能准确定量，保证了检测方法的高度准确性及广泛适用性。

实施例4

本发明实施例用于测定回收率和精密度。

分别取含25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2的标准工作液，配制成高、中、低3种浓度，进行加样回收率和精密度实验，按实施例2中的检测方法进行测定，分析测定3批次，25羟基-维生素D3、25羟基-维生素D2的回收率和精密度如表4所示。

表4

可以看出，25羟基-维生素D2、25羟基-维生素D3在低、中、高的3个添加水平范围内，平均回收率为96.37％～103.51％，重现性良好，加样回收率良好，精密度为2.74％～5.64％，检测结果的准确度较高，可消除系统误差。

最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.同时检测血液中25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2含量的方法，其特征在于，包括：

利用高效液相串联质谱仪，在一定检测条件下，分别检测至少三个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图，其中，任一标准溶液中均含有浓度已知的25羟基-维生素D3的标准品及内标物、25羟基-维生素D2的标准品及内标物，不同标准溶液中同一标准品的浓度不同；

根据各个标准溶液的色谱图，拟合得到25羟基-维生素D3的标准曲线方程和25羟基-维生素D2的标准曲线方程；

将一定量的混合内标工作液添加到50-200μL血液样本中，加入一定量的蛋白沉淀试剂后涡旋混匀，再加入一定量的萃取剂，涡旋混匀后离心取上清液，将上清液吹干后加入一定量的复溶液并涡旋混匀，超声1-3min后离心取上清液得到待测样本；其中，所述血液样本经处理至少2mL待检测血液而得到，所述混合内标工作液中含有浓度已知的25羟基-维生素D3的内标物和25羟基-维生素D2的内标物；

利用高效液相串联质谱仪，在相同检测条件下，检测所述待测样本，得到待测样本的色谱图；

根据待测样本的色谱图和拟合得到的各个标准曲线方程，计算所述血液样本中25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2的含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述检测条件中的液相条件包括：C8色谱柱。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，

所述液相条件包括：ZORBAX Eclipse XDB-C8色谱柱，色谱柱的长度为50mm、内径为2.1mm、填料粒径为5μm，流动相A为含体积比为0.05％-0.25％的甲酸的水，流动相B为含体积比为0.05％-0.25％的甲酸的甲醇，分析时间为3.5-4.5min，柱温为20-35℃，进样量为10-30μL，流速为0.3-0.5mL/min。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，

所述液相条件包括：洗脱方式为等度洗脱；

流动相A为含体积比为0.1％的甲酸的水，流动相B为含体积比为0.1％的甲酸的甲醇；

流动相A与流动相B的体积比为13:87。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，

所述液相条件包括：柱温为25℃，进样量为20μL，流速为0.35mL/min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述检测条件中的串联质谱条件包括：采用电喷雾离子源ESI，正离子扫描模式，选择反应监测模式，Gas Temp为300-400℃，Gas Flow为3-8L/min，NebμLizer为25-40psi，Capillary为4000-4500V，Delta EMV(+)为300-400V。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，

所述串联质谱条件包括：Gas Temp为350℃，Gas Flow为6L/min，NebuLizer为35psi，Capillary为4500V，Delta EMV(+)为300V。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

在所述分别检测至少三个标准溶液之前，进一步包括：

制备至少三个标准工作液，标准工作液中含有浓度已知的25羟基-维生素D3标准品和25羟基-维生素D2标准品，且25羟基-维生素D3标准品的浓度在25-1600ng/mL中，25羟基-维生素D2标准品的浓度在7.8-500ng/mL中；

利用移液器移取10μL标准工作液、10μL所述混合内标工作液置于离心管中，再移取加入80μL稀释液；

将该离心管在1500-2000rpm的转速下涡旋混匀1-2min后，移取上清液以得到标准溶液；

其中，得到的至少三个标准溶液中，25羟基-维生素D3标准品的浓度为2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、160ng/mL中的至少三个，25羟基-维生素D2标准品的浓度为0.78ng/mL、1.56ng/mL、3.12ng/mL、6.25ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL中的至少三个。

9.根据权利要求1至8中任一所述的方法，其特征在于，

所述混合内标工作液中，含有110ng/mL的维生素D3-d₆和75ng/mL的维生素D2-d₃。

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