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CN110997001A - Mmp13结合免疫球蛋白 - Google Patents

Mmp13结合免疫球蛋白 Download PDF

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CN110997001A CN201880049243.0A CN201880049243A CN110997001A CN 110997001 A CN110997001 A CN 110997001A CN 201880049243 A CN201880049243 A CN 201880049243A CN 110997001 A CN110997001 A CN 110997001A
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Abstract

本发明涉及特异性结合MMP13的免疫球蛋白，并且更具体地涉及多肽，编码该多肽的核酸；制备此类多肽的方法；用于预防、治疗或诊断目的的组合物和特别是包含此类多肽的药物组合物。特别地，本发明的免疫球蛋白抑制MMP13的活性并且优选地也是稳定的。

Description

MMP13结合免疫球蛋白
1发明领域
本发明涉及结合MMP13的免疫球蛋白，并且更特别地涉及包含或基本上由一种或多种这样的免疫球蛋白组成的多肽(在本文中也分别称为“本发明的免疫球蛋白”和“本发明的多肽”)。本发明还涉及包含这样的免疫球蛋白或多肽以及编码这样的免疫球蛋白或多肽的核酸(在本文中也称为“本发明的核酸”)的构建体；用于制备这样的免疫球蛋白、多肽和构建体的方法；表达或能够表达这样的免疫球蛋白或多肽的宿主细胞；包含这样的免疫球蛋白、多肽、构建体、核酸和/或宿主细胞的组合物，并且尤其是药物组合物；和免疫球蛋白、多肽、构建体、核酸、宿主细胞和/或组合物的用途，特别是用于预防和/或治疗目的，例如本文所述的预防和/或治疗目的。通过本文的进一步描述，本发明的其他方面、实施方案、优点和应用将变得清楚。
2发明背景
骨关节炎(OA)是全世界最常见的致残原因之一。它影响了三千万美国人并且是最常见的关节病症。预计到2025年，该病将影响超过20％的美国人口。该疾病是非系统性疾病并通常仅限于很少的关节。然而，该疾病可以发生在所有关节，最常见的是膝盖、臀部、手和脊椎。OA的特征在于关节软骨(覆盖骨骼的软骨)的逐渐侵蚀，导致慢性疼痛和残疾。最终，该疾病导致关节软骨的完全破坏，下面的骨骼的硬化，骨赘的形成等，所有这些都导致丧失运动和疼痛。疼痛是OA最突出的症状，并且最通常是患者寻求医疗帮助的原因。不能治愈OA；疾病管理最好仅限于姑息治疗，而对于解决疾病发展的根本原因却作用不大。
人们强烈寻求疾病修饰抗骨关节炎药剂(DMOAD)，其可以被定义为抑制结构性疾病进展并且理想地还改善症状和/或功能的药剂。在老龄化人口的这种慢性疾病中，可能需要长期开具DMOAD，因此需要在具有多合并症和潜在的药剂与药剂相互作用的目标人群中获得出色的安全性数据。
骨关节炎可以定义为多种组的病况，其特征是关节症状、源于关节软骨缺损的体征以及包括骨骼、肌腱和肌肉的相邻组织中的变化的组合。关节软骨中最丰富的组分是蛋白聚糖和胶原蛋白(最主要的是胶原蛋白II)。软骨中的主要蛋白聚糖是聚蛋白聚糖(Aggrecan)。尽管疾病的起始可以是多因素的，但软骨破坏似乎是不受控制的蛋白水解细胞外基质(ECM)破坏的结果。
如上所述，软骨细胞外基质的主要组分是聚蛋白聚糖(Kiani等人,2002CellResearch 12:19-32)。该分子在关节软骨的正常运作中很重要，因为它提供了水合的凝胶结构，赋予了软骨以承重特性。聚蛋白聚糖是由软骨细胞表达的大的多模块分子(2317个氨基酸)。它的核心蛋白由三个球状结构域(G1、G2和G3)和一个位于G2和G3之间用于糖胺聚糖链附着的大延伸区域组成。该延伸区域包含两个结构域，一个结构域被硫酸角质素链取代(KS结构域)并且一个结构域被硫酸软骨素链取代(CS结构域)。CS结构域具有附着到其上的100-150个糖胺聚糖(GAG)链。聚蛋白聚糖与透明质酸形成大复合物，其中50-100个聚蛋白聚糖分子通过G1结构域和Link Protein与一个透明质酸分子相互作用。摄入水后(由于GAG含量)，这些复合物形成抗压缩的可逆变形凝胶。关节软骨的结构、液体滞留和功能与聚蛋白聚糖的基质含量以及与完整核心蛋白结合的硫酸软骨素的量有关。
II型胶原蛋白(胶原蛋白II，胶原II)占关节软骨的多至50％。胶原蛋白原纤维形成网络使得软骨捕获蛋白聚糖并为组织提供强度。胶原蛋白是一种结构蛋白，由三个平行的左手多脯氨酸II型(PPII)螺旋的右手束组成。由于PPII螺旋在三螺旋中的紧密堆积，所以每第三个残基都是氨基酸Gly(甘氨酸)。因为甘氨酸是没有侧链的最小氨基酸，所以它在纤维结构蛋白中起着独特的作用。在胶原蛋白中，每第三个位置都需要Gly，因为三螺旋的组装将该残基置于螺旋的内部(轴)，在那里没有空间可以给比甘氨酸的单个氢原子更大的侧基。
OA的特征在于1)聚蛋白聚糖的降解，逐渐释放结构域G3和G2(导致软骨“放气”)并最终释放G1结构域和2)胶原蛋白的降解，从而不可逆地破坏软骨结构。
有令人信服的证据表明基质金属蛋白酶(MMP)在与OA相关的组织破坏中起主要作用。MMP是锌依赖性内肽酶的一个家族，参与细胞外基质的降解和组织重塑。MMP家族成员约有28个，可分为多个亚组，包括胶原蛋白酶、明胶酶、基质溶解素(stromelysin)、膜类型MMP，基质分解素(matrilysin)、釉质溶解素(enamelysin)等。包含MMP1、MMP8、MMP13和MMP18的胶原蛋白酶能够将三螺旋原纤维胶原蛋白降解为独特的3/4和1/4片段。此外，MMP14也被证明可以裂解纤维状胶原蛋白，并且有证据表明MMP2也能够进行胶原蛋白溶解。长期以来，MMP被认为是治疗OA的有吸引力的治疗靶标。但是，由于称为肌肉骨骼综合征(MSS)的疼痛、关节僵硬的副作用，用于治疗关节炎开发的广谱MMP抑制剂在临床试验中失败了。据信MSS是由多种MMP的非选择性抑制引起的。
Nam等人(2017Proc Natl Acad Sci USA113:14970–14975)描述了纳米抗体，其明显特异性地针对MMP14的活性位点。
难以将药剂靶向关节软骨也阻碍了OA的治疗干预。由于关节软骨是无血管和无淋巴组织，因此传统的药剂递送途径(口服、静脉内、肌肉内)最终取决于通过被动扩散将药剂从滑膜毛细血管向软骨的透滑膜转移。因此，在缺乏将药剂选择性地靶向软骨的机制的情况下，需要将身体全身性地暴露于高药剂浓度以实现持续的关节内治疗剂量。由于高全身暴露，大多数传统的OA疗法都受到严重毒性的困扰。
另外，即使当关节内施用时，大多数新开发的DMOAD在关节中具有短的停留时间(Edwards 2011Vet.J.190：15-21；Larsen等人，2008J Pham Sci 97：4622-4654)。关节内(IA)递送治疗性蛋白质受到其从关节间隙的快速清除和软骨内缺乏滞留的限制。药剂在关节中的滑膜停留时间通常少于24h。由于大多数IA注射药剂的快速清除，需要频繁注射以维持有效浓度(Owen等人,1994Br.J.Clin Pharmacol.38:349-355)。然而，由于疼痛和不适，不希望经常注射IA，它们可能引起挑战性的患者依从性，以及引入关节感染的风险。
仍然需要有效的DMOAD。
3发明概述
本发明的目的是提供与现有技术的氨基酸序列和抗体相比，除其他有利特性(例如，改进的易制备性、良好的稳定性和/或降低的商品成本)之外，具有改善的预防、治疗和/或药理学特性的抗OA的多肽。特别地，本发明旨在提供用于抑制MMP，尤其是抑制MMP13的免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)和包含其的多肽。
发明人假设抑制MMP13的酶促活性的最佳区域将产生针对催化口袋的ISVD。但是，证明这是一个重大挑战。特别地，MMP13以无活性的原形式(proMMP13)的形式分泌，其中原结构域掩盖了催化口袋，因此该口袋无法进入以产生免疫应答。另一方面，活化的MMP13的半衰期短，这主要是由于自身蛋白水解所致。此外，即使在发明人克服了之前的两个问题之后，证明，各种物种之间的催化结构域的高序列保守性也放弃(forego)了强有力的免疫应答。
最后，发明人能够通过新工具的原始开发和非常规的筛选方法来应对这些挑战。
从不同的筛选活动中分离出ISVD，并对其进一步工程改造，使其具有多种有利的特征，包括稳定性、亲和力和抑制性活性。结合MMP13的本发明的单价ISVD的性能优于竞品药剂。包含在抑制MMP13的活性方面欠佳的ISVD的双互补位多肽更为有效。
因此，本发明涉及多肽，其包含结合基质金属蛋白酶(MMP)并且优选地结合基质金属蛋白酶MMP13的至少一个免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)。本发明还包括多肽，其包含两个或更多个各自独立地特异性结合MMP13的ISVD，其中
a)至少“第一”ISVD特异性结合MMP13的第一抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象；和其中
b)至少“第二”ISVD特异性结合MMP13的第二抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象，分别不同于第一抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象。
还提供了本发明的多肽，其包含结合基质金属蛋白酶(MMP)的单可变结构域(ISVD)和结合软骨蛋白聚糖和优选地聚蛋白聚糖的另外的单可变结构域(ISVD)。
另一方面涉及根据本发明的多肽，用作药物。另一个方面涉及治疗预防个体中疾病或病症的方法，例如其中涉及MMP13活性，该方法包括以有效治疗或预防所述疾病或病症的症状的量向所述个体施用根据本发明的多肽。
根据本文的进一步公开，多肽和组合物的其他方面、优点、应用和用途将变得清楚。在本说明书的文本中引用了一些文件。无论是上文还是下文，本文引用的每个文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、说明书等)均通过引用将其全部并入本文。本文中的任何内容均不得解释为承认本发明无权凭借在先发明而早于这样的公开。
4附图说明
图1：荧光胶原蛋白测定法中特征1纳米抗体(左图)和特征2纳米抗体(右图)的剂量应答曲线。
图2：MMP13先导纳米抗体的选择性。
图3：用0.6nM生物素化的40E09针对一组特征1和特征2纳米抗体在人全长MMP13上的竞争ELISA(通过小鼠抗人MMP13 mAb(R&D Systems#MAB511)包被)。通过与APMA在37℃孵育90分钟来活化MMP13。
图4：在大鼠MMT模型中，纳米抗体抑制软骨降解。
5详细说明
仍然需要安全有效的OA药物。这些药物应符合多种且经常对立的需求，尤其是在打算采用广泛适用的格式时。这样，格式应当优选地在广泛的患者中有用。格式应当优选地是安全的，并且不会因频繁IA施用而引起感染。另外，格式应当优选地是患者友好的，例如，格式应当在关节中具有延长的半衰期，使得在施用后不立即除去格式。然而，延长半衰期应当优选地不引入脱靶活性和副作用或限制功效。
本发明实现了这些需求中的至少一项。
基于非常规的筛选、表征和组合策略，本发明人令人惊讶地观察到免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)在体外和体内实验中表现异常优异。
此外，本发明人能够对ISVD进行重新工程改造以优于竞品药剂。在双互补位模式中，这种表现不仅得以保留，甚至得到了改善。
另一方面，还证明了本发明的ISVD比竞品分子明显更有效。
本发明提供了拮抗MMP特别是MMP13的多肽，其与竞品分子相比具有改善的预防、治疗和/或药理学特性，包括更安全的特征。
因此，本发明涉及针对和/或可以特异性结合(如本文所定义的)MMP并调控其活性的ISVD和多肽，优选地，所述MMP选自MMP13(胶原蛋白酶)、MMP8(胶原蛋白酶)、MMP1(胶原蛋白酶)、MMP19(基质金属蛋白酶RASI)和MMP20(釉质溶解素)，优选地，所述MMP是MMP13，所述多肽特别是包含特异性结合MMP13的至少一个免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)的多肽，其中结合MMP13调控MMP13的活性。
定义
除非另有说明或定义，否则所使用的所有术语具有其在本领域中的通常含义，这对本领域技术人员将是清楚的。参考例如标准手册，例如Sambrook等人(MolecularCloning:ALaboratory Manual(2nd Ed.)Vols.1-3,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)，F.Ausubel等人(Current protocols in molecular biology,GreenPublishing and Wiley Interscience,New York,1987)，Lewin(Genes II,John Wiley&Sons,New York,N.Y.,1985)，Old等人(Principles of Gene Manipulation:AnIntroduction to Genetic Engineering(2nd edition)University of CaliforniaPress,Berkeley,CA,1981)；Roitt等人(Immunology(6th Ed.)Mosby/Elsevier,Edinburgh,2001)，Roitt等人(Roitt’s Essential Immunology(10th Ed.)Blackwell Publishing,UK,2001)，和Janeway等人(Immunobiology(6th Ed.)Garland Science Publishing/ChurchillLivingstone,New York,2005)，以及本文引用的一般背景技术。
除非另外指出，可以以本身已知的方式执行并且已经执行未具体描述的所有方法、步骤、技术和操作，对本领域技术人员将是清楚的。再次参考例如本文提到的标准手册和一般背景技术，以及其中引用的其他参考文献。以及例如以下综述Presta(Adv.DrugDeliv.Rev.58(5-6):640-56,2006)，Levin和Weiss(Mol.Biosyst.2(1):49-57,2006)，Irving等人(J.Immunol.Methods 248(1-2):31-45,2001)，Schmitz等人(Placenta21Suppl.A:S106-12,2000)，Gonzales等人(Tumour Biol.26(1):31-43,2005)，其描述了用于蛋白质工程改造的技术，例如亲和力成熟和用于改善蛋白质例如免疫球蛋白的特异性和其他所需特性的其他技术。
必须注意的是，除非上下文另外明确指出，否则本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数形式。因此，例如，对“反应剂”的提及包括一个或多个这样的不同反应剂，并且对“该方法”的提及包括对本领域普通技术人员已知的可以修改或替代本文所述方法的等价步骤和方法的提及。
除非另有说明，否则一系列元件之前的术语“至少”应理解为是指该系列中的每个元件。仅通过常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文所述的本发明的特定实施方案的许多等价形式。这样的等价形式旨在涵盖在本发明中。
术语“和/或”在本文中无论在何处使用均包括“和”、“或”和“由所述术语连接的元件的所有或任何其他组合”的含义。
本文所用的术语“约”或“大约”是指给定值或范围的20％以内，优选地15％以内，更优选地10％以内，并且最优选地5％以内。
在整个说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”以及诸如“包含”和“含有”之类的变体将被理解为暗示包括所述整数或步骤或者整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤的组。当在本文中使用时，术语“包括”可以用术语“包含”或“含有”代替，或者有时在本文中使用用术语“具有”代替。
如本文所用，术语“序列”(例如，诸如“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“可变结构域序列”、“VHH序列”或“蛋白质序列”之类的术语)通常应理解为包括相关的氨基酸序列以及编码该氨基酸序列的核酸或核苷酸序列，除非上下文要求更严格的解释，
根据上下文，氨基酸序列被解释为表示单个氨基酸或者两个或更多个氨基酸的无支链序列。核苷酸序列被解释为表示3个或更多个核苷酸的无支链序列。
氨基酸是天然存在的蛋白质中常见的那些L-氨基酸。氨基酸残基将根据标准的三个字母或一个字母的氨基酸代码表示。参考例如WO 08/020079的第48页上的表A-2。那些包含D-氨基酸的氨基酸序列不旨在被该定义所涵盖。包含翻译后修饰的氨基酸的任何氨基酸序列都可以描述为使用该表A-2中所示的符号最初翻译的带有修饰位置的氨基酸序列，修饰位置例如羟基化或糖基化，但是这些修饰不应在氨基酸序列中明确显示。可以被表示为序列修饰的键、交联和末端帽、非肽基键等的任何肽或蛋白质都被该定义所涵盖。
术语“蛋白质”、“肽”、“蛋白质/肽”和“多肽”在整个本公开内容中可互换使用，并且各自对于本公开内容具有相同的含义。每个术语是指由两个或更多个氨基酸的线性链组成的有机化合物。化合物可以具有十个或更多个氨基酸；二十五个或更多个氨基酸；五十个或更多个氨基酸；一百个或更多个氨基酸，两百个更多个氨基酸，并且甚至三百个或更多个氨基酸。技术人员将理解，尽管不存在区分多肽和蛋白质的氨基酸数目的本领域公认的临界点，但是多肽通常包含的氨基酸少于蛋白质；多肽可以通过化学合成或重组方法制备；并且蛋白质通常通过本领域已知的重组方法在体外或体内制备。按照惯例，多肽一级结构中的酰胺键的顺序按照所写氨基酸的顺序，其中多肽的胺末端(N末端)始终在左侧，而酸末端(C末端)在右侧。
核酸或氨基酸序列被认为是“(以)(基本上)分离的(形式)”-例如，与从中获得了该核酸或氨基酸序列的反应介质或培养基相比-当其已经与通常在所述来源和介质中与之附着的至少一种其他组分分离，其他组分例如另一种核酸、另一种蛋白质/多肽、另一种生物组分或大分子或至少一种污染物、杂质或次要组分。特别地，当核酸或氨基酸序列已经纯化了至少2倍，特别是至少10倍，更特别是至少100倍，并且最高达1000倍或更多时，则认为是“(基本上)分离的”。如使用合适的技术，例如合适的色谱技术，例如聚丙烯酰胺-凝胶电泳所确定的，“(基本上)分离的形式”的核酸或氨基酸优选地是基本上均质的。
当说核苷酸序列或氨基酸序列分别“包含”另一个核苷酸序列或氨基酸序列，或“基本上由”另一个核苷酸序列或氨基酸序列“组成”时，这可以表示后一个核苷酸序列或氨基酸序列已分别并入第一个提及的核苷酸序列或氨基酸序列，但是更通常，这通常是指第一个提及的核苷酸序列或氨基酸序列在其序列内分别包含一段核苷酸或氨基酸残基，其具有与后一个序列分别具有相同的核苷酸序列或氨基酸序列，而与实际上如何产生或获得第一个提及的序列无关(例如，可以通过本文所述的任何合适的方法)。通过非限制性实例，当说本发明的多肽包含免疫球蛋白单可变结构域(“ISVD”)时，这可能意味着所述免疫球蛋白单可变结构域序列已被并入本发明多肽的序列中，但是更通常地，这通常意味着本发明的多肽在其序列内包含免疫球蛋白单可变结构域的序列，而与如何产生或获得所述本发明的多肽无关。同样，当说核酸或核苷酸序列包含另一个核苷酸序列时，第一个提及的核酸或核苷酸序列优选地是这样的，使得当其被表达成表达产物(例如多肽)时，由后一个核苷酸序列编码的氨基酸序列形成所述表达产物的一部分(换句话说，后一个核苷酸序列与第一个提及的更大的核酸或核苷酸序列处于同一阅读框中)。同样，当说本发明的构建体包含多肽或ISVD时，这可能意味着所述构建体至少分别包含所述多肽或ISVD，但是更通常地，这意味着所述构建体包含除所述多肽或ISVD之外的基团、残基(例如氨基酸残基)、部分和/或结合单元，无论所述多肽或ISVD如何与所述基团、残基(例如氨基酸残基)、部分和/或结合单元连接，并且与所述构建体的结构如何产生或获得无关。
“基本上由...组成”是指本发明的方法中使用的免疫球蛋白单可变结构域与本发明的免疫球蛋白单可变结构域完全相同，或者对应于本发明的免疫球蛋白单可变结构域，其具有添加在免疫球蛋白单可变结构域的氨基末端、羧基末端或氨基末端和羧基末端两者的有限数目的氨基酸残基，例如1-20个氨基酸，例如1-10个氨基酸残基，和优选地1-6个氨基酸残基，例如1、2、3、4、5或6个氨基酸残基。
为了比较两个或更多个核苷酸序列，可以通过将[第一核苷酸序列中与在第二核苷酸序列中相应位置处的核苷酸相同的核苷酸数目]除以[第一核苷酸序列中核苷酸的总数]并乘以[100％]来计算第一核苷酸序列和第二核苷酸序列之间的“序列同一性”百分比，其中与第一核苷酸序列相比，第二核苷酸序列中核苷酸的每个缺失、插入、取代或添加被认为是单个核苷酸(位置)上的差异。备选地，使用用于序列比对的已知计算机算法，例如NCBIBlast v2.0，使用标准设置，来计算两个或更多个核苷酸序列之间的序列同一性程度。用于确定序列同一性程度的一些其他技术、计算机算法和设置例如在WO 04/037999、EP0967284、EP 1085089、WO 00/55318、WO 00/78972、WO 98/49185和GB 2357768中进行了描述。通常为了根据上文概述的计算方法确定两个核苷酸序列之间的“序列同一性”的百分比，将具有最大核苷酸数的核苷酸序列作为“第一”核苷酸序列，并将另一个核苷酸作为该序列作为“第二”核苷酸序列。
为了比较两个或更多个氨基酸序列，可以通过将[第一氨基酸序列中与在第二氨基酸序列中相应位置处的氨基酸相同的氨基酸残基数目]除以[第一氨基酸序列中氨基酸残基的总数]并乘以[100％]来计算第一氨基酸序列和第二氨基酸序列之间的“序列同一性”(在本文中也称为“氨基酸同一性”)百分比，其中与第一氨基酸序列相比，第二氨基酸序列中氨基酸残基的每个缺失、插入、取代或添加均被认为是单个氨基酸残基(位置)的差异，即如本文所定义的“氨基酸差异”。备选地，使用已知的计算机算法例如上述用于确定核苷酸序列的序列同一性程度的算法，再次使用标准设置，来计算两个氨基酸序列之间的序列同一性程度。通常，为了根据上文概述的计算方法确定两个氨基酸序列之间的“序列同一性”的百分比，将具有最大氨基酸残基数量的氨基酸序列作为“第一”氨基酸序列，并且将另一个氨基酸序列作为“第二”氨基酸序列。
同样，在确定两个氨基酸序列之间的序列同一性程度时，技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，其通常可以描述为这样的氨基酸取代，其中氨基酸残基被替换为具有相似化学结构的另一个氨基酸残基并且其对多肽的功能、活性或其他生物学特性影响很小或基本没有影响。这样的保守氨基酸取代在本领域中是众所周知的，例如WO 04/037999、GB 335768、WO 98/49185、WO 00/46383和WO 01/09300；并且可以基于来自WO 04/037999和WO 98/49185以及来自从其中引用的其他参考文献的相关教导来选择这种取代的(优选)类型和/或组合。
这样的保守取代优选地是其中以下组(a)-(e)中的一个氨基酸被相同组中的另一个氨基酸残基取代：(a)小的脂肪、非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；(b)极性带负电荷的残基及其(不带电荷的)酰胺：Asp、Asn、Glu和Gln；(c)极性带正电荷的残基：His、Arg和Lys；(d)大的脂族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val和Cys；和(e)芳族残基：Phe、Tyr和Trp。特别优选的保守取代如下：Ala取代为Gly或取代为Ser；Arg取代为Lys；Asn取代为Gln或取代为His；Asp取代为Glu；Cys取代为Ser；Gln取代为Asn；Glu取代为Asp；Gly取代为Ala或取代为Pro；His取代为Asn或取代为Gln；Ile取代为Leu或取代为Val；Leu取代为Ile或取代为Val；Lys取代为Arg、取代为Gln或取代为Glu；Met取代为Leu、取代为Tyr或取代为Ile；Phe取代为Met、取代为Leu或取代为Tyr；Ser取代为Thr；Thr取代为Ser；Trp取代为Tyr；Tyr取代为Trp；和/或Phe取代为Val，取代为Ile或取代为Leu。
应用于本文所述多肽的任何氨基酸取代也可以基于由Schulz等人(“Principlesof Protein Structure”,Springer-Verlag,1978)开发的不同物种的同源蛋白质之间氨基酸变异的频率的分析，基于由Chou和Fasman(Biochemistry13:211,1974；Adv.Enzymol.,47:45-149,1978)开发的结构形成潜能的分析，以及基于Eisenberg等人(Proc.Natl.AcadSci.USA81:140-144,1984)、Kyte和Doolittle(J.Molec.Biol.157:105-132,1981)和Goldman等人(Ann.Rev.Biophys.Chem.15:321-353,1986)开发的蛋白质中疏水性模式的分析，全部通过引用将其全部并入本文。关于纳米抗体的一级、二级和三级结构的信息在本文的描述和以上引用的一般背景技术中给出。同样，出于该目的，来自美洲驼的VHH结构域的晶体结构例如由Desmyter等人(Nature Structural Biology,3:803,1996)、Spinelli等人(Natural Structural Biology,3:752-757,1996)和Decanniere等人(Structure,7(4):361,1999)给出。关于在常规VH结构域中形成VH/VL界面的一些氨基酸残基以及这些位置上潜在的骆驼化取代的进一步信息可以在上面引用的现有技术中找到。
如果氨基酸序列和核酸序列在其整个长度上具有100％的序列同一性(如本文所定义)，则称它们“完全相同”。
当比较两个氨基酸序列时，术语“氨基酸差异”是指与第二序列相比，在第一序列的位置上的单个氨基酸残基的插入、缺失或取代；应当理解，两个氨基酸序列可以包含一个、两个或更多个这样的氨基酸差异。更具体地，在本发明的ISVD和/或多肽中，术语“氨基酸差异”是指分别与a)、c)或e)的CDR序列相比，b)、d)或f)中指定的CDR序列的位置上的单个氨基酸残基的插入、缺失或取代；应当理解，分别与a)、c)或e)的CDR序列相比，b)、d)和f)的CDR序列可包含1、2、3、4或最大5个这样的氨基酸差异。
“氨基酸差异”可以是改善本发明的MMP13结合物例如本发明的多肽的特性，或者至少不会减损本发明的MMP13结合物例如本发明的多肽的所需特性或者所需特性的平衡或组合的任何1、2、3、4或最大5个取代、缺失或插入，或其任意组合。在这方面，与包含一个或多个CDR序列而不具有1、2、3、4或最大5个取代、缺失或插入的多肽相比，本发明的所得MMP13结合物，例如本发明的多肽应至少以相同、大约相同或更高的亲和力结合MMP13。亲和力可以通过本领域已知的任何合适的方法来测量，但是优选地通过实施例部分中描述的方法来测量。
在这方面，根据b)、d)和/或f)的CDR的氨基酸序列可以是分别衍生自根据a)、c)和/或e)的氨基酸序列的氨基酸序列，通过亲和力成熟使用一种或多种本身已知或如实施例中所述的亲和力成熟技术。例如，并且取决于用于表达本发明多肽的宿主生物，可以以将一种或多种用于翻译后修饰的位点(例如一个或多个糖基化位点)除去的方式设计这样的缺失和/或取代，这在本领域技术人员的能力范围内(参阅实施例)。
如本文所用，在任何SEQ ID NO的上下文中“由…表示”等同于“包含或由所述SEQID NO组成”并且优选地等同于“由所述SEQ ID NO组成”。
本说明书中使用的“纳米抗体家族”、“VHH家族”或“家族”是指一组具有相同长度(即，其序列中具有相同数目的氨基酸)的纳米抗体和/或VHH序列，并且其中位置8和位置106之间的氨基酸序列(根据Kabat编号)具有89％或更高的氨基酸序列同一性。
可以互换使用的术语“表位”和“抗原决定簇”是指大分子例如多肽或蛋白质的一部分，其被抗原结合分子例如本发明的免疫球蛋白、常规抗体、免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽识别，并且更特别地被所述分子的抗原结合位点识别。表位定义了免疫球蛋白的最小结合位点，并因此代表了免疫球蛋白的特异性的靶标。
识别表位的抗原结合分子(例如本发明的免疫球蛋白、常规抗体、免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽)的一部分被称为“互补位”。
可以“结合”或“特异性结合”某些表位、抗原或蛋白质(或其至少一部分、片段或表位)，对其具有“亲和力”和/或“具有特异性”的氨基酸序列(例如本发明的免疫球蛋白单可变结构域、抗体、多肽或通常地其抗原结合蛋白或多肽或片段)被称为“对”或“针对”所述表位、抗原或蛋白质蛋白质或者是关于这样的表位、抗原或蛋白质的“结合”分子，或者被称为“抗”表位、“抗”抗原或“抗”蛋白质(例如“抗”-MMP13)。
亲和力表示分子相互作用的强度或稳定性。亲和力通常以KD或解离常数给出，其单位是mol/L(或M)。亲和力也可以表示为缔合常数KA，其等于1/KD并具有(mol/升)-1(或M-1)的单位。在本说明书中，两个分子之间相互作用的稳定性将主要根据其相互作用的KD值来表示；对于技术人员显而易见的是，鉴于关系KA＝1/KD，通过其KD值指定分子相互作用的强度，也可以用于计算相应的KA值。KD值在热力学意义上也表征了分子相互作用的强度，因为它通过众所周知的关系ΔG＝RTln(KD)(等效地ΔG＝-RTln(KA))与结合的自由能(ΔG)的变化有关，其中R等于气体常数，T等于绝对温度并且ln表示自然对数。
被认为有意义的(例如特异性的)生物学相互作用的KD通常在10-12M(0.001nM)至10-5M(10000nM)的范围内。相互作用越强，其KD越低。
KD还可以表示为复合物的解离速率常数(表示为koff)与其缔合速率(表示为kon)的比率(因此KD＝koff/kon和KA＝kon/koff)。解离速率koff的单位是s-1(其中s为秒的SI单位表示法)。缔合速率Kon的单位为M-1s-1。缔合速率可在102M-1s-1至约107M-1s-1之间变化，接近双分子相互作用的扩散受限缔合速率常数。离解速率与给定分子相互作用的半衰期有关，关系为t1/2＝ln(2)/koff。解离速率可以在10-6s-1(接近不可逆复合物，t1/2为数天)至1s-1(t1/2＝0.69s)之间变化。
抗原结合蛋白(例如ISVD)与抗原或抗原决定簇的特异性结合可以通过本身已知的任何合适方式来确定，包括例如饱和结合测定法和/或竞争性结合测定法，例如放射性免疫测定法(RIA)、酶免疫测定法(EIA)和夹心竞争测定法，以及它们本身在本领域中已知的不同变体；以及本文提及的其他技术。
可以通过本身已知的不同技术来测量两个分子之间的分子相互作用的亲和力，例如众所周知的表面等离振子共振(SPR)生物传感器技术(参见例如Ober等人，2001，Intern.Immunology 13:1551-1559)，其中一个分子固定化在生物传感器芯片上，另一个分子在流动条件下通过固定化的分子，产生kon、koff测量值并从而得出KD(或KA)值。这可以例如使用众所周知的
Figure BDA0002377824260000131
仪器(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala,Sweden)来执行。Kinetic Exclusion Assay
Figure BDA0002377824260000132
(Drake等人,2004,AnalyticalBiochemistry 328:35-43)在不标记结合配偶体的情况下测量溶液中的结合事件，并且基于动力学排除复合物的解离。溶液中(in-solution)亲和力分析也可以使用
Figure BDA0002377824260000133
免疫测定系统执行，该系统提供了自动化生物分析和快速样品周转的平台(Fraley等人，2013，Bioanalysis 5:1765-74)。
对于本领域技术人员而言还将清楚的是，如果测量过程例如通过与一个分子的生物传感器上的涂层有关的假象在某种程度上影响隐含分子的固有结合亲和力，则所测量的KD可以对应于表观KD。同样，如果一个分子包含用于另一个分子的一个以上识别位点，则可以测量表观KD。在这种情况下，两个分子相互作用的亲合力(avidity)可能影响所测得的亲和力。特别是，KD的准确测量可能会非常费力，并因此，通常会确定明显的KD值来评估两个分子的结合强度。应当指出的是，只要所有测量均以一致的方式进行(例如，保持测定法条件不变)，表观KD测量就可以用作真实KD的近似值，并因此在本文档中，以相等的重要性或相关性对待KD和表观KD。
术语“特异性”是指特定抗原结合分子或抗原结合蛋白(例如本发明的ISVD或多肽)分子可以结合的不同类型的抗原或抗原决定簇的数目，例如在WO 08/020079的第53-65页段落n)中所描述。可以基于亲和力(affinity)和/或亲合力(avidity)来确定抗原结合蛋白的特异性，如WO 08/020079的第53-56页所述(通过引用并入本文)，该文献也描述了用于测量抗原结合分子(例如本发明的多肽或ISVD)和相关抗原之间的结合的一些优选技术。通常，抗原结合蛋白(例如本发明的ISVD和/或多肽)将以10-5至10-12摩尔/升或更低，和优选地10-7至10-12摩尔/升或更低和更优选地10-8至10-12摩尔/升的解离常数(KD)(即缔合常数(KA)是105至1012升/摩尔或更高，和优选地107至1012升/摩尔或更高，和更优选地108至1012升/摩尔)结合其抗原。通常认为任何大于10-4mol/升的KD值(或任何小于104升/mol的KA值)都表示非特异性结合。优选地，本发明的单价ISVD将以小于500nM，优选地小于200nM，更优选地小于10nM，例如小于500pM，例如10至5pM或更低的亲和力结合所需抗原。
当免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽与第一抗原结合的亲和力(如上所述，并且适当地表示为KD值、KA值、Koff速率和/或Kon速率)是免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽结合第二靶标或抗原的亲和力的至少10倍，例如至少100倍，和优选地至少1000倍或更好时，则称它与另一个(第二)靶标或抗原相比对(第一)靶标或抗原是“特异性的”。例如，免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽可以以比所述免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽结合第二靶标或抗原的KD低至少10倍，例如低至少100倍，和优选地低至少1000倍或甚至更低的KD值结合第一靶标或抗原。优选地，当免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽与第二靶标或抗原相比对第一靶标或抗原是“特异性的”时，其针对(如本文所定义)所述第一靶标或抗原，而不针对所述第二靶标或抗原。
抗原结合蛋白与抗原或抗原决定簇的特异性结合可以通过本身已知的任何合适方式来确定，包括例如饱和结合测定法、Scatchard分析和/或竞争性结合测定法，例如放射免疫测定法(RIA)，酶免疫测定法(EIA)和夹心竞争测定法及其本领域已知的不同变体；以及本文提及的其他技术。如本领域技术人员将清楚的并且如在WO 08/020079的第53-56页所描述的，解离常数可以是实际或表观解离常数。确定解离常数的方法对技术人员是清楚的，并且例如包括WO 08/020079的第53-56页提到的技术。
可用于评估亲和力的另一个优选方法是Friguet等人1985(J.Immunol.Methods77:305-19)的2步ELISA(酶联免疫吸附测定法)程序。该方法建立了溶液相结合平衡测量，并避免了与分子之一在例如塑料的支持物上吸附有关的可能的假象。如本领域技术人员将清楚的并且例如在WO 08/020079的第53-56页所描述的，解离常数可以是实际或表观解离常数。确定解离常数的方法对技术人员是清楚的，并且例如包括WO 08/020079的第53-56页提到的技术。
在一方面，本发明涉及MMP13结合物，例如本发明的ISVD和多肽，其中所述MMP13结合物不结合MMP1或MMP14(膜类型)。
最后，应注意，在许多情况下，有经验的科学家可以断定，确定相对于某些参考分子的结合亲和力很方便。例如，为了评估分子A和B之间的结合强度，可以例如使用已知结合B并适当标记有荧光团或发色团或其他化学部分(例如生物素)的参考分子C，以便在ELISA或FACS(荧光激活细胞分选)或其他格式中容易检测(荧光团用于荧光检测，生色团用于光吸收检测，生物素用于链霉亲和素介导的ELISA检测)。通常，参考分子C保持固定的浓度，并且A的浓度随B的给定浓度或量而变化。结果，获得的IC50值对应于A的浓度，在该浓度对于在缺失A的情况对C测得的信号减半。如果已知KD ref，即参考分子的KD，以及参考分子的总浓度cref，则可以从以下公式获得相互作用A-B的表观KD：KD＝IC50/(1+cref/KDref)。注意，如果cref<<KD ref，则KD≈IC50。如果对被比较的结合物以一致的方式(例如，保持cref固定)执行IC50的测量，则可以通过比较IC50来评估分子相互作用的强度或稳定性的差异，并且在本文中将该测量判断为等同于KD或表观KD。
半数最大抑制浓度(IC 50)也可以是对化合物抑制生物学或生化功能(例如，药理作用)的有效性的量度。该定量量度表明抑制给定的生物学过程(或过程的组分，即酶、细胞、细胞受体、趋化性、再生障碍、转移、侵袭性等)的一半需要多少多肽或ISVD(例如纳米抗体)。换句话说，它是物质的半最大(50％)抑制浓度(IC)(50％IC或IC50)。通过确定抑制激动剂最大生物学反应一半所需的浓度，可以计算给定拮抗剂如本发明的多肽或ISVD(例如纳米抗体)的IC50值。可以通过构建剂量-应答曲线并检查不同浓度的拮抗剂(例如本发明的多肽或ISVD(例如，纳米抗体))对逆转激动剂活性的作用来确定药剂的KD。
术语半最大有效浓度(EC50)是指在指定的暴露时间后，诱导在基线和最大值之间一半的应答的化合物的浓度。在本文中，它用作对多肽或ISVD(例如纳米抗体)效力的量度。分级的剂量应答曲线的EC50代表化合物的浓度，在该浓度观察到其最大作用的50％。浓度优选地以摩尔单位表示。
在生物系统中，配体浓度的小变化通常导致遵循s函数(sigmoidalfunction)的应答的快速变化。随着配体浓度增加，应答增加开始减慢的拐点是EC50。这可以通过推导最佳拟合线来在数学上确定。在大多数情况下，依靠图进行估计很方便。如果在实施例部分中提供了EC50，则将实验设计为尽可能准确地反映KD。换句话说，EC50值然后可以被认为是KD值。术语“平均KD”涉及在至少1个，但优选地大于1个，例如至少2个实验中获得的平均KD值。术语“平均”是指数学术语“平均”(数据总和除以数据中项目的数量)。
它还与IC50有关，IC50是对化合物其抑制(50％抑制)的量度。对于竞争结合测定法和功能性拮抗剂测定法，IC50是剂量-应答曲线的最常见的综合量度。对于激动剂/刺激物测定法，最常见的综合测量是EC50。
抑制常数(Ki)是对于抑制剂的效力的指示；它是产生半最大抑制所需的浓度。与可以根据实验条件潜在地改变的IC50不同(但参见上文)，Ki是绝对值并通常被称为药物的抑制常数。抑制常数Ki可以通过使用Cheng-Prusoff方程来计算：
Figure BDA0002377824260000161
其中[L]是配体的固定浓度。
如本文所用，术语本发明的多肽的“效力”是其特定的作用发生所需的本发明的多肽的量的函数。将其简单测量为该多肽的IC50的倒数。它是指所述本发明的多肽调控和/或部分地或完全地抑制MMP13的活性的能力。更特别地，它可以指所述多肽减少或甚至完全抑制本文定义的MMP13活性的能力。这样，它可以指所述多肽抑制蛋白水解的能力，所述蛋白水解例如蛋白酶活性内肽酶活性，和/或结合底物的能力，底物例如聚蛋白聚糖、胶原蛋白II、胶原蛋白I、胶原蛋白III、胶原蛋白IV、胶原蛋白IX、胶原蛋白X、胶原蛋白XIV和明胶。可以通过本领域已知或本文描述的任何合适的测定法来测量效力。
本发明的多肽的“功效(efficacy)”是测量在饱和多肽浓度，作用本身的最大强度。功效指示可从本发明的多肽可获得的最大应答。它是指多肽产生所需(治疗)作用的能力。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽结合MMP13，其KD是1E-07M至1E-13M之间，例如1E-08M至1E-12M，优选地最多1E-07M，优选地低于1E-08M或1E-09M，或甚至低于1E-10M，例如5E-11M，4E-11M，3E-11M，2E-11M，1.7E-11M，1E-11M或甚至5E-12M，4E-12M，3E-12M，1E- 12M，例如通过KinExA确定的。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽抑制MMP13的活性，其IC50是1E-07M至1E-12M，例如1E-08M至1E-11M，例如通过竞争ELISA、竞争TIMP-2ELISA、荧光肽测定法、荧光胶原蛋白测定法或胶原溶解测定法确定的，例如在实施例部分中详细描述的。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽抑制MMP13的活性，其IC50最多是1E-07M，优选地1E-08M，5E-09M，或4E-9M，3E-9M，2E-9M，例如1E-9M。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽结合MMP13，其EC50是1E- 07M至1E-12M，例如1E-08M至1E-11M，例如通过竞争ELISA、竞争TIMP-2ELISA、荧光肽测定法、荧光胶原蛋白测定法或胶原溶解测定法确定的。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽结合MMP13，其解离速率小于5E-04s-1，例如通过SPR确定的。
如果氨基酸序列(例如ISVD或多肽)对两种不同的抗原或抗原决定簇(例如来自不同哺乳动物物种的MMP13，例如人MMP13、狗MMP13、牛MMP13、大鼠MMP13、猪MMP13、小鼠MMP13、兔MMP13、食蟹猴MMP13和/或恒河猴MMP13)具有特异性(如本文所定义)，则称氨基酸序列(例如ISVD或多肽)对这两种不同的抗原或抗原决定簇是“交叉反应性的”。应当理解，尽管对于两种不同抗原的结合亲和力可以不同，例如相差倍数2、5、10、50、100或甚至更多，只要对这些不同的抗原或抗原决定簇具有特异性(如本文所定义)，则ISVD或多肽可以被认为是交叉反应性的。
MMP13也称为CLG3或胶原蛋白酶3、MANDP1、MMP-13、基质金属肽酶13或MDST。
MMP13的相关结构信息可以在例如下表1(参阅表B)中所示的UniProt登录号处找到。
表1
Figure BDA0002377824260000171
Figure BDA0002377824260000181
“人MMP13”是指包含SEQ ID NO：115的氨基酸序列的MMP13。在一方面，本发明的多肽特异性结合来自人、小家鼠、狼、牛、恒河猴、褐家鼠、原鸡和/或黑猩猩的MMP13，优选地人MMP13，优选地SEQ ID NO：115。
术语“(交叉)阻断”，“(交叉)阻断的”，“(交叉)阻断性”，“竞争性结合”，“(交叉)竞争”，“(交叉)竞争性”和“(交叉)竞争型”在本文中可互换使用，是指免疫球蛋白、抗体、ISVD、多肽或其他结合试剂干扰其他免疫球蛋白、抗体、ISVD、多肽或结合试剂与给定靶标结合的能力。免疫球蛋白、抗体、ISVD、多肽或其他结合试剂能够干扰另一种与靶标结合的程度，并因此是否可以说是根据本发明的交叉阻断，可以通过使用竞争结合测定法来确定，所述竞争结合测定法是本领域常见的，例如，通过在竞争ELISA中针对在噬菌体上展示的ISVD筛选纯化的ISVD。用于确定针对靶标的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂是否能够如本文所定义的(交叉)-阻断、竞争性结合或(交叉)竞争性的其他方法例如在Xiao-Chi Jia等人(Journal of Immunological Methods 288：91-98，2004)，Miller等人(Journal of Immunological Methods 365:118-125,2011)和/或本文所述的方法(参见例如实施例7)中描述。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，例如由SEQ ID NO：111、11、112、12、109、9、110、10、1、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、2、3、4、5、6、7或8表示的，其中所述多肽与多肽竞争，例如通过竞争ELISA确定的。
本发明涉及确定与本文所述的多肽竞争的竞争物如多肽的方法，本文所述的多肽例如由SEQ ID NO：111、11、112、12、109、9、110、10、1、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、2、3、4、5、6、7或8中的任何一个表示，其中本文所述的多肽与竞争物(例如多肽)竞争或交叉阻断竞争物(例如多肽)与MMP13例如人MMP13(SEQ ID NO：115)的结合，其中与不存在本发明多肽的情况下竞争物与MMP13的结合相比，存在本发明多肽的情况下竞争物与MMP13的结合被降低了至少5％，例如10％、20％、30％、40％、50％或更多，例如80％、90％或甚至100％(即在给定测定法中实际上不可检测)。竞争和交叉阻断可以通过本领域已知的任何方式来确定，例如竞争ELISA。在一方面，本发明涉及本发明的多肽，其中所述多肽交叉阻断由SEQID NO：111、11、112、12、109、9、110、10、1、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、2、3、4、5、6、7或8表示的至少一种多肽与MMP13的结合，和/或被由SEQ NO：111、11、112、12、109、9、110、10、1、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、2、3、4、5、6、7或8表示的至少一种多肽交叉阻断与MMP13的结合。
本发明还涉及与本文所述的多肽竞争的竞争物，多肽例如SEQ ID NO：111、11、112、12、109、9、110、10、1、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、2、3、4、5、6、7或8，其中竞争物与本文所述的多肽竞争或交叉阻断与MMP13的结合，其中与不存在所述竞争物的情况下本发明的多肽与MMP13的结合相比，存在所述竞争物的情况下本发明的多肽与MMP13的结合降低了至少5％，例如10％、20％、30％、40％、50％或更高，例如80％，或甚至更高，例如至少90％或甚至100％(即在给定测定法中实际上不可检测)。在一方面，本发明涉及多肽，其交叉阻断本发明的多肽例如SEQ ID NO：111、11、112、12、109、9、110、10、1、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、2、3、4、5、6、7或8之一与MMP13的结合，和/或被SEQ ID NO：111、11、112、12、109、9、110、10、1、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、2、3、4、5、6、7或8中的至少一种交叉阻断与MMP13的结合，优选地其中所述多肽包含特异性结合MMP13的至少一个VH、VL、dAb、免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)，其中结合MMP13调控MMP13的活性。
“MMP13活性”和“MMP13的活性”(这些术语在本文可互换使用)包括但不限于一方面是蛋白水解，例如蛋白酶活性(也称为蛋白酶或肽酶活性)，和肽链内切酶活性，以及结合底物，例如通过血色素结合蛋白样结构域和肽聚糖结合结构域。MMP13活性包括底物的结合和/或蛋白水解，底物例如聚蛋白聚糖、胶原蛋白II、胶原蛋白I、胶原蛋白III、胶原蛋白IV、胶原蛋白IX、胶原蛋白X、胶原蛋白XIV和明胶。如本文所用，蛋白水解是通过对将多肽链中的氨基酸连接在一起的肽键进行水解而将蛋白质分解成更小的多肽或氨基酸。
在本发明的上下文中，“调控的”或“调控”通常是指通过MMP13改变活性，如使用合适的体外、细胞或体内测定法(例如本文所述的那些)所测量的。特别地，“调控的”或“调控”可以表示与在相同条件但不存在本发明的ISVD或多肽的情况下在相同测定法中的MMP13活性相比，降低或抑制MMP13的活性，或者备选地增加MMP13的活性至少1％，优选地至少5％，例如至少10％或至少25％，例如至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，或90％或更多，如使用合适的体外、细胞或体内测定法(例如本文所述的那些)所测量的。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽调控MMP13的活性，优选地抑制MMP13的活性。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽抑制MMP13的蛋白酶活性，例如抑制对底物例如聚蛋白聚糖、胶原蛋白II、胶原蛋白I、胶原蛋白III、胶原蛋白IV、胶原蛋白IX、胶原蛋白X、胶原蛋白XIV和/或明胶的蛋白水解。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽阻断MMP13与底物例如聚蛋白聚糖、胶原蛋白II、胶原蛋白I、胶原蛋白III、胶原蛋白IV、胶原蛋白IX、胶原蛋白X、胶原蛋白XIV和/或明胶的结合，其中所述胶原蛋白优选地是胶原蛋白II。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽阻断MMP13与胶原蛋白和/或聚蛋白聚糖的结合至少20％，例如至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或甚至更高，例如通过基于ELISA的竞争测定法(参阅Howes等人,2014J.Biol.Chem.289:24091–24101)确定的。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽拮抗或抑制MMP13的活性，例如(i)蛋白酶活性，优选地裂解聚蛋白聚糖和/或胶原蛋白，其中所述胶原蛋白优选地是胶原蛋白II；(ii)胶原蛋白与血色素结合蛋白样结构域的结合。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽抑制MMP13的蛋白酶活性，优选地至少5％，例如10％、20％、30％、40％、50％或甚至更多，例如至少60％、70％、80％、90％、95％或甚至更高，如通过本领域已知的任何合适的方法确定的，例如通过竞争测定法或如在实施例部分中所述的。
ISVD
除非另有说明，否则术语“免疫球蛋白”和“免疫球蛋白序列”-无论在本文中用于指重链抗体还是常规的4-链抗体-均用作通用术语以包括全尺寸抗体、其单个链以及其所有部分、结构域或片段(包括但不限于抗原结合结构域或片段，例如分别地VHH结构域或VH/VL结构域)。
如本文所用，术语(多肽或蛋白质的)“结构域”是指折叠的蛋白质结构，其具有独立于蛋白质的其余部分而保留其三级结构的能力。通常，结构域负责蛋白质的离散功能特性，并且在许多情况下，可以添加、去除或转移至其他蛋白质而不会损失蛋白质的其余部分和/或结构域的功能。
如本文所用，术语“免疫球蛋白结构域”是指抗体链(例如，常规4链抗体或重链抗体的链)的球状区域，或指基本上由这样的球状区域组成的多肽。免疫球蛋白结构域的特征在于它们保留了抗体分子的免疫球蛋白折叠特征，其由排列在两个β折叠中的约7条反平行β链的两层三明治组成，并可选地由保守的二硫键稳定。
如本文所用，术语“免疫球蛋白可变结构域”是指基本上由以下组成的免疫球蛋白结构域：四个“框架区”，所述“框架区”在本领域中和在下文中分别称为“框架区1”或“FR1”；“框架区域2”或“FR2”；“框架区域3”或“FR3”；和“框架区域4”或“FR4”；这些框架区被三个“互补决定区”或“CDR”间断，后者在本领域中和在下文中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”；“互补决定区2”或“CDR2”；和“互补决定区3”或“CDR3”。因此，免疫球蛋白可变结构域的一般结构或序列可以如下所示：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可变结构域通过携带抗原结合位点而赋予抗体针对抗原的特异性。在本发明所有方面的优选实施方案中，根据本发明的免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)优选地由或基本上由4个框架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3组成，以如上所述的一般结构。优选的框架序列例如在下表A-2中概述，并且可以用于本发明的ISVD中。优选地，表A-2中描述的CDR与同一ISVD构建体的各自框架区匹配。
术语“免疫球蛋白单可变结构域”(在本文中缩写为“ISVD”或“ISV”)，并且与“单可变结构域”互换使用，定义了其中抗原结合位点存在于单个免疫球蛋白域上并由其形成的分子。这将免疫球蛋白单可变结构域与“常规”免疫球蛋白或其片段分开，其中两个免疫球蛋白结构域，特别是两个可变结构域相互作用而形成抗原结合位点。通常，在常规的免疫球蛋白中，重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)相互作用而形成抗原结合位点。在后一种情况下，VH和VL的互补决定区(CDR)将有助于抗原结合位点，即，总共6个CDR将参与抗原结合位点的形成。
鉴于以上定义，常规4链抗体(例如本领域已知的IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子)或者衍生自这样的常规4链抗体的Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段(例如二硫键连接的Fv或scFv片段)或双抗体(所有都是本领域中已知的)的抗原结合结构域通常不被视为免疫球蛋白单可变结构域，在这些情况下，通常不通过一个(单个)免疫球蛋白结构域而是通过一对(相关的)免疫球蛋白结构域例如轻链和重链可变结构域，即通过免疫球蛋白结构域的VH-VL对(它们共同结合相应抗原的表位)，发生与抗原的各个表位的结合。
相反，ISVD能够特异性结合抗原的表位，而无需与另外的免疫球蛋白可变结构域配对。ISVD的结合位点由单个VHH、VH或VL结构域形成。因此，ISVD的抗原结合位点由不超过三个的CDR形成。
这样，单可变结构域可以是轻链可变结构域序列(例如，VL序列)或其合适的片段；或者重链可变结构域序列(例如，VH序列或VHH序列)或其合适的片段；只要它能够形成单个抗原结合单元(即基本上由单可变结构域组成的功能性抗原结合单元，这样单个抗原结合域就不需要与另一个可变结构域相互作用即可形成功能性抗原结合单元)。
在本发明的一个实施方案中，ISVD是重链可变结构域序列(例如，VH序列)；更具体地说，ISVD可以是衍生自常规四链抗体的重链可变结构域序列或衍生自重链抗体的重链可变结构域序列。
例如，ISVD可以是(单)结构域抗体(或适合用作(单)结构域抗体的肽)，“dAb”或dAb(或适合用作dAb的肽)或纳米抗体(如本文所定义，包括但不限于VHH)；其他单可变结构域，或其任何一个的任何合适的片段。
特别地，ISVD可以是
Figure BDA0002377824260000221
(如本文所定义的)或其合适的片段。[注：
Figure BDA0002377824260000222
和
Figure BDA0002377824260000223
是Ablynx N.V.的注册商标。]对于Nanobody的一般描述，请参考下面的进一步描述，以及本文引用的现有技术，例如在WO08/020079(第16页)中描述的。
“VHH结构域”，也称为VHH、VHH结构域、VHH抗体片段和VHH抗体，最初被描述为“重链抗体”的抗原结合免疫球蛋白(可变)结构域(即“不含轻链的抗体”；Hamers-Casterman等人，1993Nature 363：446-448)。选择术语“VHH结构域”是为了将这些可变结构域与常规4链抗体中存在的重链可变结构域(在本文中称为“VH结构域”或“VH结构域”)和存在于常规4-链抗体中的轻链可变结构域(在本文中称为“VL结构域”或“VL结构域”)相区分。对于VHH和纳米抗体的进一步描述，参考Muyldermans的综述文章(Reviews in MolecularBiotechnology 74:277-302，2001)，以及以下专利申请，其被作为一般背景技术提及：布鲁塞尔自由大学(Vrije Universiteit Brussel)的WO 94/04678、WO 95/04079和WO 96/34103；联合利华(Unilever)的WO 94/25591、WO 99/37681、WO 00/40968、WO 00/43507、WO00/65057、WO 01/40310、WO 01/44301、EP 1134231和WO 02/48193；Vlaams Instituutvoor Biotechnologie(VIB)的WO 97/49805、WO 01/21817、WO 03/035694、WO 03/054016和WO 03/055527；Algonomics N.V.和Ablynx N.V.的WO 03/050531；加拿大国家研究委员会的WO 01/90190；抗体研究所的WO 03/025020(＝EP 1433793)；以及Ablynx N.V.的WO 04/041867、WO 04/041862、WO 04/041865、WO 04/041863、WO 04/062551、WO 05/044858、WO06/40153、WO 06/079372、WO 06/122786、WO 06/122787和WO 06/122825，以及Ablynx N.V.的其他公开的专利申请。也参考了这些申请中提到的其他现有技术，特别是国际申请WO06/040153的第41-43页提及的参考文献列表，该列表和参考文献通过引用并入本文。如这些参考文献中所述，纳米抗体(特别是VHH序列和部分人源化的纳米抗体)尤其特征在于在一个或多个框架序列中存在一个或多个“标志残基(Hallmark residue)”。纳米抗体的进一步描述，包括纳米抗体的人源化和/或骆驼化，以及其他修饰、部分或片段、衍生物或“纳米抗体融合体”、多价构建体(包括接头序列的一些非限制性示例)和延长纳米抗体的半衰期的不同修饰，并且它们的制备方法可以可见于WO 08/101985和WO 08/142164。对于纳米抗体的进一步一般性描述，参考本文引用的现有技术，例如在WO 08/020079(第16页)中描述。
特别地，在本发明的MMP13结合物(例如本发明的ISVD和/或多肽)中存在的框架序列，可以包含一个或多个标志残基(例如，在WO 08/020079中所述(表A-3至A-8))，使得本发明的MMP13结合物是纳米抗体。通过本文的进一步公开(参见例如表A-2)，这些框架序列(的合适组合)的一些优选但非限制性实例将变得清楚。通常，纳米抗体(特别是VHH序列和部分人源化的纳米抗体)可以特别地特征在于一个或多个框架序列中存在一个或多个“标志残基”(例如，在WO 08/020079，第61页第24行到第98页第3行中进一步描述)。
更特别地，本发明提供了MMP13结合物，其包含至少一个免疫球蛋白单可变结构域，其是具有(一般)结构的氨基酸序列。
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1至FR4分别是指框架区1至4，并且其中CDR1至CDR3分别是指互补决定区1至3，并且其中所述ISVD：
i)与SEQ ID NO：111、11、112、12、109、9、110、10、1、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、2、3、4、5、6、7或8(参阅表A-1)的至少一个氨基酸序列具有至少80％，更优选地90％，甚至更优选地95％的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性的程度，忽略形成CDR序列的氨基酸残基。在这方面，也参考表A-2，其列出了SEQ ID NO：1-22和109-112的免疫球蛋白单可变结构域的框架1序列(SEQ ID NO：67-79)，框架2序列(SEQ ID NO：80-87和108)，框架3序列(SEQ ID NO:88-99和113-114)和框架4序列(SEQ ID NO：100-104)；或
ii)如表A-2所示的框架序列的组合；
并且其中：
iii)优选地，在根据Kabat编号的位置11、37、44、45、47、83、84、103、104和108的一个或多个氨基酸残基选自WO 08/020079的表A-3至表A-8中所述的标志残基。
本发明的MMP13结合物，例如本发明的ISVD和/或多肽，还可以包含以下共同待决的美国临时申请中描述的特定突变/氨基酸残基，其全部以“Improved immunoglobulinvariable domains”为标题：2014年5月16日提交的US 61/994552；2014年6月18日提交的US61/014,015；2014年8月21日提交的US 62/040,167；以及2014年9月8日提交的US 62/047,560(均转让给Ablynx N.V.)。
特别地，本发明的MMP13结合物，例如本发明的ISVD和/或多肽，可以适当地包含(i)在位置112的K或Q；或(ii)在位置110的K或Q与在位置11的V相组合；或(iii)在位置89的T；或(iv)在位置89的L，以及在位置110的K或Q；或(v)在位置11的V和位置89的L；或者(i)至(v)的任何适当组合。
也如在所述共同待决的美国临时申请中所述，当本发明的MMP13结合物，例如本发明的ISVD和/或多肽，包含根据上述(i)至(v)之一的突变(或适当的组合)时：
位置11的氨基酸残基优选地选自L、V或K(并且最优选地V)；和/或
位置14的氨基酸残基优选地选自A或P；和/或
位置41的氨基酸残基优选地选自A或P；和/或
位置89的氨基酸残基优选地选自T、V或L；和/或
位置108的氨基酸残基优选地选自Q或L；和/或
位置110的氨基酸残基优选地选自T、K或Q；和/或
位置112的氨基酸残基优选地选自S、K或Q。
如在所述同待决的美国临时申请中所提到的，所述突变在防止或减少所谓的“预先存在的抗体”与本发明的免疫球蛋白和化合物的结合方面是有效的。为此，本发明的MMP13结合物，例如本发明的ISVD和/或多肽，还可包含(可选地与所述突变组合)C末端延伸(X)n(其中n是1至10，优选地1至5，例如1、2、3、4或5(并且优选地1或2，例如1)；并且每个X是独立选择的(优选天然存在的)氨基酸残基，并且优选独立地选自丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I))，对此再次参见例如美国临时申请以及WO 12/175741。特别地，当本发明的MMP13结合物，例如本发明的ISVD和/或多肽形成蛋白质、多肽或包含蛋白质、多肽的其他化合物或构建体的C末端时，可以包含这种C末端延伸(再次，如所述美国临时申请以及WO 12/175741中进一步描述的)。
本发明的MMP13结合物可以是以任何合适的方式并且从任何合适的来源衍生的免疫球蛋白，例如免疫球蛋白单可变结构域，并且可以例如是天然存在的VHH序列(即，来自合适种类的骆驼科动物)或者合成或半合成氨基酸序列，包括但不限于“人源化”(如本文定义)纳米抗体或VHH序列，“骆驼化”(如本文定义)免疫球蛋白序列(尤其是骆驼化重链可变结构域序列)，以及已经通过例如亲和力成熟(例如，从合成的、随机的或天然存在的免疫球蛋白序列开始)、CDR嫁接、贴面、组合来自不同免疫球蛋白序列的片段、使用重叠引物的PCR组装和技术人员熟知的用于工程改造免疫球蛋白序列的相似技术的技术获得的纳米抗体；或本文进一步描述的任何前述的任何合适的组合。再次，当免疫球蛋白包含VHH序列时，如本文进一步所述，所述免疫球蛋白可以被适当地人源化，以提供本发明的一种或多种其他(部分地或完全地)人源化免疫球蛋白。类似地，当免疫球蛋白包含合成的或半合成的序列(例如部分地人源化的序列)时，所述免疫球蛋白可以可选地被进一步合适地人源化，再次如本文所述，从而再次提供本发明的一个或多个(部分地或全部地)人源化的免疫球蛋白。
“结构域抗体”，也称为“Dab”、“结构域抗体”和“dAb”(术语“结构域抗体”和“dAb”被葛兰素史克集团公司作为商标使用)已在例如EP 0368684、Ward等人(Nature 341:544-546，1989)、Holt等人(Tends in Biotechnology 21:484-490，2003)和WO 03/002609以及例如WO 04/068820、WO 06/030220、WO 06/003388和Domantis Ltd.的其他公开的专利申请中描述。结构域抗体基本上对应于非骆驼科哺乳动物，尤其是人4链抗体的VH或VL结构域。为了将表位作为单个抗原结合结构域进行结合，即，不与VL或VH结构域分别配对，需要对这种抗原结合特性进行特异性选择，例如通过使用人单个VH或VL结构域序列的文库。像VHH一样，结构域抗体具有约13至约16kDa的分子量，并且如果衍生自完整的人序列，则不需要人源化用于例如在人类中的治疗用途。
还应当注意，尽管在本发明的上下文中由于它们不是哺乳动物起源而为次优选，但是单可变结构域可以衍生自某些鲨鱼物种(例如，所谓的“IgNAR结构域”，参见例如WO05/18629)。
本发明特别涉及ISVD，其中所述ISVD选自VHH、人源化的VHH和骆驼化的VH。
VHH结构域的氨基酸残基根据Kabat等人("Sequence of proteins ofimmunological interest",US Public Health Services,NIH Bethesda,MD,PublicationNo.91)给出的VH结构域的通用编号进行编号，如应用于来自骆驼科动物的VHH结构域那样，例如Riechmann和Muyldermans(J.Immunol.Methods 231:25-38,1999)的图2所示。对VH结构域的氨基酸残基进行编号的替代方法，该方法也可以以类似的方式应用于VHH结构域，是本领域已知的。但是，在本说明书、权利要求书和附图中，除非另有说明，否则将遵循如上所述应用于VHH域的根据Kabat的编号。
应当注意的是-如本领域对于VH结构域和VHH结构域所公知的-每个CDR中的氨基酸残基总数可以变化并且可以不对应于通过Kabat编号表示的氨基酸残基的总数(即，根据Kabat编号的一个或多个位置可以不在实际序列中被占据，或者实际序列可以包含比Kabat编号所允许的数目更多的氨基酸残基)。这意味着，通常，根据Kabat的编号可以对应于或可以不对应于实际序列中氨基酸残基的实际编号。VH结构域和VHH结构域中的氨基酸残基总数通常为110至120，通常为112至115。但是，应注意，更小和更长的序列也可以适用于此本文所述的目的。
关于CDR，如本领域公知的，存在多种约定来定义和描述VH或VHH片段的CDR，例如Kabat定义(其基于序列可变性并且是最常用的)和Chothia定义(基于结构环区域的位置)。例如参考网站http://www.bioinf.org.uk/abs/。为了本说明书和权利要求书的目的，最优选地基于Abm定义(其基于Oxford Molecular的AbM抗体建模软件)来定义CDR，因为这被认为是Kabat和Chothia定义之间的最佳折衷方案(请参阅http://www.bioinf.org.uk/abs/)。如本文所用，FR1包含在位置1-25的氨基酸残基，CDR1包含在位置26-35的氨基酸残基，FR2包含在位置36-49的氨基酸，CDR2包含在位置50-58的氨基酸残基，FR3包含在位置59-94的氨基酸残基，CDR3包含在位置95-102的氨基酸残基，并且FR4包含在位置103-113的氨基酸残基。
在本发明的含义中，术语“免疫球蛋白单可变结构域”或“单可变结构域”包括衍生自非人类来源的多肽，优选地骆驼科动物，优选地骆驼科动物重链抗体。如本文所述，它们可以被人源化。此外，该术语包括衍生自非骆驼科动物来源的多肽，例如小鼠或人类，其已经被“骆驼化”，如本文所述。
因此，可以将ISVD例如结构域抗体和纳米抗体(包括VHH域)进行人源化。特别地，人源化的ISVD，例如纳米抗体(包括VHH结构域)可以是如本文一般定义的ISVD，但是其中存在至少一个氨基酸残基(特别是在至少一个框架残基中)是和/或对应于人源化取代(如本文所定义)。可以通过将天然存在的VHH序列的框架区序列与一个或多个紧密相关的人VH序列的相应框架序列进行比较来确定潜在有用的人源化取代，然后，可以将由此确定的一个或多个潜在有用的人源化取代(或其组合)引入所述VHH序列中(以本身已知的任何方式，如本文进一步所述)，并且可以测试所得的人源化的VHH序列与靶标的亲和力、稳定性、表达的容易程度和水平、和/或其他所需属性。以此方式，借助于有限程度的反复试验，技术人员可以基于本文的公开内容确定其他合适的人源化取代(或其合适的组合)。而且，基于前述，ISVD例如纳米抗体(包括VHH结构域)的(框架区)可以被部分地人源化或完全人源化。
本发明的另一类特别优选的ISVD包括具有与天然存在的VH结构域的氨基酸序列相对应的氨基酸序列、但是已被“骆驼化”的ISVD，即将来自常规4链抗体的天然存在VH结构域的氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基取代为在重链抗体的VHH结构域中相应位置的一个或多个氨基酸残基。这可以以本身已知的方式来执行，这对于本领域技术人员而言将是清楚的，例如基于本文的描述。如本文所定义，优选地将这种“骆驼化”取代插入形成和/或存在于VH-VL界面和/或于所谓的骆驼科标志残基的氨基酸位置(也参见例如WO 94/04678以及Davies和Riechmann(1994和1996))。优选地，用作产生或设计骆驼化的免疫球蛋白单可变结构域的起始材料或起点的VH序列优选地是来自哺乳动物的VH序列，更优选地人的VH序列，例如VH3序列。然而，应注意的是，本发明的这种骆驼化的免疫球蛋白单可变结构域可以以本身已知的任何合适方式获得并因此并不严格限于使用包含天然存在的VH结构域的多肽作为起始材料获得的多肽。参考例如Davies和Riechmann(FEBS 339:285-290,1994；Biotechnol.13:475-479,1995；Prot.Eng.9:531-537,1996)以及Riechmann和Muyldermans(J.Immunol.Methods 231:25-38,1999)
例如，再次如本文进一步所述，“人源化”和“骆驼化”都可以通过提供分别编码天然存在的VHH结构域或VH结构域的核苷酸序列，然后以本身已知的方式改变所述核苷酸序列中的一个或多个密码子使得新核苷酸序列分别编码本发明的“人源化的”或“骆驼化的”ISVD来执行。然后可以以本身已知的方式表达该核酸，以提供所需的本发明的ISVD。备选地，分别基于天然存在的VHH结构域或VH结构域的氨基酸序列，可以分别设计所需的本发明的人源化或骆驼化ISVD的氨基酸序列，然后使用本身已知的肽合成技术从头合成。再次，分别基于天然存在的VHH结构域或VH结构域的氨基酸序列或核苷酸序列，可以分别设计编码所需的人源化或骆驼化的本发明的ISVD的核苷酸序列，然后使用本身已知的核酸合成技术从头合成，然后可以以本身已知的方式表达由此获得的核酸，从而提供所需的本发明的ISVD。
ISVD例如结构域抗体和纳米抗体(包括VHH结构域和人源化VHH结构域)也可以通过在一个或多个CDR的氨基酸序列中引入一个或多个改变来进行亲和力成熟，这种改变可导致与各自的亲本分子相比，所得ISVD对于其各自抗原的亲和力提高。本发明的亲和力成熟的ISVD分子可以通过本领域已知的方法来制备，例如，如Marks等人(Biotechnology 10:779-783,1992)，Barbas等人(Proc.Nat.Acad.Sci，USA91:3809-3813,1994)，Shier等人(Gene169:147-155，1995)，Yelton等人(Immunol.155:1994-2004,1995)，Jackson等人(J.Immunol.154:3310-9,1995)，Hawkins等人(J.Mol.Biol.226:889 896,1992)，Johnson和Hawkins(Affinity maturation of antibodies using phage display,OxfordUniversity Press,1996)所述。
从诸如VH、VL、VHH、结构域抗体或纳米抗体的ISVD开始，设计/选择和/或制备多肽的过程在本文中也被称为“格式化”所述ISVD；并且构成多肽部分的ISVD被称为被“格式化的”或以所述多肽的“格式”。基于本文公开内容，其中ISVD可以被格式化的方式的实例以及这样的格式的实例对于本领域技术人员将是清楚的；并且这种格式化的免疫球蛋白单可变结构域构成了本发明的另一方面。
优选的CDR在表A-2中描述。
特别地，本发明涉及如本文所述的ISVD，其中所述ISVD特异性结合MMP13并且基本上由4个框架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中
(i)CDR1选自
(a)SEQ ID NO：27、28、25、26、23、29、30、31、32、33、34、35、36和24；和
(b)与SEQ ID NO：27、28、25、26、23、29、30、31、32、33、34、35、36和24具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；
(ii)CDR2选自
(c)SEQ ID NO：42、43、40、41、37、44、45、46、47、48、49、50、51、38和39；和
(d)与SEQ ID NO：42、43、40、41、37、44、45、46、47、48、49、50、51、38和39具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；和
(iii)CDR3选自
(e)SEQ ID NO：56、107、57、54、106、55、52、58、59、60、61、62、63、64、65、66和53；和
(f)与SEQ ID NO：56、107、57、54、106、55、52、58、59、60、61、62、63、64、65、66和53具有1、2、3或4个氨基酸差异的氨基酸序列。
特别地，本发明涉及如本文所述的ISVD，其中所述ISVD特异性结合MMP13并且基本上由4个框架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中
(i)CDR1选自：
(a)SEQ ID NO：23；和
(b)与SEQ ID NO：23具有1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中在位置7，Y已改变为R；
(ii)CDR2选自
(c)SEQ ID NO：37；和
(d)与SEQ ID NO：37具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列，
其中
-在位置4，V已改变为T；
-在位置5，G已改变为A；和/或
-在位置9，N已改变为H；
(iii)CDR3选自
(e)SEQ ID NO：52；和
(f)与SEQ ID NO：52具有1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中在位置6，Y已改变为S。
特别地，本发明涉及如本文所述的ISVD，其中所述ISVD特异性结合MMP13并且基本上由4个框架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中
(i)CDR1是SEQ ID NO：26；
(ii)CDR2是SEQ ID NO：41；和
(iii)CDR3选自：
(e)SEQ ID NO：55；和
(f)与SEQ ID NO：55具有1或2个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置8，N已改变为Q或S；和/或
-在位置19，N已改变为V或Q。
特别地，本发明涉及如本文所述的ISVD，其中所述ISVD特异性结合MMP13并且基本上由4个框架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中
(i)CDR1是SEQ ID NO：28；
(ii)CDR2是SEQ ID NO：43；和
(iii)CDR3选自：
(e)SEQ ID NO：57；和
(f)与SEQ ID NO：57具有1、2、3或4个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置10，D已改变为E、G、A、P、T、R、M、W或Y；
-在位置16，M已改变为A、R、N、D、E、Q、Z、G、I、L、K、F、P、S、W、Y或V；
-在位置17、D已改变为A、R、N、C、E、Q、Z、G、H、I、L、K、M、S、T、W、Y或V；和/或
-在位置18，Y已改变为A、R、N、D、C、E、Q、Z、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W或V。
特别地，本发明涉及如本文所述的ISVD，其中所述ISVD特异性结合MMP13并且基本上由4个框架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中
-CDR1选自由SEQ ID NO：27、28、25、26、23、29、30、31、32、33、34、35、36和24；
-CDR2选自SEQ ID NO：42、43、40、41、37、44、45、46、47、48、49、50、51、38和39；和
-CDR3选自SEQ ID NO：56、107、57、54、106、55、52、58、59、60、61、62、63、64、65、66和53。
特别地，本发明涉及如本文所述的ISVD，其中所述ISVD特异性结合MMP13并且基本上由4个框架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中所述ISVD选自ISVD的组，其中：
-CDR1是SEQ ID NO:27,CDR2是SEQ ID NO:42，并且CDR3是SEQ ID NO:56；
-CDR1是SEQ ID NO:28,CDR2是SEQ ID NO:43，并且CDR3是SEQ ID NO:107；
-CDR1是SEQ ID NO:28,CDR2是SEQ ID NO:43，并且CDR3是SEQ ID NO:57；
-CDR1是SEQ ID NO:25,CDR2是SEQ ID NO:40，并且CDR3是SEQ ID NO:54；
-CDR1是SEQ ID NO:26,CDR2是SEQ ID NO:41，并且CDR3是SEQ ID NO:106；
-CDR1是SEQ ID NO:26,CDR2是SEQ ID NO:41，并且CDR3是SEQ ID NO:55；
-CDR1是SEQ ID NO:23,CDR2是SEQ ID NO:37，并且CDR3是SEQ ID NO:52；
-CDR1是SEQ ID NO:26,CDR2是SEQ ID NO:48，并且CDR3是SEQ ID NO:62；
-CDR1是SEQ ID NO:26,CDR2是SEQ ID NO:41，并且CDR3是SEQ ID NO:63；
-CDR1是SEQ ID NO:29,CDR2是SEQ ID NO:44，并且CDR3是SEQ ID NO:58；
-CDR1是SEQ ID NO:30,CDR2是SEQ ID NO:45，并且CDR3是SEQ ID NO:58；
-CDR1是SEQ ID NO:31,CDR2是SEQ ID NO:46，并且CDR3是SEQ ID NO:59；
-CDR1是SEQ ID NO:32,CDR2是SEQ ID NO:47，并且CDR3是SEQ ID NO:60；
-CDR1是SEQ ID NO:33,CDR2是SEQ ID NO:41，并且CDR3是SEQ ID NO:61；
-CDR1是SEQ ID NO:34,CDR2是SEQ ID NO:49，并且CDR3是SEQ ID NO:64；
-CDR1是SEQ ID NO:35,CDR2是SEQ ID NO:50，并且CDR3是SEQ ID NO:65；
-CDR1是SEQ ID NO:36,CDR2是SEQ ID NO:51，并且CDR3是SEQ ID NO:66；
-CDR1是SEQ ID NO:23,CDR2是SEQ ID NO:39，并且CDR3是SEQ ID NO:53；和
-CDR1是SEQ ID NO:24,CDR2是SEQ ID NO:38，并且CDR3是SEQ ID NO:52。
在一个特别优选的方面，本发明涉及如本文所述的ISVD，其中所述ISVD特异性结合MMP13并且基本上由4个框架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中CDR1是SEQ ID NO：27，CDR2是SEQ ID NO：42，并且CDR3是SEQ ID NO：56。
特别地，本发明涉及如本文所述的ISVD，其中所述ISVD特异性结合MMP13并且基本上由4个框架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中所述ISVD选自SEQ ID NO：111、11、112、12、109、9、110、10、1、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、2、3、4、5、6、7和8。
应当理解，但不限于，本发明的免疫球蛋白单可变结构域可以用作制备多肽的“构件”，所述多肽可以可选地包含一个或多个另外的免疫球蛋白单可变结构域，其可以用作构件(即针对MMP13的相同或另一个表位和/或针对MMP13的一个或多个其他抗原、蛋白质或靶标)。
多肽
本发明的多肽包含至少一个结合MMP，优选地MMP13的ISVD，例如两个结合MMP13的ISVD，并且优选地还有至少一个结合聚蛋白聚糖的ISVD，更优选地两个结合聚蛋白聚糖的ISVD。在本发明的多肽中，ISVD可以直接连接或通过接头连接。甚至更优选地，本发明的多肽包含C末端延伸。如将在下文中详细描述的，C末端延伸基本上防止/去除了人类受试者/患者的大多数样品中预先存在的抗体/因子的结合。C末端延伸存在于最后一个(位于最C末端)ISVD的最后一个氨基酸残基(通常是丝氨酸残基)的C-末端。
如下文进一步详述，ISVD可以衍生自VHH、VH或VL结构域，但是，选择ISVD使得它们在本发明的多肽中不形成VH和VL结构域的互补对。纳米抗体、VHH和人源化的VHH是不寻常的，因为它们衍生自没有轻链的天然骆驼科动物抗体，并且实际上这些结构域无法与骆驼科动物轻链连接以形成互补的VHH和VL对。因此，本发明的多肽不包含互补的ISVD和/或形成互补的ISVD对，例如互补的VH/VL对。
通常，包含或基本上由单个构件，例如单个ISVD或单个纳米抗体组成的多肽或构建体将在本文中分别称为“单价”多肽和“单价构建体”。包含两个或更多个构件(例如，ISVD)的多肽或构建体在本文中也称为“多价”多肽或构建体，并且在这种多肽或构建体中存在的构件/ISVD将在本文中也称为处于“多价格式”。例如，“二价”多肽可以包含两个ISVD，可选地通过接头序列连接，而“三价”多肽可以包含三个ISVD，可选地通过两个接头序列连接；而“四价”多肽可包含四个ISVD，可选通过三个接头序列连接，等等。
在多价多肽中，两个或更多个ISVD可以相同或不同，并且可以针对相同的抗原或抗原决定簇(例如针对相同的部分或表位或者针对不同的部分或表位)或者可以备选地针对不同的抗原或抗原决定簇；或者其任何合适的组合。包含至少两个构件(例如ISVD)的多肽和构建体，其中至少一个构件针对第一抗原(即MMP13)，而至少一个构件针对第二抗原(即，与MMP13不同)也将被称为“多特异性”多肽和构建体，并且在这种多肽和构建体中存在的构件(例如ISVD)在本文中也将被称为“多特异性格式”。因此，例如，本发明的“双特异性”多肽是包含至少一个针对第一抗原(即MMP13)的ISVD和至少一个针对第二抗原(即与MMP13不同)的另外ISVD的多肽，而本发明的“三特异性”多肽是包含至少一个针对第一抗原(即MMP13)的ISVD，至少一个针对第二抗原(即与MMP13不同)的另外ISVD，和至少一个针对第三种抗原(即与MMP13和第二种抗原不同)的另外ISVD的多肽；等等。
在一方面，本发明涉及多肽，其包含两个或更多个特异性结合MMP13的ISVD，其中
a)至少“第一”ISVD特异性结合MMP13的第一抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象；优选地所述特异性结合MMP13的“第一”ISVD选自SEQ ID NO:111、11、110、10、112、12、109、9、13、14、15、16、17、18、19、20、21和22；并且其中
b)至少“第二”ISVD特异性结合MMP13的第二抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象，分别不同于第一抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象，优选地所述特异性结合MMP13的“第二”ISVD选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7和8。
在一方面，本发明涉及包含两个或更多个特异性结合MMP13的ISVD的多肽，所述ISVD选自SEQ ID NO：160至165，优选地SEQ ID NO：160(参阅表A-3)。
“多互补位”多肽和“多互补位”构建体，例如“双互补位”多肽或构建体和“三互补位”多肽或构建体，包含或基本上由两个或更多个各自具有不同互补位的构件组成。
因此，结合MMP13的本发明的ISVD可以是基本上分离的形式(如本文所定义的)，或者它们可以形成构建体或多肽的部分，其可以包含或基本上由结合MMP13的一个或多个ISVD组成并且其可可选地还包含一个或多个另外的氨基酸序列(全部可选地经由一个或多个合适的接头连接)。本发明涉及多肽或构建体，其包含或基本由至少一个根据本发明的ISVD，例如结合MMP13的本发明的一个或多个ISVD(或其合适的片段)组成。
本发明的一个或多个ISVD可以用作这种多肽或构建体中的构件，从而分别提供本发明的单价、多价或多互补位多肽或构建体，全部如本文所述。本发明还涉及多肽，其是包含或基本上由一个本发明的单价多肽或ISVD组成的单价构建体。
因此，本发明还涉及多肽或构建体，其分别是多价多肽或多价构建体，例如包含或基本由两个或更多个本发明的ISVD组成的二价或三价多肽或构建体(对于包含一个或多个VHH结构域的多价和多特异性多肽及其制备，也参考例如Conrath等人(J.Biol.Chem.276:7346-7350,2001)，以及例如WO 96/34103，WO 99/23221和WO 2010/115998)。
在一方面，以其最简单的形式，本发明的多价多肽或构建体是本发明的二价多肽或构建体，其包含针对MMP13的第一ISVD，例如纳米抗体，和针对MMP13的相同的第二ISVD，例如纳米抗体，其中所述第一和第二ISVD，例如纳米抗体，可以可选地通过接头序列(如本文所定义)连接。以其最简单的形式，本发明的多价多肽或构建体可以是本发明的三价多肽或构建体，其包含针对MMP13的第一ISVD，例如纳米抗体，针对MMP13的相同的第二ISVD，例如纳米抗体，和针对MMP13的相同的第三ISVD，例如纳米抗体，其中所述第一、第二和第三ISVD，例如纳米抗体，可以可选地经由一个或多个，特别是两个接头序列连接。在一方面，本发明涉及包含或基本上由结合MMP13的至少两个根据本发明的ISVD例如2、3或4个ISVD(或其合适的片段)组成的多肽或构建体。两个或更多个ISVD可可选地经由一个或多个肽接头连接。
在另一方面，本发明的多价多肽或构建体可以是本发明的双特异性多肽或构建体，其包含针对MMP13的第一ISVD，例如纳米抗体，和针对第二抗原例如聚蛋白聚糖的第二ISVD，例如纳米抗体，其中所述第一和第二ISVD，例如纳米抗体，可以可选地通过接头序列(如本文所定义)连接；而本发明的多价多肽或构建体也可以是本发明的三特异性多肽或构建体，其包含针对MMP13的第一ISVD，例如纳米抗体，针对第二抗原例如聚蛋白聚糖的第二ISVD，例如纳米抗体，和针对第三抗原的第三ISVD，例如纳米抗体，其中所述第一、第二和第三ISVD，例如纳米抗体，可以通过一个或多个，特别是两个接头序列，连接在一起。
本发明进一步涉及多价多肽，其包含或(基本上)由结合MMP13，优选地人MMP13的至少一个ISVD(或其合适的片段)，和至少一个另外的ISVD，例如结合聚蛋白聚糖的ISVD组成。
根据本发明的特别优选的三价、双特异性多肽或构建体是本文所述的实施例和表A-3中所示的那些。
在一个优选的方面，本发明的多肽或构建体包含或基本上由至少两个ISVD组成，其中所述至少两个ISVD可以相同或不同，但是其中至少一个ISVD针对MMP13。
存在于本发明的多价多肽或构建物中的两个或更多个ISVD可以由轻链可变结构域序列(例如VL序列)或重链可变结构域序列(例如VH序列)组成；它们可以由衍生自常规四链抗体的重链可变结构域序列或衍生自重链抗体的重链可变结构域序列组成。在优选的方面，它们由结构域抗体(或适合用作单结构域抗体的肽)，单结构域抗体(或适合用作单结构域抗体的肽)，“dAb”(或适合用作dAb的肽)，
Figure BDA0002377824260000361
(包括但不限于VHH)，人源化的VHH序列，骆驼化的VH序列；或通过亲和力成熟获得的VHH序列组成。两个或更多个免疫球蛋白单可变结构域可以由部分地或完全地人源化的纳米抗体或者部分地或完全地人源化的VHH组成。
在本发明的一个方面，存在于本发明的多互补位(优选地双互补位或三互补位)多肽或构建体中的第一ISVD和第二ISVD彼此不(交叉)竞争与MMP13的结合，并且因此属于给不同的家族。因此，本发明涉及包含两个或更多个ISVD的多互补位(优选地双互补位)多肽或构建体，其中每个ISVD属于不同的家族。在一方面，本发明的该多互补位(优选地双互补位)多肽或构建体的第一ISVD不交叉阻断本发明的该多互补位(优选地双互补位)多肽或构建体的第二ISVD与MMP13的结合，和/或第一ISVD不被第二ISVD交叉阻断与MMP13的结合。在另一方面，本发明的多互补位(优选双互补位)多肽或构建体的第一ISVD交叉阻断本发明的该多互补位(优选双互补位)多肽或构建体的第二ISVD与MMP13的结合，和/或第一ISVD被第二ISVD交叉阻止与MMP13的结合。
在一个特别优选的方面，本发明的多肽或构建体包含或基本上由三个或更多个ISVD组成，其中至少两个ISVD针对MMP13。应当理解，所述至少两个针对MMP13的ISVD可以相同或不同，可以针对MMP13的相同表位或不同表位，可以属于相同表位组或不同表位组，和/或可以结合MMP13的相同或不同结构域。
在一个优选的方面，本发明的多肽或构建体包含或基本由结合MMP13的至少两个ISVD组成，其中所述至少两个ISVD可以相同或不同，其独立地选自SEQ ID NO：111、11、110、10、112、12、109、9、13、14、15、16、17、18、19、20、21和22以及SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7和8，更优选地所述至少两个ISVD独立地选自SEQ ID NO：111、11、110、10、112、12、109、9和1和/或至少一个ISVD选自SEQ ID NO：111、11、110、10、112、12、109、9、13、14、15、16、17、18、19、20、21和22以及至少一个ISVD选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7和8。
在另一方面，本发明涉及包含针对MMP13的两个或更多个ISVD的多互补位(优选地双互补位)多肽或构建体，所述ISVD结合与SEQ ID NO：111、11、110、10、112、12、109、9、13、14、15、16、17、18、19、20、21和22中任何一个所结合的以及SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7和8中任何一个所结合的相同的表位。
在另一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO：160-165(即SEQ ID NO：160、161、162、163、164或165)和176-192(即176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191或192)中任何一个，优选地SEQ ID NO：192具有至少80％、90％，95％或100％(更优选地至少95％和最优选地100％)的序列同一性。
保留
本领域需要更有效的疗法用于影响关节软骨的病症，例如骨关节炎。即使当关节内施用时，用于治疗受影响的软骨的大多数药剂的滞留时间也不足。本发明人假设，可以通过将治疗药剂缀合至这样的部分来显著地增加治疗药剂例如本发明的构建体、多肽和ISVD的功效，所述部分将药剂“锚定”在关节中并因此增加药剂的保留，但不应破坏所述治疗药剂的功效(该部分在本文中也表示为“软骨锚定蛋白”或“CAP”)。通过降低毒性和副作用，这种锚定概念不仅可以增加药剂的功效，而且可以增加患病关节的操作特异性，从而扩大了可能的有用药剂的数量。
预期用于临床用途的分子的最终格式包括结合MMP13的一个或两个构件，例如ISVD，和具有这种保留作用模式的一个或多个构件，例如ISVD，以及可能的其他部分。在实施例部分中，证明了这种格式保留了MMP13结合和治疗作用，如抑制活性，以及保留特性。具有保留作用模式的一个或多个构件，例如ISVD，可以是在其中涉及MMP13的疾病(如关节炎疾病、骨关节炎、脊椎干骺端发育不良、腰椎间盘退变疾病、退变性关节疾病、类风湿性关节炎、剥离性骨软骨炎、聚蛋白聚糖病变和恶性肿瘤的转移)中具有保留作用的任何构件(“CAP构件”)。
“CAP构件”用于引导、锚定和/或保留其他构件，例如，治疗性构件，例如在所需位点的结合MMP13的ISVD，例如在关节中，其中所述其他构件，例如治疗性构件发挥其作用，例如结合和/或抑制MMP13的活性。
本发明人进一步假设，尽管聚蛋白聚糖在影响关节软骨的多种病症中被严重糖基化和降解，但聚蛋白聚糖结合物，例如结合聚蛋白聚糖的ISVD，可能潜在地起着这样的锚的作用。而且，考虑到药剂进入临床之前所需的多种动物模型的成本和广泛测试，这种聚蛋白聚糖结合物应优选地具有宽的交叉反应性，例如聚蛋白聚糖结合物应与多种物种的聚蛋白聚糖结合。
使用多种巧妙的免疫、筛选和表征方法，本发明人能够鉴定具有优异的选择性、稳定性和特异性特征的多种聚蛋白聚糖结合物，其能够延长在关节中的保留和活性(参见共同待决的申请)。
在一方面，本发明涉及用于减少和/或抑制组合物、多肽或构建体从关节流出的方法，其中所述方法包括施用药学上有效量的至少一个根据本发明的多肽、根据本发明的构建体或根据本发明的组合物提供给有此需要的人。
在本发明中，术语“减少和/或抑制流出”是指减少和/或抑制组合物、多肽或构建体从关节内向外流动。优选地，与在相同条件下但不存在本发明的聚蛋白聚糖结合物例如结合聚蛋白聚糖的ISVD的情况下前述组合物、多肽或构建体在关节中的流出相比，流出减少和/或抑制至少10％，例如至少20％、30％、40％或50％，或者甚至更多，例如至少60％、70％、80％、90％或甚至100％。
除了其中涉及MMP13的疾病，例如关节炎疾病、骨关节炎、脊椎干骺端发育不良、腰椎间盘退变疾病、退变性关节疾病、类风湿性关节炎、剥离性骨软骨炎、聚蛋白聚糖病变和恶性肿瘤的转移，预期本发明的聚蛋白聚糖结合物也可以用在影响软骨的多种其他疾病中，例如关节病和软骨营养不良，关节炎疾病(例如骨关节炎、类风湿性关节炎、痛风性关节炎、银屑病关节炎、外伤性破裂或脱离)，软骨发育不全，肋软骨炎，脊椎干骺端发育不良，椎间盘突出症，腰椎间盘退变疾病，退化性关节疾病，和复发性多发性软骨炎(在本文中通常称为“聚蛋白聚糖相关疾病”)。
所述CAP构件，例如结合聚蛋白聚糖的ISVD，优选地结合软骨组织，例如软骨和/或半月板。在一个优选的方面，CAP构件对其他物种具有交叉反应性并且特异性结合人的聚蛋白聚糖(SEQ ID NO：105)、狗聚蛋白聚糖、牛聚蛋白聚糖、大鼠聚蛋白聚糖；猪聚蛋白聚糖；小鼠聚蛋白聚糖，兔聚蛋白聚糖；食蟹猴聚蛋白聚糖和/或恒河猴聚蛋白聚糖中的一种或多种。聚蛋白聚糖的相关结构信息可以例如以在下表2中描绘的(UniProt)登录号找到。
优选的CAP构件是结合聚蛋白聚糖，优选地人聚蛋白聚糖，优选地由表B所示的SEQID NO：105表示的人聚蛋白聚糖的ISVD。
表2
名称 登录号
人聚蛋白聚糖(SEQ ID NO:105) P16112
狗聚蛋白聚糖 Q28343
牛聚蛋白聚糖 P13608
大鼠聚蛋白聚糖 P07897
猪聚蛋白聚糖(核心) Q29011
小鼠聚蛋白聚糖 Q61282
兔聚蛋白聚糖 G1U677-1
食蟹猴聚蛋白聚糖 XP_005560513.1
恒河猴聚蛋白聚糖 XP_002804990.1
因此，本发明涉及根据本发明的多肽或构建体，还包含至少一个CAP构件。
因此，本发明涉及根据本发明的多肽或构建体，还包含至少一个特异性结合聚蛋白聚糖的ISVD，如表E所示，并且优选地选自由SEQ ID NO：166-168表示的ISVD。
特别地，本发明涉及特异性结合聚蛋白聚糖的ISVD，其中所述ISVD基本上由4个框架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中所述ISVD选自一组ISVD，其中(a)CDR1是SEQ ID NO：169，CDR2是SEQ ID NO：170，并且CDR3是SEQ ID NO：171；(b)CDR1是SEQ ID NO：172，CDR2是SEQ ID NO：173，并且CDR3是SEQ ID NO：174。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其包含至少2个特异性结合聚蛋白聚糖的ISVD。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其包含至少2个特异性结合聚蛋白聚糖的ISVD，其中所述至少2个特异性结合聚蛋白聚糖的ISVD可以相同或不同。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其包含至少2个特异性结合聚蛋白聚糖的ISVD，其中所述至少2个特异性结合聚蛋白聚糖的ISVD独立地选自SEQ ID NO：166-168。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其包含至少2个特异性结合聚蛋白聚糖的ISVD，其中所述至少2个特异性结合聚蛋白聚糖的ISVD由SEQ ID NO：166-168表示。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其包含特异性结合聚蛋白聚糖的ISVD，其中所述特异性结合聚蛋白聚糖的ISVD特异性结合人聚蛋白聚糖[SEQ ID NO：105]。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述ISVD特异性结合聚蛋白聚糖特异性结合人聚蛋白聚糖(SEQ ID NO：105)，狗聚蛋白聚糖，牛聚蛋白聚糖，大鼠聚蛋白聚糖；猪聚蛋白聚糖；小鼠聚蛋白聚糖，兔聚蛋白聚糖；食蟹猴聚蛋白聚糖和/或恒河猴聚蛋白聚糖。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述特异性结合聚蛋白聚糖的ISVD优选地结合软骨组织，例如软骨和/或半月板。
应当理解，本发明的ISVD、多肽和构建体优选地是稳定的。本发明的多肽、构建体或ISVD的稳定性可以通过本领域技术人员已知的常规测定法来测量。典型的测定法包括(但不限于)这样的测定法，其中确定所述多肽、构建体或ISVD的活性，然后在滑膜液中孵育所需的时间段，然后再次确定活性，例如在实施例部分中详细描述的。
在一方面，本发明涉及本发明的ISVD、多肽或构建体，其在滑膜液(SF)中在37℃具有至少7天，例如至少14天，21天，1个月，2个月或甚至3个月的稳定性。
一方面，本发明涉及本发明的ISVD、多肽或构建体，其以至少5μm，例如至少10μm、20μm、30μm、40μm、50μm或甚至更多渗透入软骨。
可以通过本领域技术人员已知的常规测定法测量治疗性构件例如本发明的多价多肽或构建体中结合MMP13的ISVD的所需活性。典型的测定法包括(但不限于)GAG释放测定法，如在实施例部分中详细描述的。
相对亲和力可以取决于ISVD在多肽中的位置。应当理解，可以根据本领域技术人员的需要选择本发明的多肽中的ISVD的顺序(方向)。各个ISVD的顺序以及多肽是否包含接头都是设计选择的问题。与其他方向相比，具有或不具有接头的某些方向可以提供优选的结合特性。例如，本发明的多肽中第一ISVD(例如ISVD 1)和第二ISVD(例如ISVD 2)的顺序可以是(从N末端到C末端)：(i)ISVD 1(例如纳米抗体1)-[接头]-ISVD 2(例如纳米抗体2)-[C-末端延伸]；或(ii)ISVD 2(例如，纳米抗体2)-[接头]-ISVD 1(例如纳米抗体1)-[C-末端延伸]；(其中方括号之间的部分，即接头和C端延伸是可选的)。本发明涵盖所有方向。可以通过常规筛选容易地鉴定包含提供期望的结合特征的ISVD的方向的多肽，例如在实施例部分中举例说明的。优选的顺序是从N末端至C末端：结合MMP13的ISVD-[接头]-结合聚蛋白聚糖的ISVD-[C端延伸]，其中方括号之间的部分是可选的。另一个优选的顺序是从N末端到C末端：结合MMP13的ISVD-[接头]-结合聚蛋白聚糖的ISVD-[接头]-结合聚蛋白聚糖的ISVD-[C末端延伸]，其中方括号之间的部分是可选的。例如参见表F。
半衰期
在本发明的特定方面，与没有所述部分的本发明的相应构建体或多肽相比，本发明的构建体或多肽可具有赋予增加的半衰期的部分。基于本文的进一步公开，本发明的此类构建体和多肽的一些优选但非限制性的实例对于本领域技术人员将变得清楚，并且例如包含已被化学修饰以增加其半衰期(例如，通过聚乙二醇化)的本发明的ISVD或多肽；本发明的MMP13结合物，例如本发明的ISVD和/或多肽，其包含至少一个用于结合血清蛋白(例如血清白蛋白)的另外的结合位点；或者包含至少一个本发明的ISVD的本发明的多肽，该ISVD与增加本发明的氨基酸序列的半衰期的至少一个部分(特别是至少一个氨基酸序列)连接。基于本文的进一步公开，包含此类半衰期延长部分或ISVD的本发明的构建体例如本发明的多肽的实例对于本领域技术人员将变得清楚；并且例如包括但不限于多肽，其中本发明的一个或多个ISVD合适地连接至一个或多个血清蛋白或其片段(例如(人)血清白蛋白或其合适的片段)或者一个或多个可以结合血清蛋白的结合单位(例如结构域抗体、适合用作结构域抗体的免疫球蛋白单可变结构域，单结构域抗体，适合用作单结构域抗体的免疫球蛋白单可变结构域，dAb，适合用作dAb的免疫球蛋白单可变结构域或者可以结合血清蛋白例如血清白蛋白(例如人血清白蛋白)、血清免疫球蛋白(例如IgG)或转铁蛋白的纳米抗体；参考进一步说明和本文提及的参考文献)；其中本发明的氨基酸序列连接至Fc部分(例如人Fc)或者其合适部分或片段的多肽；或者其中本发明的一个或多个免疫球蛋白单可变结构域适当地连接至一个或多个可结合血清蛋白的小蛋白或肽的多肽，例如WO 91/01743、WO 01/45746、WO 02/076489、WO2008/068280、WO2009/127691和PCT/EP2011/051559中所述的蛋白和肽。
在一方面，本发明提供了本发明的构建体或多肽，其中所述构建体或所述多肽还包含血清蛋白结合部分或血清蛋白。优选地，所述血清蛋白结合部分结合血清白蛋白，例如人血清白蛋白。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其包含结合血清白蛋白的ISVD。
通常，具有增加的半衰期的本发明的构建体或多肽优选地具有半衰期是本发明相应的构建体或多肽本身(即没有赋予增加的半衰期的部分)的半衰期的至少1.5倍，优选地至少2倍，例如至少5倍，例如至少10倍或大于20倍。例如，与本发明的相应的构建体或多肽本身(即不具有赋予增加的半衰期的部分)相比，具有增加的半衰期的本发明的构建体或多肽可以具有半衰期例如在人中增加大于1小时，优选地大于2小时，更优选地大于6小时，例如大于12小时，或甚至大于24、48或72小时。
在本发明的一个优选的但非限制性的方面，与本发明的相应的构建体或多肽本身(即不具有赋予增加的半衰期的部分)相比，本发明的构建体和本发明的多肽具有血清半衰期例如在人中增加大于1小时，优选地大于2小时，更优选大于6小时，例如大于12小时，或甚至大于24、48或72小时。
在本发明的另一个优选但非限制性的方面，本发明的此类构建体，例如本发明的多肽显示在人中的血清半衰期是至少约12小时，优选地至少24小时，更优选地至少48小时，甚至更优选地至少72小时或更多。例如，本发明的构建体或多肽具有半衰期是至少5天(例如约5至10天)，优选地至少9天(例如约9至14天)，更优选地至少约10天(例如约10至15天)，或至少约11天(例如约11至16天)，更优选地至少约12天(例如约12至18天或更多)，或大于14天(例如大约14到19天)。
在本发明的一个特别优选但非限制性的方面，本发明提供了本发明的构建体和本发明的多肽，其包含除了一个或多个结合MMP13的构件和可能地一个或多个CAP构件例如结合聚蛋白聚糖的ISVD外，至少一个结合血清白蛋白的构件，例如结合血清白蛋白例如本文所述的人血清白蛋白的ISVD。优选地，所述结合血清白蛋白的ISVD包含或基本上由4个框架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中CDR1是SFGMS，CDR2是SISGSGSDTLYADSVKG，并且CDR3是GGSLSR。优选地，所述结合人血清白蛋白的ISVD选自Alb8、Alb23、Alb129、Alb132、Alb11、Alb11(S112K)-A、Alb82、Alb82-A、Alb82-AA、Alb82-AAA、Alb82-G、Alb82-GG、Alb82-GGG、Alb92、Alb135或Alb223(参见表D)。
在一个实施方案中，本发明涉及本发明的构建体，例如包含血清蛋白结合部分的多肽，其中所述血清蛋白结合部分是非基于抗体的多肽。
其他部分
在一方面，本发明涉及如本文所述的构建体，其包含一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元。一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元优选地选自聚乙二醇分子、血清蛋白或其片段、可以结合血清蛋白的结合单元、Fc部分和可以结合血清蛋白的小蛋白或肽、其他氨基酸残基、标签或其他功能部分结合，例如毒素、标签、放射化学物质等。
在一个实施方案中，如下文所述，本发明涉及本发明的构建体，例如包含赋予半衰期延长的部分的多肽，其中所述部分是PEG。因此，本发明还涉及包含PEG的本发明的构建体或多肽。
所述另外的氨基酸残基可以或可以不改变、更改或以其他方式影响本发明的多肽的其他(生物学)性质，并且可以或可以不向本发明的多肽添加其他功能性。例如，这样的氨基酸残基：
a)可以包含N末端Met残基，例如作为在异源宿主细胞或宿主生物中表达的结果。
b)可以形成信号序列或前导序列，其指导合成后从宿主细胞分泌多肽(例如，根据用于表达本发明多肽的宿主细胞的不同，提供本发明多肽的前、原或前原形式)。合适的分泌前导肽对技术人员将是清楚的，并且可以如本文进一步描述。通常，这种前导序列将与多肽的N-末端连接，尽管本发明在最广泛的意义上不限于此。
c)可以形成“标签”，例如允许或促进多肽纯化的氨基酸序列或残基，例如使用针对所述序列或残基的亲和技术。此后，可以除去所述序列或残基(例如通过化学或酶促裂解)以提供多肽(为此目的，标签可以可选地通过可裂解的接头序列或包含可裂解的基序而连接至氨基酸序列或多肽序列)。这种残基的一些优选但非限制性实例是多个组氨酸残基、谷胱甘肽残基、myc标签例如AAAEQKLISEEDLNGAA(SEQ ID NO:175)、MYC-HIS-标签(SEQ IDNO:123)或FLAG-HIS6-标签(SEQ ID NO:124)(参见表B)；
d)可以是已经被官能化和/或可以用作附着官能团的位点的一个或多个氨基酸残基。合适的氨基酸残基和官能团对本领域技术人员将是清楚的，并且包括但不限于本文中针对本发明的多肽的衍生物提及的氨基酸残基和官能团。
本发明还包括构建体和/或多肽，其包含本发明的ISVD并且还包含其他功能性部分，例如毒素、标签、放射化学物质等。
其他基团、残基、部分或结合单元可以是例如化学基团、残基、部分，其本身可以具有或可以不具有生物学和/或药理学活性。例如但不限于，这样的基团可与本发明的一个或多个ISVD或多肽连接，以提供本发明的多肽或构建体的“衍生物”。
因此，本发明在其最广泛的意义上还包括作为本发明的构建体和/或多肽的衍生物的构建体和/或多肽。这样的衍生物通常可通过对本发明的构建体和/或多肽和/或形成本发明多肽的一个或多个氨基酸残基进行修饰，特别是通过化学和/或生物学(例如，酶促)修饰而获得。
这样的修饰的实例，以及可以以这种方式(即在蛋白质主链上，但优选地在侧链上)修饰的多肽序列内氨基酸残基的实例，可用于引入这样的修饰的方法和技术以及这样的修饰的潜在用途和优点对本领域技术人员将是清楚的(还参见Zangi等人,NatBiotechnol 31(10):898-907,2013)。
例如，这样的修饰可涉及将一个或多个(官能)基团、残基或部分(例如，通过共价连接或以任何其他合适的方式)引入本发明的多肽中或上，并且特别是赋予本发明的构建体和/或多肽以一种或多种所需特性或功能的一个或多个官能团、残基或部分。这样的官能团的实例对于技术人员将是清楚的。
例如，这种修饰可以包括引入(例如，通过共价结合或以任何其他合适的方式)一个或多个功能部分，其增加本发明的构建体或多肽的半衰期、溶解度和/或吸收，降低本发明的构建体或多肽的免疫原性和/或毒性，消除或减弱本发明的构建体或多肽的任何不良副作用，和/或赋予其他有利的特性和/或降低本发明的构建体或多肽的不良性质；或上述两个或更多个的任意组合。这样的功能性部分和用于引入它们的技术的实例对于技术人员将是清楚的，并且通常可以包括上文引用的一般背景技术中提及的所有功能性部分和技术，以及本身已知的用于修饰药物蛋白，特别是用于修饰抗体或抗体片段(包括ScFv和单结构域抗体)的功能性部分和技术，例如可参考Remington(Pharmaceutical Sciences，16thed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1980)。这样的功能性部分可以例如直接(例如共价地)连接至本发明的多肽，或可选地通过合适的接头或间隔子连接，这对于本领域技术人员将是清楚的。
一个具体实例是本发明的衍生多肽或构建体，其中本发明的多肽或构建体已被化学修饰以增加其半衰期(例如，通过聚乙二醇化)。这是增加药物蛋白的半衰期和/或降低其免疫原性的最广泛使用的技术之一，并且包括附着合适的药理学可接受的聚合物，例如聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物(例如甲氧基聚(乙二醇)或mPEG)。通常，可以使用任何合适形式的聚乙二醇化，例如本领域中用于抗体和抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFv)的聚乙二醇化；参考例如Chapman(Nat.Biotechnol.54:531-545,2002)，Veronese和Harris(Adv.Drug Deliv.Rev.54:453-456,2003)，Harris和Chess(Nat.Rev.Drug.Discov.2:214-221,2003)和WO 04/060965。用于蛋白质聚乙二醇化的多种反应剂也是可商购的，例如购自美国的Nektar Therapeutics。
优选地，使用定点聚乙二醇化，特别是通过半胱氨酸残基(参见例如Yang等人(Protein Engineering 16:761-770,2003)。例如，为此目的，PEG可以附着至天然存在于本发明的多肽中的半胱氨酸残基，可以修饰本发明的构建体或多肽以适当地引入一个或多个半胱氨酸残基用于PEG的附着，或者将包含用于PEG附着的一个或多个半胱氨酸残基的氨基酸序列融合到本发明的构建体或多肽的N-和/或C-末端，都使用本身是本领域技术人员已知的蛋白质工程改造的技术。
优选地，对于本发明的构建体或多肽，使用分子量大于5000，例如大于10,000并且小于200,000，例如小于100,000，例如在20,000-80,000范围内的PEG。
另一个通常次优选的修饰包括N-连接或O-连接的糖基化，通常作为共翻译和/或翻译后修饰的一部分，这取决于用于表达本发明多肽的宿主细胞。
根据本发明的多肽或构建体的预期用途，另一种修饰可以包括引入一个或多个可检测的标签或其他产生信号的基团或部分。合适的标签以及用于附着、使用和检测它们的技术对于技术人员将是清楚的，并且例如包括但不限于荧光标签(例如荧光素、异硫氰酸盐、若丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯甲醛以及荧光胺和荧光金属例如152Eu或镧系元素中的其他金属)，磷光标签，化学发光标签或生物发光标签(例如，鲁米诺、异鲁米诺、热吖啶鎓酯(theromatic acridinium ester)、咪唑、吖啶鎓盐、草酸酯、二氧杂环丁烷或GFP及其类似物)，放射性同位素(例如3H、125I、32P、35S、14C、51Cr、36Cl、57Co、58Co、59Fe和75Se)，金属，金属螯合物或金属阳离子(例如金属阳离子，例如99mTc、123I、111In、131I、97Ru、67Cu、67Ga和68Ga或者其他特别适用于体内、体外或原位诊断和成像的金属或金属阳离子，例如(157Gd、55Mn、162Dy、52Cr和56Fe))，以及生色团和酶(例如苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-V-甾族异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸三糖异构酶、生物素亲和素蛋白过氧化物酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-VI-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶)。其他合适的标签对于技术人员将是清楚的，并且例如包括可以使用NMR或ESR光谱法检测的部分。
这样标记的本发明的多肽和构建体也可以例如用于体外、体内或原位测定法(包括本身已知的免疫测定法，例如ELISA、RIA、EIA和其他“夹心测定法”等)以及体内诊断和成像的目的，取决于特定标签的选择。
如本领域技术人员将清楚的，另一种修饰可以包括引入螯合基团，例如以螯合上述金属或金属阳离子中的一种。合适的螯合基团例如包括但不限于二乙撑三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。
另一修饰可以包括引入功能部分，其是特异性结合对的一部分，例如生物素-(链)亲和素结合对。这种功能部分可用于将本发明的多肽与结合至结合对的另一半的另一个蛋白质、多肽或化合物连接，即通过形成结合对。例如，本发明的构建体或多肽可以与生物素缀合，并与与亲和素或链霉亲和素缀合的另一种蛋白质、多肽、化合物或载体连接。例如，这种缀合的本发明的构建体或多肽可以用作报告子，例如在诊断系统中，其中可检测的信号产生剂与亲和素或链霉亲和素缀合。这样的结合对还可例如用于将本发明的构建体或多肽与载体结合，所述载体包括适合于药学目的的载体。一个非限制性实例是由Cao和Suresh(Journal of Drug Targeting 8:257,2000)描述的脂质体制剂。这样的结合对还可用于将治疗活性剂连接至本发明的多肽。
其他潜在的化学和酶修饰对技术人员将是清楚的。也可以出于研究目的(例如，研究功能-活动关系)引入这样的修饰。参考例如Lundblad和Bradshaw(Biotechnol.Appl.Biochem.26:143-151,1997)。
优选地，构建体、多肽和/或衍生物使得它们以本文定义的(例如，如针对本发明的多肽所定义的)亲和力(适当地测量和/或表达为KD值(实际或表观)、KA值(实际或表观)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地以IC50值，如本文进一步描述的)结合MMP13。
本发明的这样的构建体和/或多肽及其衍生物也可以是基本上分离的形式(如本文所定义)。
在一方面，本发明涉及本发明的构建体，其包含或基本上由根据本发明的ISVD或根据本发明的多肽组成，并且还包含一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元，其可选地通过一个或多个肽接头连接。
在一方面，本发明涉及本发明的构建体，其中一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元选自聚乙二醇分子、血清蛋白或其片段，可以结合血清蛋白的结合单元、Fc部分和可以结合血清蛋白的小蛋白或肽。
接头
在本发明的构建体，例如本发明的多肽中，两个或更多个构件，例如ISVD，和可选的一个或多个其他基团、药剂、试剂、残基、部分或结合单元可以彼此直接连接(例如，如WO99/23221中所述)和/或可以通过一个或多个合适的间隔子或接头彼此连接，或其任何组合。用于多价和多特异性多肽的合适的间隔子或接头对本领域技术人员将是清楚的，并且通常可以是本领域中用于连接氨基酸序列的任何接头或间隔子。优选地，所述接头或间隔子适合用于构建旨在用于药学用途的构建体、蛋白质或多肽。
例如，本发明的多肽可以是例如三价、三特异性多肽，包含一个构件，例如结合MMP13的ISVD，CAP构件，例如结合聚蛋白聚糖的ISVD，以及潜在地另一个构件，例如第三ISVD，其中所述第一、第二和第三构件，如ISVD，可以可选地通过一个或多个，并且特别是2个接头序列连接。而且，本发明提供了本发明的构建体或多肽，其包含结合MMP13的第一ISVD和可能地结合聚蛋白聚糖的第二ISVD和/或可能地第三ISVD和/或可能地第四ISVD，其中所述第一ISVD和/或所述第二ISVD和/或可能地所述第三ISVD和/或可能地所述第四ISVD经由接头连接，特别是3个接头。
一些特别优选的接头包括本领域中用来连接抗体片段或抗体结构域的接头。这些包括上文引用的一般背景技术中提及的接头，以及例如本领域中用于构建双抗体或ScFv片段的接头(然而，在这方面，应注意，尽管在双抗体和ScFv片段中，所用的接头序列应具有一定长度、一定程度的柔韧性和其他特性，以使相关的VH和VL结构域结合在一起形成完整的抗原结合位点，对在本发明的多肽中使用的接头的长度或柔韧性没有特殊限制，因为每个ISVD，如纳米抗体，其本身形成完整的抗原结合位点)。
例如，接头可以是合适的氨基酸序列，并且特别是1至50，优选地1至30，例如1至10个氨基酸残基的氨基酸序列。这样的氨基酸序列的一些优选实例包括gly-ser接头，例如(glyxsery)2类型，例如(例如(gly4ser)3或(gly3ser2)3，如WO 99/42077中所述和在本文提及的Ablynx的申请中描述的GS30、GS15、GS9和GS7接头(参见例如WO 06/040153和WO 06/122825)，以及铰链样区域，例如天然存在的重链抗体的铰链区或类似序列(如WO 94/04678中所述)。表C中描述了优选的接头。
一些其他特别优选的接头是聚丙氨酸(例如AAA)，以及接头GS30(WO 06/122825中的SEQ ID NO：85)和GS9(WO 06/122825中的SEQ ID NO：84)。
其他合适的接头通常包含有机化合物或聚合物，特别是适合用于药学用途的蛋白质的那些。例如，聚(乙二醇)部分已用于连接抗体结构域，参见例如WO 04/081026。
在本发明的范围内包括所用接头的长度、柔韧性的程度和/或其他性质(尽管不是关键性的，因为通常对于ScFv片段中所用的接头而言)可能对本发明的最终构建体例如本发明的多肽的性质有一定影响，包括但不限于对MMP13或对一个或多个其他抗原的亲和力、特异性或亲合力。基于本文的公开内容，技术人员将能够可选地在一些有限的常规实验之后，确定用于本发明的特定构建体例如本发明的多肽的最佳接头。
例如，在包含针对MMP13和另一个靶标的构件、ISVD或纳米抗体的本发明的多价多肽中，接头的长度和柔韧性优选地使得其允许在多肽中存在的本发明的每个构件例如ISVD结合其同源靶标，例如每个靶标上的抗原决定簇。再次，基于本文的公开内容，本领域技术人员将能够可选地在一些有限的常规实验之后确定用于本发明的特定构建体例如本发明的多肽的最佳接头。
也在本发明的范围内，所使用的接头为本发明的构建体例如本发明的多肽赋予一种或多种其他有利的性质或功能性，和/或为衍生物的形成和/或为官能团的附着提供一个或多个位点(例如，如本文针对本发明的ISVD的衍生物所述)。例如，含有一个或多个带电荷的氨基酸残基的接头可以提供改善的亲水性，而形成或含有小的表位或标签的接头可以用于检测、鉴定和/或纯化的目的。再次，基于本文的公开内容，本领域技术人员将能够可选地在一些有限的常规实验之后确定用于本发明的特定多肽的最佳接头。
最后，当在本发明的构建体例如多肽中使用两个或更多个接头时，这些接头可以相同或不同。再次，基于本文的公开内容，本领域技术人员将能够可选地在一些有限的常规实验之后确定用于本发明的特定构建体或多肽的最佳接头。
通常，为了易于表达和生产，本发明的构建体，例如本发明的多肽，将是线性多肽。然而，本发明在最广泛的意义上不限于此。例如，当本发明的构建体，例如本发明的多肽，包含三个或更多个构件、ISVD或纳米抗体时，可以通过使用具有三个或更多个“臂”的接头将它们连接起来，每个“臂”连接至构件、ISVD或纳米抗体，从而提供“星形”构建体。尽管通常为次优选，但也可以使用环形构建体。
因此，本发明涉及本发明的构建体，例如本发明的多肽，其中所述ISVD彼此直接连接或通过接头连接。
因此，本发明涉及本发明的构建体，例如本发明的多肽，其中第一ISVD和/或第二ISVD和/或可能地结合血清白蛋白的ISVD通过接头连接。
因此，本发明涉及本发明的构建体，例如本发明的多肽，其中所述接头选自A3、5GS、7GS、8GS、9GS、10GS、15GS、18GS、20GS、25GS、30GS、35GS、40GS、G1铰链、9GS-G1铰链、美洲驼上长铰链区域和G3铰链的接头，例如表C中所示。
因此，本发明涉及本发明的构建体，例如本发明的多肽，其中所述多肽选自表A-3和表F所示的组，例如选自SEQ ID NO：164-165、160、161、162、163和SEQ ID NO：176、192和175-191(即175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190或191)。
制备
本发明进一步涉及用于制备本文所述的构建体、多肽、ISVD、核酸、宿主细胞和组合物的方法。
本发明的多价多肽通常可以通过这样的方法来制备，该方法至少包括以下步骤：将本发明的ISVD和/或单价多肽适当地连接至一个或多个另外的ISVD，可选地经由一个或多个合适的接头，以便提供本发明的多价多肽。本发明的多肽还可以通过这样的方法来制备，该方法通常至少包括以下步骤：提供编码本发明多肽的核酸，以合适的方式表达所述核酸，并回收表达的本发明多肽。这样的方法可以以本身已知的方式执行，这对于本领域技术人员来说是清楚的，例如基于本文进一步描述的方法和技术。
制备本发明的多价多肽的方法可以至少包括以下步骤：以合适的方式将两个或更多个本发明的ISVD和例如一个或多个接头连接在一起。本发明的ISVD(和接头)可以通过本领域已知的和本文进一步描述的任何方法缀合。优选的技术包括连接编码本发明的ISVD(和接头)的核酸序列以制备表达多价多肽的遗传构建体。连接氨基酸或核酸的技术对技术人员将是清楚的，并且再次参考标准手册，例如上面提到的Sambrook等人和Ausubel等人，以及下面的实施例。
因此，本发明还涉及本发明的ISVD在制备本发明的多价多肽中的用途。制备多价多肽的方法将包括本发明的ISVD与至少一个本发明的另外的ISVD的连接，可选地经由一个或多个接头。然后，本发明的ISVD在提供和/或制备包含2个(例如，在二价多肽中)、3个(例如，三价多肽)、4个(例如，四价)或更多个(例如，在多价多肽中)构件的多价多肽中用作结合结构域或构件。在这方面，本发明的ISVD可用作提供和/或制备包含2、3、4或更多个构件的本发明的多价，例如二价、三价或四价多肽的结合结构域或结合单元。
因此，本发明还涉及本发明的ISVD多肽(如本文所述)在制备多价多肽中的用途。制备多价多肽的方法将包括本发明的ISVD与至少一个本发明的另外的ISVD的连接，可选地经由一个或多个接头。
本领域技术人员从本文的进一步描述中可以清楚地理解，可以以本身已知的方式制备本发明的多肽和核酸。例如，可以以本身已知的、用于制备抗体，特别是用于制备抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFv片段)的任何方式来制备本发明的多肽。用于制备多肽和核酸的一些优选但非限制性的方法包括本文所述的方法和技术。
用于产生本发明的多肽的方法可以包括以下步骤：
-在合适的宿主细胞或宿主生物(在本文中也称为“本发明的宿主”)中或在编码所述的本发明的多肽的核酸的另一合适的表达系统(在本文中也称为“本发明的核酸”)中表达，
可选地，随后
-分离和/或纯化由此获得的本发明的多肽。
特别地，这种方法可以包括以下步骤：
-在使得所述的本发明的宿主表达和/或产生至少一个本发明的多肽的条件下培养和/或维持本发明的宿主；
可选地，随后
-分离和/或纯化由此获得的本发明的多肽。
因此，本发明还涉及编码本发明的多肽、ISVD或构建体的核酸或核苷酸序列(也称为“本发明的核酸”)。
本发明的核酸可以是单链或双链DNA或RNA的形式。根据本发明的一个实施方案，本发明的核酸基本上是分离的形式，如本文所定义的。本发明的核酸也可以是载体的形式，存在于载体中和/或作为载体的一部分，载体例如表达载体，例如质粒、粘粒或YAC，它们也可以基本上是分离的形式。因此，本发明还涉及包含本发明的核酸或核苷酸序列的表达载体。
基于本文给出的关于本发明的多肽的信息，可以以本身已知的方式制备或获得本发明的核酸，和/或可以从合适的天然来源分离。同样，如本领域技术人员将清楚的那样，为了制备本发明的核酸，还可以将几个核苷酸序列，例如至少两个编码本发明的ISVD的核酸和例如编码一个或多个接头的核酸以适当的方式连接一起。产生本发明的核酸的技术对于技术人员将是清楚的，并且可以例如包括但不限于自动化DNA合成；定点诱变；组合两个或更多个天然存在的和/或合成的序列(或者其两个或更多个部分)，引入导致截短的表达产物表达的突变；引入一个或多个限制酶切位点(例如，使用合适的限制酶容易产生易被消化和/或连接的盒和/或区域)，和/或通过使用一种或多种“错配”引物的PCR反应引入突变。这些和其他技术对于本领域技术人员将是清楚的，并且再次参考标准手册，例如上文提到的Sambrook等人和Ausubel等人，以及下面的实施例。
在优选但非限制性的实施方案中，本发明的遗传构建体包含
a)至少一个本发明的核酸；
b)可操作地连接至一个或多个调节元件，例如启动子和可选地合适的终止子；并且还可选地
c)本身已知的遗传构建体的一个或多个其他元件；
其中术语“调节元件”、“启动子”、“终止子”和“可操作地连接”具有其在本领域中通常的含义。
通常可以通过将本发明的核苷酸序列与上述一个或多个其他元件适当地连接来提供本发明的遗传构建体，例如使用一般手册中描述的技术，例如上文提到的Sambrook等人和Ausubel等人。
本发明的核酸和/或本发明的遗传构建体可用于转化宿主细胞或宿主生物，即用于表达和/或产生本发明的多肽。合适的宿主或宿主细胞对技术人员将是清楚的，并且可以是例如任何合适的真菌、原核或真核细胞或细胞系或者任何合适的真菌、原核或(非人)真核生物以及所有其他宿主细胞或(非人)宿主，它们本身已知用于表达和产生抗体和抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFv片段)，这对技术人员将是清楚的。还参考了上文引用的一般背景技术，以及例如WO 94/29457；WO 96/34103；WO 99/42077；Frenken等人(Res Immunol.149:589-99,1998)；Riechmann和Muyldermans(1999)，同上；van derLinden(J.Biotechnol.80:261-70,2000)；Joosten等人(Microb.Cell Fact.2:1,2003)；Joosten等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.66:384-92,2005)；以及本文引用的其他参考文献。此外，本发明的多肽还可以在无细胞表达系统中表达和/或产生，并且这样的系统的合适实例对技术人员将是清楚的。转化本发明的宿主或宿主细胞的合适技术对技术人员将是清楚的，并且可以取决于预期的宿主细胞/宿主生物和所使用的遗传构建体。再次参考上述手册和专利申请。转化的宿主细胞(可以是稳定的细胞系的形式)或宿主生物(可以是稳定的突变体系或菌株的形式)构成了本发明的其他方面。因此，本发明涉及包含根据本发明的核酸或根据本发明的表达载体的宿主或宿主细胞。优选地，这些宿主细胞或宿主生物使得它们表达或(至少)能够表达(例如在合适的条件下)本发明的多肽(并且在宿主生物的情况下：在其至少一个细胞、部分、组织或器官中)。本发明还包括本发明的宿主细胞或宿主生物的另外的世代、子代和/或后代，其可以例如通过细胞分裂或者通过有性或无性繁殖获得。
为了产生/获得本发明的多肽的表达，通常可以在表达/产生本发明的(期望的)多肽的条件下保持、维持和/或培养转化的宿主细胞或转化的宿主生物。合适的条件对技术人员将是清楚的，并且通常取决于所用的宿主细胞/宿主生物，以及取决于控制本发明(相关)核苷酸序列表达的调节元件。再次，参考以上关于本发明的遗传构建体的段落中提到的手册和专利申请。
然后可以使用本身已知的蛋白质分离和/或纯化技术，例如(制备性)层析和/或电泳技术、差异沉淀技术、亲和力技术(例如，使用与本发明的多肽融合的特异的、可裂解的氨基酸序列)和/或制备性免疫技术(即，使用针对待分离的多肽的抗体)，从宿主细胞/宿主生物和/或从其中培养所述宿主细胞或宿主生物的培养基中分离本发明的多肽。
在一方面，本发明涉及生产根据本发明的构建体、多肽或ISVD的方法，其至少包括以下步骤：(a)在合适的宿主细胞或宿主生物或另一合适的表达系统中表达根据本发明的核酸序列；可选地，随后是(b)分离和/或纯化根据本发明的构建体、多肽ISVD。
在一方面，本发明涉及包含根据本发明的构建体、多肽、ISVD或核酸的组合物。
药物(本发明的ISVD、多肽、构建体的用途)
如上所述，仍然需要安全有效的OA药物。基于非常规的筛选、表征和组合策略，本发明人鉴定了结合并抑制MMP13的ISVD。这些MMP13结合物在体外和体内实验中表现出色。而且，还证明了本发明的ISVD比竞品分子显著更有效。因此，本发明提供了与拮抗MMP，特别是MMP13的ISVD和多肽，与竞品分子相比，具有改善的预防、治疗和/或药理学特性，包括更安全的特征。另外，这些MMP13结合物当与CAP构件连接时，在关节中的保留增加并且另一方面也保持活性。
在一方面，本发明涉及根据本发明的组合物、根据本发明的ISVD、根据本发明的多肽和/或根据本发明的构建体用作药物。
在另一方面，本发明涉及本发明的ISVD、多肽和/或构建体在制备用于预防和/或治疗至少MMP13相关疾病的药物组合物中的用途；和/或用于本文提及的一种或多种治疗方法。
本发明还涉及本发明的ISVD、多肽、化合物和/或构建体在制备用于预防和/或治疗至少一种疾病或病症的药物组合物中的用途，可以通过调控MMP，优选地MMP13的活性，例如抑制聚蛋白聚糖和/或胶原蛋白降解来预防和/或治疗所述疾病或病症。
本发明还涉及本发明的ISVD、多肽、化合物和/或构建体在制备用于预防和/或治疗至少一种疾病、病症或病况的药物组合物中的用途，可以通过向患者施用本发明的ISVD、多肽、化合物和/或构建体来预防和/或治疗所述疾病、病症或病况。
本发明进一步涉及本发明的ISVD、多肽、化合物和/或构建体或者包含其的药物组合物，用于预防和/或治疗至少一种MMP13相关疾病。
预期本发明的MMP13结合物可用于多种影响软骨的疾病，例如关节病和软骨营养不良，关节炎疾病，例如骨关节炎，类风湿性关节炎，痛风性关节炎，银屑病关节炎，外伤性破裂或脱离，软骨发育不全，肋软骨炎，脊椎干骺端发育不良，椎间盘突出症，腰椎间盘退变疾病，退变性关节疾病，和复发性多发性软骨炎，剥离性骨软骨炎和聚蛋白聚糖病变(在本文中通常称为“MMP13相关疾病”)
在一方面，本发明涉及根据本发明的组合物、ISVD、多肽和/或构建体，用于治疗或预防MMP13相关疾病的症状，所述MMP13相关疾病例如是关节病和软骨营养不良，关节炎疾病，例如骨关节炎，类风湿性关节炎，痛风性关节炎，银屑病关节炎，外伤性破裂或脱离，软骨发育不全，肋软骨炎，脊椎干骺端发育不良，椎间盘突出症，腰椎间盘退变疾病，退变性关节疾病，和复发性多发性软骨炎，剥离性骨软骨炎和聚蛋白聚糖病变。更优选地，所述疾病或病症是关节炎疾病和更优选地骨关节炎。
在一方面，本发明涉及预防或治疗关节病和软骨营养不良，关节炎疾病，例如骨关节炎，类风湿性关节炎，痛风性关节炎，银屑病关节炎，外伤性破裂或脱离，软骨发育不全，肋软骨炎，脊椎干骺端发育不良，椎间盘突出症，腰椎间盘退变疾病，退变性关节疾病，和复发性多发性软骨炎的方法，其中所述方法包括向有此需要的受试者施用药物活性量的至少一个本发明的组合物、免疫球蛋白、多肽或构建体给有此需要的人。更优选地，所述疾病是关节炎疾病和最优选地骨关节炎。
在一方面，本发明涉及根据本发明的ISVD、多肽、组合物或构建体在制备用于治疗或预防疾病或病症的用途，所述疾病或病症例如关节炎和软骨营养不良，关节炎疾病，例如骨关节炎，类风湿性关节炎，痛风性关节炎，银屑病性关节炎，外伤性破裂或脱离，软骨发育不全，肋软骨炎，脊椎干骺端发育不良，椎间盘突出症，腰椎间盘退变疾病，退变性关节疾病，和复发性多发性软骨炎，剥离性骨软骨炎和聚蛋白聚糖病变。更优选地，所述疾病或病症是关节炎疾病和最优选地骨关节炎。
通过结合聚蛋白聚糖，本发明的构建体和/或多肽可以降低或抑制丝氨酸蛋白酶家族的成员，组织蛋白酶，基质金属蛋白酶(MMP)/Matrixin或具有血小板反应蛋白基序的去整合素和金属蛋白酶(ADAMTS)，MMP20，ADAMTS5(聚蛋白聚糖酶-2)，ADAMTS4(聚蛋白聚糖酶-1)和/或ADAMTS11降解聚蛋白聚糖的活性。
在本发明的上下文中，术语“预防和/或治疗”不仅包括预防和/或治疗疾病，而且通常还包括预防疾病的发作，减慢或逆转疾病的进展，预防或减慢与疾病有关的一种或多种症状的发作，减轻和/或缓解与疾病有关的一种或多种症状，减少疾病和/或与其有关的任何症状的严重性和/或持续时间，和/或预防疾病和/或与其相关的任何症状的严重程度进一步增加，预防、减少或逆转由疾病引起的任何生理损害，以及通常有益于在治疗患者的任何药理作用。
剂量方案将由主治医师和临床因素决定。如医学领域众所周知的，任何一位患者的剂量取决于许多因素，包括患者的身材、体重、体表面积、年龄，待施用的特定化合物，所用多肽(包括抗体)的活性，施用的时间和途径，总体健康状况以及与其他疗法或疗法的组合。蛋白质性药物活性物质的存在量是每剂量1g至100mg/kg体重；然而，也可以设想低于或高于该示例性范围的剂量。如果方案是连续输注，则其范围可以是每分钟每公斤体重1pg至100mg。
本发明的ISVD、多肽或构建体可以以例如0.01、0.1、0.5、1、2、5、10、20或50pg/ml的浓度使用，以抑制和/或中和MMP13的生物学功能至少约50％，优选地75％，更优选地90％，95％或至多99％，和最优选地约100％(基本上完全)，如通过本领域公知的方法测定的。
本发明的ISVD、多肽或构建体可以以例如1、2、5、10、20、25、30、40、50、75、100、200、250或500ng/mg软骨的浓度使用，以抑制和/或中和MMP13的生物学功能的至少约50％，优选地75％，更优选地90％，95％或至多99％，和最优选地约100％(基本上完全)，如通过本领域公知的方法测定的。
通常，治疗方案将包括以一个或多个药学有效量或剂量施用一个或多个本发明的ISVD、多肽和/或构建体，或者包含其的一个或多个组合物。再次基于上述因素，临床医生可以确定待施用的具体量或剂量。本发明的构建体、多肽和/或ISVD的有用剂量可以通过在动物模型中比较它们的体外活性和体内活性来测定。将在小鼠和其他动物中的有效剂量向人外推的方法是本领域已知的；例如，参见US 4,938,949。
通常，取决于待治疗的特定疾病、病症或病况，所使用的本发明的特定ISVD、多肽和/或构建体的效力，特定的施用途径和所使用的特定药物制剂或组合物，临床医生将能够确定合适的每日剂量。
用于治疗所需的本发明的构建体、多肽和/或ISVD的量不仅会随所选择的特定免疫球蛋白、多肽、化合物和/或构建体而变化，而且还会随施用途径、在治疗病症的性质以及患者的年龄和状况而变化，并且最终将由主治医师或临床医生决定。同样，本发明的构建体、多肽和/或ISVD的剂量根据靶细胞、组织、移植物、关节或器官而变化。
所需剂量可以方便地是单剂量或以适当间隔施用的分剂量，例如每天两次、三次、四个或更多次亚剂量。所述亚剂量本身可以进一步分为例如多个离散的松散间隔施用。优选地，剂量每周一次或甚至更低频率施用，例如每两周一次、每三周一次、每月一次或甚至每两个月一次。
施用方案可包括长期治疗。“长期”是指至少两周，并且优选地数周、数月或数年的持续时间。本领域普通技术人员可以仅使用本文教导的常规实验来确定该剂量范围内的必要修饰。参见Remington’s Pharmaceutical Sciences(Martin,E.W.,ed.4),MackPublishing Co.,Easton,PA.。在发生任何并发症的情况下，剂量也可以由个别医生进行调整。
通常，在以上方法中，将使用本发明的ISVD、多肽和/或构建体。然而，组合使用两个或更多个本发明的ISVD、多肽和/或构建体也在本发明的范围内。
本发明的ISVD、多肽和/或构建体可以与一个或多个其他药物活性化合物或原理组合使用，即，作为组合治疗方案，这可以产生或不产生协同作用。
药物组合物还可包含至少一种其他活性剂，例如一种或多种其他抗体或其抗原结合片段、肽、蛋白质、核酸、有机和无机分子。
再次，临床医生将能够根据上述因素和他的专家判断，选择这样的其他化合物或原理，以及合适的组合治疗方案。
特别地，本发明的ISVD、多肽和/或构建体可以与其他药物活性化合物或原理组合使用，所述化合物或原理是或可以用于预防和/或治疗本文所引用的疾病、病症和病况，其结果是可以获得或不会获得协同效果。这样的化合物和原理的实例，以及施用它们的途径、方法和药物制剂或组合物对于临床医生将是清楚的。
当将两种或更多种物质或原理用作组合治疗方案的一部分时，可以在基本上相同的时间或不同的时间(例如，基本上同时、连续地或根据交替方案)，通过相同的施用途径或通过不同的施用途径施用它们。当通过相同的施用途径同时施用物质或原理时，它们可以作为不同的药物制剂或组合物或者组合的药物制剂或组合物的一部分来施用，这对于本领域技术人员将是清楚的。
同样，当两种或更多种活性物质或原理用作组合治疗方案的一部分时，每种物质或原理可以以与当单独使用化合物或原理时使用的相同量和根据相同的方案使用，并且这种组合使用可以产生或不产生协同效应。然而，当两种或更多种活性物质或原理的组合使用产生协同作用时，也可能减少一种、多种或所有待施用的物质或原理的量，同时仍实现所需的治疗作用。这例如可以用于避免、限制或减少与一种或多种物质或原理以其通常量使用时的使用相关的任何不良副作用，同时仍获得所需的药物或治疗效果。
可以以针对所涉及的疾病、病症或病况本身已知的方式来确定和/或跟踪根据本发明使用的治疗方案的有效性，这对于临床医生将是清楚的。在适当的情况下，临床医生还将能够根据具体情况改变或修改特定的治疗方案，以达到所需的治疗作用，避免、限制或减少不良的副作用，和/或在一方面达到所需的治疗作用与另一方面避免、限制或减少不良副作用之间取得适当的平衡。
通常，将遵循治疗方案直到达到期望的治疗作用和/或只要保持期望的治疗效果。再次，这可以由临床医生确定。
因此，在另一方面，本发明涉及药物组合物，其包含至少一个本发明的构建体，至少一个本发明的多肽，至少一个本发明的ISVD或至少一个本发明的核酸和至少一个合适的载体、稀释剂或赋形剂(即，适合于药物用途)，以及可选地一个或多个其他活性物质。在一个特定的方面，本发明涉及药物组合物，其包含根据本发明的构建体、多肽、ISVD或核酸，优选地SEQ ID NO：111、11、112、12、109、9、110、10、1、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、2、3、4、5、6、7、8、160-165(即SEQ ID NO:160、161、162、163、164或165)和176-192(即SEQ ID NO:176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191或192)中的至少一个和至少一个合适的载体、稀释剂或赋形剂(即，适用于药物用途)，以及可选的一个或多个其他活性物质。
待治疗的受试者可以是任何温血动物，但特别是哺乳动物，更特别是人类。在兽医应用中，待治疗的受试者包括为商业目的饲养或作为宠物饲养的任何动物。对本领域技术人员将清楚的是，待治疗的受试者将特别是患有或处于本文所述的疾病、病症和病况风险中的人。因此，在本发明的优选实施方案中，包含本发明的多肽的药物组合物用于医学或诊断学。优选地，药物组合物用于人类医学，但是它们也可以用于兽医目的。
再次，在这样的药物组合物中，本发明的一种或多种免疫球蛋白、多肽、化合物和/或构建体，或编码它们的核苷酸，和/或包含它们的药物组合物也可以适当地与一个或多个活性原理组合，例如本文提及的那些。
本发明还涉及用于体外(例如在体外或细胞测定法中)或体内(例如在单细胞中或多细胞生物，尤其是在哺乳动物中，并且更特别是在人类中，例如在具有本发明的疾病、病症或病况的风险中或患有本发明的疾病、病症或病况的人中)使用的组合物(例如但不限于本文进一步描述的药物组合物或制备物)。
应当理解，除非另外明确指出，否则对治疗的提及既包括对已建立症状的治疗也包括预防性治疗。
通常，对于药物用途，可以将本发明的构建体、多肽和/或ISVD配制成包含至少一个本发明的构建体、多肽和/或ISVD和至少一个药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂和/或佐剂以及可选地一个或多个药物活性多肽和/或化合物的药物制备物或组合物。通过非限制性实例，这样的制剂可以是适合于口服施用，肠胃外施用(例如通过静脉内、肌肉内或皮下注射或静脉内输注)，局部施用(例如关节内施用)，通过吸入施用，通过皮肤贴剂，通过植入物，通过栓剂等的形式，其中关节内施用是优选的。这样的合适的施用形式(可以是固体、半固体或液体，取决于施用方式)以及用于制备其的方法和载体对于本领域技术人员将是清楚的，并且在本文中进一步描述。这样的药物制备物或组合物在本文中通常被称为“药物组合物”。
作为示例性的赋形剂，可以提及崩解剂、粘合剂、填充剂和润滑剂。崩解剂的实例包括琼脂、藻酸盐、碳酸钙、纤维素、胶体二氧化硅、树胶、硅酸铝镁、甲基纤维素和淀粉。粘合剂的实例包括微晶纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。填充剂的实例包括碳酸钙、磷酸钙、三碱式硫酸钙、羧甲基纤维素钙、纤维素、糊精、右旋糖、果糖、乳糖醇、乳糖、碳酸镁、氧化镁、麦芽糖醇、麦芽糖糊精、麦芽糖、山梨糖醇、淀粉、蔗糖、糖和木糖醇。润滑剂的实例包括琼脂、油酸乙酯、月桂酸乙酯、甘油、棕榈硬脂酸甘油酯、氢化植物油、氧化镁、硬脂酸酯、甘露醇、泊洛沙姆、乙二醇、苯甲酸钠、月桂基硫酸钠、硬脂酸钠、山梨糖醇和滑石。通常的稳定剂、防腐剂、湿润和乳化剂、稠度改善剂、风味改善剂、用于改变渗透压的盐、缓冲物质、增溶剂、稀释剂、润肤剂、着色剂和掩蔽剂以及抗氧化剂均考虑作为药物佐剂。
合适的载体包括但不限于碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂、水、醇类、多元醇、甘油、植物油等。
通常，本发明的构建体、多肽和/或ISVD可以以本身已知的任何合适方式配制和施用。参考例如以上引用的一般背景技术(并且尤其是参考WO04/041862、WO 04/041863、WO04/041865、WO 04/041867和WO 08/020079)以及标准手册，如Remington’sPharmaceutical Sciences,18th Ed.,Mack Publishing Company,USA(1990),Remington,the Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,Lippincott Williams andWilkins(2005)；或the Handbook of Therapeutic Antibodies(S.Dubel,Ed.),Wiley,Weinheim,2007(参见例如第252-255页)。
在一个特定的方面，本发明涉及药物组合物，其包含根据本发明的构建体、多肽、ISVD或核酸，并且还包含至少一个药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂和/或佐剂，并且可选地包含一个或多个其他药物活性多肽和/或化合物。
本发明的构建体、多肽和/或ISVD可以以用于常规抗体和抗体片段(包括ScFv和双抗体)和其他药物活性蛋白的本身已知的任何已知方式配制和施用。这样的制剂和制备它们的方法对于技术人员将是清楚的，并且例如包括优选适于肠胃外施用(例如静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、腔内、动脉内、鞘内鼻内或支气管内施用)，但是也用于局部(即关节内、透皮或皮内)施用的制备物。
局部或肠胃外施用的制备物可以是例如适于输注或注射的无菌溶液、悬浮液、分散液或乳剂。用于这种制备物的合适的载体或稀释剂例如包括WO08/020079的第143页提到的那些。通常，水溶液或悬浮液将是优选的。
本发明的构建体、多肽和/或ISVD也可以使用基因疗法中已知的递送方法进行施用，参见例如美国专利号5,399,346，其基因疗法递送方法通过引用并入本文。使用递送的基因疗法方法，用编码本发明的构建体、多肽和/或ISVD的基因转染的原代细胞可以另外地用组织特异性启动子转染以靶向特定的器官、组织、移植物、关节或细胞，并且还可以用信号和稳定化序列转染用于亚细胞局部表达。
根据本发明的其他方面，本发明的多肽可以用于体内和体外的其他应用。例如，可以将本发明的多肽用于诊断目的，例如在设计为检测和/或定量MMP13的存在和/或纯化MMP13的测定法中。也可以在特定疾病的动物模型中测试多肽，并进行毒理学、安全性和剂量研究。
最后，本发明涉及试剂盒，其包括至少一个根据本发明的多肽，至少一个编码所述组分的核酸序列，本发明的载体或载体系统和/或根据本发明的宿主细胞。可以设想，试剂盒可以以不同的形式提供，例如，作为诊断试剂盒。
现在将通过以下非限制性的优选方面、实施例和附图进一步描述本发明。
在本申请全文中引用的所有参考文献(包括文献参考文献、授权专利、公开的专利申请和共同未决的专利申请)的全部内容在此明确地通过引用并入，特别是对于上文所引用的教导。
根据WIPO标准ST.25，在说明书的主体和单独的序列表中公开了序列。在说明书的主体和单独的序列表中，使用特定编号指定的SEQ ID应相同。通过示例的方式，SEQ IDNo.：1应当在说明书的主体和单独的序列表中定义相同的序列。说明书主体中的序列定义与单独的序列表之间存在差异(例如，说明书主体中的SEQ ID no.:1错误地对应于单独序列中的SEQ ID no.:2)，则对本申请中特定序列的引用，尤其是在特定实施方案中，应理解为对本申请主体中序列的引用，而不是对单独序列表的引用。换句话说，说明书主体与单独的序列表中的序列定义/名称之间的差异应通过将单独的序列表校正为在本申请的主体中公开的序列及其名称来解决，本申请的主体包括包括说明、示例、附图和权利要求。
6实施例
下列实施例示例说明了本发明的方法和产品。对于本领域技术人员显而易见的是，在分子和细胞生物学领域中通常遇到的对所描述的条件和参数的合适修改和调整在本发明的精神和范围内。
6.1方法
6.1.1美洲鸵免疫
根据标准程序对美洲驼进行免疫，抗原的量、佐剂类型和所用注射方法有所不同。这些变化将在下面的各个部分中详细介绍。所有的免疫实验均得到当地伦理委员会的批准。
6.1.2文库构建
使用从用MMP13免疫的所有美洲驼/羊驼的血液样本中提取的总RNA制备cDNA。在一步RT-PCR反应中从cDNA扩增编码纳米抗体的核苷酸序列，并将其连接到噬菌粒载体pAX212的相应限制性酶切位点，然后通过电穿孔用连接产物转化大肠杆菌菌株TG-1。
NNK文库是通过使用简并引物的重叠延伸PCR生成的。将PCR产物克隆到表达载体(pAX129)中，并转化到大肠杆菌TG-1感受态细胞中。与纳米抗体编码序列同框，载体编码C末端FLAG3-和His6-标签。
对目的克隆进行序列验证。
6.1.3选择
使用重组MMP13探测噬菌体展示文库。如在结果部分，即实施例6.2及其后详述，将不同的抗原用于不同的选择轮次。
选择包括将抗原与文库噬菌体颗粒一起孵育2小时(在补充有2％Marvel和0.05％Tween 20的PBS中)。使用链霉亲和素包被的磁珠(Invitrogen，112-05D)捕获生物素化的抗原。将非生物素化的抗原包被在MaxiSorp平板上(Nunc，430341)。洗去未结合的噬菌体(用补充有0.05％Tween 20的PBS)；通过加入胰蛋白酶(PBS中1mg/mL)15分钟，洗脱结合的噬菌体。洗脱的噬菌体用于感染指数增长的大肠杆菌TG-1细胞，以进行噬菌体拯救。从选择的输出中制备的噬菌体在随后的选择轮次中用作输入。
6.1.4ELISA直接包被的抗原
将MaxiSorp平板(Nunc，430341)在4℃用人proMMP13包被过夜，然后在RT封闭1小时(PBS，1％酪蛋白)。在PBS+0.05％Tween20中的洗涤步骤后，在RT加入在PBS、0.1％酪蛋白、0.05％Tween 20中的周质提取物10倍稀释液一小时。用小鼠抗FLAG-HRP(Sigma(A8592))检测结合的纳米抗体。
捕获的抗原
-活化的人MMP13 ELISA
-活化的大鼠MMP13 ELISA
-活化的狗MMP13 ELISA
将MaxiSorp平板(Nunc，430341)在4℃用人MMP13抗体mAb511包被过夜，然后在RT封闭1小时(PBS，1％酪蛋白)。在PBS+0.05％Tween20中的洗涤步骤后，在RT添加20nM活化的人、大鼠或狗MMP13一小时。第二洗涤步骤后，在室温加入在PBS、0.1％酪蛋白、0.05％Tween20中的周质提取物10倍稀释液或纯化的纳米抗体的系列稀释液一小时。用小鼠抗FLAG-HRP(Sigma(A8592))检测结合的纳米抗体。
6.1.5荧光肽测定法
人、食蟹猴、大鼠、狗和牛MMP13荧光肽测定法以及人MMP1和MMP14荧光肽测定法的设置简述如下：将活化的MMP与荧光肽底物Mca-PLGL-Dpa-AR-NH2(R&D Systems#ES001)和周质提取物的1/5稀释液或纯化的纳米抗体/阳性对照的系列稀释液(总体积＝20μl在测定法缓冲液50mM Tris pH 7.5、100mM NaCl、10mM CaCl2、0.01％Tween20中)在37℃孵育2h。荧光的线性增加(v0–15至45分钟孵育)用作酶活性的量度并且使用公式100–100(存在测试纳米抗体的情况下的v0/存在阴性对照纳米抗体(Cablys)的情况下的v0)计算抑制％。
6.1.6胶原蛋白溶解测定法
该测定法的设置简述如下：将250ng/ml免疫级人胶原蛋白II(Chondrex#20052)与5nM活化的MMP13在100μl测定法缓冲液(50mM Tris-Cl pH7.5、100mM NaCl、10mM CaCl2、0.01％Tween-20)中孵育。在35℃孵育1.5h后，反应用EDTA(10μl的30mM储备液)进行中和。将MMP13裂解的胶原蛋白在38℃用弹性蛋白酶进一步降解20分钟，以避免降解的II型胶原蛋白(II型胶原蛋白检测试剂盒(Chondrex#6009)提供的10μl的1/3稀释原液)重新退火。通过ELISA(II型胶原蛋白检测试剂盒(Chondrex#6009)中提供的试剂)检测剩余的完整胶原蛋白。
6.1.7荧光胶原蛋白测定法
简言之，该测定法的设置如下：将100μg/ml来自牛皮肤的I型DQTM胶原蛋白(荧光素缀合物；Molecular Probes#D-12060批号1149062)与10nM活化的MMP13和纯化的纳米抗体/阳性对照的系列稀释液在40μl测定缓冲液(50mM Tris-Cl pH 7.5、100mM NaCl、10mMCaCl2、0.01％Tween-20)中在37℃孵育2小时。荧光的线性增加(v0–15至45分钟孵育)用作酶活性的量度并且使用公式100–100(存在测试纳米抗体的情况下的v0/存在阴性纳米抗体(Cablys)的情况下的v0)计算抑制％。
6.1.8 TIMP-2竞争测定法
在抗人TIMP-2抗体(R&D Systems#MAB9711)包被的平板上(2μg/ml在PBS中；过夜)捕获50μl TIMP-2(0.63nM；R&D Systems#971-TM)(1h在RT)。在此捕获过程中，将1.26nM活化的MMP-13-生物素与Nanobody/TIMP-3/MSC2392891A在70μl测定缓冲液(50mM Tris-ClpH 7.5、100mM NaCl、10mM CaCl2、0.01％Tween-20)中的系列稀释液预孵育。将50μl的该混合物加入捕获的TIMP-2中并且在室温孵育1小时。用50μl链霉亲和素-HRP(1:5000DakoCytomation#P0397)检测MMP13-生物素。
6.1.9热位移测定法(TSA)
基本上根据Ericsson等人(2006Anals of Biochemistry,357:289-298)，用5μl纯化的单价纳米抗体进行TSA。
6.1.10分析性尺寸排阻色谱法(分析性SEC)
在Ultimate 3000机器(Dionex)上结合Biosep-SEC-3(Agilent)柱进行分析性SEC实验。
6.1.11强制氧化
将纳米抗体样品(1mg/ml)在RT和暗处接受PBS中的10mM H2O2四小时，平行进行无H2O2的对照样品，然后使用Zeba脱盐旋转柱(0.5ml)(Thermo Scientific)将缓冲液切换至PBS。然后在1200或1290系列机器(Agilent Technologies)上在70℃的Zorbax 300SB-C3柱(Agilent Technologies)上通过RPC分析应激的和对照样品。通过确定与主要蛋白峰相比，氧化应激导致的峰前峰面积百分比来定量纳米抗体的氧化。
6.1.12温度应激
将纳米抗体样品(1-2mg/ml)在PBS中在-20℃(阴性对照)25和40℃保存四周。孵育期后，用胰蛋白酶或LysC消化纳米抗体。然后在与Q-TOF质谱仪(6530Accurate Mass Q-TOF(Agilent))偶联的1290系列机器(Agilent Technologies)上在60℃的Acquity UPLCBEH300-C18柱(Agilent Technologies)上通过RPC分析应激的和对照样品的肽。
6.2免疫
MMP13以非活性原形式(proMMP13)分泌。一旦原结构域被裂解，它就会被活化，留下由形成催化口袋的催化结构域和血色素结合蛋白样结构域(PDB:1PEX)组成的活性酶，血色素结合蛋白样结构域被描述为功能为底物胶原蛋白II(Col II)的对接/相互作用结构域。
假设抑制MMP13酶促活性的最佳区域是催化口袋。然而，提高针对催化口袋的免疫应答提出了许多重要的问题。
首先，在proMMP13中，原结构域掩盖了催化口袋，因此无法接近口袋以产生免疫应答。
其次，活化的MMP13具有短半衰期，这主要是由于自身蛋白水解所致。这种短的半衰期阻碍了强免疫应答的发展。
第三，催化域的序列在物种间高度保守。因此，预期的免疫应答将是弱的，如果产生的话。
6.2.1免疫策略
为了处理这些问题并增加成功获得结合催化口袋的MMP13抑制剂的机会，设计了复杂而详尽的免疫策略，包括各种格式的MMP13。最终，进行了以下免疫：
(a)用截短的MMP13变体免疫3只美洲驼，所述变体由催化结构域组成并含有突变F72D，该突变保护MMP13免于自身蛋白水解；
(b)用与(a)相同的截短的MMP13变体免疫3只美洲驼，所述变体除了突变F72D之外，还包含使酶功能失活的突变E120A；
(c)再用全长proMMP13蛋白免疫3只另外的美洲驼；和
(d)用编码分泌的proMMP13变体(V123A)或GPI锚定的proMMP13变体(V123A)的质粒混合物免疫3只美洲驼。描述了用于MMP13的V123A突变，引起Cys104与催化性锌离子之间的弱相互作用，导致自发的自活化。
6.2.2血清滴度
测定针对proMMP13和催化结构域(F72D)的血清滴度。
通常，用蛋白proMMP13(c)或编码proMMP13 V123A(d)的DNA免疫的动物显示出对proMMP13的良好免疫应答，但对催化结构域(F72D)仅应答弱。用催化结构域(F72D)(a)或无活性催化结构域(F72D，E120A)(b)免疫的动物针对催化结构域显示没有或仅有弱的免疫应答。
6.2.3文库构建
尽管针对催化结构域的血清滴度低，但是发明人确信广泛的筛选将能够鉴定针对催化口袋的抑制性结合物。
从PBL(原代血淋巴细胞)提取RNA并且将其用作RT-PCR的模板，以扩增纳米抗体编码基因片段。将这些片段克隆到噬菌粒载体pAX212中，从而能够产生展示与His6-和FLAG3-标签融合的纳米抗体的噬菌体颗粒。根据标准方案(Phage Display of Peptides andProteins:A Laboratory Manual 1st Edition,Brian K.Kay,Jill Winter,JohnMcCafferty,Academic Press,1996)制备并储存噬菌体。
最终获得的18个免疫文库的平均尺寸是约5*108个单个克隆。
6.3初筛
用18个免疫文库和两个合成的纳米抗体文库进行噬菌体展示选择。使用不同的抗原呈递格式，针对人proMMP13，活化的人、大鼠和狗MMP13以及人MMP13催化域(F72D)的不同组合，对文库进行2至4轮富集。以在ELISA(使用表达纳米抗体的大肠杆菌细胞的周质提取物)中针对人和大鼠MMP13的结合情况和在测量使用广谱MMP荧光肽底物的肽水解后荧光增加的荧光肽测定法中的抑制活性，筛选来自选择结果的单个克隆。在胶原蛋白溶解测定法中进一步筛选在ELISA中显示结合但在荧光肽测定法中未显示抑制活性的纳米抗体。胶原蛋白溶解测定法使用天然底物代替肽替代物。由于胶原蛋白具有与MMP13的相互作用表面比荧光肽大得多，因此假设纳米抗体会干扰胶原蛋白降解，但不会干扰肽的降解。然而，胶原蛋白溶解测定法与周质提取物不相容并且需要使用纯化的纳米抗体。
6.3.1活动1
在第一次选择活动中，MMP13作为直接包被的抗原出现。这在人和大鼠MMP13ELISA(结合测定法)中产生了很高的命中率，包括与人MMP13结合的纳米抗体的良好多样性以及ELISA中广泛的结合信号。发现大多数纳米抗体与大鼠MMP13有交叉反应性。然而，在荧光肽测定法(抑制测定法)中获得了极低的命中率。此外，观察到的抑制作用是不完全的并且其中一些纳米抗体没有显示出大鼠交叉反应性。
因为没有获得单价的完全抑制性纳米抗体，所以发明人假设正确的表位没有被靶向并且选择期间使用的条件不是最佳的。但是，由于缺乏阳性对照，测试选择条件受到阻碍。
最终发现直接包被干扰酶活性。
6.3.2活动2
在活动2中，选择是通过生物素化的MMP13在溶液中进行的。但是，使用通过非中和抗体代替直接包被的proMMP13捕获的活化的人和大鼠MMP13，ELISA命中率远低于活动1。在荧光肽测定法中，命中率也非常低。然而，发现了一种在胶原蛋白溶解测定法中进行完全抑制的纳米抗体。由于酶的原形式用于结合物富集，假设关键表位被原肽掩盖。
6.3.3活动3
鉴于活动1和活动2的令人失望的结果，发明人选择通过使用由非中和抗体捕获的活化的MMP13来优化催化结构域中关键表位的呈递。ELISA也使用相同的捕获格式。这导致人和大鼠MMP13的ELISA中命中率更高。然而，尽管荧光肽测定法的命中率与先前的活动相比略高，但是纳米抗体仍仅给出不完全抑制并且确实显示出弱的或没有大鼠交叉反应性，表明捕获的MMP13呈递仍不是最理想的。
发现三个克隆，包括C0101040E09(“40E09”)，尽管在荧光肽测定法中给出了不完全抑制，但在胶原蛋白溶解测定法中发现是阳性的。克隆并测序了40E09的家族成员：C0101PMP040E08、C0101PMP042A04、C0101PMP040B05、C0101PMP042D12、C0101PMP042A03、C0101PMP024A08和C0101PMP040D01(参阅表A-1和A-2)。下表6.3.3A、6.3.3B和6.3.3C描述了CDR区的序列变异性。将克隆40E09的CDR的氨基酸序列用作参考，与之比较家族成员的CDR(CDR1在Kabat的第26位开始，CDR2在Kabat的第50位开始以及CDR3在Kabat的第95位开始)。
表6.3.3A(40E09 CDR1)
Figure BDA0002377824260000671
*在一个克隆中多至1个CDR1突变(SEQ ID NO:23)
表6.3.3B(40E09 CDR2)
Figure BDA0002377824260000672
Figure BDA0002377824260000681
*在一个克隆中多至3个CDR2突变(SEQ ID NO:37)
表6.3.3C(40E09 CDR3)
Figure BDA0002377824260000682
*在一个克隆中多至1个CDR突变(SEQ ID NO:52)
6.3.4活动4
在第4次活动中，除了衍生自免疫策略(a)和(c)的免疫纳米抗体噬菌体展示文库，还探索了衍生自选择策略(b)和(d)的文库(参阅实施例6.2.1)。选择策略集中在溶液中使用的MMP13催化结构域(F72D)上。荧光肽测定法的命中率在文库间增加并且许多纳米抗体显示出完全抑制。抑制性纳米抗体在ELISA中仅显示出较弱的结合，这证实了在活动3中使用的捕获的MMP13呈递对于关键表位的可及性也不是最理想的。因此，使用大鼠荧光肽测定法代替ELISA来评估大鼠交叉反应性。具有确定的抑制潜能的纳米抗体家族的代表都是大鼠交叉反应的，这表明被这一特定组的克隆识别的表位位于保守的MMP13催化口袋中。
总而言之，发现对MMP13的任何常规操作都会干扰酶的活性和TIMP-2结合(数据未显示)。在更改和评估多种参数后，包括不同的抗原(例如proMMP13，催化结构域(F72D)，活化的人MMP13，活化的大鼠MMP13，活化的狗MMP13，不同的测定法，包括ELISA，人荧光肽测定法，大鼠荧光肽测定法和人胶原蛋白溶解测定法，不同的测定法设置，包括包被条件的变化，溶液中和捕获MMP13)，发现鉴定完全抑制性纳米抗体的唯一成功策略是使用催化结构域(F72D)或活化的MMP13物种进行选择(活动4)。
6.3.5先导组
对在荧光肽或胶原蛋白溶解测定法中鉴定的抑制性纳米抗体进行测序。根据序列信息，可以将纳米抗体分为多个家族。来源于筛选活动2和3的4个家族在胶原蛋白溶解测定法中显示出完全抑制，但在荧光肽测定法中没有显示活性；在本文中进一步表示为“特征1”克隆(参阅40E09及其家族成员)。来源于筛选活动4的10个家族在胶原蛋白溶解测定法和荧光肽测定法中均显示抑制活性；在本文中进一步表示为“特征2”克隆。
选择每个纳米抗体家族的代表性克隆，总共14个代表。表A-1描述了代表性克隆的序列。
6.4单价先导组的体外表征
为了进一步在功能上表征代表性的纳米抗体克隆，将它们再克隆到pAX129中，转化到大肠杆菌中并根据标准方案进行表达和纯化(例如Maussang等人2013J Biol Chem288(41):29562-72)。随后，对这些克隆进行多种功能性体外测定。
6.4.1酶促测定法
在荧光肽测定法(用不同的MMP13直向同源物的设定)和人胶原蛋白水解测定法中测试了纳米抗体的效力/功效(在筛选过程中也使用了两种测定法，参见实施例6.3)。另外，建立了第二种基于胶原蛋白的测定法(荧光胶原蛋白测定法)，该测定法使用了与胶原蛋白溶解测定法相比更高的胶原蛋白浓度，以模拟软骨中的高胶原蛋白浓度条件，其中预期MMP13抑制剂是有活性的。在该测定法中，由于荧光团的相互淬灭作用，完整的FITC标记的胶原蛋白底物的荧光低。裂解后，淬灭消失并且荧光增加。
表6.4.1给出了酶促测定法中效力的概述。
Figure BDA0002377824260000691
Figure BDA0002377824260000701
表6.4.1MMP13酶促测定法中先导组的效力。仅当效力为
Figure BDA0002377824260000703
100％时才报告效力。
在图1中，描绘了当使用高浓度的牛胶原蛋白I(荧光胶原蛋白测定法)时，抑制活化的人MMP13的剂量应答曲线。
Figure BDA0002377824260000702
图1：荧光胶原蛋白测定法中特征1纳米抗体(左图)和特征2纳米抗体(右图)的剂量应答曲线。
尽管特征1纳米抗体在低胶原蛋白浓度条件下的胶原蛋白溶解测定法中显示出全部功效，但在高胶原蛋白浓度条件下的荧光胶原蛋白测定法中其功效却下降(图1，左图)。
同样，竞品药剂MSC2392891A在荧光胶原蛋白测定法中显示出更弱的功效(图1)。
特征2代表性纳米抗体在胶原蛋白溶解测定法和荧光胶原蛋白测定法中均有效且是完全功效的。在此测定法中，大多数纳米抗体的活性均高于竞品药剂。这些特征2代表在人、食蟹猴、大鼠、狗和牛荧光肽测定法中显示了相当的效力(参阅表6.4.1)和功效(图1，右图)。
6.4.2结合测定法
为了评估结合亲和力，使用了ELISA设置。然而，发现该测定法仅适合于评估特征1纳米抗体的亲和力，而不适合于评估特征2纳米抗体的亲和力(参阅实施例6.3)。
结果在表6.4.2A中描述。
Figure BDA0002377824260000711
表6.4.2A：通过ELISA评估的特征1纳米抗体的结合亲和力(EC50)
总之，特征1纳米抗体的结合亲和力对于所测试的三个物种而言是相当的(即相差小于10倍)。尽管克隆40E09对人MMP13的结合亲和力仅是第二好的，但它在物种间却表现出最好的亲和力。
由于发现特征2纳米抗体与TIMP-2竞争结合MMP13，因此建立了TIMP-2竞争ELISA并用于评估特征2纳米抗体的亲和力。值得注意的是，特征1纳米抗体不与TIMP-2竞争。
结果在表6.4.2B中描述。
Figure BDA0002377824260000712
表6.4.2B通过TIMP-2竞争ELISA评估的特征2纳米抗体的效力(IC50)
总之，该评级与酶促测定法获得的效力相似，纳米抗体516G08、529C12和62C02表现出最佳的抑制潜力，而纳米抗体59F06、525C04和63F01次之。
6.4.3选择性测定法
为了确定纳米抗体对MMP13的选择性(相对于针对MMP1和MMP14)，使用荧光肽测定法。MMP1和MMP14是两个密切相关的MMP家族成员。由于特征1纳米抗体在MMP13荧光肽测定法中未显示抑制，因此只能测试特征2纳米抗体。在这些测定中，非选择性MMP抑制剂TIMP-2用作阳性对照。
结果如图2所示。
Figure BDA0002377824260000721
图2.MMP13先导纳米抗体的选择性
所有的纳米抗体都是高度选择性的。它们没有显示出MMP1抑制并且对于某些纳米抗体，在高浓度的MMP14上仅观察到非常小的抑制。
6.4.4表位分组(binning)
为了进行表位分组，在竞争ELISA中针对纯化的纳米抗体40E09(特征1)测试了衍生自特征1和特征2的一组单价纳米抗体。
竞争ELISA的结果如图3所示。
Figure BDA0002377824260000731
图3.0.6nM生物素化的40E09针对一组特征1和特征2纳米抗体在人全长MMP13上的竞争ELISA，通过小鼠抗人MMP13 mAb(R&D Systems#MAB511)捕获。通过与APMA在37℃孵育1h30来活化MMP13。
特征1纳米抗体32B08、43B05、43E10和40E09(阳性对照)均与40E09竞争。另一方面，无论特征2纳米抗体59F06、62C02、63F01、513C04、516G08和517A01还是阴性对照cAbLys均不与40E09竞争。
因此，特征1纳米抗体似乎与特征2纳米抗体(暂时称为“组2”)属于不同的表位组(暂时称为“组1”)，这也反映了免疫和选择策略。
6.5二价构建体
如以上实施例6.4.1中所示，特征1纳米抗体在荧光肽测定法中未显示抑制(参见表6.4.1)。发明人着手研究特征1纳米抗体和特征2纳米抗体的组合的作用。
作为最佳物种交叉反应性结合物(参见实施例6.4.2)，选择纳米抗体40E09作为特征1纳米抗体的代表。对于特征2，选择了三个纳米抗体：516G08、62C02和517A01。特征1和特征2纳米抗体以二价格式与35GS接头组合(参见表6.5；Nb(A)-35GS-Nb(B))。将二价纳米抗体克隆到pAX205中，转化到巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)中，按照标准程序进行表达和纯化。
为了评估这些二价构建体的效力，使用了大鼠荧光肽测定法，但与筛选设置相比，MMP13浓度更低(0.15nM而不是1.33nM)，以提高测定法的灵敏度。在该调整的荧光肽测定法以及人荧光胶原蛋白测定法中测试了二价构建体。
结果数据总结在表6.5中。
Figure BDA0002377824260000741
表6.5：二价纳米抗体在大鼠荧光肽测定法(调整为更灵敏)和人荧光胶原蛋白测定法中的效力
结果表明，由特征1纳米抗体与特征2纳米抗体组合而组成的二价构建体在调整的大鼠荧光肽测定法中比其一价构件更有效，效力提高了多至40倍。同样在人荧光胶原蛋白测定法中，观察到效力提高(多至4倍)。在两种测定法中，二价构建体对阳性、非选择性对照TIMP-2均具有同等效力。
因此，尽管特征1纳米抗体本身并没有特别的抑制作用，但是当在二价构建体中组合时，它们改善了特征2纳米抗体的效力。
6.6生物物理表征
为了促进患者的便利，低施用频率和高保留的治疗化合物是优选的。因此，优选纳米抗体具有高稳定性。
为了测试稳定性，对五种代表性特征2纳米抗体和一种代表性特征1纳米抗体进行了生物物理表征。
6.6.1热位移测定法
野生型抗MMP13纳米抗体的热稳定性在热位移测定法(TSA)中进行了研究。
结果描述于表6.6.1中。
纳米抗体 在pH7的Tm(℃)
C0101516G08 65.2
C0101040E09 68.6
C0101080A01 68.6
C0101062C02 76.4
C0101517A01 77.8
C0101529C12 82.7
表6.6.1：单价纳米抗体在pH 7的Tm
在pH 7的Tm值的范围是65℃至83℃，表明好至非常好的稳定性特征。
6.6.2分析性SEC
通过分析性尺寸排阻色谱法(aSEC)研究了选定组的5个代表性抗MMP13纳米抗体的多聚化和聚集的趋势。
结果的总结显示在表6.6.2中。
Figure BDA0002377824260000751
表6.6.2：MMP13先导纳米抗体的分析性SEC参数
五个代表性的纳米抗体具有保留时间在单价纳米抗体的预期范围内(7.6-8.2min)，并且所有纳米抗体的主峰相对面积和总体回收率均高于90％。
基于TSA和aSEC的生物物理特性被认为适合于所有测试的纳米抗体的进一步开发。
6.7选择克隆用于进一步开发和序列优化
基于代表性纳米抗体和二价构建体的功能和生物物理特性，选择4种示例性先导纳米抗体：62C02、529C12、80A01和二价构建体C01010080(“0080”，由特征2纳米抗体517A01和特征1纳米抗体40E09组成)用于进一步开发。
本发明人着手优化先导组的氨基酸序列(“序列优化”或“SO”)。在序列优化过程中，尝试(1)敲除用于翻译后修饰(PTM)的位点；(2)将亲本纳米抗体人源化；以及(3)敲除潜在的预先存在抗体的表位。同时，纳米抗体的功能和生物物理特征应优选维持或甚至得到改善。
6.7.1翻译后修饰(PTM)
被评估的翻译后修饰(PTM)是：Met-氧化、Asn-脱酰胺、Asp-异构化、Asn-糖基化和焦谷氨酸形成。
尽管在序列优化期间未分析E1D突变(通常掺入以防止焦谷氨酸形成)，但已将其包括在格式化的纳米抗体中。所有MMP13先导纳米抗体均接受了该突变，除62C02外，观察到其效力下降12倍。因此，决定不将E1D突变掺入62C02构件。
为了评估潜在的PTM，在先导组上施加了强制氧化和温度应激。除了C0101517A01(“517A01”)和C0101080A01(“80A01”)以外，未观察到先导组的任何修改。
在强制氧化和温度应激条件下，C0101080A01易于发生Asp异构化和Met氧化。然而，异构化和氧化的程度在所评估的条件下是不同的，并且在每种情况下仅低于或高于施加的阈值。最终，氨基酸残基54-55、100d-100e，M100j和101-102被鉴定为负责PTM的残基。值得注意的是，所有这些残基都位于CDR2或CDR3区域，并且因此潜在地参与靶标结合。为了尝试适应不同的要求，构建了NKK文库，其中将这些残基突变，并且随后在荧光肽测定法中进行筛选，以评估可能的效力损失并筛选生物物理特性(Tm)。出乎意料地发现，可以在这些CDR中突变多个位置而没有任何显著的效力损失，即保持超过80％的抑制。
·对于D100dX文库，9个氨基酸(“AA”)取代显示出>80％抑制(E、G、A、P、T、R、M、W和Y)。
·对于M100jX文库，16个AA取代显示出>85％抑制(所有，除了T、C和H)。
·对于D101X文库，16个AA取代显示出>90％抑制(所有，除了D、F和P)。
·对于Y102X文库，大多数克隆显示出>90％。因此，相信氨基酸位置102可以突变为任何残基。
以下保守突变是特别优选的：D100dE和M100jL。
在下表6.7.1A、6.7.1B和6.7.1C中提供了CDR区中优选突变的概述。克隆80A01的CDR的氨基酸序列用作参照，与之比较家族成员的CDR。根据Kabat编号，CDR1从氨基酸残基26开始，CDR2从氨基酸残基50开始，CDR3从氨基酸残基95开始。
表6.7.1A(80A01SO CDR1)
Figure BDA0002377824260000771
*在一个克隆中多至0个CDR1突变(SEQ ID NO:28)
表6.7.1B(80A01SO CDR2)
Figure BDA0002377824260000772
*在一个克隆中多至0个CDR2突变SEQ ID NO:43
表6.7.1C(80A01SO CDR3)
Figure BDA0002377824260000773
*在一个克隆中多至4个CDR突变(SEQ ID NO:57)
X1＝E、G、A、P、T、R、M、W、Y
X2＝A、R、N、D、E、Q、Z、G、I、L、K、F、P、S、W、Y和V
X3＝A、R、N、C、E、Q、Z、G、H、I、L、K、M、S、T、W、Y和V
X4＝A、R、N、D、C、E、Q、Z、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W和V
在强制氧化和温度应激条件下，C0101517A01易于脱酰胺。最终，通过温度应激实验，氨基酸残基N100b和N101被鉴定为对脱酰胺敏感的残基。然而，这些残基位于CDR3区域中，并可能参与靶标结合。因此，敲除脱酰胺位点可以对结合产生影响。同样在这种情况下，构建了NKK文库，其中易于脱酰胺的残基被突变，并且然后在荧光肽测定法中进行筛选，以评估可能的效力损失并针对生物物理特性(Tm)进行筛选。
完全出乎意料地表明，将N100b突变为Q或S或者将N101突变为Q或V消除了脱酰胺作用，但同时导致与亲本纳米抗体C0101517A01相比，Tm增加了1-3℃，而效力却相当。表6.7.1D中显示了4种优选的变体，其也总结了TSA和荧光肽测定法的结果。下表描述了CDR中优选突变的概述。
TSA 荧光肽测定法
纳米碱基ID 突变 Tm(℃)@pH7 IC50(nM)
C010100087 亲本 78 2.5
C010100647 N100bQ,N101V 81 2.1
C010100648 N100bQ,N101Q 81 2.8
C010100649 N100bS,N101Q 79 2
C010100650 N100bS,N101V 81 2.1
表6.7.1D.第二轮C0101517A01序列优化变体的数据总结
下表6.7.1E、6.7.1F和6.7.1G提供了CDR区中优选突变的概述。克隆517A01的CDR的氨基酸序列用作参照，与其他克隆的CDR进行比较。根据Kabat编号，CDR1从氨基酸残基26开始，CDR2从氨基酸残基50开始，CDR3从氨基酸残基95开始。
表6.7.1E(517A01SO CDR1)
Figure BDA0002377824260000781
*在一个克隆中多至0个CDR1突变(SEQ ID NO:26)
表6.7.1F(517A01SO CDR2)
Figure BDA0002377824260000782
*在一个克隆中多至0个CDR2突变(SEQ ID NO:41)
表6.7.1G(517A01SO CDR3)
Figure BDA0002377824260000791
*在一个克隆中多至2个CDR突变(SEQ ID NO:55)
6.7.2人源化
为了人源化，使纳米抗体序列与人IGHV3-IGHJ种系共有序列更同源。除了纳米抗体的“标志”残基外，将在纳米抗体和人IGHV3-IGHJ种系共有序列之间不同的构架区中的特定氨基酸改变为人对应物，从而蛋白质结构、活性和稳定性保持完好。
6.7.3预先存在的抗体和抗药剂抗体
发明人针对指导序列优化策略的免疫原性相关临床后果进行了早期风险评估。评估包括候选药剂的免疫原性以及基于作用方式和最终生物治疗分子性质的抗药剂抗体的可能影响。为此，评估了纳米抗体的序列，以潜在地(i)最小化任何天然预先存在的现有抗体的结合和(ii)降低引起治疗紧急免疫原性应答的潜能。
将突变L11V和V89L引入所有MMP13纳米抗体。
6.7.4优选的SO克隆
在表A-1和表A-2中，基于先导组的序列优化描述了序列，其中根据PTM、人源化和潜在的预先存在的抗体和抗药剂抗体的表位对序列进行了详述。
6.8双特异性构建体
抗MMP13纳米抗体应优先地在目的位点(例如关节)具有活性，以抑制MMP13的软骨降解功能。聚蛋白聚糖大量存在于关节中并且主要的蛋白聚糖存在于细胞外基质(ECM)中，占总蛋白质含量的约50％。因此，至少在理论上，将抗MMP13纳米抗体锚定至聚蛋白聚糖结合物将允许将抗MMP13纳米抗体引导至相关组织并改善其保留。
开始将本发明的抗MMP13结合物与这些聚蛋白聚糖结合物组合，并在人荧光肽测定法和竞争ELISA测定法中测试所得双特异性构建体的效力。如表中所示，产生并测试了包含聚蛋白聚糖结合物和MMP13抑制剂的多种双特异性构建体。
表6.8A和表6.8B描绘了典型结果的格式和效力。
人荧光肽测定法(MMP13)
Figure BDA0002377824260000801
Figure BDA0002377824260000811
表6.8A：在人荧光肽测定法中测试双特异性MMP13-CAP纳米抗体。将效力与它们各自的单特异性对应物进行比较。TIMP-2和MSC2392891A在每个单独的测定法中用作内部参考。SO：优化的序列，不包括前Ab突变。SOvar：非最终SO变体。
IC50竞争ELISA(CAP)
Figure BDA0002377824260000812
表6.8B：在竞争ELISA测定法中测试双特异性MMP13-CAP纳米抗体。将效力与它们各自的单特异性对应物(ALB26融合)进行比较。SO：优化的序列(不包括原Ab突变)。SOvar：非最终SO变体。
表6.8A和6.8B中显示的结果表明，将一个或多个聚蛋白聚糖结合物与一个或多个MMP13抑制剂组合对MMP13抑制剂的效力没有负面作用。值得注意的是，在大多数情况下，先导组MMP13抑制剂具有与非选择性MMP抑制剂TIMP-2相同的效力。
实施例6.9：体内大鼠MMT模型DMOAD研究
为了进一步证明与本发明的CAP结合物融合的MMP13抑制剂的体内功效，使用了在大鼠中通过手术诱导的内侧半月板撕裂(MMT)模型。简言之，将抗MMP13纳米抗体缀合至CAP结合物(“754”或C010100754)。在大鼠的一个膝盖中进行手术以诱导OA样症状。在手术后3天通过IA注射开始治疗。手术后42天进行组织病理学检查。抽取中期和终末血清样品进行探索性生物标志物分析。确定内侧和总的实质性软骨退变宽度，以及软骨退变减少的百分比。每组使用20只动物。
对胫骨内侧的软骨退变的抑制如图4所示。
结果表明，与媒介物相比，MMP13-CAP构建体在42天后大大降低了软骨宽度。这些结果表明
(a)CAP部分对抗MMP13纳米抗体(754)的活性没有负面影响，与实施例6.8的结果一致；
(b)CAP部分使得能够保留抗MMP13纳米抗体；和
(c)抗MMP13纳米抗体对软骨宽度有积极影响。
Figure BDA0002377824260000821
图4在大鼠MMT模型中纳米抗体对软骨退变的抑制
在本申请全文中引用的所有参考文献(包括文献参考文献、授权专利、公开的专利申请和共同待决的专利申请)的全部内容在此明确地通过引用并入，特别是对于上文所引用的教导。
Figure BDA0002377824260000841
Figure BDA0002377824260000851
Figure BDA0002377824260000861
Figure BDA0002377824260000871
Figure BDA0002377824260000881
Figure BDA0002377824260000891
Figure BDA0002377824260000901
Figure BDA0002377824260000911
Figure BDA0002377824260000921
表C：各种接头序列(“ID”是指本文所用的SEQ ID NO)
Figure BDA0002377824260000931
表D：结合血清白蛋白的ISVD序列(“ID”是指本文所用的SEQ ID NO)，包括CDR序列
Figure BDA0002377824260000932
Figure BDA0002377824260000941
表E：结合聚蛋白聚糖的ISVD序列(“ID”是指本文所用的SEQ ID NO)，包括CDR序列
Figure BDA0002377824260000951
Figure BDA0002377824260000961
Figure BDA0002377824260000971
Figure BDA0002377824260000981
Figure BDA0002377824260000991
序列表
<110> Merck Patent GmbH
Ablynx N.V.
<120> MMP13结合免疫球蛋白
<130> MEPAT.0104
<150> EP17174402.2
<151> 2017-06-02
<160> 197
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Ser Val Gly Arg Ile Thr Asn Tyr Ala Val Ser Val Arg
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Gly Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Gly Gly Leu Gln Gly Tyr Trp Gly Leu Gly Thr Gln Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 2
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 2
Lys Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser Arg Arg
20 25 30
Ser Met Asn Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Ser Thr Gly Arg Ile Thr Asn Tyr Ala Val Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Gly Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Gly Gly Leu Gln Gly Tyr Trp Gly Leu Gly Thr Gln Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 3
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Arg Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser Arg Arg
20 25 30
Ser Met Asn Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Ser Thr Gly Arg Ile Thr Asn Tyr Ala Val Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Gly Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Gly Gly Leu Gln Gly Tyr Trp Gly Leu Gly Thr Gln Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 4
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 4
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser Arg Arg
20 25 30
Ser Met Asn Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Ser Thr Gly Arg Ile Thr Asn Tyr Ala Val Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Gly Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Gly Gly Leu Gln Gly Tyr Trp Gly Leu Gly Thr Gln Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 5
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Glu Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Ser Val Gly Arg Ile Thr Asn Tyr Ala Val Ser Val Arg
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Gly Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Gly Gly Leu Gln Gly Tyr Trp Gly Leu Gly Thr Gln Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 6
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Arg Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Ser Val Gly Arg Ile Thr Asn Tyr Ala Val Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Gly Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Gly Gly Leu Gln Gly Tyr Trp Gly Leu Gly Thr Gln Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 7
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Ser Val Gly Arg Ile Thr Asn Tyr Ala Val Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Gly Thr Gly Phe Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Gly Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Gly Gly Leu Gln Gly Tyr Trp Gly Leu Gly Thr Gln Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 8
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Arg Lys Gln Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Ser Thr Ala Arg Ile Thr His Tyr Ala Val Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Gly Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Gly Gly Leu Gln Gly Ser Trp Gly Leu Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 9
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 9
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Ala Val Asp Ala Ser Arg Gly Leu Pro Tyr Glu Leu Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 10
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 10
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ala Ala Leu Ala Val Tyr Gly Pro Asn Arg Tyr Arg Tyr Gly Pro
100 105 110
Val Gly Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 11
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ala Ala
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Asp Asp Gly Ser Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Thr Gly Tyr Gly Ala Thr Thr Thr Arg Pro Gly Arg Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 12
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 12
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ala Tyr Tyr
20 25 30
Ser Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Ser Gly Ile Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ala Asp Pro Ser His Tyr Tyr Ser Glu Tyr Asp Cys Gly Tyr
100 105 110
Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 13
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 13
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Ser Ile Phe Arg Ile Asn
20 25 30
Val Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
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Ala Ala Ile Thr Ser Gly Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
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Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 14
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 14
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Arg Ile Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ile Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 15
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Trp Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Arg Arg Val Tyr Tyr Asp Thr Tyr Pro Asn Leu Arg Gly
100 105 110
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 16
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 16
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ala Ala Arg Gly Pro Gly Ser Val Gly Pro Ser Glu Glu Tyr Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 17
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 17
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Pro Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ala Ala Arg Gly Gly Gly Tyr Arg Ala Ser Gly Gly Pro Leu Ser
100 105 110
Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 18
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 18
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ala Ala Leu Gly Ser Thr Gly Ser Gly Ser Thr Pro Val Pro Glu
100 105 110
Tyr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 19
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 19
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ala Ala Arg Gly Gly Val Ala Gly Thr Asp Gly Pro Leu Gly Asp
100 105 110
Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 20
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 20
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Ser Ile Phe Ser Gly Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Ser Gly Gly Val Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Asp Ile Arg Tyr Pro Thr Gly Leu Val Gly Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 21
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Thr Gly Ile Phe Arg Ile Asn
20 25 30
Thr Met Gly Trp His Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Thr Phe Thr Ser Asp Asp Asn Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Asp Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His
85 90 95
Ala Thr Thr Val Met Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 22
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 22
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Glu Gly Gly Thr Val Glu Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Pro Gly Pro Gly Ile Arg Thr Asn
20 25 30
Phe Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Glu Lys Glu Arg Glu Met Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Arg Asp Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Thr Ser Thr Phe Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Gln Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Thr Asp Pro His Ile Leu His Asn Asp Arg Ala Gly Ala Phe Leu Val
100 105 110
Glu Asp Tyr Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 23
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 23
Gly Ser Thr Phe Ser Arg Tyr Ser Met Asn
1 5 10
<210> 24
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 24
Gly Ser Thr Phe Ser Arg Arg Ser Met Asn
1 5 10
<210> 25
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 25
Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn Ala Met Gly
1 5 10
<210> 26
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 26
Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gly
1 5 10
<210> 27
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 27
Gly Phe Ala Phe Ser Ala Ala Tyr Met Ser
1 5 10
<210> 28
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 28
Gly Phe Thr Leu Ala Tyr Tyr Ser Ile Gly
1 5 10
<210> 29
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 29
Gly Ser Ile Phe Arg Ile Asn Val Met Ala
1 5 10
<210> 30
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 30
Gly Ser Ile Phe Arg Ile Asn Ala Met Gly
1 5 10
<210> 31
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 31
Gly Arg Thr Phe Ser Arg Tyr Val Met Gly
1 5 10
<210> 32
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 32
Gly Leu Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gly
1 5 10
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 33
Gly Pro Thr Phe Ser Asp Tyr Ala Met Gly
1 5 10
<210> 34
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 34
Gly Ser Ile Phe Ser Gly Asn Ala Met Gly
1 5 10
<210> 35
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 35
Thr Gly Ile Phe Arg Ile Asn Thr Met Gly
1 5 10
<210> 36
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 36
Gly Pro Gly Ile Arg Thr Asn Phe Met Ala
1 5 10
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 37
Gly Ile Ser Val Gly Arg Ile Thr Asn
1 5
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 38
Gly Ile Ser Thr Gly Arg Ile Thr Asn
1 5
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 39
Gly Ile Ser Thr Ala Arg Ile Thr His
1 5
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 40
Ala Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr
1 5
<210> 41
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 41
Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr
1 5 10
<210> 42
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 42
Ser Ile Ser Asp Asp Gly Ser Lys Thr Tyr
1 5 10
<210> 43
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 43
Cys Ile Ser Ser Gly Ile Asp Gly Ser Thr Tyr
1 5 10
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 44
Ala Ile Thr Ser Gly Gly Thr Thr Asn
1 5
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 45
Ala Ile Ile Ser Gly Gly Thr Thr Tyr
1 5
<210> 46
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 46
Ala Ile Asn Trp Ser Ser Gly Ser Thr Tyr
1 5 10
<210> 47
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 47
Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Arg Thr Tyr
1 5 10
<210> 48
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 48
Ala Ile Ser Trp Gly Gly Gly Ser Thr Tyr
1 5 10
<210> 49
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 49
Ala Ile Thr Ser Gly Gly Val Thr Asn
1 5
<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 50
Thr Phe Thr Ser Asp Asp Asn Thr Lys
1 5
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 51
Ser Ile Ser Arg Asp Gly Ser Thr His
1 5
<210> 52
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 52
Gly Gly Leu Gln Gly Tyr
1 5
<210> 53
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 53
Gly Gly Leu Gln Gly Ser
1 5
<210> 54
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 54
Ala Val Asp Ala Ser Arg Gly Leu Pro Tyr Glu Leu Tyr Tyr Tyr
1 5 10 15
<210> 55
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 55
Ala Leu Ala Val Tyr Gly Pro Asn Arg Tyr Arg Tyr Gly Pro Val Gly
1 5 10 15
Glu Tyr Asn Tyr
20
<210> 56
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 56
Gly Tyr Gly Ala Thr Thr Thr Arg Pro Gly Arg Tyr
1 5 10
<210> 57
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 57
Asp Pro Ser His Tyr Tyr Ser Glu Tyr Asp Cys Gly Tyr Tyr Gly Met
1 5 10 15
Asp Tyr
<210> 58
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 58
Asp Ile Gly Trp Pro Tyr Val Leu Asp Tyr Asp Phe
1 5 10
<210> 59
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 59
Asp Arg Arg Val Tyr Tyr Asp Thr Tyr Pro Asn Leu Arg Gly Tyr Asp
1 5 10 15
Tyr
<210> 60
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 60
Ala Arg Gly Pro Gly Ser Val Gly Pro Ser Glu Glu Tyr Asn Tyr
1 5 10 15
<210> 61
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 61
Ala Arg Gly Gly Gly Tyr Arg Ala Ser Gly Gly Pro Leu Ser Glu Tyr
1 5 10 15
Asn Tyr
<210> 62
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 62
Ala Leu Gly Ser Thr Gly Ser Gly Ser Thr Pro Val Pro Glu Tyr Arg
1 5 10 15
Tyr
<210> 63
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 63
Ala Arg Gly Gly Val Ala Gly Thr Asp Gly Pro Leu Gly Asp Tyr Asn
1 5 10 15
Tyr
<210> 64
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 64
Asp Ile Arg Tyr Pro Thr Gly Leu Val Gly Asp Tyr
1 5 10
<210> 65
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 65
Thr Thr Val Met Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Asp Tyr
1 5 10
<210> 66
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 66
Asp Pro His Ile Leu His Asn Asp Arg Ala Gly Ala Phe Leu Val Glu
1 5 10 15
Asp Tyr Asp His
20
<210> 67
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 67
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 68
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 68
Lys Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 69
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 69
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Arg Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 70
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 70
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 71
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 71
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Glu Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 72
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 72
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Arg Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 73
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 73
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser
20 25
<210> 74
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 74
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 75
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 75
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 76
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 76
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 77
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 77
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser
20 25
<210> 78
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 78
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser
20 25
<210> 79
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 79
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Glu Gly Gly Thr Val Glu Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Pro
20 25
<210> 80
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 80
Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Phe Val Ala
1 5 10
<210> 81
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 81
Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Arg Lys Gln Arg Glu Phe Val Ala
1 5 10
<210> 82
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 82
Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala
1 5 10
<210> 83
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 83
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala
1 5 10
<210> 84
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 84
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val Ser
1 5 10
<210> 85
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 85
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ser
1 5 10
<210> 86
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 86
Trp His Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val Ala
1 5 10
<210> 87
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 87
Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Glu Lys Glu Arg Glu Met Val Ala
1 5 10
<210> 88
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 88
Tyr Ala Val Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
1 5 10 15
Glu Gly Thr Gly Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
20 25 30
Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala
35
<210> 89
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 89
Tyr Ala Val Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
1 5 10 15
Glu Gly Thr Gly Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
20 25 30
Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala
35
<210> 90
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 90
Tyr Ala Val Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
1 5 10 15
Glu Gly Thr Gly Phe Leu Gln Met Asn Gly Leu Lys Pro Glu Asp Thr
20 25 30
Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala
35
<210> 91
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 91
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
1 5 10 15
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
20 25 30
Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala
35
<210> 92
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 92
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
1 5 10 15
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
20 25 30
Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ala
35
<210> 93
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 93
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
1 5 10 15
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Asp Asp Thr
20 25 30
Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Thr
35
<210> 94
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 94
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
1 5 10 15
Lys Asn Thr Met Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr
20 25 30
Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
35
<210> 95
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 95
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
1 5 10 15
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
20 25 30
Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr Ala
35
<210> 96
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 96
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
1 5 10 15
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
20 25 30
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
35
<210> 97
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 97
Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
1 5 10 15
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
20 25 30
Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ala
35
<210> 98
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 98
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
1 5 10 15
Glu Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Asp Leu Lys Pro Glu Asp Thr
20 25 30
Ala Val Tyr Tyr Cys His Ala
35
<210> 99
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 99
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala
1 5 10 15
Thr Ser Thr Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Gln Val Glu Asp Thr
20 25 30
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr
35
<210> 100
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 100
Trp Gly Leu Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 101
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 101
Trp Gly Leu Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 102
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 102
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 103
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 103
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 104
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 104
Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 105
<211> 2415
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 105
Met Thr Thr Leu Leu Trp Val Phe Val Thr Leu Arg Val Ile Thr Ala
1 5 10 15
Ala Val Thr Val Glu Thr Ser Asp His Asp Asn Ser Leu Ser Val Ser
20 25 30
Ile Pro Gln Pro Ser Pro Leu Arg Val Leu Leu Gly Thr Ser Leu Thr
35 40 45
Ile Pro Cys Tyr Phe Ile Asp Pro Met His Pro Val Thr Thr Ala Pro
50 55 60
Ser Thr Ala Pro Leu Ala Pro Arg Ile Lys Trp Ser Arg Val Ser Lys
65 70 75 80
Glu Lys Glu Val Val Leu Leu Val Ala Thr Glu Gly Arg Val Arg Val
85 90 95
Asn Ser Ala Tyr Gln Asp Lys Val Ser Leu Pro Asn Tyr Pro Ala Ile
100 105 110
Pro Ser Asp Ala Thr Leu Glu Val Gln Ser Leu Arg Ser Asn Asp Ser
115 120 125
Gly Val Tyr Arg Cys Glu Val Met His Gly Ile Glu Asp Ser Glu Ala
130 135 140
Thr Leu Glu Val Val Val Lys Gly Ile Val Phe His Tyr Arg Ala Ile
145 150 155 160
Ser Thr Arg Tyr Thr Leu Asp Phe Asp Arg Ala Gln Arg Ala Cys Leu
165 170 175
Gln Asn Ser Ala Ile Ile Ala Thr Pro Glu Gln Leu Gln Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Asp Gly Phe His Gln Cys Asp Ala Gly Trp Leu Ala Asp Gln Thr
195 200 205
Val Arg Tyr Pro Ile His Thr Pro Arg Glu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys
210 215 220
Asp Glu Phe Pro Gly Val Arg Thr Tyr Gly Ile Arg Asp Thr Asn Glu
225 230 235 240
Thr Tyr Asp Val Tyr Cys Phe Ala Glu Glu Met Glu Gly Glu Val Phe
245 250 255
Tyr Ala Thr Ser Pro Glu Lys Phe Thr Phe Gln Glu Ala Ala Asn Glu
260 265 270
Cys Arg Arg Leu Gly Ala Arg Leu Ala Thr Thr Gly His Val Tyr Leu
275 280 285
Ala Trp Gln Ala Gly Met Asp Met Cys Ser Ala Gly Trp Leu Ala Asp
290 295 300
Arg Ser Val Arg Tyr Pro Ile Ser Lys Ala Arg Pro Asn Cys Gly Gly
305 310 315 320
Asn Leu Leu Gly Val Arg Thr Val Tyr Val His Ala Asn Gln Thr Gly
325 330 335
Tyr Pro Asp Pro Ser Ser Arg Tyr Asp Ala Ile Cys Tyr Thr Gly Glu
340 345 350
Asp Phe Val Asp Ile Pro Glu Asn Phe Phe Gly Val Gly Gly Glu Glu
355 360 365
Asp Ile Thr Val Gln Thr Val Thr Trp Pro Asp Met Glu Leu Pro Leu
370 375 380
Pro Arg Asn Ile Thr Glu Gly Glu Ala Arg Gly Ser Val Ile Leu Thr
385 390 395 400
Val Lys Pro Ile Phe Glu Val Ser Pro Ser Pro Leu Glu Pro Glu Glu
405 410 415
Pro Phe Thr Phe Ala Pro Glu Ile Gly Ala Thr Ala Phe Ala Glu Val
420 425 430
Glu Asn Glu Thr Gly Glu Ala Thr Arg Pro Trp Gly Phe Pro Thr Pro
435 440 445
Gly Leu Gly Pro Ala Thr Ala Phe Thr Ser Glu Asp Leu Val Val Gln
450 455 460
Val Thr Ala Val Pro Gly Gln Pro His Leu Pro Gly Gly Val Val Phe
465 470 475 480
His Tyr Arg Pro Gly Pro Thr Arg Tyr Ser Leu Thr Phe Glu Glu Ala
485 490 495
Gln Gln Ala Cys Pro Gly Thr Gly Ala Val Ile Ala Ser Pro Glu Gln
500 505 510
Leu Gln Ala Ala Tyr Glu Ala Gly Tyr Glu Gln Cys Asp Ala Gly Trp
515 520 525
Leu Arg Asp Gln Thr Val Arg Tyr Pro Ile Val Ser Pro Arg Thr Pro
530 535 540
Cys Val Gly Asp Lys Asp Ser Ser Pro Gly Val Arg Thr Tyr Gly Val
545 550 555 560
Arg Pro Ser Thr Glu Thr Tyr Asp Val Tyr Cys Phe Val Asp Arg Leu
565 570 575
Glu Gly Glu Val Phe Phe Ala Thr Arg Leu Glu Gln Phe Thr Phe Gln
580 585 590
Glu Ala Leu Glu Phe Cys Glu Ser His Asn Ala Thr Ala Thr Thr Gly
595 600 605
Gln Leu Tyr Ala Ala Trp Ser Arg Gly Leu Asp Lys Cys Tyr Ala Gly
610 615 620
Trp Leu Ala Asp Gly Ser Leu Arg Tyr Pro Ile Val Thr Pro Arg Pro
625 630 635 640
Ala Cys Gly Gly Asp Lys Pro Gly Val Arg Thr Val Tyr Leu Tyr Pro
645 650 655
Asn Gln Thr Gly Leu Pro Asp Pro Leu Ser Arg His His Ala Phe Cys
660 665 670
Phe Arg Gly Ile Ser Ala Val Pro Ser Pro Gly Glu Glu Glu Gly Gly
675 680 685
Thr Pro Thr Ser Pro Ser Gly Val Glu Glu Trp Ile Val Thr Gln Val
690 695 700
Val Pro Gly Val Ala Ala Val Pro Val Glu Glu Glu Thr Thr Ala Val
705 710 715 720
Pro Ser Gly Glu Thr Thr Ala Ile Leu Glu Phe Thr Thr Glu Pro Glu
725 730 735
Asn Gln Thr Glu Trp Glu Pro Ala Tyr Thr Pro Val Gly Thr Ser Pro
740 745 750
Leu Pro Gly Ile Leu Pro Thr Trp Pro Pro Thr Gly Ala Glu Thr Glu
755 760 765
Glu Ser Thr Glu Gly Pro Ser Ala Thr Glu Val Pro Ser Ala Ser Glu
770 775 780
Glu Pro Ser Pro Ser Glu Val Pro Phe Pro Ser Glu Glu Pro Ser Pro
785 790 795 800
Ser Glu Glu Pro Phe Pro Ser Val Arg Pro Phe Pro Ser Val Glu Leu
805 810 815
Phe Pro Ser Glu Glu Pro Phe Pro Ser Lys Glu Pro Ser Pro Ser Glu
820 825 830
Glu Pro Ser Ala Ser Glu Glu Pro Tyr Thr Pro Ser Pro Pro Glu Pro
835 840 845
Ser Trp Thr Glu Leu Pro Ser Ser Gly Glu Glu Ser Gly Ala Pro Asp
850 855 860
Val Ser Gly Asp Phe Thr Gly Ser Gly Asp Val Ser Gly His Leu Asp
865 870 875 880
Phe Ser Gly Gln Leu Ser Gly Asp Arg Ala Ser Gly Leu Pro Ser Gly
885 890 895
Asp Leu Asp Ser Ser Gly Leu Thr Ser Thr Val Gly Ser Gly Leu Thr
900 905 910
Val Glu Ser Gly Leu Pro Ser Gly Asp Glu Glu Arg Ile Glu Trp Pro
915 920 925
Ser Thr Pro Thr Val Gly Glu Leu Pro Ser Gly Ala Glu Ile Leu Glu
930 935 940
Gly Ser Ala Ser Gly Val Gly Asp Leu Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu
945 950 955 960
Val Leu Glu Thr Ser Ala Ser Gly Val Gly Asp Leu Ser Gly Leu Pro
965 970 975
Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Thr Ala Pro Gly Val Glu Asp Ile Ser
980 985 990
Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Thr Ala Pro Gly Val Glu
995 1000 1005
Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Thr Ala Pro
1010 1015 1020
Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr
1025 1030 1035 1040
Thr Ala Pro Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val
1045 1050 1055
Leu Glu Thr Thr Ala Pro Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser
1060 1065 1070
Gly Glu Val Leu Glu Thr Ala Ala Pro Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly
1075 1080 1085
Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Ala Ala Pro Gly Val Glu Asp
1090 1095 1100
Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Ala Ala Pro Gly
1105 1110 1115 1120
Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Ala
1125 1130 1135
Ala Pro Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu
1140 1145 1150
Glu Thr Ala Ala Pro Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly
1155 1160 1165
Glu Val Leu Glu Thr Ala Ala Pro Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu
1170 1175 1180
Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Ala Ala Pro Gly Val Glu Asp Ile
1185 1190 1195 1200
Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Ala Ala Pro Gly Val
1205 1210 1215
Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Ala Ala
1220 1225 1230
Pro Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu
1235 1240 1245
Thr Ala Ala Pro Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu
1250 1255 1260
Val Leu Glu Thr Ala Ala Pro Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro
1265 1270 1275 1280
Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Thr Ala Pro Gly Val Glu Glu Ile Ser
1285 1290 1295
Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Thr Ala Pro Gly Val Asp
1300 1305 1310
Glu Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Thr Ala Pro
1315 1320 1325
Gly Val Glu Glu Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr
1330 1335 1340
Ser Thr Ser Ala Val Gly Asp Leu Ser Gly Leu Pro Ser Gly Gly Glu
1345 1350 1355 1360
Val Leu Glu Ile Ser Val Ser Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro
1365 1370 1375
Ser Gly Glu Val Val Glu Thr Ser Ala Ser Gly Ile Glu Asp Val Ser
1380 1385 1390
Glu Leu Pro Ser Gly Glu Gly Leu Glu Thr Ser Ala Ser Gly Val Glu
1395 1400 1405
Asp Leu Ser Arg Leu Pro Ser Gly Glu Glu Val Leu Glu Ile Ser Ala
1410 1415 1420
Ser Gly Phe Gly Asp Leu Ser Gly Val Pro Ser Gly Gly Glu Gly Leu
1425 1430 1435 1440
Glu Thr Ser Ala Ser Glu Val Gly Thr Asp Leu Ser Gly Leu Pro Ser
1445 1450 1455
Gly Arg Glu Gly Leu Glu Thr Ser Ala Ser Gly Ala Glu Asp Leu Ser
1460 1465 1470
Gly Leu Pro Ser Gly Lys Glu Asp Leu Val Gly Ser Ala Ser Gly Asp
1475 1480 1485
Leu Asp Leu Gly Lys Leu Pro Ser Gly Thr Leu Gly Ser Gly Gln Ala
1490 1495 1500
Pro Glu Thr Ser Gly Leu Pro Ser Gly Phe Ser Gly Glu Tyr Ser Gly
1505 1510 1515 1520
Val Asp Leu Gly Ser Gly Pro Pro Ser Gly Leu Pro Asp Phe Ser Gly
1525 1530 1535
Leu Pro Ser Gly Phe Pro Thr Val Ser Leu Val Asp Ser Thr Leu Val
1540 1545 1550
Glu Val Val Thr Ala Ser Thr Ala Ser Glu Leu Glu Gly Arg Gly Thr
1555 1560 1565
Ile Gly Ile Ser Gly Ala Gly Glu Ile Ser Gly Leu Pro Ser Ser Glu
1570 1575 1580
Leu Asp Ile Ser Gly Arg Ala Ser Gly Leu Pro Ser Gly Thr Glu Leu
1585 1590 1595 1600
Ser Gly Gln Ala Ser Gly Ser Pro Asp Val Ser Gly Glu Ile Pro Gly
1605 1610 1615
Leu Phe Gly Val Ser Gly Gln Pro Ser Gly Phe Pro Asp Thr Ser Gly
1620 1625 1630
Glu Thr Ser Gly Val Thr Glu Leu Ser Gly Leu Ser Ser Gly Gln Pro
1635 1640 1645
Gly Val Ser Gly Glu Ala Ser Gly Val Leu Tyr Gly Thr Ser Gln Pro
1650 1655 1660
Phe Gly Ile Thr Asp Leu Ser Gly Glu Thr Ser Gly Val Pro Asp Leu
1665 1670 1675 1680
Ser Gly Gln Pro Ser Gly Leu Pro Gly Phe Ser Gly Ala Thr Ser Gly
1685 1690 1695
Val Pro Asp Leu Val Ser Gly Thr Thr Ser Gly Ser Gly Glu Ser Ser
1700 1705 1710
Gly Ile Thr Phe Val Asp Thr Ser Leu Val Glu Val Ala Pro Thr Thr
1715 1720 1725
Phe Lys Glu Glu Glu Gly Leu Gly Ser Val Glu Leu Ser Gly Leu Pro
1730 1735 1740
Ser Gly Glu Ala Asp Leu Ser Gly Lys Ser Gly Met Val Asp Val Ser
1745 1750 1755 1760
Gly Gln Phe Ser Gly Thr Val Asp Ser Ser Gly Phe Thr Ser Gln Thr
1765 1770 1775
Pro Glu Phe Ser Gly Leu Pro Ser Gly Ile Ala Glu Val Ser Gly Glu
1780 1785 1790
Ser Ser Arg Ala Glu Ile Gly Ser Ser Leu Pro Ser Gly Ala Tyr Tyr
1795 1800 1805
Gly Ser Gly Thr Pro Ser Ser Phe Pro Thr Val Ser Leu Val Asp Arg
1810 1815 1820
Thr Leu Val Glu Ser Val Thr Gln Ala Pro Thr Ala Gln Glu Ala Gly
1825 1830 1835 1840
Glu Gly Pro Ser Gly Ile Leu Glu Leu Ser Gly Ala His Ser Gly Ala
1845 1850 1855
Pro Asp Met Ser Gly Glu His Ser Gly Phe Leu Asp Leu Ser Gly Leu
1860 1865 1870
Gln Ser Gly Leu Ile Glu Pro Ser Gly Glu Pro Pro Gly Thr Pro Tyr
1875 1880 1885
Phe Ser Gly Asp Phe Ala Ser Thr Thr Asn Val Ser Gly Glu Ser Ser
1890 1895 1900
Val Ala Met Gly Thr Ser Gly Glu Ala Ser Gly Leu Pro Glu Val Thr
1905 1910 1915 1920
Leu Ile Thr Ser Glu Phe Val Glu Gly Val Thr Glu Pro Thr Ile Ser
1925 1930 1935
Gln Glu Leu Gly Gln Arg Pro Pro Val Thr His Thr Pro Gln Leu Phe
1940 1945 1950
Glu Ser Ser Gly Lys Val Ser Thr Ala Gly Asp Ile Ser Gly Ala Thr
1955 1960 1965
Pro Val Leu Pro Gly Ser Gly Val Glu Val Ser Ser Val Pro Glu Ser
1970 1975 1980
Ser Ser Glu Thr Ser Ala Tyr Pro Glu Ala Gly Phe Gly Ala Ser Ala
1985 1990 1995 2000
Ala Pro Glu Ala Ser Arg Glu Asp Ser Gly Ser Pro Asp Leu Ser Glu
2005 2010 2015
Thr Thr Ser Ala Phe His Glu Ala Asn Leu Glu Arg Ser Ser Gly Leu
2020 2025 2030
Gly Val Ser Gly Ser Thr Leu Thr Phe Gln Glu Gly Glu Ala Ser Ala
2035 2040 2045
Ala Pro Glu Val Ser Gly Glu Ser Thr Thr Thr Ser Asp Val Gly Thr
2050 2055 2060
Glu Ala Pro Gly Leu Pro Ser Ala Thr Pro Thr Ala Ser Gly Asp Arg
2065 2070 2075 2080
Thr Glu Ile Ser Gly Asp Leu Ser Gly His Thr Ser Gln Leu Gly Val
2085 2090 2095
Val Ile Ser Thr Ser Ile Pro Glu Ser Glu Trp Thr Gln Gln Thr Gln
2100 2105 2110
Arg Pro Ala Glu Thr His Leu Glu Ile Glu Ser Ser Ser Leu Leu Tyr
2115 2120 2125
Ser Gly Glu Glu Thr His Thr Val Glu Thr Ala Thr Ser Pro Thr Asp
2130 2135 2140
Ala Ser Ile Pro Ala Ser Pro Glu Trp Lys Arg Glu Ser Glu Ser Thr
2145 2150 2155 2160
Ala Ala Ala Pro Ala Arg Ser Cys Ala Glu Glu Pro Cys Gly Ala Gly
2165 2170 2175
Thr Cys Lys Glu Thr Glu Gly His Val Ile Cys Leu Cys Pro Pro Gly
2180 2185 2190
Tyr Thr Gly Glu His Cys Asn Ile Asp Gln Glu Val Cys Glu Glu Gly
2195 2200 2205
Trp Asn Lys Tyr Gln Gly His Cys Tyr Arg His Phe Pro Asp Arg Glu
2210 2215 2220
Thr Trp Val Asp Ala Glu Arg Arg Cys Arg Glu Gln Gln Ser His Leu
2225 2230 2235 2240
Ser Ser Ile Val Thr Pro Glu Glu Gln Glu Phe Val Asn Asn Asn Ala
2245 2250 2255
Gln Asp Tyr Gln Trp Ile Gly Leu Asn Asp Arg Thr Ile Glu Gly Asp
2260 2265 2270
Phe Arg Trp Ser Asp Gly His Pro Met Gln Phe Glu Asn Trp Arg Pro
2275 2280 2285
Asn Gln Pro Asp Asn Phe Phe Ala Ala Gly Glu Asp Cys Val Val Met
2290 2295 2300
Ile Trp His Glu Lys Gly Glu Trp Asn Asp Val Pro Cys Asn Tyr His
2305 2310 2315 2320
Leu Pro Phe Thr Cys Lys Lys Gly Thr Val Ala Cys Gly Glu Pro Pro
2325 2330 2335
Val Val Glu His Ala Arg Thr Phe Gly Gln Lys Lys Asp Arg Tyr Glu
2340 2345 2350
Ile Asn Ser Leu Val Arg Tyr Gln Cys Thr Glu Gly Phe Val Gln Arg
2355 2360 2365
His Met Pro Thr Ile Arg Cys Gln Pro Ser Gly His Trp Glu Glu Pro
2370 2375 2380
Arg Ile Thr Cys Thr Asp Ala Thr Thr Tyr Lys Arg Arg Leu Gln Lys
2385 2390 2395 2400
Arg Ser Ser Arg His Pro Arg Arg Ser Arg Pro Ser Thr Ala His
2405 2410 2415
<210> 106
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 106
Ala Leu Ala Val Tyr Gly Pro Ser Arg Tyr Arg Tyr Gly Pro Val Gly
1 5 10 15
Glu Tyr Gln Tyr
20
<210> 107
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 107
Asp Pro Ser His Tyr Tyr Ser Glu Tyr Glu Cys Gly Tyr Tyr Gly Met
1 5 10 15
Asp Tyr
<210> 108
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 108
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
1 5 10
<210> 109
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 109
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Ala Val Asp Ala Ser Arg Gly Leu Pro Tyr Glu Leu Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 110
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 110
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ala Ala Leu Ala Val Tyr Gly Pro Ser Arg Tyr Arg Tyr Gly Pro
100 105 110
Val Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 111
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 111
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ala Ala
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Asp Asp Gly Ser Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Thr Gly Tyr Gly Ala Thr Thr Thr Arg Pro Gly Arg Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 112
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 112
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ala Tyr Tyr
20 25 30
Ser Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Ser Gly Ile Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ala Asp Pro Ser His Tyr Tyr Ser Glu Tyr Glu Cys Gly Tyr
100 105 110
Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 113
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 113
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
1 5 10 15
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
20 25 30
Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Thr
35
<210> 114
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 114
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
1 5 10 15
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
20 25 30
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
35
<210> 115
<211> 471
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 115
Met His Pro Gly Val Leu Ala Ala Phe Leu Phe Leu Ser Trp Thr His
1 5 10 15
Cys Arg Ala Leu Pro Leu Pro Ser Gly Gly Asp Glu Asp Asp Leu Ser
20 25 30
Glu Glu Asp Leu Gln Phe Ala Glu Arg Tyr Leu Arg Ser Tyr Tyr His
35 40 45
Pro Thr Asn Leu Ala Gly Ile Leu Lys Glu Asn Ala Ala Ser Ser Met
50 55 60
Thr Glu Arg Leu Arg Glu Met Gln Ser Phe Phe Gly Leu Glu Val Thr
65 70 75 80
Gly Lys Leu Asp Asp Asn Thr Leu Asp Val Met Lys Lys Pro Arg Cys
85 90 95
Gly Val Pro Asp Val Gly Glu Tyr Asn Val Phe Pro Arg Thr Leu Lys
100 105 110
Trp Ser Lys Met Asn Leu Thr Tyr Arg Ile Val Asn Tyr Thr Pro Asp
115 120 125
Met Thr His Ser Glu Val Glu Lys Ala Phe Lys Lys Ala Phe Lys Val
130 135 140
Trp Ser Asp Val Thr Pro Leu Asn Phe Thr Arg Leu His Asp Gly Ile
145 150 155 160
Ala Asp Ile Met Ile Ser Phe Gly Ile Lys Glu His Gly Asp Phe Tyr
165 170 175
Pro Phe Asp Gly Pro Ser Gly Leu Leu Ala His Ala Phe Pro Pro Gly
180 185 190
Pro Asn Tyr Gly Gly Asp Ala His Phe Asp Asp Asp Glu Thr Trp Thr
195 200 205
Ser Ser Ser Lys Gly Tyr Asn Leu Phe Leu Val Ala Ala His Glu Phe
210 215 220
Gly His Ser Leu Gly Leu Asp His Ser Lys Asp Pro Gly Ala Leu Met
225 230 235 240
Phe Pro Ile Tyr Thr Tyr Thr Gly Lys Ser His Phe Met Leu Pro Asp
245 250 255
Asp Asp Val Gln Gly Ile Gln Ser Leu Tyr Gly Pro Gly Asp Glu Asp
260 265 270
Pro Asn Pro Lys His Pro Lys Thr Pro Asp Lys Cys Asp Pro Ser Leu
275 280 285
Ser Leu Asp Ala Ile Thr Ser Leu Arg Gly Glu Thr Met Ile Phe Lys
290 295 300
Asp Arg Phe Phe Trp Arg Leu His Pro Gln Gln Val Asp Ala Glu Leu
305 310 315 320
Phe Leu Thr Lys Ser Phe Trp Pro Glu Leu Pro Asn Arg Ile Asp Ala
325 330 335
Ala Tyr Glu His Pro Ser His Asp Leu Ile Phe Ile Phe Arg Gly Arg
340 345 350
Lys Phe Trp Ala Leu Asn Gly Tyr Asp Ile Leu Glu Gly Tyr Pro Lys
355 360 365
Lys Ile Ser Glu Leu Gly Leu Pro Lys Glu Val Lys Lys Ile Ser Ala
370 375 380
Ala Val His Phe Glu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Leu Phe Ser Gly Asn
385 390 395 400
Gln Val Trp Arg Tyr Asp Asp Thr Asn His Ile Met Asp Lys Asp Tyr
405 410 415
Pro Arg Leu Ile Glu Glu Asp Phe Pro Gly Ile Gly Asp Lys Val Asp
420 425 430
Ala Val Tyr Glu Lys Asn Gly Tyr Ile Tyr Phe Phe Asn Gly Pro Ile
435 440 445
Gln Phe Glu Tyr Ser Ile Trp Ser Asn Arg Ile Val Arg Val Met Pro
450 455 460
Ala Asn Ser Ile Leu Trp Cys
465 470
<210> 116
<211> 471
<212> PRT
<213> 黑猩猩
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 116
Met His Pro Gly Val Leu Ala Ala Phe Leu Phe Leu Ser Trp Ala His
1 5 10 15
Cys Arg Ala Leu Pro Leu Pro Ser Gly Gly Asp Glu Asp Asp Leu Ser
20 25 30
Glu Glu Asp Leu Gln Phe Ala Glu Arg Tyr Leu Arg Ser Tyr Tyr His
35 40 45
Pro Thr Asn Leu Ala Gly Ile Leu Lys Glu Asn Ala Ala Ser Ser Met
50 55 60
Thr Glu Arg Leu Arg Glu Met Gln Ser Phe Phe Gly Leu Glu Val Thr
65 70 75 80
Gly Lys Leu Asp Asp Asn Thr Leu Asp Val Met Lys Lys Pro Arg Cys
85 90 95
Gly Val Pro Asp Val Gly Glu Tyr Asn Val Phe Pro Arg Thr Leu Lys
100 105 110
Trp Ser Lys Met Asn Leu Thr Tyr Arg Ile Val Asn Tyr Thr Pro Asp
115 120 125
Met Thr His Ser Glu Val Glu Lys Ala Phe Lys Lys Ala Phe Lys Val
130 135 140
Trp Ser Asp Val Thr Pro Leu Asn Phe Thr Arg Leu His Asp Gly Ile
145 150 155 160
Ala Asp Ile Met Ile Ser Phe Gly Ile Lys Glu His Gly Asp Phe Tyr
165 170 175
Pro Phe Asp Gly Pro Ser Gly Leu Leu Ala His Ala Phe Pro Pro Gly
180 185 190
Pro Asn Tyr Gly Gly Asp Ala His Phe Asp Asp Asp Glu Thr Trp Thr
195 200 205
Ser Ser Ser Lys Gly Tyr Asn Leu Phe Leu Val Ala Ala His Glu Phe
210 215 220
Gly His Ser Leu Gly Leu Asp His Ser Lys Asp Pro Gly Ala Leu Met
225 230 235 240
Phe Pro Ile Tyr Thr Tyr Thr Gly Lys Ser His Phe Met Leu Pro Asp
245 250 255
Asp Asp Val Gln Gly Ile Gln Ser Leu Tyr Gly Pro Gly Asp Glu Asp
260 265 270
Pro Asn Pro Lys His Pro Lys Thr Pro Asp Lys Cys Asp Pro Ser Leu
275 280 285
Ser Leu Asp Ala Ile Thr Ser Leu Arg Gly Glu Thr Met Ile Phe Lys
290 295 300
Asp Arg Phe Phe Trp Arg Leu His Pro Gln Gln Val Asp Ala Glu Leu
305 310 315 320
Phe Leu Thr Lys Ser Phe Trp Pro Glu Leu Pro Asn Arg Ile Asp Ala
325 330 335
Ala Tyr Glu His Pro Ser His Asp Leu Ile Phe Ile Phe Arg Gly Arg
340 345 350
Lys Phe Trp Ala Leu Asn Gly Tyr Asp Ile Leu Glu Gly Tyr Pro Lys
355 360 365
Lys Ile Ser Glu Leu Gly Leu Pro Lys Glu Val Lys Lys Ile Ser Ala
370 375 380
Thr Val His Phe Glu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Leu Phe Ser Gly Asn
385 390 395 400
Gln Val Trp Arg Tyr Asp Asp Thr Asn His Ile Met Asp Lys Asp Tyr
405 410 415
Pro Arg Leu Ile Glu Glu Glu Phe Pro Gly Ile Gly Asp Lys Val Asp
420 425 430
Ala Val Tyr Glu Lys Asn Gly Tyr Ile Tyr Phe Phe Asn Gly Pro Ile
435 440 445
Gln Phe Glu Tyr Ser Ile Trp Ser Asn Arg Ile Val Arg Val Met Pro
450 455 460
Ala Asn Ser Ile Leu Trp Cys
465 470
<210> 117
<211> 471
<212> PRT
<213> 恒河猴
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 117
Met His Pro Gly Val Leu Ala Ala Phe Leu Phe Leu Ser Trp Thr His
1 5 10 15
Cys Arg Ala Leu Pro Leu Pro Ser Gly Gly Asp Glu Asp Asp Leu Ser
20 25 30
Glu Glu Asp Leu Gln Phe Ala Glu Arg Tyr Leu Arg Ser Tyr Tyr Tyr
35 40 45
Pro Thr Asn Leu Ala Gly Ile Leu Lys Glu Asn Ala Ala Ser Ser Met
50 55 60
Thr Asp Arg Leu Arg Glu Met Gln Ser Phe Phe Gly Leu Glu Val Thr
65 70 75 80
Gly Lys Leu Asp Asp Asn Thr Leu Asp Val Met Lys Lys Pro Arg Cys
85 90 95
Gly Val Pro Asp Val Gly Glu Tyr Asn Val Phe Pro Arg Thr Leu Lys
100 105 110
Trp Ser Lys Met Asn Leu Thr Tyr Arg Ile Val Asn Tyr Thr Pro Asp
115 120 125
Met Thr His Ser Glu Val Glu Lys Ala Phe Lys Lys Ala Phe Lys Val
130 135 140
Trp Ser Asp Val Thr Pro Leu Asn Phe Thr Arg Leu His Asp Gly Ile
145 150 155 160
Ala Asp Ile Met Ile Ser Phe Gly Thr Lys Glu His Gly Asp Phe Tyr
165 170 175
Pro Phe Asp Gly Pro Ser Gly Leu Leu Ala His Ala Phe Pro Pro Gly
180 185 190
Pro Asn Tyr Gly Gly Asp Ala His Phe Asp Asp Asp Glu Thr Trp Thr
195 200 205
Ser Ser Ser Lys Gly Tyr Asn Leu Phe Leu Val Ala Ala His Glu Phe
210 215 220
Gly His Ser Leu Gly Leu Asp His Ser Lys Asp Pro Gly Ala Leu Met
225 230 235 240
Phe Pro Ile Tyr Thr Tyr Thr Gly Lys Ser His Phe Met Leu Pro Asp
245 250 255
Asp Asp Val Gln Gly Ile Gln Ser Leu Tyr Gly Pro Gly Asp Glu Asp
260 265 270
Pro Asn Pro Lys His Pro Lys Thr Pro Asp Lys Cys Asp Pro Ser Leu
275 280 285
Ser Leu Asp Ala Ile Thr Ser Leu Arg Gly Glu Thr Met Ile Phe Lys
290 295 300
Asp Arg Phe Phe Trp Arg Leu His Pro Gln Gln Val Asp Ala Glu Leu
305 310 315 320
Phe Leu Thr Lys Ser Phe Trp Pro Glu Leu Pro Asn Arg Ile Asp Ala
325 330 335
Ala Tyr Glu His Pro Ser His Asp Leu Ile Phe Ile Phe Arg Gly Arg
340 345 350
Lys Phe Trp Ala Leu Asn Gly Tyr Asp Ile Leu Glu Gly Tyr Pro Lys
355 360 365
Lys Ile Ser Glu Leu Gly Phe Pro Lys Glu Val Lys Lys Ile Ser Ala
370 375 380
Ala Val His Phe Glu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Leu Phe Ser Gly Asn
385 390 395 400
Gln Val Trp Arg Tyr Asp Asp Thr Asn His Ile Met Asp Lys Asp Tyr
405 410 415
Pro Arg Leu Ile Glu Glu Asp Phe Pro Gly Ile Gly Asp Lys Val Asp
420 425 430
Ala Val Tyr Glu Lys Asn Gly Tyr Ile Tyr Phe Phe Asn Gly Pro Ile
435 440 445
Gln Phe Glu Tyr Ser Ile Trp Ser Asn Arg Ile Val Arg Val Met Pro
450 455 460
Ala Asn Ser Ile Leu Trp Cys
465 470
<210> 118
<211> 496
<212> PRT
<213> 狼
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 118
Met Ser His His Cys Arg Ser Ile Lys Val Lys Val Leu Val Trp Glu
1 5 10 15
Arg Gln Gln Ala Pro Gly Thr Thr Thr Lys Met Leu Pro Gly Ile Leu
20 25 30
Ala Ala Phe Leu Cys Leu Ser Trp Thr Gln Cys Trp Ser Leu Pro Leu
35 40 45
Pro Ser Asp Gly Asp Asp Asp Leu Ser Glu Glu Asp Phe Gln Leu Ala
50 55 60
Glu Arg Tyr Leu Lys Ser Tyr Tyr Tyr Pro Leu Asn Pro Ala Gly Ile
65 70 75 80
Leu Lys Lys Ser Ala Ala Gly Ser Val Ala Asp Arg Leu Arg Glu Met
85 90 95
Gln Ser Phe Phe Gly Leu Glu Val Thr Gly Lys Leu Asp Asp Asn Thr
100 105 110
Leu Asp Ile Met Lys Lys Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val Gly Glu
115 120 125
Tyr Asn Val Phe Pro Arg Thr Leu Lys Trp Ser Lys Thr Asn Leu Thr
130 135 140
Tyr Arg Ile Val Asn Tyr Thr Pro Asp Leu Thr His Ser Glu Val Glu
145 150 155 160
Lys Ala Phe Lys Lys Ala Phe Lys Val Trp Ser Asp Val Thr Pro Leu
165 170 175
Asn Phe Thr Arg Leu His Asp Gly Thr Ala Asp Ile Met Ile Ser Phe
180 185 190
Gly Thr Lys Glu His Gly Asp Phe Tyr Pro Phe Asp Gly Pro Ser Gly
195 200 205
Leu Leu Ala His Ala Phe Pro Pro Gly Pro Asn Tyr Gly Gly Asp Ala
210 215 220
His Phe Asp Asp Asp Glu Thr Trp Thr Ser Ser Ser Lys Gly Tyr Asn
225 230 235 240
Leu Phe Leu Val Ala Ala His Glu Phe Gly His Ser Leu Gly Leu Asp
245 250 255
His Ser Lys Asp Pro Gly Ala Leu Met Phe Pro Ile Tyr Thr Tyr Thr
260 265 270
Gly Lys Ser His Phe Met Leu Pro Asp Asp Asp Val Gln Gly Ile Gln
275 280 285
Ser Leu Tyr Gly Pro Gly Asp Glu Asp Pro Asn Pro Arg His Pro Lys
290 295 300
Thr Pro Asp Lys Cys Asp Pro Ser Leu Ser Leu Asp Ala Ile Thr Ser
305 310 315 320
Leu Arg Gly Glu Thr Met Ile Phe Lys Asp Arg Phe Phe Trp Arg Leu
325 330 335
His Pro Gln Gln Val Asp Ala Glu Leu Phe Leu Thr Lys Ser Phe Trp
340 345 350
Pro Glu Leu Pro Asn Arg Ile Asp Ala Ala Tyr Glu His Pro Ser Arg
355 360 365
Asp Leu Ile Phe Ile Phe Arg Gly Arg Lys Tyr Trp Ala Leu Asn Gly
370 375 380
Tyr Asp Ile Leu Glu Gly Tyr Pro Gln Lys Ile Ser Glu Leu Gly Phe
385 390 395 400
Pro Lys Glu Val Lys Lys Ile Ser Ala Ala Val His Phe Glu Asp Thr
405 410 415
Gly Lys Thr Leu Phe Phe Ser Gly Asn Gln Val Trp Ser Tyr Asp Asp
420 425 430
Thr Asn Gln Ile Met Asp Lys Asp Tyr Pro Arg Leu Ile Glu Glu Asp
435 440 445
Phe Pro Gly Ile Gly Asp Lys Val Asp Ala Val Tyr Glu Lys Asn Gly
450 455 460
Tyr Ile Tyr Phe Phe Asn Gly Pro Ile Gln Phe Glu Tyr Asn Ile Trp
465 470 475 480
Ser Lys Arg Ile Val Arg Val Met Pro Ala Asn Ser Leu Leu Trp Cys
485 490 495
<210> 119
<211> 471
<212> PRT
<213> 牛
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 119
Met His Pro Arg Val Leu Ala Gly Phe Leu Phe Phe Ser Trp Thr Ala
1 5 10 15
Cys Trp Ser Leu Pro Leu Pro Ser Asp Gly Asp Ser Glu Asp Leu Ser
20 25 30
Glu Glu Asp Phe Gln Phe Ala Glu Ser Tyr Leu Lys Ser Tyr Tyr Tyr
35 40 45
Pro Gln Asn Pro Ala Gly Ile Leu Lys Lys Thr Ala Ala Ser Ser Val
50 55 60
Ile Asp Arg Leu Arg Glu Met Gln Ser Phe Phe Gly Leu Glu Val Thr
65 70 75 80
Gly Arg Leu Asp Asp Asn Thr Leu Asp Ile Met Lys Lys Pro Arg Cys
85 90 95
Gly Val Pro Asp Val Gly Glu Tyr Asn Val Phe Pro Arg Thr Leu Lys
100 105 110
Trp Ser Lys Met Asn Leu Thr Tyr Arg Ile Val Asn Tyr Thr Pro Asp
115 120 125
Leu Thr His Ser Glu Val Glu Lys Ala Phe Arg Lys Ala Phe Lys Val
130 135 140
Trp Ser Asp Val Thr Pro Leu Asn Phe Thr Arg Ile His Asn Gly Thr
145 150 155 160
Ala Asp Ile Met Ile Ser Phe Gly Thr Lys Glu His Gly Asp Phe Tyr
165 170 175
Pro Phe Asp Gly Pro Ser Gly Leu Leu Ala His Ala Phe Pro Pro Gly
180 185 190
Pro Asn Tyr Gly Gly Asp Ala His Phe Asp Asp Asp Glu Thr Trp Thr
195 200 205
Ser Ser Ser Lys Gly Tyr Asn Leu Phe Leu Val Ala Ala His Glu Phe
210 215 220
Gly His Ser Leu Gly Leu Asp His Ser Lys Asp Pro Gly Ala Leu Met
225 230 235 240
Phe Pro Ile Tyr Thr Tyr Thr Gly Lys Ser His Phe Met Leu Pro Asp
245 250 255
Asp Asp Val Gln Gly Ile Gln Ser Leu Tyr Gly Pro Gly Asp Glu Asp
260 265 270
Pro Tyr Ser Lys His Pro Lys Thr Pro Asp Lys Cys Asp Pro Ser Leu
275 280 285
Ser Leu Asp Ala Ile Thr Ser Leu Arg Gly Glu Thr Leu Ile Phe Lys
290 295 300
Asp Arg Phe Phe Trp Arg Leu His Pro Gln Gln Val Glu Ala Glu Leu
305 310 315 320
Phe Leu Thr Lys Ser Phe Gly Pro Glu Leu Pro Asn Arg Ile Asp Ala
325 330 335
Ala Tyr Glu His Pro Ser His Asp Leu Ile Phe Ile Phe Arg Gly Arg
340 345 350
Lys Phe Trp Ala Leu Ser Gly Tyr Asp Ile Leu Glu Asp Tyr Pro Lys
355 360 365
Lys Ile Ser Glu Leu Gly Phe Pro Lys His Val Lys Lys Ile Ser Ala
370 375 380
Ala Leu His Phe Glu Asp Ser Gly Lys Thr Leu Phe Phe Ser Glu Asn
385 390 395 400
Gln Val Trp Ser Tyr Asp Asp Thr Asn His Val Met Asp Lys Asp Tyr
405 410 415
Pro Arg Leu Ile Glu Glu Val Phe Pro Gly Ile Gly Asp Lys Val Asp
420 425 430
Ala Val Tyr Gln Lys Asn Gly Tyr Ile Tyr Phe Phe Asn Gly Pro Ile
435 440 445
Gln Phe Glu Tyr Ser Ile Trp Ser Asn Arg Ile Val Arg Val Met Thr
450 455 460
Thr Asn Ser Leu Leu Trp Cys
465 470
<210> 120
<211> 472
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 120
Met His Ser Ala Ile Leu Ala Thr Phe Phe Leu Leu Ser Trp Thr Pro
1 5 10 15
Cys Trp Ser Leu Pro Leu Pro Tyr Gly Asp Asp Asp Asp Asp Asp Leu
20 25 30
Ser Glu Glu Asp Leu Val Phe Ala Glu His Tyr Leu Lys Ser Tyr Tyr
35 40 45
His Pro Ala Thr Leu Ala Gly Ile Leu Lys Lys Ser Thr Val Thr Ser
50 55 60
Thr Val Asp Arg Leu Arg Glu Met Gln Ser Phe Phe Gly Leu Glu Val
65 70 75 80
Thr Gly Lys Leu Asp Asp Pro Thr Leu Asp Ile Met Arg Lys Pro Arg
85 90 95
Cys Gly Val Pro Asp Val Gly Glu Tyr Asn Val Phe Pro Arg Thr Leu
100 105 110
Lys Trp Ser Gln Thr Asn Leu Thr Tyr Arg Ile Val Asn Tyr Thr Pro
115 120 125
Asp Met Ser His Ser Glu Val Glu Lys Ala Phe Arg Lys Ala Phe Lys
130 135 140
Val Trp Ser Asp Val Thr Pro Leu Asn Phe Thr Arg Ile Tyr Asp Gly
145 150 155 160
Thr Ala Asp Ile Met Ile Ser Phe Gly Thr Lys Glu His Gly Asp Phe
165 170 175
Tyr Pro Phe Asp Gly Pro Ser Gly Leu Leu Ala His Ala Phe Pro Pro
180 185 190
Gly Pro Asn Tyr Gly Gly Asp Ala His Phe Asp Asp Asp Glu Thr Trp
195 200 205
Thr Ser Ser Ser Lys Gly Tyr Asn Leu Phe Ile Val Ala Ala His Glu
210 215 220
Leu Gly His Ser Leu Gly Leu Asp His Ser Lys Asp Pro Gly Ala Leu
225 230 235 240
Met Phe Pro Ile Tyr Thr Tyr Thr Gly Lys Ser His Phe Met Leu Pro
245 250 255
Asp Asp Asp Val Gln Gly Ile Gln Phe Leu Tyr Gly Pro Gly Asp Glu
260 265 270
Asp Pro Asn Pro Lys His Pro Lys Thr Pro Glu Lys Cys Asp Pro Ala
275 280 285
Leu Ser Leu Asp Ala Ile Thr Ser Leu Arg Gly Glu Thr Met Ile Phe
290 295 300
Lys Asp Arg Phe Phe Trp Arg Leu His Pro Gln Gln Val Glu Ala Glu
305 310 315 320
Leu Phe Leu Thr Lys Ser Phe Trp Pro Glu Leu Pro Asn His Val Asp
325 330 335
Ala Ala Tyr Glu His Pro Ser Arg Asp Leu Met Phe Ile Phe Arg Gly
340 345 350
Arg Lys Phe Trp Ala Leu Asn Gly Tyr Asp Ile Leu Glu Gly Tyr Pro
355 360 365
Arg Lys Ile Ser Asp Leu Gly Phe Pro Lys Glu Val Lys Arg Leu Ser
370 375 380
Ala Ala Val His Phe Glu Asn Thr Gly Lys Thr Leu Phe Phe Ser Glu
385 390 395 400
Asn His Val Trp Ser Tyr Asp Asp Val Asn Gln Thr Met Asp Lys Asp
405 410 415
Tyr Pro Arg Leu Ile Glu Glu Glu Phe Pro Gly Ile Gly Asn Lys Val
420 425 430
Asp Ala Val Tyr Glu Lys Asn Gly Tyr Ile Tyr Phe Phe Asn Gly Pro
435 440 445
Ile Gln Phe Glu Tyr Ser Ile Trp Ser Asn Arg Ile Val Arg Val Met
450 455 460
Pro Thr Asn Ser Ile Leu Trp Cys
465 470
<210> 121
<211> 472
<212> PRT
<213> 褐家鼠
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 121
Met His Ser Ala Ile Leu Ala Thr Phe Phe Leu Leu Ser Trp Thr His
1 5 10 15
Cys Trp Ser Leu Pro Leu Pro Tyr Gly Asp Asp Asp Asp Asp Asp Leu
20 25 30
Ser Glu Glu Asp Leu Glu Phe Ala Glu His Tyr Leu Lys Ser Tyr Tyr
35 40 45
His Pro Val Thr Leu Ala Gly Ile Leu Lys Lys Ser Thr Val Thr Ser
50 55 60
Thr Val Asp Arg Leu Arg Glu Met Gln Ser Phe Phe Gly Leu Asp Val
65 70 75 80
Thr Gly Lys Leu Asp Asp Pro Thr Leu Asp Ile Met Arg Lys Pro Arg
85 90 95
Cys Gly Val Pro Asp Val Gly Glu Tyr Asn Val Phe Pro Arg Thr Leu
100 105 110
Lys Trp Ser Gln Thr Asn Leu Thr Tyr Arg Ile Val Asn Tyr Thr Pro
115 120 125
Asp Ile Ser His Ser Glu Val Glu Lys Ala Phe Arg Lys Ala Phe Lys
130 135 140
Val Trp Ser Asp Val Thr Pro Leu Asn Phe Thr Arg Ile His Asp Gly
145 150 155 160
Thr Ala Asp Ile Met Ile Ser Phe Gly Thr Lys Glu His Gly Asp Phe
165 170 175
Tyr Pro Phe Asp Gly Pro Ser Gly Leu Leu Ala His Ala Phe Pro Pro
180 185 190
Gly Pro Asn Leu Gly Gly Asp Ala His Phe Asp Asp Asp Glu Thr Trp
195 200 205
Thr Ser Ser Ser Lys Gly Tyr Asn Leu Phe Ile Val Ala Ala His Glu
210 215 220
Leu Gly His Ser Leu Gly Leu Asp His Ser Lys Asp Pro Gly Ala Leu
225 230 235 240
Met Phe Pro Ile Tyr Thr Tyr Thr Gly Lys Ser His Phe Met Leu Pro
245 250 255
Asp Asp Asp Val Gln Gly Ile Gln Ser Leu Tyr Gly Pro Gly Asp Glu
260 265 270
Asp Pro Asn Pro Lys His Pro Lys Thr Pro Glu Lys Cys Asp Pro Ala
275 280 285
Leu Ser Leu Asp Ala Ile Thr Ser Leu Arg Gly Glu Thr Met Ile Phe
290 295 300
Lys Asp Arg Phe Phe Trp Arg Leu His Pro Gln Gln Val Glu Pro Glu
305 310 315 320
Leu Phe Leu Thr Lys Ser Phe Trp Pro Glu Leu Pro Asn His Val Asp
325 330 335
Ala Ala Tyr Glu His Pro Ser Arg Asp Leu Met Phe Ile Phe Arg Gly
340 345 350
Arg Lys Phe Trp Ala Leu Asn Gly Tyr Asp Ile Met Glu Gly Tyr Pro
355 360 365
Arg Lys Ile Ser Asp Leu Gly Phe Pro Lys Glu Val Lys Arg Leu Ser
370 375 380
Ala Ala Val His Phe Glu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Phe Phe Ser Gly
385 390 395 400
Asn His Val Trp Ser Tyr Asp Asp Ala Asn Gln Thr Met Asp Lys Asp
405 410 415
Tyr Pro Arg Leu Ile Glu Glu Glu Phe Pro Gly Ile Gly Asp Lys Val
420 425 430
Asp Ala Val Tyr Glu Lys Asn Gly Tyr Ile Tyr Phe Phe Asn Gly Pro
435 440 445
Ile Gln Phe Glu Tyr Ser Ile Trp Ser Asn Arg Ile Val Arg Val Met
450 455 460
Pro Thr Asn Ser Leu Leu Trp Cys
465 470
<210> 122
<211> 471
<212> PRT
<213> 原鸡
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 122
Met Gln Pro Arg Leu Ser Ala Val Phe Phe Phe Leu Leu Gly Leu Ser
1 5 10 15
Phe Cys Leu Thr Val Pro Ile Pro Leu Asp Asp Ser His Glu Phe Thr
20 25 30
Glu Glu Asp Leu Arg Phe Ala Glu Arg Tyr Leu Arg Thr His Tyr Asp
35 40 45
Leu Arg Pro Asn Pro Thr Gly Ile Met Lys Lys Ser Ala Asn Thr Met
50 55 60
Ala Ser Lys Leu Arg Glu Met Gln Ala Phe Phe Gly Leu Glu Val Thr
65 70 75 80
Gly Lys Leu Asp Glu Glu Thr Tyr Glu Leu Met Gln Lys Pro Arg Cys
85 90 95
Gly Val Pro Asp Val Gly Glu Tyr Asn Phe Phe Pro Arg Lys Leu Lys
100 105 110
Trp Ser Asn Thr Asn Leu Thr Tyr Arg Ile Met Ser Tyr Thr Ser Asp
115 120 125
Leu Arg Arg Ala Glu Val Glu Arg Ala Phe Lys Arg Ala Phe Lys Val
130 135 140
Trp Ser Asp Val Thr Pro Leu Asn Phe Thr Arg Ile Arg Ser Gly Thr
145 150 155 160
Ala Asp Ile Met Ile Ser Phe Gly Thr Lys Glu His Gly Asp Phe Tyr
165 170 175
Pro Phe Asp Gly Pro Ser Gly Leu Leu Ala His Ala Phe Pro Pro Gly
180 185 190
Pro Asp Tyr Gly Gly Asp Ala His Phe Asp Asp Asp Glu Thr Trp Ser
195 200 205
Asp Asp Ser Arg Gly Tyr Asn Leu Phe Leu Val Ala Ala His Glu Phe
210 215 220
Gly His Ser Leu Gly Leu Glu His Ser Arg Asp Pro Gly Ala Leu Met
225 230 235 240
Phe Pro Ile Tyr Thr Tyr Thr Gly Lys Ser Gly Phe Val Leu Pro Asp
245 250 255
Asp Asp Val Gln Gly Ile Gln Glu Leu Tyr Gly Ala Gly Asp Arg Asp
260 265 270
Pro Asn Pro Lys His Pro Lys Thr Pro Glu Lys Cys Ala Ala Asp Leu
275 280 285
Ser Ile Asp Ala Ile Thr Lys Leu Arg Gly Glu Met Leu Val Phe Lys
290 295 300
Asp Arg Phe Phe Trp Arg Leu His Pro Gln Met Val Glu Ala Glu Leu
305 310 315 320
Val Leu Ile Lys Ser Phe Trp Pro Glu Leu Pro Asn Lys Ile Asp Ala
325 330 335
Ala Tyr Glu Asn Pro Ile Lys Asp Leu Val Phe Met Phe Lys Gly Lys
340 345 350
Lys Val Trp Ala Met Asn Gly Tyr Asp Ile Val Glu Gly Phe Pro Lys
355 360 365
Lys Ile Tyr Glu Met Gly Phe Pro Lys Glu Met Lys Arg Ile Asp Ala
370 375 380
Val Val His Ile Asp Asp Thr Gly Lys Thr Leu Phe Phe Thr Gly Asn
385 390 395 400
Lys Tyr Trp Ser Tyr Asp Glu Glu Thr Glu Val Met Asp Thr Gly Tyr
405 410 415
Pro Lys Phe Ile Glu Asp Glu Phe Ala Gly Ile Gly Asp Arg Val Asp
420 425 430
Ala Val Tyr His Arg Asn Gly Tyr Leu Tyr Phe Phe Asn Gly Pro Leu
435 440 445
Gln Phe Glu Tyr Ser Ile Trp Ser Lys Arg Ile Val Arg Ile Leu His
450 455 460
Thr Asn Ser Leu Phe Trp Cys
465 470
<210> 123
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 123
Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala
1 5 10 15
Ala His His His His His His
20
<210> 124
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 124
Ala Ala Ala Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ala Ala His His His His
20 25 30
His His
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<400> 125
000
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<211> 5
<212> PRT
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<220>
<223> 氨基酸序列
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1 5
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<211> 7
<212> PRT
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<220>
<223> 氨基酸序列
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
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<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 131
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 132
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 132
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 133
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 134
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 135
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 135
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 136
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 136
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser
35
<210> 137
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 137
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40
<210> 138
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 138
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 139
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 139
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
1 5 10 15
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
20
<210> 140
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 140
Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Ala Ala Ala
1 5 10
<210> 141
<211> 62
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 141
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys
1 5 10 15
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
20 25 30
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu
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Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
50 55 60
<210> 142
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 142
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 143
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 143
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 144
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 144
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
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85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala
115
<210> 145
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 145
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Val Ser Ser Ala
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<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 146
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
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85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 147
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Val Ser Ser Ala
115
<210> 148
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 148
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 149
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 149
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala
115
<210> 150
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 150
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
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65 70 75 80
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100 105 110
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<210> 151
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 151
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
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65 70 75 80
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Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ala Ala
115
<210> 152
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 152
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
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Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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65 70 75 80
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100 105 110
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115
<210> 153
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 153
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
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100 105 110
Val Ser Ser Gly Gly
115
<210> 154
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 154
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 155
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115
<210> 156
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 156
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
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<212> PRT
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<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 157
Ser Phe Gly Met Ser
1 5
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<211> 17
<212> PRT
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<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 158
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1 5 10 15
Gly
<210> 159
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 159
Gly Gly Ser Leu Ser Arg
1 5
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<211> 278
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 160
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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65 70 75 80
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100 105 110
Val Gly Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val
165 170 175
Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr
180 185 190
Phe Ser Arg Tyr Ser Met Asn Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln
195 200 205
Arg Glu Phe Val Ala Gly Ile Ser Val Gly Arg Ile Thr Asn Tyr Ala
210 215 220
Val Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Gly
225 230 235 240
Thr Gly Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val
245 250 255
Tyr Tyr Cys Asn Ala Gly Gly Leu Gln Gly Tyr Trp Gly Leu Gly Thr
260 265 270
Leu Val Thr Val Ser Ser
275
<210> 161
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 161
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Ser Ile Phe Arg Ile Asn
20 25 30
Val Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Ser Gly Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr
85 90 95
Ala Asp Ile Gly Trp Pro Tyr Val Leu Asp Tyr Asp Phe Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val
145 150 155 160
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
165 170 175
Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser Arg Tyr Ser Met Asn Trp Tyr
180 185 190
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Phe Val Ala Gly Ile Ser Val
195 200 205
Gly Arg Ile Thr Asn Tyr Ala Val Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile
210 215 220
Ser Arg Asp Asn Ala Glu Gly Thr Gly Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
225 230 235 240
Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Gly Gly Leu Gln
245 250 255
Gly Tyr Trp Gly Leu Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
260 265
<210> 162
<211> 270
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 162
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ala Ala
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Asp Asp Gly Ser Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Thr Gly Tyr Gly Ala Thr Thr Thr Arg Pro Gly Arg Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu
145 150 155 160
Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu
165 170 175
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser Arg Tyr Ser Met Asn Trp
180 185 190
Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Phe Val Ala Gly Ile Ser
195 200 205
Val Gly Arg Ile Thr Asn Tyr Ala Val Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr
210 215 220
Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Gly Thr Gly Tyr Leu Gln Met Asn Ser
225 230 235 240
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Gly Gly Leu
245 250 255
Gln Gly Tyr Trp Gly Leu Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
260 265 270
<210> 163
<211> 278
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 163
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Ser Val Gly Arg Ile Thr Asn Tyr Ala Val Ser Val Arg
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Gly Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Gly Gly Leu Gln Gly Tyr Trp Gly Leu Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
145 150 155 160
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg
165 170 175
Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
180 185 190
Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr
195 200 205
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
210 215 220
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
225 230 235 240
Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ala Ala Leu Ala Val Tyr Gly Pro Asn Arg
245 250 255
Tyr Arg Tyr Gly Pro Val Gly Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
260 265 270
Leu Val Thr Val Ser Ser
275
<210> 164
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 164
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Ser Val Gly Arg Ile Thr Asn Tyr Ala Val Ser Val Arg
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Gly Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Gly Gly Leu Gln Gly Tyr Trp Gly Leu Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
145 150 155 160
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Ser
165 170 175
Ile Phe Arg Ile Asn Val Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys
180 185 190
Gln Arg Glu Leu Val Ala Ala Ile Thr Ser Gly Gly Thr Thr Asn Tyr
195 200 205
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
210 215 220
Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala
225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Tyr Ala Asp Ile Gly Trp Pro Tyr Val Leu Asp Tyr
245 250 255
Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
260 265
<210> 165
<211> 270
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 165
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Ser Val Gly Arg Ile Thr Asn Tyr Ala Val Ser Val Arg
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Gly Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Gly Gly Leu Gln Gly Tyr Trp Gly Leu Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu
145 150 155 160
Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
165 170 175
Ala Phe Ser Ala Ala Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg
180 185 190
Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Asp Asp Gly Ser Lys Thr Tyr
195 200 205
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
210 215 220
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Asp Asp Thr
225 230 235 240
Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Thr Gly Tyr Gly Ala Thr Thr Thr Arg Pro
245 250 255
Gly Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
260 265 270
<210> 166
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 166
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ile Ile Asn
20 25 30
Val Val Arg Trp Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ala Asn Tyr Val Asp Ser Val Arg
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Val Pro Thr Thr His Tyr Gly Gly Val Tyr Tyr Gly Pro Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 167
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 167
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ile Ile Asn
20 25 30
Val Val Arg Trp Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ala Asn Tyr Val Asp Ser Val Arg
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Val Pro Thr Thr His Tyr Gly Gly Val Tyr Tyr Gly Pro Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120
<210> 168
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 168
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Tyr Arg Arg Arg Arg Ala Ser Ser Asn Arg Gly Leu Trp Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
<210> 169
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 169
Gly Ser Thr Phe Ile Ile Asn Val Val Arg
1 5 10
<210> 170
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 170
Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ala Asn
1 5
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 171
Pro Thr Thr His Tyr Gly Gly Val Tyr Tyr Gly Pro Tyr
1 5 10
<210> 172
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 172
Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met Gly
1 5 10
<210> 173
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 173
Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Arg Thr Tyr
1 5 10
<210> 174
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 174
Tyr Arg Arg Arg Arg Ala Ser Ser Asn Arg Gly Leu Trp Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 175
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 175
Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala
1 5 10 15
Ala
<210> 176
<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 176
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ala Ala
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Asp Asp Gly Ser Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Thr Gly Tyr Gly Ala Thr Thr Thr Arg Pro Gly Arg Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu
145 150 155 160
Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
165 170 175
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ile Ile Asn Val Val Arg Trp
180 185 190
Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Ser
195 200 205
Ser Gly Gly Asn Ala Asn Tyr Val Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr
210 215 220
Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser
225 230 235 240
Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Val Pro Thr Thr
245 250 255
His Tyr Gly Gly Val Tyr Tyr Gly Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
260 265 270
Val Thr Val Ser Ser
275
<210> 177
<211> 433
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 177
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ala Ala
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Asp Asp Gly Ser Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Thr Gly Tyr Gly Ala Thr Thr Thr Arg Pro Gly Arg Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu
145 150 155 160
Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
165 170 175
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ile Ile Asn Val Val Arg Trp
180 185 190
Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Ser
195 200 205
Ser Gly Gly Asn Ala Asn Tyr Val Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr
210 215 220
Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser
225 230 235 240
Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Val Pro Thr Thr
245 250 255
His Tyr Gly Gly Val Tyr Tyr Gly Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
260 265 270
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
275 280 285
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
290 295 300
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
305 310 315 320
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
325 330 335
Ser Gly Ser Thr Phe Ile Ile Asn Val Val Arg Trp Tyr Arg Arg Ala
340 345 350
Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asn
355 360 365
Ala Asn Tyr Val Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
370 375 380
Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu
385 390 395 400
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Val Pro Thr Thr His Tyr Gly Gly
405 410 415
Val Tyr Tyr Gly Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
420 425 430
Ser
<210> 178
<211> 280
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 178
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ala Ala
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Asp Asp Gly Ser Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Thr Gly Tyr Gly Ala Thr Thr Thr Arg Pro Gly Arg Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu
145 150 155 160
Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
165 170 175
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met Gly Trp
180 185 190
Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Ser
195 200 205
Trp Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
210 215 220
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn
225 230 235 240
Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Tyr Arg
245 250 255
Arg Arg Arg Ala Ser Ser Asn Arg Gly Leu Trp Asp Tyr Trp Gly Gln
260 265 270
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
275 280
<210> 179
<211> 284
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 179
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ala Tyr Tyr
20 25 30
Ser Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Ser Gly Ile Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ala Asp Pro Ser His Tyr Tyr Ser Glu Tyr Asp Cys Gly Tyr
100 105 110
Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
165 170 175
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe
180 185 190
Ile Ile Asn Val Val Arg Trp Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gln Arg
195 200 205
Glu Leu Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ala Asn Tyr Val Asp
210 215 220
Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
225 230 235 240
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr
245 250 255
Tyr Cys Asn Val Pro Thr Thr His Tyr Gly Gly Val Tyr Tyr Gly Pro
260 265 270
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
275 280
<210> 180
<211> 440
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 180
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ala Tyr Tyr
20 25 30
Ser Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Ser Gly Ile Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ala Asp Pro Ser His Tyr Tyr Ser Glu Tyr Asp Cys Gly Tyr
100 105 110
Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
165 170 175
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe
180 185 190
Ile Ile Asn Val Val Arg Trp Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gln Arg
195 200 205
Glu Leu Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ala Asn Tyr Val Asp
210 215 220
Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
225 230 235 240
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr
245 250 255
Tyr Cys Asn Val Pro Thr Thr His Tyr Gly Gly Val Tyr Tyr Gly Pro
260 265 270
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
275 280 285
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
290 295 300
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
305 310 315 320
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
325 330 335
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ile Ile Asn Val
340 345 350
Val Arg Trp Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala
355 360 365
Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ala Asn Tyr Val Asp Ser Val Arg Gly
370 375 380
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
385 390 395 400
Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Val
405 410 415
Pro Thr Thr His Tyr Gly Gly Val Tyr Tyr Gly Pro Tyr Trp Gly Gln
420 425 430
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
435 440
<210> 181
<211> 287
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 181
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ala Tyr Tyr
20 25 30
Ser Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Ser Gly Ile Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ala Asp Pro Ser His Tyr Tyr Ser Glu Tyr Asp Cys Gly Tyr
100 105 110
Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
165 170 175
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe
180 185 190
Ser Ser Tyr Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg
195 200 205
Glu Phe Val Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala
210 215 220
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
225 230 235 240
Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val
245 250 255
Tyr Tyr Cys Ala Ala Tyr Arg Arg Arg Arg Ala Ser Ser Asn Arg Gly
260 265 270
Leu Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
275 280 285
<210> 182
<211> 438
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 182
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ala Ala Leu Ala Val Tyr Gly Pro Ser Arg Tyr Arg Tyr Gly Pro
100 105 110
Val Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
165 170 175
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr
180 185 190
Phe Ser Arg Tyr Ser Met Asn Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln
195 200 205
Arg Glu Phe Val Ala Gly Ile Ser Val Gly Arg Ile Thr Asn Tyr Ala
210 215 220
Val Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
225 230 235 240
Thr Gly Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val
245 250 255
Tyr Tyr Cys Asn Ala Gly Gly Leu Gln Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
260 265 270
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
275 280 285
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
290 295 300
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
305 310 315 320
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
325 330 335
Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln
340 345 350
Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly
355 360 365
Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
370 375 380
Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
385 390 395 400
Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Tyr Arg Arg Arg Arg
405 410 415
Ala Ser Ser Asn Arg Gly Leu Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
420 425 430
Val Thr Val Ser Ser Ala
435
<210> 183
<211> 434
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 183
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ala Ala Leu Ala Val Tyr Gly Pro Ser Arg Tyr Arg Tyr Gly Pro
100 105 110
Val Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val
165 170 175
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr
180 185 190
Phe Ser Arg Tyr Ser Met Asn Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln
195 200 205
Arg Glu Phe Val Ala Gly Ile Ser Val Gly Arg Ile Thr Asn Tyr Ala
210 215 220
Val Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Gly
225 230 235 240
Thr Gly Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val
245 250 255
Tyr Tyr Cys Asn Ala Gly Gly Leu Gln Gly Tyr Trp Gly Leu Gly Thr
260 265 270
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
275 280 285
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
290 295 300
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
305 310 315 320
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
325 330 335
Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ile Ile Asn Val Val Arg Trp Tyr Arg Arg
340 345 350
Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly
355 360 365
Asn Ala Asn Tyr Val Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
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Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro
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Gly Val Tyr Tyr Gly Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
420 425 430
Ser Ser
<210> 184
<211> 590
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 184
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
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Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Thr Ala Ala Leu Ala Val Tyr Gly Pro Ser Arg Tyr Arg Tyr Gly Pro
100 105 110
Val Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val
165 170 175
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr
180 185 190
Phe Ser Arg Tyr Ser Met Asn Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln
195 200 205
Arg Glu Phe Val Ala Gly Ile Ser Val Gly Arg Ile Thr Asn Tyr Ala
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Val Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Gly
225 230 235 240
Thr Gly Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val
245 250 255
Tyr Tyr Cys Asn Ala Gly Gly Leu Gln Gly Tyr Trp Gly Leu Gly Thr
260 265 270
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
275 280 285
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
290 295 300
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
305 310 315 320
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
325 330 335
Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ile Ile Asn Val Val Arg Trp Tyr Arg Arg
340 345 350
Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly
355 360 365
Asn Ala Asn Tyr Val Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
370 375 380
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Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Val Pro Thr Thr His Tyr Gly
405 410 415
Gly Val Tyr Tyr Gly Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
420 425 430
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
435 440 445
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
450 455 460
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
465 470 475 480
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser
485 490 495
Thr Phe Ile Ile Asn Val Val Arg Trp Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Lys
500 505 510
Gln Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ala Asn Tyr
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Val Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
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Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala
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565 570 575
Gly Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
580 585 590
<210> 185
<211> 437
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 185
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ala Ala Leu Ala Val Tyr Gly Pro Ser Arg Tyr Arg Tyr Gly Pro
100 105 110
Val Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val
165 170 175
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr
180 185 190
Phe Ser Arg Tyr Ser Met Asn Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln
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Arg Glu Phe Val Ala Gly Ile Ser Val Gly Arg Ile Thr Asn Tyr Ala
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Val Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Gly
225 230 235 240
Thr Gly Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val
245 250 255
Tyr Tyr Cys Asn Ala Gly Gly Leu Gln Gly Tyr Trp Gly Leu Gly Thr
260 265 270
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
275 280 285
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
290 295 300
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
305 310 315 320
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
325 330 335
Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln
340 345 350
Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly
355 360 365
Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
370 375 380
Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
385 390 395 400
Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Tyr Arg Arg Arg Arg
405 410 415
Ala Ser Ser Asn Arg Gly Leu Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
420 425 430
Val Thr Val Ser Ser
435
<210> 186
<211> 278
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 186
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
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Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Thr Ala Ala Leu Ala Val Tyr Gly Pro Ser Arg Tyr Arg Tyr Gly Pro
100 105 110
Val Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
165 170 175
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr
180 185 190
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Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val
245 250 255
Tyr Tyr Cys Asn Ala Gly Gly Leu Gln Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
260 265 270
Leu Val Thr Val Ser Ser
275
<210> 187
<211> 278
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 187
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
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Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Thr Ala Ala Leu Ala Val Tyr Gly Pro Ser Arg Tyr Arg Tyr Gly Pro
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Val Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
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Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr
180 185 190
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195 200 205
Arg Glu Phe Val Ala Gly Ile Ser Val Gly Arg Ile Thr Asn Tyr Ala
210 215 220
Val Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
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Thr Gly Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val
245 250 255
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Leu Val Thr Val Ser Ser
275
<210> 188
<211> 283
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 188
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn
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Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
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Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
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<210> 189
<211> 279
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 189
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn
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Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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245 250 255
Thr Thr His Tyr Gly Gly Val Tyr Tyr Gly Pro Tyr Trp Gly Gln Gly
260 265 270
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
275
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<211> 435
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 190
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
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Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
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50 55 60
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100 105 110
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115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
145 150 155 160
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
165 170 175
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ile Ile Asn Val Val
180 185 190
Arg Trp Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Thr
195 200 205
Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ala Asn Tyr Val Asp Ser Val Arg Gly Arg
210 215 220
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met
225 230 235 240
Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Val Pro
245 250 255
Thr Thr His Tyr Gly Gly Val Tyr Tyr Gly Pro Tyr Trp Gly Gln Gly
260 265 270
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
275 280 285
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
290 295 300
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
305 310 315 320
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
325 330 335
Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ile Ile Asn Val Val Arg Trp Tyr Arg
340 345 350
Arg Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly
355 360 365
Gly Asn Ala Asn Tyr Val Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser
370 375 380
Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
385 390 395 400
Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Val Pro Thr Thr His Tyr
405 410 415
Gly Gly Val Tyr Tyr Gly Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
420 425 430
Val Ser Ser
435
<210> 191
<211> 282
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 191
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Ala Val Asp Ala Ser Arg Gly Leu Pro Tyr Glu Leu Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
145 150 155 160
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
165 170 175
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met
180 185 190
Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala
195 200 205
Ile Ser Trp Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
210 215 220
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
225 230 235 240
Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
245 250 255
Tyr Arg Arg Arg Arg Ala Ser Ser Asn Arg Gly Leu Trp Asp Tyr Trp
260 265 270
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
275 280
<210> 192
<211> 434
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 192
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ala Ala
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Asp Asp Gly Ser Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Thr Gly Tyr Gly Ala Thr Thr Thr Arg Pro Gly Arg Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu
145 150 155 160
Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
165 170 175
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ile Ile Asn Val Val Arg Trp
180 185 190
Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Ser
195 200 205
Ser Gly Gly Asn Ala Asn Tyr Val Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr
210 215 220
Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser
225 230 235 240
Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Asn Val Pro Thr Thr
245 250 255
His Tyr Gly Gly Val Tyr Tyr Gly Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
260 265 270
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
275 280 285
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
290 295 300
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
305 310 315 320
Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
325 330 335
Ser Gly Ser Thr Phe Ile Ile Asn Val Val Arg Trp Tyr Arg Arg Ala
340 345 350
Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asn
355 360 365
Ala Asn Tyr Val Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
370 375 380
Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu
385 390 395 400
Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Asn Val Pro Thr Thr His Tyr Gly Gly
405 410 415
Val Tyr Tyr Gly Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
420 425 430
Ser Ala
<210> 193
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 193
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Lys Ser Ala
115
<210> 194
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 194
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ala Ala
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Asp Asp Gly Ser Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Thr Gly Tyr Gly Ala Thr Thr Thr Arg Pro Gly Arg Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Asp Tyr Lys Asp
115 120 125
His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp
130 135 140
Asp Lys Gly Ala Ala His His His His His His
145 150 155
<210> 195
<211> 162
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 195
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ala Tyr Tyr
20 25 30
Ser Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Ser Gly Ile Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ala Asp Pro Ser His Tyr Tyr Ser Glu Tyr Asp Cys Gly Tyr
100 105 110
Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
Gly Ala Ala Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp
130 135 140
Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ala Ala His His His His
145 150 155 160
His His
<210> 196
<211> 312
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 196
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ala Ala Leu Ala Val Tyr Gly Pro Asn Arg Tyr Arg Tyr Gly Pro
100 105 110
Val Gly Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val
165 170 175
Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr
180 185 190
Phe Ser Arg Tyr Ser Met Asn Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln
195 200 205
Arg Glu Phe Val Ala Gly Ile Ser Val Gly Arg Ile Thr Asn Tyr Ala
210 215 220
Val Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Gly
225 230 235 240
Thr Gly Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val
245 250 255
Tyr Tyr Cys Asn Ala Gly Gly Leu Gln Gly Tyr Trp Gly Leu Gly Thr
260 265 270
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ala Ala Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly
275 280 285
Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly
290 295 300
Ala Ala His His His His His His
305 310
<210> 197
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 197
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Ala Val Asp Ala Ser Arg Gly Leu Pro Tyr Glu Leu Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Asp Tyr
115 120 125
Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp
130 135 140
Asp Asp Asp Lys Gly Ala Ala His His His His His His
145 150 155

Claims (49)

1.多肽，其包含结合基质金属蛋白酶(MMP)的至少一个免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)。
2.根据权利要求1的多肽，其中所述MMP选自MMP13(胶原蛋白酶)、MMP8(胶原蛋白酶)、MMP1(胶原蛋白酶)、MMP19和MMP20(釉质溶解素)，优选地所述MMP是MMP13。
3.根据权利要求2的多肽，其中所述结合MMP13的ISVD不结合MMP1或MMP14(膜类型)。
4.根据权利要求3的多肽，其中所述结合MMP13的ISVD包含3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)，其中
(i)CDR1选自SEQ ID NO：27、28、25、26、23、29、30、31、32、33、34、35、36和24；和
与SEQ ID NO：27、28、25、26、23、29、30、31、32、33、34、35、36和24具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；
(ii)CDR2选自SEQ ID NO：42、43、40、41、37、44、45、46、47、48、49、50、51、38和39；和
与SEQ ID NO：42、43、40、41、37、44、45、46、47、48、49、50、51、38和39具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；
和
(iii)CDR3选自SEQ ID NO：56、107、57、54、106、55、52、58、59、60、61、62、63、64、65、66和53；和
与SEQ ID NO：56、107、57、54、106、55、52、58、59、60、61、62、63、64、65、66和53具有1、2、3或4个氨基酸差异的氨基酸序列。
5.根据权利要求4的多肽，其中
(i)CDR1选自：
(a)SEQ ID NO：23；和
(b)与SEQ ID NO：23具有1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置7，Y已改变为R；
(ii)CDR2选自：
(c)SEQ ID NO：37；和
(d)与SEQ ID NO：37具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列，
其中氨基酸差异定义如下：
-在位置4，V已改变为T；和/或
-在位置5，G已改变为A；和/或
-在位置9，N已改变为H；
和
(iii)CDR3选自：
(e)SEQ ID NO：52；和
(f)与SEQ ID NO：52具有1个氨基酸差异的氨基酸序列，即在位置6，Y已改变为S。
6.根据权利要求4的多肽，其中
(i)CDR1是SEQ ID NO：26；
(ii)CDR2是SEQ ID NO：41；和
(iii)CDR3选自：
(e)SEQ ID NO：55；和
(f)与SEQ ID NO：55具有1或2个氨基酸差异的氨基酸序列，其中氨基酸差异定义如下：
-在位置8，N已改变为Q或S；和/或
-在位置19，N已改变为V或Q。
7.根据权利要求4的多肽，其中
(i)CDR1是SEQ ID NO：28；
(ii)CDR2是SEQ ID NO：43；和
(iii)CDR3选自：
(e)SEQ ID NO：57；和
(f)与SEQ ID NO：57具有1、2、3或4个氨基酸差异的氨基酸序列，其中氨基酸差异定义如下：
-在位置10，D已改变为E、G、A、P、T、R、M、W或Y；和/或
-在位置16，M已改变为A、R、N、D、E、Q、Z、G、I、L、K、F、P、S、W、Y或V；和/或
-在位置17，D已改变为A、R、N、C、E、Q、Z、G、H、I、L、K、M、S、T、W、Y或V；和/或
-在位置18，Y已改变为A、R、N、D、C、E、Q、Z、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W或V。
8.根据权利要求1至16中任一项的多肽，其中：
-CDR1选自SEQ ID NO：27、28、25、26、23、29、30、31、32、33、34、35、36和24；
-CDR2选自SEQ ID NO：42、43、40、41、37、44、45、46、47、48、49、50、51、38和39；和
-CDR3选自SEQ ID NO：56、107、57、54、106、55、52、58、59、60、61、62、63、64、65、66和53。
9.根据权利要求17中任一项的多肽，其中所述ISVD包含选自以下的CDR1、CDR2和CDR3组合：
-CDR1是SEQ ID NO：27，CDR2是SEQ ID NO：42，并且CDR3是SEQ ID NO：56；
-CDR1是SEQ ID NO：28，CDR2是SEQ ID NO：43，并且CDR3是SEQ ID NO：107；
-CDR1是SEQ ID NO：28，CDR2是SEQ ID NO：43，并且CDR3是SEQ ID NO：57；
-CDR1是SEQ ID NO：25，CDR2是SEQ ID NO：40，并且CDR3是SEQ ID NO：54；
-CDR1是SEQ ID NO：26，CDR2是SEQ ID NO：41，并且CDR3是SEQ ID NO：106；
-CDR1是SEQ ID NO：26，CDR2是SEQ ID NO：41，并且CDR3是SEQ ID NO：55；
-CDR1是SEQ ID NO：23，CDR2是SEQ ID NO：37，并且CDR3是SEQ ID NO：52；
-CDR1是SEQ ID NO：26，CDR2是SEQ ID NO：48，并且CDR3是SEQ ID NO：62；
-CDR1是SEQ ID NO：26，CDR2是SEQ ID NO：41，并且CDR3是SEQ ID NO：63；
-CDR1是SEQ ID NO：29，CDR2是SEQ ID NO：44，并且CDR3是SEQ ID NO：58；
-CDR1是SEQ ID NO：30，CDR2是SEQ ID NO：45，并且CDR3是SEQ ID NO：58；
-CDR1是SEQ ID NO：31，CDR2是SEQ ID NO：46，并且CDR3是SEQ ID NO：59；
-CDR1是SEQ ID NO：32，CDR2是SEQ ID NO：47，并且CDR3是SEQ ID NO：60；
-CDR1是SEQ ID NO：33，CDR2是SEQ ID NO：41，并且CDR3是SEQ ID NO：61；
-CDR1是SEQ ID NO：34，CDR2是SEQ ID NO：49，并且CDR3是SEQ ID NO：64；
-CDR1是SEQ ID NO：35，CDR2是SEQ ID NO：50，并且CDR3是SEQ ID NO：65；
-CDR1是SEQ ID NO：36，CDR2是SEQ ID NO：51，并且CDR3是SEQ ID NO：66；
-CDR1是SEQ ID NO：23，CDR2是SEQ ID NO：39，并且CDR3是SEQ ID NO：53；和
-CDR1是SEQ ID NO：24，CDR2是SEQ ID NO：38，并且CDR3是SEQ ID NO：52。
10.根据前述权利要求中任一项的多肽，其中所述ISVD由或基本上由4个框架区(分别是FR1至FR4)和所述3个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3组成。
11.根据前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1具有至少95％序列同一性的多肽。
12.根据权利要求4、8、9和10中任一项的多肽，其中CDR1是SEQ ID NO：27，CDR2是SEQID NO：42并且CDR3是SEQ ID NO：56。
13.根据权利要求4至10和12中任一项的多肽，其中所述ISVD选自SEQ ID NO：111、11、112、12、109、9、110、10、1、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、2、3、4、5、6、7和8。
14.根据权利要求1至13中任一项的多肽，其中所述多肽结合MMP13，其KD是1E-07M至1E- 13M，例如1E-08M至1E-12M，优选地最多是1E-07M，优选地低于1E-08M或1E-09M，或甚至低于1E-10M，例如5E-11M，4E-11M，3E-11M，2E-11M，1.7E-11M，1E-11M或甚至5E-12M，4E-12M，3E-12M、1E-12M，例如通过KinExA确定的。
15.根据权利要求1至14中任一项的多肽，其中所述多肽抑制MMP13的活性，其IC50是1E-07M至1E-12M，例如1E-08M至1E-11M，例如通过竞争ELISA、TIMP-2竞争ELISA、荧光肽测定法、荧光胶原蛋白测定法或胶原溶解测定法确定的。
16.根据权利要求15的多肽，其中所述多肽抑制MMP13的活性，其IC50最多是1E-07M，优选地1E-08M，5E-09M，或4E-9M，3E-9M，2E-9M，例如1E-9M。
17.根据权利要求1至16中任一项的多肽，其中所述多肽结合MMP13，其EC50是1E-07M至1E-12M，例如1E-08M至1E-11M，例如通过ELISA确定的。
18.根据权利要求1至14中任一项的多肽，其中所述多肽结合MMP13，其解离速率小于5E-04s-1，例如通过SPR确定的。
19.根据权利要求1至18中任一项的多肽，其中所述MMP13是人MMP13、大鼠MMP13、狗MMP13、牛MMP13、食蟹猴MMP13，优选地人MMP13，优选地SEQ ID NO：115。
20.根据权利要求1至19中任一项的多肽，其中所述多肽拮抗MMP13的活性，例如(i)蛋白酶活性，优选地裂解聚蛋白聚糖和/或胶原蛋白，其中所述胶原蛋白优选地是胶原蛋白II；(ii)胶原蛋白与血色素结合蛋白样结构域的结合。
21.根据权利要求20的多肽，其中所述多肽阻断MMP13与胶原蛋白和/或聚蛋白聚糖的结合至少20％，例如至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或甚至更高。
22.根据权利要求1至20中任一项的多肽，其中所述多肽抑制MMP13的蛋白酶活性，例如抑制底物的蛋白水解，所述底物是例如聚蛋白聚糖、胶原蛋白II、胶原蛋白I、胶原蛋白III、胶原蛋白IV、胶原蛋白IX、胶原蛋白X、胶原蛋白XIV和/或明胶，其中所述胶原蛋白优选地是II型胶原蛋白。
23.根据权利要求1-22中任一项的多肽，其包含至少2个ISVD，其中至少1个ISVD特异性结合MMP，优选地MMP13。
24.根据权利要求23的多肽，其中所述至少2个ISVD特异性结合MMP，优选地MMP13。
25.多肽，其包含两个或更多个各自独立地特异性结合MMP13的ISVD，其中
a)至少“第一”ISVD特异性结合MMP13的第一抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象；并且其中
b)至少“第二”ISVD特异性结合MMP13的第二抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象，分别不同于第一抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象。
26.根据权利要求25的多肽，其中所述特异性结合MMP13的“第一”ISVD选自SEQ ID NO：111、11、110、10、112、12、109、9、13、14、15、16、17、18、19、20、21和22。
27.根据权利要求25或26的多肽，其中所述特异性结合MMP13的“第二”ISVD选自SEQ IDNO：1、2、3、4、5、6、7和8。
28.根据前述权利要求1至27中任一项的多肽，其还包含至少一个特异性结合聚蛋白聚糖的ISVD，其优选地选自SEQ ID NO：166、167和168。
29.根据权利要求1至28中任一项的多肽，其包含至少2个特异性结合聚蛋白聚糖的ISVD。
30.根据权利要求29的多肽，其中所述至少2个特异性结合聚蛋白聚糖的ISVD可以相同或不同。
31.根据权利要求29或30所述的多肽，其中所述至少2个特异性结合聚蛋白聚糖的ISVD独立地选自SEQ ID NO：166-168。
32.根据权利要求28至31中任一项的多肽，其中所述特异性结合聚蛋白聚糖的ISVD特异性结合人聚蛋白聚糖[SEQ ID NO：105]。
33.根据权利要求28至32中任一项的多肽，其中所述特异性结合聚蛋白聚糖的ISVD特异性结合狗聚蛋白聚糖，牛聚蛋白聚糖，大鼠聚蛋白聚糖；猪聚蛋白聚糖；小鼠聚蛋白聚糖，兔聚蛋白聚糖；食蟹猴聚蛋白聚糖和/或恒河猴聚蛋白聚糖。
34.根据权利要求28至33中任一项的多肽，其中所述特异性结合聚蛋白聚糖的ISVD优选地结合软骨组织，例如软骨和/或半月板。
35.根据权利要求1至34中任一项的多肽，其中所述多肽在37℃在滑膜液(SF)中具有至少7天，例如14天、21天、1个月、2个月或甚至3个月的稳定性。
36.根据权利要求1至35中任一项的多肽，其还包含结合血清白蛋白的ISVD。
37.根据权利要求36的多肽，其中所述结合血清白蛋白的ISVD基本上由4个框架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中CDR1是SEQ ID NO：157，CDR2是SEQ ID NO：158，并且CDR3是SEQ ID NO：159。
38.根据权利要求37的多肽，其中所述结合血清白蛋白的ISVD选自ALB135(SEQ ID NO：193)、ALB129(SEQ ID NO：144)、ALB8(SEQ ID NO：142)、ALB23(SEQ ID NO：143)和ALB132(SEQ ID NO：145)。
39.根据权利要求23至38中任一项的多肽，其中所述至少2个ISVD彼此直接连接或经由接头连接。
40.根据权利要求39的多肽，其中所述接头选自SEQ ID NO：125-141，优选地SEQ IDNO：129。
41.根据权利要求1至40中任一项的多肽，其还包含C-末端延伸。
42.根据权利要求41的多肽，其中所述C-末端延伸是C-末端延伸(X)n，其中n是1至10，优选地1至5，例如1、2、3、4或5(并且优选地1或2，例如1)；并且每个X是独立地选择的(优选地天然存在的)氨基酸残基，并且优选地独立地选自丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)。
43.根据权利要求1至42中任一项的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、109、110、111、112、160、161、162、163、164、165、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191或192中的任何一个具有至少80％、90％、95％或100％的序列同一性。
44.治疗预防个体的疾病或病症的方法，例如所述疾病或病症中涉及MMP13活性，所述方法包括以有效治疗或预防所述疾病或病症的症状的量向所述个体施用根据权利要求1至43中任一项的多肽。
45.根据权利要求44的方法，其中所述疾病或病症选自关节病和软骨营养不良，关节炎疾病，例如骨关节炎、类风湿性关节炎，痛风性关节炎，银屑病关节炎，外伤性破裂或脱离，软骨发育不全，肋软骨炎，脊椎干骺端发育异常，椎间盘突出症，腰椎间盘退变疾病，退变性关节疾病，和复发性多发性软骨炎，剥离性骨软骨炎和聚蛋白聚糖病变。
46.根据权利要求1至43中任一项的多肽，用作药物。
47.根据权利要求1至43中任一项的多肽，用于治疗或预防以下症状：关节病和软骨营养不良，关节炎疾病，例如骨关节炎，类风湿性关节炎，痛风性关节炎，银屑病关节炎，外伤性破裂或脱离、软骨发育不全，肋软骨炎，脊椎干骺端发育异常，椎间盘突出症，腰椎间盘退变疾病，退变性关节疾病，和复发性多发性软骨炎，剥离性骨软骨炎和聚蛋白聚糖病变。
48.根据权利要求1至43中任一项的多肽，其中所述多肽交叉阻断根据SEQ ID NO：111、11、112、12、109、9、110、10、1、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、2、3、4、5、6、7和8中任一项的至少一种多肽与MMP13的结合，和/或被根据SEQ ID NO：111、11、112、12、109、9、110、10、1、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、2、3、4、5、6、7和8中任一项的至少一种多肽交叉阻断与MMP13的结合。
49.多肽，其交叉阻断根据SEQ ID NO：111、11、112、12、109、9、110、10、1、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、2、3、4、5、6、7和8中任一项的多肽与MMP13的结合，和/或被根据SEQ IDNO：111、11、112、12、109、9、110、10、1、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、2、3、4、5、6、7和8中任一项的至少一种多肽交叉阻断与MMP13的结合，其中所述多肽包含特异性结合MMP13的至少一个VH、VL、dAb、免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)，其中与MMP13的结合调控MMP13的活性。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111733140A (zh) * 2020-04-04 2020-10-02 华中农业大学 一种抗犬基质金属蛋白酶的杂交瘤细胞株及其制备方法和一种单克隆抗体及其应用
WO2022143552A1 (zh) * 2020-12-28 2022-07-07 浙江纳米抗体技术中心有限公司 Pd-1结合分子及其应用

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023049249A1 (en) * 2021-09-23 2023-03-30 Biomedit, Llc VHH ANTIBODIES TARGETING FimH AND METHODS OF USING THE SAME
WO2024133935A1 (en) 2022-12-23 2024-06-27 Ablynx Nv Protein-based conjugation carriers
US20240368250A1 (en) 2023-02-17 2024-11-07 Ablynx N.V. Polypeptides binding to the neonatal fc receptor

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1826130A (zh) * 2003-07-18 2006-08-30 塞诺菲-安万特德国有限公司 Pak抑制物用于治疗关节疾病的用途
WO2008074840A2 (en) * 2006-12-19 2008-06-26 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against a metalloproteinase from the adam family and polypeptides comprising the same for the treatment of adam-related diseases and disorders
WO2009008414A1 (ja) * 2007-07-10 2009-01-15 Shionogi & Co., Ltd. Ｍｍｐ１３に対する中和活性を有するモノクローナル抗体
EP2258392A1 (en) * 2002-11-08 2010-12-08 Ablynx N.V. Method of administering therapeutic polypeptides
US20120088722A1 (en) * 2010-10-08 2012-04-12 D Angelo Marina Compositions and methods for inhibition of mmp:mmp-substrate interactions
CN102482700A (zh) * 2009-07-02 2012-05-30 葛兰素集团有限公司 多肽和治疗方法
CN106573984A (zh) * 2014-08-13 2017-04-19 克里普索生物科技公司 针对mmp9的特异性抗体
WO2018073216A1 (en) * 2016-10-18 2018-04-26 Vib Vzw Means and methods to treat inflammation

Family Cites Families (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB335768A (en) 1929-10-24 1930-10-02 Jacoviac Maurice Improvements in protecting devices for gramophone disc records
US4938949A (en) 1988-09-12 1990-07-03 University Of New York Treatment of damaged bone marrow and dosage units therefor
AU634186B2 (en) 1988-11-11 1993-02-18 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
SE509359C2 (sv) 1989-08-01 1999-01-18 Cemu Bioteknik Ab Användning av stabiliserade protein- eller peptidkonjugat för framställning av ett läkemedel
PT1621554E (pt) 1992-08-21 2009-07-13 Univ Bruxelles Imunoglobtainas desprovidas de cadeias leves
DK0698097T3 (da) 1993-04-29 2001-10-08 Unilever Nv Produktion af antistoffer eller (funktionaliserede) fragmenter deraf afledt af Camelidae-immunoglobuliner med tung kæde
DE69426527T2 (de) 1993-06-09 2001-08-30 Nederlandse Organisatie Voor Toegepast-Natuurwetenschappelijk Onderzoek Tno, Delft Verfahren zur herstellung von fusionsproteinen, die scfv fragmente enthalten, in transformierten schimmelpilzen
FR2708622B1 (fr) 1993-08-02 1997-04-18 Raymond Hamers Vecteur recombinant contenant une séquence d'un gène de lipoprotéine de structure pour l'expression de séquences de nucléotides.
EP0739981A1 (en) 1995-04-25 1996-10-30 Vrije Universiteit Brussel Variable fragments of immunoglobulins - use for therapeutic or veterinary purposes
DK0937140T3 (da) 1996-06-27 2008-01-28 Vlaams Interuniv Inst Biotech Antistofmolekyler, som interagerer specifikt med et målmolekyles aktive sted eller klöft
WO1998029560A1 (fr) * 1996-12-26 1998-07-09 Fuji Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha Anticorps monoclonal contre la collagenase 3 et procede de dosage immunologique utilisant cet anticorps
US6329516B1 (en) 1997-04-28 2001-12-11 Fmc Corporation Lepidopteran GABA-gated chloride channels
DK1027439T3 (da) 1997-10-27 2010-05-10 Bac Ip Bv Multivalente antigenbindende proteiner
WO1999037681A2 (en) 1998-01-26 1999-07-29 Unilever Plc Method for producing antibody fragments
CA2321199A1 (en) 1998-02-19 1999-08-26 William A. Brady Compositions and methods for regulating lymphocyte activation
EP0967284A1 (en) 1998-05-28 1999-12-29 Pfizer Limited Phosphodiesterases
AU3041100A (en) 1999-01-05 2000-07-24 Unilever Plc Binding of antibody fragments to solid supports
ATE276359T1 (de) 1999-01-19 2004-10-15 Unilever Nv Verfahren zur herstellung von antikörperfragmenten
WO2000046383A2 (en) 1999-02-05 2000-08-10 Rijksuniversiteit Leiden Method of modulating metabolite biosynthesis in recombinant cells
US6617122B1 (en) 1999-03-15 2003-09-09 Xenon Genetics, Inc. Process for identifying modulators of ABC1 activity
CN100434441C (zh) 1999-04-22 2008-11-19 荷兰联合利华有限公司 利用单价抗原-结合蛋白抑制病毒感染
MXPA01013175A (es) 1999-06-18 2002-06-04 Cv Therapeutics Inc Composiciones y metodos para incrementar el flujo del colesterol y elevar hdl utilizando un cassette de enlace atp transportador de proteina abc1.
WO2001009300A2 (en) 1999-08-02 2001-02-08 Keygene N.V. Method for generating cgmmv resistant plants, genetic constructs, and obtained cgmmv-resistant plants
GB9922124D0 (en) 1999-09-17 1999-11-17 Pfizer Ltd Phosphodiesterase enzymes
US6479280B1 (en) 1999-09-24 2002-11-12 Vlaams Interuniversitair Institutuut Voor Biotechnologie Vzw Recombinant phages capable of entering host cells via specific interaction with an artificial receptor
DE19955408A1 (de) 1999-11-18 2001-05-23 Bayer Ag GABA-B-Rezeptoren
EP1242460B1 (en) 1999-11-29 2006-10-18 Unilever Plc Immobilisation of proteins using a polypeptide segment
ATE440111T1 (de) 1999-11-29 2009-09-15 Bac Ip B V Immobilisierte antigenbindende moleküle aus einer domäne
DE60030323T2 (de) 1999-12-24 2007-10-11 Genentech, Inc., South San Francisco Verfahren und verbindungen zur verlängerung der halbwertzeiten bei der ausscheidung von biowirksamen verbindungen
ES2324280T3 (es) 2000-03-14 2009-08-04 Unilever N.V. Dominios variables de la cadena pesada de anticuerpos frente a lipasas dieteticas humanas y sus usos.
AU2001268855A1 (en) 2000-05-26 2001-12-03 National Research Council Of Canada Single-domain antigen-binding antibody fragments derived from llama antibodies
DK1360207T3 (da) 2000-12-13 2011-09-05 Bac Ip B V Proteinarray af variable domæner af tunge immunoglobulinkæder fra kameler
JP4336771B2 (ja) 2001-03-09 2009-09-30 モルフォシス アーゲー 血清アルブミン結合部分
ATE477280T1 (de) 2001-06-28 2010-08-15 Domantis Ltd Doppelspezifischer ligand und dessen verwendung
US20060073141A1 (en) 2001-06-28 2006-04-06 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
EP1433793A4 (en) 2001-09-13 2006-01-25 Inst Antibodies Co Ltd METHOD FOR CREATING A CAMEL ANTIBODY LIBRARY
JP2005289809A (ja) 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) 突然変異重鎖抗体
US20050214857A1 (en) 2001-12-11 2005-09-29 Algonomics N.V. Method for displaying loops from immunoglobulin domains in different contexts
US20050037358A1 (en) 2001-12-21 2005-02-17 Serge Muyldermans Method for cloning of variable domain sequences
WO2003055527A2 (en) 2002-01-03 2003-07-10 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Immunoconjugates useful for treatment of tumours
KR20040094413A (ko) 2002-02-01 2004-11-09 오메로스 코포레이션 연골 분해를 전신 억제하기 위한 조성물 및 방법
US7521543B2 (en) 2002-10-23 2009-04-21 Ludwig Institute For Cancer Research A34 and A33-like 3 DNA, proteins, antibodies thereto and methods of treatment using same
RU2455312C2 (ru) 2002-11-08 2012-07-10 Аблинкс Н.В. Однодоменные антитела, направленные против фактора некроза опухолей альфа, и их применение
AU2003283137B8 (en) 2002-11-08 2010-07-29 Ablynx N.V. Camelidae antibodies against immunoglobulin E and use thereof for the treatment of allergic disorders
US7432330B2 (en) 2002-12-31 2008-10-07 Nektar Therapeutics Al, Corporation Hydrolytically stable maleimide-terminated polymers
EP2390270A1 (en) 2003-01-10 2011-11-30 Ablynx N.V. Therapeutic polypeptides, homologues thereof, fragments thereof and for use in modulating platelet-mediated aggregation
US7461263B2 (en) 2003-01-23 2008-12-02 Unspam, Llc. Method and apparatus for a non-revealing do-not-contact list system
DE602004017726D1 (de) 2003-06-30 2008-12-24 Domantis Ltd Pegylierte Single-domain-antikörper (dAb)
JP2007521234A (ja) 2003-08-12 2007-08-02 ウィリアム エム ヤーブロー 尋常性ざ瘡の治療薬及び使用方法
PT1687338E (pt) 2003-11-07 2011-01-20 Ablynx Nv Anticorpos de domínio único vhh de camelídeos direccionados para o receptor do factor de crescimento epidérmico e suas utilizações
EP1689716A1 (en) 2003-12-04 2006-08-16 Wyeth Biaryl sulfonamides and methods for using same
US7563443B2 (en) 2004-09-17 2009-07-21 Domantis Limited Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof
RU2007117752A (ru) 2004-10-13 2008-11-20 Аблинкс Н.В. (Be) Нанотела (nanobodies тм) против бета-амилоида и полипептидов, содержащих бета-амилоид, для лечения нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь альцгеймера
EP1844073A1 (en) 2005-01-31 2007-10-17 Ablynx N.V. Method for generating variable domain sequences of heavy chain antibodies
EP2949668B1 (en) 2005-05-18 2019-08-14 Ablynx N.V. Improved nanobodies tm against tumor necrosis factor-alpha
TR201815552T4 (tr) 2005-05-20 2018-11-21 Ablynx Nv Agregasyon ile ilgili hastalıkların tedavisine yönelik iyileştirilmiş nanoantikorlar (TM).
EP2057191A1 (en) 2006-08-18 2009-05-13 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against il-6r and polypeptides comprising the same for the treatment of deseases and disorders associated with il-6-mediated signalling
AU2007328900A1 (en) 2006-12-05 2008-06-12 Ablynx N.V. Peptides capable of binding to serum proteins
CN101663319A (zh) 2007-02-21 2010-03-03 埃博灵克斯股份有限公司 针对血管内皮生长因子的氨基酸序列和包括其的多肽用于治疗特征在于过量和/或病理性血管发生或新血管形成的病症和疾病
KR20120125601A (ko) 2007-05-24 2012-11-16 아블린쓰 엔.브이. Ｒａｎｋ-ｌ에 대한 아미노산 서열, 및 이를 포함하는 골 질환 및 장애 치료용 폴리펩티드
WO2009102366A2 (en) 2007-11-19 2009-08-20 Wyeth Expression of orphan gpr64 in inflammatory diseases
EP2268668A1 (en) 2008-04-17 2011-01-05 Ablynx N.V. Peptides capable of binding to serum proteins and compounds, constructs and polypeptides comprising the same
BRPI1013877A2 (pt) 2009-04-10 2017-08-15 Ablynx Nv Sequências de aminoácidos melhoradas contra il-6r e polipeptídeos que compreendem os mesmos para o tratamento de doenças e distúrbios relacionados com il-6r
US11644471B2 (en) * 2010-09-30 2023-05-09 Ablynx N.V. Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
PT2723769T (pt) 2011-06-23 2017-04-04 Ablynx Nv Técnicas para prever, detetar e reduzir a interferência de proteínas não específicas em ensaios que envolvem domínios variáveis únicos de immunoglobulina
FR2982283B1 (fr) 2011-11-07 2015-01-16 Faurecia Automotive Ind Procede de fabrication d'un voile continu de fibres comprenant des fibres longues naturelles, installation et voile associes
WO2013109829A1 (en) 2012-01-20 2013-07-25 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Ltd Anti-adamts4 antibodies and methods of treatment
FR2996003B1 (fr) * 2012-09-25 2014-10-17 Commissariat Energie Atomique Methode pour detecter specifiquement dans un echantillon une metalloprotease matricielle (mmp) d'interet uniquement dans sa forme active
LT3057992T (lt) 2013-10-15 2024-07-25 Genefrontier Corporation Žmogaus antikūnas prieš agrekanazės tipo adamts rūšis, skirtas terapiniams preparatams nuo ligų, susijusių su agrekanaze
KR20150115106A (ko) 2014-04-02 2015-10-14 광주과학기술원 Zinc-ZIP8-MTF1 억제제를 유효성분으로 포함하는 관절질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물
EP3974449A1 (en) 2015-11-13 2022-03-30 Ablynx NV Improved serum albumin-binding immunoglobulin variable domains
CN114605530A (zh) 2015-11-18 2022-06-10 埃博灵克斯股份有限公司 改进的血清白蛋白结合剂

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2258392A1 (en) * 2002-11-08 2010-12-08 Ablynx N.V. Method of administering therapeutic polypeptides
CN1826130A (zh) * 2003-07-18 2006-08-30 塞诺菲-安万特德国有限公司 Pak抑制物用于治疗关节疾病的用途
WO2008074840A2 (en) * 2006-12-19 2008-06-26 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against a metalloproteinase from the adam family and polypeptides comprising the same for the treatment of adam-related diseases and disorders
WO2009008414A1 (ja) * 2007-07-10 2009-01-15 Shionogi & Co., Ltd. Ｍｍｐ１３に対する中和活性を有するモノクローナル抗体
CN102482700A (zh) * 2009-07-02 2012-05-30 葛兰素集团有限公司 多肽和治疗方法
US20120088722A1 (en) * 2010-10-08 2012-04-12 D Angelo Marina Compositions and methods for inhibition of mmp:mmp-substrate interactions
CN106573984A (zh) * 2014-08-13 2017-04-19 克里普索生物科技公司 针对mmp9的特异性抗体
WO2018073216A1 (en) * 2016-10-18 2018-04-26 Vib Vzw Means and methods to treat inflammation

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DELPHINE DEMEESTERE ET AL.: "Development and Validation of a Small Single-domain Antibody That Effectively Inhibits Matrix Metalloproteinase 8", 《THE AMERICAN SOCIETY OF GENE & CELL THERAPY》, vol. 24, no. 5, pages 890 - 902, XP009507094, DOI: 10.1038/mt.2016.2 *
ELIANA PIVETTA ET AL.: "MMP-13 stimulates osteoclast differentiation and activation in tumour breast bone metastases", 《BREAST CANCER RESEARCH》, vol. 13, pages 1 - 15 *
M. M. HARMSEN ET AL.: "Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments", 《APPL MICROBIOL BIOTECHNOL》, vol. 77, pages 13 - 22 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111733140A (zh) * 2020-04-04 2020-10-02 华中农业大学 一种抗犬基质金属蛋白酶的杂交瘤细胞株及其制备方法和一种单克隆抗体及其应用
CN111733140B (zh) * 2020-04-04 2022-07-01 华中农业大学 一种抗犬基质金属蛋白酶的杂交瘤细胞株及其制备方法和一种单克隆抗体及其应用
WO2022143552A1 (zh) * 2020-12-28 2022-07-07 浙江纳米抗体技术中心有限公司 Pd-1结合分子及其应用

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