RU2786659C2

RU2786659C2 - Полипептиды, связывающиеся с adamts5, mmp13 и аггреканом

Info

Publication number: RU2786659C2
Application number: RU2019143684A
Authority: RU
Inventors: Сорен Стеффенсен; Геральд Бесте; Ханс Гюринг; Ларс ТОЛЯЙКИС; Кристоф ЛАДЕЛЬ; Свен ЛИНДЕМАНН; Роланд КЕЛЛЬНЕР; Ральф ГЮНТЕР
Original assignee: Мерк Патент Гмбх; Аблинкс Н.В.
Priority date: 2017-06-02
Filing date: 2018-06-04
Publication date: 2022-12-23

Abstract

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к новым гибридным иммуноглобулинам, и может быть применимо в медицине. Изобретение раскрывает полипептиды, способные связываться с протеогликановым хрящевым белком аггреканом, ADAMTS5 и/или MMP13, а также конструкции на их основе. Изобретение может быть использовано в медицинской практике при лечении или профилактике заболеваний суставов для предотвращения эрозии хрящевой ткани, в частности при остеоартрите. 11 н. и 10 з.п. ф-лы, 11 ил., 25 табл., 14 пр.

Description

1. Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к полипептидам, связывающимся с Аггреканом, а также с ADAMTS5 и/или MMP13, более конктерно к полипептидам, которые включают или по существу состоят из иммуноглобулинов, связывающихся с Аггреканом, а также иммуноглобулинов, связывающихся с ADAMTS5, и/или иммуноглобулинов, связывающихся с MMP13 (также указан в настоящей заявке как "полипептиды по изобретению” и “иммуноглобулин(ы) по изобретению”, соответственно). Изобретение также относится к конструкциям, включающим такие иммуноглобулины, такие как одиночные вариабельные домены иммуноглобулинов (ISVDs), или полипептиды, а также к нуклеиновым кислотам, кодирующим такие иммуноглобулины или полипептиды (также указаны в настоящей заявке как “нуклеиновая кислота(кислоты) по изобретению”; к способам для получения таких иммуноглобулинов, полипептидов и конструкций; к клеткам–хозяевам, экспрессирующим или способным экспрессировать такие иммуноглобулины или полипептиды; к композициям и, в частности, к фармацевтическим композициям, которые включают такие иммуноглобулины, полипептиды, конструкции, нуклеиновые кислоты и/или клетки–хозяева; и к применениям иммуноглобулинов, полипептидов, конструкций, нуклеиновых кислот, клеток–хозяев и/или композиций, в частности для профилактических и/или терапевтических целей, таких как профилактические и/или терапевтические цели, указанные в настоящей заявке. Другие аспекты, варианты осуществления, преимущества и применения изобретения будут понятны из представленного ниже описания.

2. Предпосылки создания изобретения

Остеоартрит (ОА) является одной из самых распространенных причин инвалидности во всем мире. Им страдают 30 миллионов американцев, и он является наиболее распространенным заболеванием суставов. По прогнозам, к 2025 году он затронет более 20 процентов населения США. Болезнь не системная и обычно ограничивается несколькими суставами. Однако заболевание может возникать во всех суставах, чаще всего в коленях, бедрах, руках и позвоночнике. ОА характеризуется прогрессирующей эрозией суставного хряща (хряща, который покрывает кости), что приводит к хронической боли и инвалидности. В конце концов, болезнь приводит к полному разрушению суставного хряща, склерозу лежащей ниже кости, образованию остеофитов и т.д., все это приводит к потере движения и боли. Остеоартрит можно определить как разнообразную группу состояний, характеризующихся сочетанием симптомов суставов, признаков, обусловленных дефектами суставного хряща и изменениями в соседних тканях, включая кости, сухожилия и мышцы. Наиболее заметным симптомом ОА является боль, и именно поэтому пациенты чаще всего обращаются за медицинской помощью. ОА не излечивается, то есть современные методы лечения не подавляют структурное разрушение ОА сустава. Лечение болезни ограничивается лечениями, которые в лучшем случае являются паллиативными и мало влияют на основную причину прогрессирования заболевания.

Идет интенсивный поиск препаратов, модифицирующих течение остеоартрита (DMOADs), которые можно определить как лекарственные средства, которые ингибируют прогрессирование структурных изменений при заболевании и в идеале также улучшают симптомы и/или функцию. DMOAD, вероятно, должны назначаться на длительные периоды при этом хроническом заболевании стареющей популяции, поэтому для этого необходимо получить отличные данные, касающиеся безопасности в целевой популяции с множественными сопутствующими заболеваниями и потенциальных межлекарственных взаимодействий.

Хотя начало заболевания может быть многофакторным, разрушение хряща, по–видимому, является результатом неконтролируемого протеолитического разрушения внеклеточного матрикса (ECM). Наиболее распространенными ECM компонентами суставного хряща являются коллаген (прежде всего, коллаген II) и протеогликаны, главным образом Аггрекан (Kiani et al. 2002 Cell Research 12: 19–32)

Аггрекан важен для правильного функционирования суставного хряща, поскольку он обеспечивает гидратированную гелевую структуру, которая придает хрящу способность нести нагрузку. Аггрекан представляет собой большую мультимодальную молекулу (2317 аминокислот), экспрессируемую хондроцитами. Его коровый белок состоит из трех глобулярных доменов (G1, G2 и G3) и большой протяженной области между G2 и G3 для прикрепления цепи гликозаминогликана. Эта расширенная область содержит два домена, один из которых замещен кератансульфатными цепями (домен KS), а другой – хондроитинсульфатными цепями (домен CS). Домен CS имеет 100–150 гликозаминогликановых цепей (GAG), прикрепленных к нему. Аггрекан образует большие комплексы с гиалуронаном, в которых 50–100 молекул Аггрекана взаимодействуют через домен G1 и связывающий белок с одной молекулой гиалуронана. При поглощении воды (из–за содержания GAG) эти комплексы образуют обратимо деформируемый гель, который сопротивляется сжатию. Структура, удержание жидкости и функции суставного хряща связаны с содержанием в матриксе Аггрекана и количеством хондроитинсульфата, связанного с интактным коровым белком. Структурно, ОА характеризуется разрушением Аггрекана, постепенным высвобождением доменов G3 и G2 (что приводит к “дефляции” хряща) и в конечном итоге высвобождением домена G1 и разрушением коллагена с необратимым разрушением структуры хряща. Наиболее значимый сайт расщепления Аггрекана в патогенезе ОА находится в последовательности TEGE³⁷³↓³⁷⁴ARGS. Этот сайт расщепления расположен в межглобулярном домене (IGD) Аггрекана, расположенном между доменами G1 и G2.

Антитела, которые распознают неоэпитоп ³⁷⁴ARGS, привели к открытию аггреканазы–1, которая, как было показано, представляет собой ADAMTS4, и аггреканазы–2, которая представляет собой ADAMTS5. Впоследствии было показано, что другие родственные ферменты ADAMTS, включая ADAMTS1, –8, –9, –15 и –20, обладают аггреканазной активностью. ADAMTS16 и 18 также являются слабыми аггреканазами. Различные данные свидетельствуют о том, что ADAMTS5 является основным ферментом, вовлеченным в патогенез остеоартрита. В человеческих хрящевых эксплантах и хондроцитах нокдаун ADAMTS5 ослаблял разрушение Аггрекана, что предполагает, что этот фермент может быть задействован в тканях человека. Экспрессия фермента усиливается цитокинами, такими как интерлейкин–1 и онкостатин–М, которые провоцируют разрушение Аггрекана в тканях. ADAMTS5–генерируемые фрагменты Аггрекана обнаружены в синовиальной жидкости и сыворотке пациентов с ОА (Germaschewski et al., 2014, Osteoarthritis Cartilage 22: 690–697). Несколько фармацевтических компаний разрабатывают DMOAD. Утверждается, что некоторые из этих соединений являются специфическими в отношении ADAMTS5, тогда как другие также обладают эффектом против других членов ADAMTS или даже против матриксных металлопротеиназ. В частности, считается, что эти перекрестные ингибирования против MMPs ответственны за скелетно–мышечный синдром (MSS), побочный эффект, вызываемый ингибиторами широкого спектра действия и включающий артралгию, миалгию, ригидность суставов и тендинит (Santamaria et al., 2015 Biochem J 471:391–401). Эти побочные эффекты явились причиной остановки дальнейшей разработки. Ингибитор аггреканазы AGG–523 от Pfizer использовали в I фазе клинических испытаний для лечения ОА, но в дальнейшем не использовали. Другие низкомолекулярные ингибиторы ADAMTS также не продвинулись дальше в клинических исследованиях в качестве потенциальных DMOAD (Bondeson et al., 2015 Drug Discovery 10:5–14). Ингибитор ADAMTS5 Galapagos/Servier, GLPG1972, недавно завершил фазу I испытания, но его эффективность еще не определена. Действительно, несмотря на ряд недавних клинических испытаний, в которых конкретно исследовали DMOADs, никакие такие лечения пока не были одобрены (El Bakali et al., Future Medicinal Chemistry (Review) 6:1399). Исследование моноклонального антитела (mAb) CRB0017 от Rottapharm, направленного против спейсерного домена ADAMTS5, показало, что у мышей внутрисуставное введение этого mAb существенно предотвращало прогрессирование заболевания дозозависимым образом (Chiusaroli et al., 2013 Osteoarthritis Cartilage 21:1807). Однако не было никакого сравнения с системным введением, а также его не оценивали на то, в какой степени mAb вытекает из синовиального пространства. В другом исследовании использовали системное введение mAb 12F4 мышам, которое продемонстрировало как структурную модификацию заболевания, так и облегчение связанного с болью поведения (Miller et al., 2014 Osteoarthritis Cartilage 22iii, S35). Однако однократное введение mAb 12F4 яванскому макаку вызвало очаговое кровоизлияние, зависимое от дозы повышение среднего артериального давления и нарушения сердечной проводимости (более конкретно, повышение ST и желудочковую аритмию на ЭКГ), указывающие на ишемию сердца, которые поддерживалась вплоть до 8 месяцев после введения разовой дозы (Larkin et al., 2014, Osteoarthritis Cartilage 22iii, S483). Также в этом случае побочные эффекты остановили дальнейшую клиническую разработку mAb 12F4.

Наряду с ADAMTS ферментами имеются убедительные доказательства того, что матриксные металлопротеиназы (MMP) играют главную роль в разрушении тканей, связанных с ОА. MMP представляют собой семейство цинк–зависимых эндопептидаз, участвующих в разрушении внеклеточного матрикса и ремоделировании тканей. Существует около 28 членов семейства MMP, которые можно подразделить на различные подгруппы, включая коллагеназы, желатиназы, стромелизины, MMP мембранного типа, матрилизины, эмализины и другие. Коллагеназы, включающие MMP1, MMP8, MMP13 и MMP18, способны разлагать трехспиральные фибриллярные коллагены на различающиеся 3/4 и 1/4 фрагменты. Кроме того, было показано, что MMP14 расщепляет фибриллярный коллаген, и есть доказательства того, что MMP2 также способна к коллагенолизу. MMP давно считаются привлекательными терапевтическими мишенями для лечения ОА. Однако, как указано выше, ингибиторы MMP широкого спектра действия, разработанные для лечения артрита, не прошли клинические испытания из–за болезненных сковывающих суставы побочных эффектов, т.е. MSS.

Терапевтические вмешательства в суставы также были затруднены из–за сложности направленной доставки лекарственных средств в суставной хрящ. Поскольку суставной хрящ является лишенной кровеносных и лимфатических сосудов тканью, традиционные пути доставки лекарственных средств (пероральный, внутривенный, внутримышечный) в конечном итоге зависят от транссиновиального переноса лекарственных средств из синовиальных капилляров в хрящ путем пассивной диффузии. Это подсказало идею разработки интраартикулярной (и/а) доставки лекарственных средств. Хотя и/а доставка обходила проблему пассивной диффузии, и/а доставка терапевтических белков ограничивается их быстрым выводом из суставного пространства и, прежде всего, недостаточным удерживанием в хряще. Примечательно, что время присутствия лекарственного средства в синовиальной жидкости сустава часто составляет менее 24 ч (Edwards 2011, Vet J 190: 15–21; Larsen et al., 2008 J Pham Sci 97: 4622–4654). Из–за быстрого клиренса большинства лекарственных средств, вводимых и/а путем, для поддержания эффективной концентрации потребуются частые инъекции (Owen et al., 1994 Br J Clin Pharmacol 38: 349–355). Однако частые и/а инъекции нежелательны из–за боли и дискомфорта, что может вызвать проблемы с комплаентностью пациента, а также из–за риска внесения инфекций в сустав.

Сохраняется потребность в эффективных DMOADs.

3. Сущность изобретения

Настоящее изобретение направлено на обеспечение полипептидов и конструкций против OA с улучшенными профилактическими, терапевтическими и/или фармакологическими свойствами, в дополнение к другим полезным свойствам (таким как, например, более простое получение, хорошая стабильность и/или более низкая стоимость продуктов), по сравнению аминокислотными последовательностями и антителами предшествующего уровня техники. В частности, настоящее изобретение направлено на обеспечение полипептидов, ингибирующих ADAMTS5 и/или MMP13, при этом удерживаемых в течение продолжительного периода в суставах.

Понимая, что остеоартрит развивается неравномерно и что темпы прогрессирования поражения могут быть очень разными – в крайних случаях остеоартрит может оставаться стабильным в течение десятилетий, в то время как у других пациентов ОА прогрессирует очень быстро до полного разрушения хряща за несколько месяцев – авторы настоящего изобретения выдвинули гипотезу (однако, не будучи связанными какой–либо теорией), что такая вариабельная картина прогрессирования заболевания может быть обусловлена неоднородным паттерном активности различных протеаз.

После идентификации эффективных ингибиторов протеаз из различных семейств и закрепляющихся в хряще фрагментов с использованием креативных и нетрадиционных скрининговых, характеризационных и комбинаторных стратегий, авторы настоящего изобретения разработали комбинации, в которых были объединены различные функциональные фрагменты. Были сконструированы два полипептида с двойной специфичностью, включающие закрепляющиеся в хряще фрагменты, связывающие Аггрекан (CAP), и либо ингибитор ADAMTS5, либо ингибитор MMP13, а также полипептиды с тройной специфичностью, включающие ингибитор ADAMTS5, ингибитор MMP13 и CAP связующие.

Было продемонстрировано, что полипептиды по изобретению оставались эффективными в различных модельных системах, представляющих различные ОА состояния, даже когда эталонные молекулы (Wyeth и Pfizer) не были эффективны.

Авторы настоящего изобретения смогли идентифицировать и реконструировать CAP связующие, которые оставались эффективными даже в комбинации с двумя другими компонентами. Также было продемонстрировано, что CAP фрагмент полипептидов по изобретению приводил к повышенному удерживанию в суставе.

Также было продемонстрировано, что полипептиды по изобретению остаются стабильными в суставе.

Следовательно, полипептиды по настоящему изобретению, с одной стороны, могли бы быть широко полезны для пациентов с ОА, в то время как, с другой стороны, нагрузку при схеме (и/а) введения можно было бы облегчить. Кроме того, путем объединения различных фрагментов в одной молекуле эффективная доза может быть увеличена.

Соответственно, настоящее изобретение относится к полипептиду, выбранному из группы, состоящей из (a) полипептидов, включающих по меньшей мере 2 одиночных вариабельных домена иммуноглобулина (ISVD), в которых первый ISVD специфически связывается с матриксной металлопротеиназой (MMP), а второй ISVD специфически связывается с Аггреканом, и необязательно включающих третий ISVD, специфически связывающийся с Аггреканом; (b) полипептидов, включающих по меньшей мере 2 ISVD, в которых первый ISVD специфически связывается с дезинтегрином и металлопротеиназой с мотивами тромбоспондина (ADAMTS), и второй ISVD специфически связывается с Аггреканом, и необязательно, включающих третий ISVD, специфически связывающийся с Аггреканом; и (c) полипептидов, включающих по меньшей мере 3 ISVD, в которых первый ISVD специфически связывается с MMP, второй ISVD специфически связывается с ADAMTS, а третий ISVD специфически связывается с Аггреканом, и необязательно, включающих четвертый ISVD, специфически связывающийся с Аггреканом.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду, описанному в настоящей заявке, в котором первый ISVD специфически связывается с MMP, второй ISVD специфически связывается с ADAMTS, третий ISVD специфически связывается с Аггреканом и четвертый ISVD специфически связывается с Аггреканом, предпочтительно указанная MMP представляет собой MMP13.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает ISVD, описанный в настоящей заявке, где указанный ISVD имеет структуру FR1–CDR1–FR2–CDR2–FR3–CDR3–FR4, в которой CDR1, CDR2 и CDR3 имеют значение, определенное ниже, и FR1, FR2, FR3 и FR4 представляют собой каркасные последовательности.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду, описанному в настоящей заявке, где указанный ISVD, специфически связывающийся с MMP13, по существу состоит из 4 каркасных областей (FR1 – FR4, соответственно) и 3 определяющих комплементарность областей (CDR1 – CDR3, соответственно), где (i) (a) CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 8; и (b) аминокислотные последовательности, которые имеют 1, 2 или 3 аминокислотных отличия от SEQ ID NO: 8; (ii) (c) CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 10; и (d) аминокислотные последовательности, которые имеют 1, 2 или 3 аминокислотных отличия от SEQ ID NO: 10; и (iii) (e) CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 12; и (f) аминокислотные последовательности, которые имеют 1, 2 или 3 аминокислотных отличия от SEQ ID NO: 12; предпочтительно, где CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 8, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 10 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 12; еще более предпочтительно, где указанный ISVD, специфически связывающийся с MMP13, представлен SEQ ID NO: 2.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду, описанному в настоящей заявке, где указанный ADAMTS представляет собой ADAMTS5, предпочтительно, где указанный ISVD, специфически связывающийся с ADAMTS5, по существу состоит из 4 каркасных областей (FR1 – FR4, соответственно) и 3 определяющих комплементарность областей (CDR1 – CDR3, соответственно), где (i) (a) CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 14 [GRTVSSYAMG]; и (b) аминокислотные последовательности, которые имеют 1, 2 или 3 аминокислотных отличия от SEQ ID NO: 14; (ii) (c) CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 16 [GISRSAERTY]; и (d) аминокислотные последовательности, которые имеют 1, 2 или 3 аминокислотных отличия от SEQ ID NO: 16; и (iii) (e) CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 18 [DLDPNRIFSREEYAY]; и (f) аминокислотные последовательности, которые имеют 1, 2 или 3 аминокислотных отличия от SEQ ID NO: 18; еще более предпочтительно, где CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 14, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 16 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 18; и еще более предпочтительно, где указанный ISVD, специфически связывающийся с ADAMTS5, представлен SEQ ID NO: 3.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду, описанному в настоящей заявке, где указанный ISVD, специфически связывающийся с Аггреканом, по существу состоит из 4 каркасных областей (FR1 – FR4, соответственно) и 3 определяющих комплементарность областей (CDR1 – CDR3, соответственно), где (i) (a) CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 19; и (b) аминокислотные последовательности, которые имеют 1, 2 или 3 аминокислотных отличия от SEQ ID NO: 19; (ii) (c) CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 21; и (d) аминокислотные последовательности, которые имеют 1, 2 или 3 аминокислотных отличия от SEQ ID NO: 21; и (iii) (e) CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 23; и (f) аминокислотные последовательности, которые имеют 1, 2 или 3 аминокислотных отличия от SEQ ID NO: 23; более предпочтительно, где CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 19, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 21 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 23; еще более предпочтительно, где указанный ISVD, специфически связывающийся с Аггреканом, представлен SEQ ID NO: 4.

В предпочтительных вариантах осуществления всех аспектов изобретения одиночный вариабельный домен иммуноглобулина (ISVD) в соответствии с изобретением предпочтительно состоит из или по существу состоит из 4 каркасных областей (FR1 – FR4, соответственно) и 3 определяющих комплементарность областей CDR1, CDR2 и CDR3, как указано в настоящей заявке выше и ниже. Предпочтительные каркасные последовательности раскрыты, например, в таблице A–2 ниже, и их можно использовать в ISVD по изобретению. Предпочтительно, CDR, представленные в таблице A–2, соответствуют соответствующим каркасным областям такой же ISVD конструкции.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду, описанному в настоящей заявке, где указанные ISVD связаны друг с другом через линкер, предпочтительно указанный линкер выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 24–40, предпочтительно SEQ ID NO: 28 [9GS] или SEQ ID NO: 35 [35GS].

В одном аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду, описанному в настоящей заявке, в котором указанный первый ISVD специфически связывается с MMP13, указанный второй ISVD специфически связывается с ADAMTS5, указанный третий ISVD специфически связывается с Аггреканом и указанный четвертый ISVD специфически связывается с Аггреканом, предпочтительно представленному SEQ ID NO: 1 или 62.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду, описанному в настоящей заявке, в котором указанный первый ISVD специфически связывается с MMP13, указанный второй ISVD специфически связывается с Аггреканом и указанный третий ISVD специфически связывается с Аггреканом, предпочтительно представленному SEQ ID NO: 5 или 63.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду, описанному в настоящей заявке, в котором указанный первый ISVD специфически связывается с ADAMTS5, указанный второй ISVD специфически связывается с Аггреканом, и указанный третий ISVD специфически связывается с Аггреканом, предпочтительно представленному SEQ ID NO: 6 или 64.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к конструкции, которая включает или по существу состоит из полипептида, описанного в настоящей заявке, которая дополнительно включает одну или более других групп, остатков, фрагментов или связывающих элементов, необязательно связанных через один или более пептидных линкеров.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, описанный в настоящей заявке, или конструкцию, описанную в настоящей заявке.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к вектору экспрессии, включающему нуклеиновую кислоту, описанную в настоящей заявке.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к хозяину или клетке–хозяину, включающему нуклеиновую кислоту, описанную в настоящей заявке, или вектор экспрессии, описанный в настоящей заявке.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, включающей полипептид, описанный в настоящей заявке, конструкцию, описанную в настоящей заявке, или нуклеиновую кислоту, описанную в настоящей заявке.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу для получения полипептида, описанного в настоящей заявке, при этом указанный способ по меньшей мере включает следующие стадии: a) экспрессию, в подходящей клетке–хозяине, организме–хозяине или подходящей системе экспрессии, нуклеиновой кислоты, описанной в настоящей заявке; необязательно с последующим b) выделением и/или очисткой полипептида, описанного в настоящей заявке.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, описанной в настоящей заявке, которая представляет собой фармацевтическую композицию, предпочтительно указанная композиция дополнительно включает по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент и/или адъювант, и необязательно включает один или более дополнительных фармацевтически активных полипептидов и/или соединений.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, описанной в настоящей заявке, полипептиду, описанному в настоящей заявке, или конструкции, описанной в настоящей заявке, для применения в качестве лекарственного средства.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, описанной в настоящей заявке, полипептиду, описанному в настоящей заявке, или конструкции, описанной в настоящей заявке, для применения в предотвращении симптома или лечении артропатий и хондродистрофий, артритного заболевания, такого как остеоартрит, ревматоидный артрит, подагрический артрит, псориатический артрит, травматического разрыва или отслоения, ахондроплазии, реберного хондрита, спондилоэпиметафизарной дисплазии, межпозвоночной грыжи, дегенерации поясничного диска, дегенеративного заболевания суставов, рецидивирующего полихондрита, рассекающего остеохондрита, аггреканопатий, NASH, хронического периодонтита и аневризм брюшной аорты.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу предотвращения симптома или лечения заболевания или расстройства у индивидуума, включающему введение полипептида, описанного в настоящей заявке, конструкции, описанной в настоящей заявке, или композиции, описанной в настоящей заявке, указанному индивидууму в количестве, эффективном для лечения или профилактики симптома артропатий и хондродистрофий, артритного заболевания, такого как остеоартрит, ревматоидный артрит, подагрический артрит, псориатический артрит, травматического разрыва или отслоения, ахондроплазии, реберного хондрита, спондилоэпиметафизарной дисплазии, межпозвоночной грыжи, дегенерации поясничного диска, дегенеративного заболевания суставов, рецидивирующего полихондрита, рассекающего остеохондрита, аггреканопатий, NASH, хронического периодонтита и аневризм брюшной аорты.

Другие аспекты, преимущества, применения и использования полипептидов и композиций станут ясны из дальнейшего раскрытия. Несколько документов цитируется в различных разделах описания настоящего изобретения. Каждый из документов, процитированных выше или ниже в настоящей заявке (включая все патенты, патентные заявки, научные публикации, спецификации изготовителей, инструкции и т.д.), включены в настоящую заявку посредством ссылки во всей их полноте. Ничто в настоящей заявке не должно истолковываться как признание того, что изобретение не имеет права датировать задним числом такое раскрытие в силу предшествующего изобретения.

4. Описание чертежей

Фиг. 1: Функциональное ингибирование молекулы ADAMTS5 полипептидом 949 ("C010100949", SEQ ID NO: 1) в анализе ферментативной активности на основе FRET. V_i: скорость (кривая процесса) ингибируемой ферментативной реакции; V₀: скорость неингибируемой ферментативной реакции. Каждая точка представляет собой среднее значение технических повторных измерений. ‘Усы’: стандартное отклонение технических повторных измерений. Этот график является репрезентативным для 3 независимых экспериментов.

Фиг. 2: Функциональное ингибирование MMP13 человека, яванского макака и крысы полипептидом 949 в анализе ферментативной активности на основе FRET. Слева: Ингибирование молекулы cdMMP13 полипептидом 949 (ALX–1011). Справа: Ингибирование активированного proMMP13 (полипептид 949 обозначен как C010100949). V_i: скорость (кривая процесса) ингибируемой ферментативной реакции, V₀: скорость неингибируемой ферментативной реакции. Cd: каталитический домен; pro: активированный pro–MMP13. Каждая точка представляет собой среднее значение технических повторных измерений. ‘Усы’: стандартное отклонение технических повторных измерений. Графики являются репрезентативными для по меньшей мере двух независимых экспериментов.

Фиг. 3: Эффективность полипептида 949 ("NB949") в анализе эксплантата бычьего хряща. Эффективность рассчитывали по сравнению с эталонным низкомолекулярным ингибитором аггреканазы (AGG–523, Wyeth), который в этих условиях полностью ингибирует IL–1α–стимулированное высвобождение GAG, что было установлено как 100%, а неиндуцированный хрящ – 0%.

Фиг. 4: Эффективность полипептида 949 в анализе эксплантата человеческого хряща. Эффективность рассчитывали по сравнению с эталонным низкомолекулярным ингибитором аггреканазы (AGG–523, Wyeth), который в этих условиях полностью ингибирует IL–1α–стимулированное высвобождение GAG, что было установлено как 100%, а неиндуцированный хрящ – 0%.

Фиг. 5: Эффект CAP–опосредованного закрепления в хряще полипептидов в анализе бычьего эксплантата.

Фиг. 6: Полипептид 949 ("C010100949" или "MAC949") ингибирует высвобождение C2M (расщепление Col II=структура) и C3M (расщепление Col III=ассоциируется с симптомами) из ко–культуры.

Фиг. 7: Удерживание в хряще: локальные концентрации конструкций нанотел в различных точках времени у крыс.

Фиг. 8: Ширина значительной дегенерации медиального большеберцового хряща в различных группах.

Фиг. 9: Ширина дегенерации медиального большеберцового хряща.

Фиг. 10: Анализ походки на помосте.

Фиг. 11: Концентрации в сыворотке (средняя концентрация в нг/мл) против времени после первой дозы (ч) полипептидов у крыс с остеоартритом и здоровых крыс, получающих одну интраартикулярную инъекцию 400 мкг конструкции нанотела на сустав (правый коленный). Точки представляют собой индивидуальные концентрации у здоровых животных; треугольники представляют собой индивидуальные концентрации у OA животных; и линии представляют собой средние концентрации.

5. Подробное описание

Сохраняется потребность в безопасных и эффективных лекарственных средствах для лечения ОА, в частности DMOAD. Эти лекарственные средства должны соответствовать различным и часто противоречащим требованиям, особенно когда предполагается широко применяемый формат. Такой формат предпочтительно должен быть полезен широкому кругу пациентов. Формат предпочтительно должен быть безопасным и не вызывать инфекции из–за частого применения. Кроме того, формат предпочтительно должен быть удобен для пациента, например, предусматривать удобный режим и путь введения, например системного введения. Например, предпочтительно, чтобы такой формат не удалялся мгновенно из кровотока после введения. Однако продление периода полужизни предпочтительно не должно приводить к нецелевой активности и побочным эффектам или ограничивать эффективность.

Настоящее изобретение реализует по меньшей мере одно из этих требований.

Основываясь на нетрадиционных скрининговых, характеризационных и комбинаторных стратегиях, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что одиночные вариабельные домены иммуноглобулинов (ISVD) показали исключительно хорошие результаты в экспериментах in vitro, ex vivo и in vivo.

Кроме того, авторам настоящего изобретения удалось переконструировать ISVD, еще более превосходящие препараты–компараторы в том, что касается облегчения ОА. Кроме того, было продемонстрировано, что ISVD по изобретению значительно более безопасны, чем соединения предшествующего уровня техники.

Кроме того, авторы изобретения продемонстрировали, что, комбинируя различные функциональные компоненты, включая ингибиторы MMP13, ингибиторы ADAMTS5 и связывающие Аггрекан компоненты, был получен даже лучший эффект, чем с любым из ингибиторов.

Настоящее изобретение направлено на обеспечение комбинаций ISVD, оказывающих антагонистическое действие на ADAMTS, в частности ADAMTS5, и/или ISVD, оказывающих антагонистическое действие на MMP, в частности MMP13, в сочетании с CAP связующими (например, Аггрекан связывающими компонентами), с улучшенными профилактическими, терапевтическими и/или фармакологическими свойствами, включая более безопасный профиль, по сравнению аминокислотными последовательностями и антителами предшествующего уровня техники.

Соответственно, настоящее изобретение относится к полипептидам, выбранным из группы, состоящей из

(a) полипептидов, включающих по меньшей мере 2 одиночных вариабельных домена иммуноглобулина (ISVD), где первый ISVD специфически связывается с матриксной металлопротеиназой (MMP), а второй ISVD специфически связывается с Аггреканом, и необязательно включающих третий ISVD, специфически связывающийся с Аггреканом;

(b) полипептидов, включающих по меньшей мере 2 ISVD, где первый ISVD специфически связывается с дезинтегрином и металлопротеиназой с мотивами тромбоспондина (ADAMTS), а второй ISVD специфически связывается с Аггреканом, и необязательно включающих третий ISVD, специфически связывающийся с Аггреканом; и

(c) полипептидов, включающих по меньшей мере 3 ISVD, где первый ISVD специфически связывается с MMP, второй ISVD специфически связывается с ADAMTS, а третий ISVD специфически связывается с Аггреканом, и необязательно включающих четвертый ISVD, специфически связывающийся с Аггреканом.

Если не указано или не определено иначе, все используемые термины имеют их обычное известное в данной области значение, которое будет понятно специалисту. Например, делается ссылка на справочники, такие как Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2^ndEd.) Vols. 1–3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), F. Ausubel et al. (Current protocols in molecular biology, Green Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987), Lewin (Genes II, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1985), Old et al. (Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering (2^nd edition) University of California Press, Berkeley, CA, 1981); Roitt et al. (Immunology (6^th Ed.) Mosby/Elsevier, Edinburgh, 2001), Roitt et al. (Roitt’s Essential Immunology (10^th Ed.) Blackwell Publishing, UK, 2001), и Janeway et al. (Immunobiology (6^th Ed.) Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York, 2005), а также на общую информацию, известную из уровня техники, цитируемую в настоящей заявке.

Если не указано иное, все способы, стадии, процедуры и манипуляции, которые не описаны подробно конкретным образом, можно осуществить и осуществляются способом, известным per se, как будет понятно квалифицированному специалисту. Снова делается ссылка на справочники и общую информацию, известную из уровня техники, указанные в настоящей заявке, и на дополнительные ссылочные документы, цитируемые в них; а также, например, на следующие обзоры Presta (Adv. Drug Deliv. Rev. 58 (5–6): 640–56, 2006), Levin and Weiss (Mol. Biosyst. 2(1): 49–57, 2006), Irving et al. (J. Immunol. Methods 248(1–2): 31–45, 2001), Schmitz et al. (Placenta 21 Suppl. A: S106–12, 2000), Gonzales et al. (Tumour Biol. 26(1): 31–43, 2005), которые описывают методы конструирования белков, такие как созревание аффинности и другие методы для улучшения специфичности и других желаемых свойств белков, таких как иммуноглобулины.

Следует указать, что в контексте настоящей заявки формы единственного числа, обозначаемые артиклями "a", "an" и "the", включают также и множественное число, если только из контекста явно не следует иное. Таким образом, например, ссылка на "реагент" включает один или более из таких различных реагентов, и ссылка на "способ" включает ссылку на эквивалентные стадии и способы, известные специалистам в данной области, которые можно было бы модифицировать или заменить ими способы, описанные в настоящей заявке.

Если не указано иное, термин "по меньшей мере", предшествующий серии элементов, следует понимать как относящийся к каждому элементу в серии. Специалистам в данной области техники будут понятны, или они смогут установить, используя не более чем обычные эксперименты, множество эквивалентов конкретных вариантов осуществления изобретения, описанных в настоящей заявке. Такие эквиваленты предназначены для охвата настоящим изобретением.

Термин "и/или" везде, где он используется в настоящей заявке, включает значение "и", "или" и "все или любая другая комбинация элементов, связанных указанным термином".

Термин "около" или "приблизительно" в контексте настоящей заявки означает в пределах 20%, предпочтительно в пределах 15%, более предпочтительно в пределах 10% и наиболее предпочтительно в пределах 5% от данного значения или диапазона.

Во всех разделах описания и в формуле изобретения, которая следует за ним, если контекст не требует иного, слово "включать" и варианты, такие как "включает" и "включающий", подразумевают включение указанного целого или стадии или группы целых или стадий, но не исключение любого другого целого или стадии или группы целых или стадий. В контексте настоящей заявки термин "включающий" может быть заменен термином "содержащий" или "включающий в себя", или иногда термином "имеющий".

Термин “последовательность” в контексте настоящей заявки (например в терминах, таких как “последовательность иммуноглобулина”, “последовательноста антитела”, “последовательност вариабельного домена”, “последовательность V_HH” или “последовательность белка”) в основном следует понимать как включающую релевантную аминокислотную последовательность, а также кодирующие ее нуклеиновые кислоты или нуклеотидные последовательности, если только контекст не требует более ограниченной интерпретации.

Аминокислотные последовательности интерпретируются как обозначающие одну аминокислоту или неразветвленную последовательность из двух или более аминокислот, в зависимости от контекста. Нуклеотидные последовательности интерпретируются как обозначающие неразветвленную последовательность из 3 или более нуклеотидов.

Аминокислоты представляют собой такие L–аминокислоты, которые обычно присутствуют в природных белках. Аминокислотные остатки будут указаны в соответствии со стандартным трехбуквенным или однобуквенным обозначением аминокислот. См. Таблицу A–2 на стр. 48 WO 08/020079. Те аминокислотные последовательности, которые содержат D–аминокислоты, не рассматриваются как охватываемые этим определением. Любая аминокислотная последовательность, которая содержит посттрансляционно модифицированные аминокислоты, может быть описана как аминокислотная последовательность, которая первоначально транслируется с использованием символов, показанных в этой Таблице A–2 с модифицированными положениями; например гидроксилированиями или гликозилированиями, но эти модификации не должны быть прямо показаны в аминокислотной последовательности. Любой пептид или белок, который может быть выражен как включающий модифицирующие последовательность связи, поперечные связи и концевые кэпы, непептидильные связи и т.д., охватывается этим определением, как это все известно из уровня техники.

Термины "белок", "пептид", "белок/пептид" и "полипептид" используются взаимозаменяемо повсеместно в настоящем раскрытии и каждый имеет одинаковое значение для целей настоящего раскрытия. Каждый термин относится к органическому соединению, образованному линейной цепью из двух или более аминокислот. Соединение может иметь десять или более аминокислот; двадцать пять или более аминокислот; пятьдесят или более аминокислот; сто или более аминокислот, двести или более аминокислот и даже триста или более аминокислот. Специалистам в данной области должно быть понятно, что полипептиды, как правило, включают меньше аминокислот, чем белки, хотя в данной области нет никакой признанной точки, разграничивающей полипептид и белок на основании количества аминокислот; что полипептиды могут быть получены путем химического синтеза или рекомбинантными методами; и что белки, как правило, получают in vitro или in vivo рекомбинантными методами, известными из уровня техники. Согласно правилам, амидная связь в первичной структуре полипептидов расположена в порядке, в котором записываются аминокислоты, где амино–конец (N–конец) полипептида всегда находится слева, тогда как кислотный конец (C–конец) находится справа.

Считается, что нуклеиновокислотная или аминокислотная последовательность находится “(в) (по существу) выделенной (форме)” – например, по сравнению с реакционной средой или средой культивирования, из которой она была получена – когда она отделена от по меньшей мере одного другого компонента, с которым она обычно ассоциирована в указанном источнике или среде, такого как другая нуклеиновая кислота, другой белок/полипептид, другой биологический компонент или макромлекула или по меньшей мере одно загрязняющее вещество, примесь или второстепенный компонент. В частности, нуклеиновокислотная или аминокислотная последовательность считается “(по существу) выделенной”, когда очищена по меньшей мере 2–кратно, в частности по меньшей мере 10–кратно, более конктерно по меньшей мере 100–кратно, и даже 1000–кратно или более. Нуклеиновая кислота или аминокислота, которая находится “в (по существу) выделенной форме”, предпочтительно является по существу гомогенной, как определено с использованием подходящего метода, такого как подходящий хроматографический метод, такой как электрофорез в полиакриламидном геле.

Когда указано, что нуклеотидная последовательность или аминокислотная последовательность “включают” другую нуклеотидную последовательность или аминокислотную последовательность, соответственно, или “по существу состоят из” другой нуклеотидной последовательности или аминокислотной последовательности, это может означать, что последняя нуклеотидная последовательность или аминокислотная последовательность инкорпорирована в первую указанную нуклеотидную последовательность или аминокислотную последовательность, соответственно, но более типично это, как правило, означает, что первая указанная нуклеотидная последовательность или аминокислотная последовательность включает в своей последовательности участок из нуклеотидов или аминокислотных остатков, соответственно, который имеет такую же нуклеотидную последовательность или аминокислотную последовательность, соответственно, как последняя последовательность, независимо от того, как первая указанная последовательность в действительности была образована или получена (например, это может быть с использованием любого подходящего способа, описанного в настоящей заявке). В качестве не ограничивающего примера, когда указано, что полипептид по изобретению включает одиночный вариабельный домен иммуноглобулина ("ISVD"), это может означать, что указанная последовательность одиночного вариабельного домена иммуноглобулина была инкорпорирована в последовательность полипептида по изобретению, но более типично это, как правило, означает, что полипептид по изобретению содержит в своей последовательности последовательность одиночных вариабельных доменов иммуноглобулина, независимо от того, как указанный полипептид по изобретению был образован или получен. Также, когда нуклеиновая кислота или нуклеотидная последовательность указана как включающая другую нуклеотидную последовательность, первая указанная нуклеиновая кислота или нуклеотидная последовательность предпочтительно является такой, что когда она экспрессируется в продукт экспрессии (например, полипептид), аминокислотная последовательность, кодируемая последней нуклеотидной последовательностью, образует часть указанного продукта экспрессии (иными словами, последняя нуклеотидная последовательность находится в той же рамке считывания, что и первая указанная, более крупная нуклеиновая кислота или нуклеотидная последовательность). Также, когда указано, что конструкция по изобретению включает полипептид или ISVD, это может означать, что указанная конструкция по меньшей мере включает указанный полипептид или ISVD, соответственно, но более типично это означает, что указанная конструкция включает группы, остатки (например, аминокислотные остатки), фрагменты и/или связывающие элементы в дополнение к указанному полипептиду или ISVD, незавимо от того, как указанный полипептид или ISVD связан с указанными группами, остатками (например, аминокислотными остатками), фрагментами и/или связывающими элементами, и независимо от того, как указанная конструкция была образована или получена.

Термин “по существу состоят из” означает, что ISVD, используемый в изобретении, либо является точно таким же, как ISVD по изобретению, либо соответствует ISVD по изобретению, который имеет ограниченное количество аминокислотных остатков, такое как 1–20 аминокислотных остатков, например 1–10 аминокислотных остатков и предпочтительно 1–6 аминокислотных остатков, например 1, 2, 3, 4, 5 или 6 аминокислотных остатков, добавленных на амино–концевом участке, на карбоки–концевом участке или на обоих амино–концевом участке и карбоки–концевом участке ISVD.

Для целей сравнения двух или более нуклеотидных последовательностей процент “идентичности последовательностей” между первой нуклеотидной последовательностью и второй нуклеотидной последовательностью можно рассчитать путем деления [количества нуклеотидов в первой нуклеотидной последовательности, которые идентичны нуклеотидам в соответствующих положениях во второй нуклеотидной последовательности] на [общее число нуклеотидов в первой нуклеотидной последовательности] и умножения на [100%], где каждая делеция, вставка, замена или добавление нуклеотида во второй нуклеотидной последовательности – по сравнению с первой нуклеотидной последовательностью – считается отличием по одному нуклеотиду (положению). Альтернативно, степень идентичности последовательностей между двумя или более нуклеотидными последовательностями можно рассчитать с использованием известного компьютерного алгоритма для выравнивания последовательностей, такого как NCBI Blast v2.0, с использованием стандартных установочных параметров. Некоторые другие методы, компьютерные алгоритмы и установочные параметры для определения степени идентичности последовательностей описаны, например, в WO 04/037999, EP 0967284, EP 1085089, WO 00/55318, WO 00/78972, WO 98/49185 и GB 2357768. Обычно для целей определения процента “идентичности последовательностей” между двумя нуклеотидными последовательностями в соответствии с методом расчета, описанным выше, нуклеотидную последовательность с наибольшим числом нуклеотидов принимают за “первую” нуклеотидную последовательность, а другую нуклеотидную последовательность принимают за “вторую” нуклеотидную последовательность.

Для целей сравнения двух или более аминокислотных последовательностей процент “идентичности последовательностей” между первой аминокислотной последовательностью и второй аминокислотной последовательностью (также указан в настоящей заявке как “идентичность аминокислот”) можно рассчитать путем деления [количества аминокислотных остатков в первой аминокислотной последовательности, которые идентичны аминокислотным остаткам в соответствующих положениях во второй аминокислотной последовательности] на [общее число аминокислотных остатков в первой аминокислотной последовательности] и умножения на [100%], где каждая делеция, вставка, замена или добавление аминокислотного остатка во второй аминокислотной последовательности – по сравнению с первой аминокислотной последовательностью – считается отличием по одному аминокислотному остатку (положению), т.е. “отличием аминокислот”, как определено в настоящей заявке. Альтернативно, степень идентичности последовательностей между двумя аминокислотными последовательностями можно рассчитать с использованием известного компьютерного алгоритма, такого как указанные выше для определения степени идентичности последовательностей для нуклеотидных последовательностей, также с использованием стандартных установочных параметров. Обычно для целей определения процента “идентичности последовательностей” между двумя аминокислотными последовательностями в соответствии с методом расчета, описанным выше, аминокислотную последовательность с наибольшим количеством аминокислотных остатков принимают за “первую” аминокислотную последовательность, а другую аминокислотную последовательность принимают за “вторую” аминокислотную последовательность.

Также, при определении степени идентичности последовательностей между двумя аминокислотными последовательностями, специалист в данной области может принять во внимание так называемые “консервативные” аминокислотные замены, которые, как правило, могут быть описаны как аминокислотные замены, в которых аминокислотный остаток заменяют другим аминокислотным остатком подобной химической структуры и которые имеют незначительное или по существу никакого влияния на функцию, активность или другие биологические свойства полипептида. Такие консервативные аминокислотные замены хорошо известны из уровня техники, например из WO 04/037999, GB 335768, WO 98/49185, WO 00/46383 и WO 01/09300; и (предпочтительные) типы и/или комбинации таких замен можно выбрать на основании соответствующих указаний в WO 04/037999, а также WO 98/49185 и других ссылочных документах, цитируемых в них.

Такие консервативные замены предпочтительно представляют собой замены, в которых одну аминокислоту в следующих группах (a) – (e) заменяют другим аминокислотным остатком в той же группе: (a) малые алифатические неполярные или слегка полярные остатки: Ala, Ser, Thr, Pro и Gly; (b) полярные отрицательно заряженные остатки и их (незаряженные) амиды: Asp, Asn, Glu и Gln; (c) полярные положительно заряженные остатки: His, Arg и Lys; (d) крупные алифатические неполярные остатки: Met, Leu, Ile, Val и Cys; и (e) ароматические остатки: Phe, Tyr и Trp. Особенно предпочтительными консервативными заменами являются следующие: Ala на Gly или на Ser; Arg на Lys; Asn на Gln или на His; Asp на Glu; Cys на Ser; Gln на Asn; Glu на Asp; Gly на Ala или на Pro; His на Asn или на Gln; Ile на Leu или на Val; Leu на Ile или на Val; Lys на Arg, на Gln или на Glu; Met на Leu, на Tyr или на Ile; Phe на Met, на Leu или на Tyr; Ser на Thr; Thr на Ser; Trp на Tyr; Tyr на Trp; и/или Phe на Val, на Ile или на Leu.

Любые аминокислотные замены, применимые к полипептидам, описанным в настоящей заявке, могут также основываться на анализе частот аминокислотных вариаций между гомологичными белками разных видов, разработанном Schulz et al. (“Principles of Protein Structure”, Springer–Verlag, 1978), на анализах структурообразующих потенциалов, разработанных Chou и Fasman (Biochemistry 13: 211, 1974; Adv. Enzymol., 47: 45–149, 1978), и на анализе паттернов гидрофобности в белках, разработанных Eisenberg et al. (Proc. Natl. Acad Sci. USA 81: 140–144, 1984), Kyte and Doolittle (J. Molec. Biol. 157: 105–132, 1981) и Goldman et al. (Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321–353, 1986), все они включены в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте. Информация о первичной, вторичной и третичной структуре нанотел представлена в описании настоящего изобретения и в общем уровне техники, указанном выше. Кроме того, для этой цели кристаллическая структура V_HHдомена ламы, например, представлена в Desmyter et al. (Nature Structural Biology, 3: 803, 1996), Spinelli et al. (Natural Structural Biology, 3: 752–757, 1996) и Decanniere et al. (Structure, 7 (4): 361, 1999). Дополнительную информацию о некоторых аминокислотных остатках, которые в обычных V_H доменах образуют границу раздела V_H/V_L, и потенциальных заменах верблюжьего происхождения в этих положениях можно найти в предшествующем уровне техники, указанном выше.

Аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновых кислот указаны как “абсолютно одинаковые”, если они имеют идентичность последовательностей 100% (как определено в настоящей заявке) по всей их длине.

При сравнении двух аминокислотных последовательностей, термин “аминокислотное(аминокислотные) отличие” относится к вставке, делеции или замене одного аминокислотного остатка в определенном положении в первой последовательности по сравнению со второй последовательностью; должно быть понятно, что две аминокислотные последовательности могут содержать одно, два или более таких аминокислотных отличий. Более конкретно, в ISVDs и/или полипептидах по настоящему изобретению термин “аминокислотное(аминокислотные) отличие” относится к вставке, делеции или замене одного аминокислотного остатка в определенном положении последовательности CDR, определенной в (b), (d) или (f), по сравнению с последовательностью CDR соответственно (a), (c) или (e); должно быть понятно, что последовательность CDR (b), (d) и (f) может содержать одно, два, три, четыре или максимально пять таких аминокислотных отличий по сравнению с последовательностью CDR соответственно (a), (c) или (e).

“Аминокислотное(аминокислотные) отличие” может представлять собой любое одно, два, три, четыре или максимально пять замен, делеций или вставок, или любую их комбинацию, которые либо улучшают свойства ISVD по изобретению, т.е. связывающего ADAMTS5, связывающего MMP13 и/или связывающего Аггрекан агента по изобретению, такого как полипептид по изобретению, либо которые по меньшей мере не намного ухудшают желаемые свойства или баланс или комбинацию желаемых свойств ISVDs по изобретению, т.е. связывающего ADAMTS5, связывающего MMP13 и/или связывающего Аггрекан агента по изобретению, такого как полипептид(полипептиды) по изобретению, включающий связывающий Аггрекан и связывающий MMP13 и/или связывающий ADAMTS5 компонент. В этой связи, полученный полипептид(полипептиды) по изобретению должны по меньшей мере связываться с Аггреканом и MMP13 и/или ADAMTS5 с такой же, почти такой же или более высокой аффинностью по сравнению с полипептидом, включающим одну или более CDR последовательностей без одной, двух, трух, четырех или максимально пяти замен, делеций или вставок. Аффинность можно измерить любым подходящим способом, известным из уровня техники, но предпочтительно ее измеряют способом, описанным в разделе Примеры.

В этой связи, аминокислотная последовательность CDR в соответствии с (b), (d) и/или (f), как указано в настоящей заявке, может представлять собой аминокислотную последовательность, которая получена из аминокислотной последовательности в соответствии с (a), (c) и/или (e), соответственно, путем созревания аффинности с использованием одного или более методов созревания аффинности, известных per se или описанных в примерах. Например, и в зависимости от используемого организма–хозяина для экспрессии полипептида по изобретению, такие делеции и/или замены могут быть рассчитаны таким образом, чтобы удалить один или более сайтов для посттрансляционной модификации (таких как один или более сайтов гликозилирования), что должно быть известно специалистам в данной области (см. Примеры).

“Семейство нанотел”, “семейство V_HH” или “семейство”, как используется в настоящем описании, относится к группе нанотел и/или последовательностей V_HH, которые имеют одинаковую длину (т.е. они имеют одинаковое количество аминокислот в их последовательности) и у которых аминокислотные последовательности между положением 8 и положением 106 (в соответствии с нумерацией Kabat) имеют идентичность аминокислотных последовательностей 89% или более.

Термины “эпитоп” и “антигенная детерминанта”, которые можно использовать взаимозаменяемо, относятся к части макромлекулы, такой как полипептид или белок, которая распознается антиген–связывающими молекулами, такими как иммуноглобулины, традиционные антитела, одиночные вариабельные домены иммуноглобулинов и/или полипептиды по изобретению, и более конкретно антиген–связывающим сайтом указанных молекул. Эпитопы определяют минимальный связывающий сайт для иммуноглобулина и, таким образом, представляют собой мишень специфичности иммуноглобулина.

Часть антиген–связывающей молекулы (такой как иммуноглобулин, традиционное антитело, одиночный вариабельный домен иммуноглобулина и/или полипептид по изобретению), которая распознает эпитоп, называется “паратопом”.

Аминокислотная последовательность (такая как одиночный вариабельный домен иммуноглобулина, антитело, полипептид по изобретению или, как правило, антиген–связывающий белок или полипептид или его фрагмент), которая может “связываться с” или “специфически связываться с”, которая “обладает аффинностью к” и/или которая “обладает специфичностью к” определенному эпитопу, антигену или белку (или по меньшей мере к одной его части, фрагменту или эпитопу) называется "против" или “направленная против” указанного эпитопа, антигена или белка, или представляет собой “связывающую” молекулу по отношению к такому эпитопу, антигену или белку, или называется “анти”–эпитоп, “анти”–антиген или “анти”–белок (например, “анти”–Аггрекан, “анти”–MMP13 и/или “анти”–ADAMTS5).

Аффинность означает силу или стабильность молекулярного взаимодействия. Аффинность обычно представляют как K_D, или константу диссоциации, которую представляют в единицах моль/литр (или M). Аффинность также можно выразить как константу ассоциации, K_A, которая равна 1/K_D и которую представляют в единицах (моль/литр)^–1 (или M^–1). В настоящем описании стабильность взаимодействия между двумя молекулами в основном может быть выражена как K_D значение их взаимодействия; квалифицированному специалисту будет понятно, что исходя из отношения K_A=1/K_D, определяющего силу молекулярного взаимодействия по его K_D значению, также можно использовать для расчета соответствующее K_A значение. K_D–значениехарактеризует силу молекулярного взаимодействия также с термодинамической точки зрения, поскольку оно связано с изменением свободной энергии (DG) связывания хорошо известным отношением DG=RT.ln(K_D) (эквиваленто DG=–RT.ln(K_A)), где R=газовая постоянная, T=абсолютная температура и ln означает натуральный логарифм.

K_Dдля биологических взаимодействий, которые считаются значимыми (например, специфическими), типично находятся в пределах от 10^–12M (0,001 нМ) до 10^–5M (10000 нМ). Чем сильнее взаимодействие, тем ниже его K_D.

K_D также можно выразить как отношение константы скорости диссоциации комплекса, обозначаемой как k_off, к скорости его ассоциации, обозначаемой как k_on (таким образом, K_D =k_off/k_on и K_A=k_on/k_off). Скорость диссоциации k_offвыражают в единицах сек^–1 (где сек означает секунду (единица системы СИ)). Скорость ассоциации k_on выражают в единицах M^–1сек^–1. Скорость ассоциации может варьироваться в пределах от 10² M^–1сек^–1 до около 10⁷ M^–1сек^–1, приближаясь к диффузионно–ограниченной константе скорости ассоциации для бимолекулярных взаимодействий. Скорость диссоциации связана с периодом полужизни данного молекулярного взаимодействия отношением t_1/2=ln(2)/k_off. Скорость диссоциации может варьироваться в пределах от 10^–6 сек^–1 (близко к необратимому комплексу с t_1/2 несколько дней) до 1 сек^–1 (t_1/2=0,69 сек).

Специфическое связывание антиген–связывающего белка, такого как ISVD, с антигеном или антигенной детерминантой можно определить любым подходящим способом, известным per se, включая, например, анализы насыщения при связывании и/или анализы конкурентного связывания, такие как радиоиммуноанализы (RIA), иммуноферментные анализы (EIA) и конкурентные сэндвич–анализы, и их различные варианты, известные per se в данной области техники; а также другие методы, указанные в настоящей заявке.

Аффинность молекулярного взаимодействия между двумя молекулами можно измерить разными способами, известными per se, такими как хорошо известный биосенсорный метод поверхностного плазмонного резонанса (SPR) (см., например, Ober et al. 2001, Intern. Immunology 13: 1551–1559), где одна молекула иммобилизована на биосенсорном чипе, а другую молекулу пропускают над иммобилизованной молекулой в режиме течения, с получением k_on, k_offзначений и, следовательно, K_D (или K_A) значений. Это, например, можно осуществить с использованием хорошо известных устройств BIACORE® (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden). Кинетический анализ исключения (KINEXA®) (Drake et al. 2004, Analytical Biochemistry 328: 35–43) измеряет события связывания в растворе без мечения партнеров по связыванию и основан на кинетическом исключении диссоциации комплекса. Анализ аффинности в растворе также можно осуществить с использованием системы иммуноанализа GYROLAB®, которая обеспечивает платформу для автоматического биоанализа и быструю оборачиваемость образцов (Fraley et al. 2013, Bioanalysis 5: 1765–74), или ELISA.

Также, квалифицированному специалисту должно быть понятно, что измеренная K_D может соответствовать кажущейся K_D, если способ измерения как–либо влияет на истинную аффинность связывания потенциальных молекул, например, посредством артефактов, связанных с нанесением на биосенсор одной молекулы. Также, кажущуюся K_D можно измерить, если одна молекула содержит более одного сайта распознавания для другой молекулы. В такой ситуации на измеряемую аффинность может влиять авидность взаимодействия двух таких молекул. В частности, точное измерение K_D может быть очень трудозатратным, и в результате часто кажущиеся K_D значения определяют для оценки силы связывания двух молекул. Следует отметить, что при условии, что все измерения осуществляют согласованным образом (например, поддерживая условия анализа неизменными), кажущиеся K_D значения можно использовать в качестве приближения к истинной K_D, и, следовательно, в настоящем документе K_D и кажущуюся K_D следует рассматривать как равным образом важные или актуальные.

Термин “специфичность” относится к количеству различных типов антигенов или антигенных детерминант, с которыми может связываться конкретная антиген–связывающая молекула или антиген–связывающий белок (такой как ISVD или полипептид по изобретению). Специфичность антиген–связывающего белка можно определить на основании аффинности и/или авидности, например, как описано на стр. 53–56 WO 08/020079 (включенной в настоящую заявку посредством ссылки), которая также описывает некоторые предпочтительные методы для измерения связывания между антиген–связывающей молекулой (такой как полипептид или ISVD по изобретению) и соответствующим антигеном. Типично, антиген–связывающие белки (такие как ISVD и/или полипептиды по изобретению) будут связываться с их антигеном с константой диссоциации (K_D) от 10^–5 до 10^–12 моль/литр или меньше, и предпочтительно от 10^–7 до 10^–12 моль/литр или меньше, и более предпочтительно от 10^–8 до 10^–12 моль/литр (т.е. с константой ассоциации (K_A) от 10⁵ до 10¹² литр/моль или более, и предпочтительно от 10⁷ до 10¹² литр/моль или более, и более предпочтительно от 10⁸ до 10¹² литр/моль). Любое K_D значение больше чем 10^–4 моль/литр (или любое K_A значение меньше чем 10⁴ литр/моль), как правило, считается как указывающее на неспецифическое связывание. Предпочтительно, одновалентный ISVD по изобретению будет связываться с желаемым антигеном с аффинностью меньше чем 500 нМ, предпочтительно меньше чем 200 нМ, более предпочтительно меньше чем 10 нМ, такой как меньше чем 500 пМ, например между 10 и 5 пМ или меньше. См. также параграф n) на стр. 53–56 WO 08/020079.

ISVD и/или полипептид называют “специфическим в отношении” (первой) мишени или антигена по сравнению с другой (второй) мишенью или антигеном, когда он связывается с первым антигеном с аффинностью (как описано выше, и соответствующим образом выраженной как K_D значение, K_A значение, K_off скорость и/или K_on скорость), которая больше по меньшей мере в 10 раз, например, по меньшей мере в 100 раз и предпочтительно по меньшей мере в 1000 раз или более, чем аффинность, с которой ISVD и/или полипептид связывается со второй мишенью или антигеном. Например, ISVD и/или полипептид может связываться с первой мишенью или антигеном с K_D значением, которое по меньшей мере в 10 раз меньше, например, по меньшей мере в 100 раз меньше, и предпочтительно по меньшей мере в 1000 раз меньше или даже еще меньше, чем K_D, с которой указанный ISVD и/или полипептид связывается со второй мишенью или антигеном. Предпочтительно, когда ISVD и/или полипептид является “специфическим в отношении” первой мишени или антигена по сравнению со второй мишенью или антигеном, он направлен против (как определено в настоящей заявке) указанной первой мишени или антигена, но не направлен против указанной второй мишени или антигена.

Специфическое связывание антиген–связывающего белка с антигеном или антигенной детерминантой можно определить любым подходящим способом, известным per se, включая, например, анализы насыщения при связывании и/или анализы конкурентного связывания, такие как радиоиммуноанализы (RIA), иммуноферментные анализы (EIA) и их различные варианты, известные из уровня техники; а также другие методы, указанные в настоящей заявке.

Предпочтительный подход, который можно использовать для оценки аффинности, представляет собой 2–стадийную процедуру ELISA (Твердофазный иммуноферментный анализ) Friguet et al. 1985 (J. Immunol. Methods 77: 305–19). Этот способ устанавливает измерение равновесия связывания в фазе раствора и избегает возможных артефактов, связанных с адсорбцией одной из молекул на подложке, такой как пластик. Как будет понятно квалифицированному специалисту, константа диссоциации может представлять собой действительную или кажущуюся константу диссоциации. Способы для определения константы диссоциации будут понятны квалифицированным специалистам и, например, включают способы, указанные на стр. 53–56 WO 08/020079.

Наконец, следует отметить, что во многих ситуациях опытный специалист может решить, что удобно определять аффинность связывания по сравнению с некоторой референсной молекулой. Например, для оценки силы связывания между молекулами A и B можно, например, использовать референсную молекулу C, известную как связывающуюся с B и соответствующим образом меченную группой флуорофора или хромофора или другой химической группой, такой как биотин, чтобы легко можно было осуществить детекцию в ELISA или FACS (флуоресцентно–активируемый клеточный сортинг) или в другом формате (флуорофор для флуоресцентной детекции, хромофор для детекции на основе поглощения света, биотин для стрептавидин–опосредованной ELISA детекции). Типично, референсную молекулу C поддерживают при фиксированной концентрации, а концентрация A варьируется в соответствии с заданной концентрацией или количеством B. В результате, получают IC₅₀значение, соответствующее концентрации A, при которой сигнал, измеренный для C в отсутствие A, уменьшается наполовину. При условии, что известна K_{D ref}, K_D референсной молекулы, а также общая концентрация c_refреференсной молекулы, кажущуюся K_D для взаимодействия A–B можно получить с использованием следующей формулы: K_D =IC₅₀/(1+c_ref/ K_Dref). Следует отметить, что, если c_ref << K_D _ref, K_D ≈ IC₅₀. При условии, что измерение IC₅₀ осуществляют единообразным образом (например, поддерживая фиксированную c_ref) для связующих, которые сравнивают, разницу в силе или стабильностм молекулярного взаимодействия можно оценить путем сравнения IC₅₀, и этот показатель считается эквивалентным K_D или кажущейся K_D повсеместно в тексте настоящего описания.

Полумаксимальная ингибирующая концентрация (IC₅₀) также может быть показателем эффективности соединения в ингибировании биологической или биохимической функции, например фармакологического эффекта. Этот количественный показатель указывает какое количество полипептида или ISVD (например, нанотела) необходимо для ингибирования наполовину данного биологического процесса (или компонента процесса, т.е. фермента, клетки, клеточного рецептора, хемотаксиса, анаплазии, метастазов, инвазивности и т.д.). Иначе говоря, это полумаксимальная (50%) ингибирующая концентрация (IC) вещества (50% IC, или IC₅₀). IC₅₀значения можно рассчитать для данного антагониста, такого как полипептид или ISVD (например, нанотело) по изобретению, путем определения концентрации, необходимой для ингибирования наполовину максимального биологического ответа агониста. K_Dлекарственного средства можно определить путем построения кривой доза–ответ и изучения эффекта различных концентраций антагониста, такого как полипептид или ISVD (например, нанотело) по изобретению, на реверсию активности агониста.

Термин "полумаксимальная эффективная концентрация" (ЕС₅₀) относится к концентрации соединения, которая индуцирует ответ на полпути между исходным уровнем и максимумом после определенного времени воздействия. В контексте настоящей заявки он используется в качестве показателя эффективности полипептида, ISVD (например, нанотела). ЕС₅₀ значение, полученное из кривой доза–ответ при постепенном увеличении дозы, представляет собой концентрацию соединения, при которой наблюдается 50% его максимального эффекта. Концентрацию предпочтительно выражают в молярных единицах.

В биологических системах небольшие изменения в концентрации лиганда обычно приводят к быстрым изменениям ответа в соответствии с сигмоидальной функцией. Точка перегиба, в которой усиление ответа с увеличением концентрации лиганда начинает замедляться, представляет собой значение EC₅₀. Это можно определить математически путем выведения наиболее подходящей линии. В большинстве случаев удобно осуществлять оценку на основании графика. В случае, если в разделе Примеры указана EC₅₀, эксперименты были разработаны так, чтобы максимально точно отразить K_D. Другими словами, EC₅₀ значения могут затем рассматриваться как K_D значения. Термин "среднее значение K_D" относится к среднему значению K_D, полученному по меньшей мере в 1, но предпочтительно более чем в 1, например по меньшей мере в 2 экспериментах. Термин "средний" относится к математическому термину "средний" (сумма данных, деленная на количество элементов в данных).

Это также связано с значением IC₅₀,которое является критерием оценки соединения, его ингибирующего действия (ингибирование 50%). Для конкурентных анализов связывания и анализов функциональных антагонистов IC₅₀ является наиболее типичным итоговым показателем кривой доза–ответ. Для анализов агонистов/стимуляторов наиболее типичным итоговым показателем является EC₅₀.

Константа ингибирования (Ki) является показателем того, насколько сильным является ингибитор; это концентрация, необходимая для обеспечения полумаксимального ингибирования. В отличие от IC₅₀, которая может изменяться в зависимости от условий эксперимента, Ki является абсолютной величиной и часто указывается как константа ингибирования лекарственного средства. Константу ингибирования Ki можно рассчитать с использованием уравнения Ченга–Прусоффа:

в котором [L] представляет собой фиксированную концентрацию лиганда.

Термин “активность” полипептида и/или ISVD по изобретению в контексте настоящей заявки означает функцию количества полипептида и/или ISVD по изобретению, необходимого для проявления его специфического эффекта. Это относится к способности указанного полипептида и/или ISVD по изобретению модулировать и/или частично или полностью ингибировать активность MMP13 и/или модулировать и/или частично или полностью ингибировать активность ADAMTS5.

В частности, это может относиться к способности указанного полипептида снижать или даже полностью ингибировать активность MMP13, определенного в настоящей заявке. Таким образом, это может относиться к способности указанного полипептида ингибировать протеолиз, такой как протеазная активность, эндопептидазные активности, связывание с субстратом, таким как, например, Аггрекан, Коллаген II, Коллаген I, Коллаген III, Коллаген IV, Коллаген IX, Коллаген X, Коллаген XIV и желатин. Действенность можно измерить при помощи любого подходящего анализа, известного из уровня техники или описанного в настоящей заявке.

В частности, это может относиться к способности указанного полипептида и/или ISVD снижать или даже полностью ингибировать активность ADAMTS5, определенного в настоящей заявке, и/или активность MMP13, определенного в настоящей заявке. Действенность можно измерить при помощи любого подходящего анализа, известного из уровня техники или описанного в настоящей заявке. В контексте настоящей заявки "аггреканазная активность" определяется как протеолитическое расщепление Аггрекана.

“Эффективность” полипептида по изобретению определяет максимальную силу его эффекта как такового, при насыщающих концентрациях полипептида. Эффективность означает максимальный ответ, достигаемый полипептидом по изобретению. Это относится к способности полипептида обеспечивать желаемый (терапевтический) эффект.

В одном аспекте изобретение относится к полипептиду, описанному в настоящей заявке, где указанный полипептид связывается с ADAMTS5 с K_D значением между 1E^–07M и 1E^–13 M, таким как между 1E^–08M и 1E^–12 M, предпочтительно максимально 1E^–07 M, предпочтительно меньше чем 1E^–08 M или 1E^–09M, или даже меньше чем 1E^–10 M, таким как 5E^–11 M, 4E^–11 M, 3E^–11 M, 2E^–11 M, 1,7E^–11 M, 1E^–11 M или даже 5E^–12 M, 4E^–12 M, 3E^–12 M, 1E^–12 M, например, как определено методом Gyrolab или KinExA.

В одном аспекте изобретение относится к полипептиду, описанному в настоящей заявке, где указанный полипептид связывается с MMP13 с K_D значением между 1E^–07M и 1E^–13 M, таким как между 1E^–08M и 1E^–12 M, предпочтительно максимально 1E^–07 M, предпочтительно меньше чем 1E^–08 M или 1E^–09M, или даже меньше чем 1E^–10 M, таким как 5E^–11 M, 4E^–11 M, 3E^–11 M, 2E^–11 M, 1,7E^–11 M, 1E^–11 M или даже 5E^–12 M, 4E^–12 M, 3E^–12 M, 1E^–12 M, например, как определено методом Gyrolab или KinExA.

В одном аспекте изобретение относится к полипептиду, описанному в настоящей заявке, где указанный полипептид связывается с Аггреканом с K_D значением между 1E^–07M и 1E^–13 M, таким как между 1E^–08M и 1E^–12 M, предпочтительно максимально 1E^–07 M, предпочтительно меньше чем 1E^–08 M или 1E^–09M, или даже меньше чем 1E^–10 M, таким как 5E^–11 M, 4E^–11 M, 3E^–11 M, 2E^–11 M, 1,7E^–11 M, 1E^–11 M или даже 5E^–12 M, 4E^–12 M, 3E^–12 M, 1E^–12 M, например, как определено методом Gyrolab или KinExA.

В одном аспекте изобретение относится к полипептиду, описанному в настоящей заявке, где указанный полипептид связывается с ADAMTS5 со скоростью диссоциации меньше чем 5E^–04 сек^–1, такой как, например, меньше чем 1E^–04 сек^–1 или 5E^–05 сек^–1, или даже меньше чем 1E^–05 сек^–1, например, как определено методом SPR.

В одном аспекте изобретение относится к полипептиду, описанному в настоящей заявке, где указанный полипептид связывается с MMP13 со скоростью диссоциации меньше чем 5E^–04 сек^–1, такой как меньше чем 1E^–04 сек^–1 или 5E^–05 сек^–1, или даже меньше чем 1E^–05 сек^–1, например, как определено методом SPR.

В одном аспекте изобретение относится к полипептиду, описанному в настоящей заявке, где указанный полипептид связывается с Аггреканом со скоростью диссоциации меньше чем 5E^–04 сек^–1, такой как меньше чем 1E^–04 сек^–1 или 5E^–05 сек^–1, или даже меньше чем 1E^–05 сек^–1, например, как определено методом SPR.

В одном аспекте изобретение относится к полипептиду, описанному в настоящей заявке, где указанный полипептид модулирует активность ADAMTS5 и/или активность MMP13 с EC₅₀ значением между 1E^–07 M и 1E^–12 M, таким как между 1E^–08 M и 1E^–11 M, например, как определено в анализе связывания ELISA (для определения активности ADAMTS5), или, например, в конкурентном анализе ELISA, конкурентном TIMP–2 ELISA, флуорогенный анализ пептида, флуорогенный анализ коллагена или коллагенoлитический анализ (для определения активности MMP13).

В одном аспекте изобретение относится к полипептиду, описанному в настоящей заявке, где указанный полипептид ингибирует активность ADAMTS5 и/или MMP13 с значением IC₅₀ между 1E^–07 M и 1E^–12 M, таким как между 1E^–08 M и 1E^–11 M, например, как определено в FRET анализе человеческого белка или в AlphaLISA анализе человеческого белка (для определения активности ADAMTS5) или, например, в конкурентном ELISA, конкурентном TIMP–2 ELISA, анализе флуорогенного пептида, анализе флуорогенного коллагена или коллагенолитическом анализе (для определения MMP13 активности).

В одном аспекте изобретение относится к полипептиду, описанному в настоящей заявке, где указанный полипептид ингибирует ферментативную активность ADAMTS5 и/или MMP13 с значением IC₅₀ максимально 1E^–07 M, предпочтительно 1E^–08 M, 5E^–09 M, или 4E^–9 M, 3E^–9 M, 2E^–9 M, таким как 1E^–9 M.

Аминокислотная последовательность, такая как ISVD или полипептида, указана как “перекрестно–реагирующая” для двух различных антигенов или антигенных детерминант (таких как например, ADAMTS5 из разных видов млекопитающих, например, ADAMTS5 человека, ADAMTS5 быка, ADAMTS5 крысы, ADAMTS5 морской свинки, ADAMTS5 мыши или ADAMTS5 яванского макака, или таких как например, MMP13 из разных видов млекопитающих, например, MMP13 человека, MMP13 собаки, MMP13 быка, MMP13 крысы, MMP13 свиньи, MMP13 мыши, MMP13 кролика, MMP13 яванского макака и/или MMP13 макака–резуса, или таких как, например, Аггрекан из разных видов млекопитающих, например, Аггрекан человека, Аггрекан собаки, Аггрекан быка, Аггрекан крысы, Аггрекан свиньи, Аггрекан мыши, Аггрекан кролика, Аггрекан яванского макака и/или Аггрекан макака–резус), если она является специфической в отношении (как определено в настоящей заявке) этих различных антигенов или антигенных детерминант. Должно быть понятно, что ISVD или полипептид может считаться перекрестно–реагирующим, хотя аффинность связывания для двух различных антигенов может отличаться, например в 2, 5, 10, 50, 100 или более раз, при условии, что он является специфическим в отношении (как определено в настоящей заявке) этих разных антигенов или антигенных детерминант.

ADAMTS5 также известен как ADAMTS11, ADMP–2 или Аггреканаза–2. Соответствующую информацию о структуре ADAMTS5 можно найти, например, по номерам доступа UniProt, как показано в таблице B–1 ниже (см. Таблицу B).

Таблица B–1
Белок, номер доступа	Ген	Организм
Q9UNA0	ADAMTS5	H.sapiens
Q9TT92	ADAMTS5	B.taurus
Q6TY19	ADAMTS5	R.norvegicus
H0VFP0	ADAMTS5	Cavia Porcellus
Q9R001	ADAMTS5	M.musculus
F6Z3S6	ADAMTS5	M.mulatta

"ADAMTS5 человека" относится к ADAMTS5, включающему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67. В одном аспекте полипептид по изобретению специфически связывается с ADAMTS5 из Human sapiens, Mus musculus, Cavia Porcellus, Bos taurus, Macaca mulatta и/или Rattus norvegicus, предпочтительно ADAMTS5 человека, предпочтительно SEQ ID NO: 67.

MMP13 также известен как CLG3 или Коллагеназа 3, MANDP1, MMP–13, Матриксная металлопептидаза 13 или MDST. Соответствующую информацию о структуре MMP13 можно найти, например, по номерам доступа UniProt, как показано в таблице B–2 ниже (см. Таблицу B).

Таблица B–2
Белок, номер доступа	Ген	Организм
NP_002418.1	MMP13	H.sapiens
XP_001154361.1	MMP13	P.troglodytes
XP_001098996.1	MMP13	M.mulatta
XP_536598.3	MMP13	C.lupus
NP_776814.1	MMP13	B.taurus
NP_032633.1	Mmp13	M.musculus
NP_598214.1	Mmp13	R.norvegicus
XP_003640635.1	MMP13	G.gallus

"MMP13 человека" относится к MMP13, включающему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66. В одном аспекте полипептид по изобретению специфически связывается с MMP13 из Human sapiens, Mus musculus, Canis lupus, Bos taurus, Macaca mulatta, Rattus norvegicus, Gallus gallus и/или P.troglodytes, предпочтительно MMP13 человека, предпочтительно SEQ ID NO: 66.

Аггрекан также известен как аггрекан 1, ACAN, AGC1, AGCAN, CSPGCP, MSK16, SEDK, коровый белок хрящ–специфического протеогликана (CSPCP) или хондроитинсульфат протеогликан 1 (CSPG1). Аггрекан у человека кодируется геном ACAN, который находится на хромосоме Chr 15: q26.1. Соответствующую информацию о структуре Аггрекана можно найти, например, по номерам доступа UniProt, как показано в таблице B–3 ниже (см. Таблицу B).

Таблица B–3
Белок, номер доступа	Ген	Организм
P16112	ACAN	H.sapiens
XP_003952775.2	ACAN	P.troglodytes
XP_002804990.1	ACAN	M.mulatta
Q28343	ACAN	C.lupus
P13608	ACAN	B.taurus
Q61282	ACAN	M.musculus
P07897	ACAN	R.norvegicus
Q29011	ACAN	S.scrofa
G1U677–1	ACAN	O.cuniculus
NP_990286.2	ACAN	G.gallus

"Аггрекан человека" относится к аггрекану, включающему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68. В одном аспекте полипептид по изобретению специфически связывается с Аггреканом из Human sapiens, Mus musculus, Bos taurus, Macaca mulatta, Pan troglodytes, Gallus gallus, Canis lupus, Sus scrofa, Oryctolagus cuniculus и/или Rattus norvegicus, предпочтительно Аггреканом человека, предпочтительно SEQ ID NO: 68.

Термины “(перекрестно)–блокировать”, “(перекрестно)–блокированный”, “(перекрестное)–блокирование”, “конкурентное связывание”, “(перекрестно)–конкурировать”, “(перекрестно)–конкурирующий” и “(перекрестно)–конкурентный” используются взаимозаменяемо в настоящей заявке как обозначающие способность иммуноглобулина, антитела, ISVD, полипептида или другого связывающего агента препятствовать связыванию других иммуноглобулинов, антител, ISVD, полипептидов или связывающих агентов с данной мишенью. Степень, в которой иммуноглобулин, антитело, ISVD, полипептид или другой связывающий агент способен препятствовать связыванию другого агента с мишенью, а, соответственно, то, можно ли назвать это перекрестным блокированием в соответствии с изобретением, можно определить с использованием конкурентных анализов связывания, которые являются обычными в данной области техники, таких как, например, скрининг очищенных ISVD против ISVD, экспонированных на фаге, в конкурентном ELISA. Особенно подходящие количественные анализы перекрестного блокирования включают ELISA.

Другие способы для определения, действительно ли иммуноглобулин, антитело, ISVD, полипептид или другой связывающий агент, направленный против мишени, (перекрестно)–блокирует, способен (перекрестно)–блокировать, конкурентно связывается или является (перекрестно)–конкурентным, как определено в настоящей заявке, могут включать "сэндвич–анализ" на основе SPR, такой как, например, описанный в разделе Примеры. Другие подходящие способы описаны, например, В Xiao–Chi Jia et al. (Journal of Immunological Methods 288: 91–98, 2004), Miller et al. (Journal of Immunological Methods 365: 118–125, 2011).

"ADAMTS5 активности" и "активности ADAMTS5" (эти термины используются взаимозаменяемо в настоящей заявке) включают, но не ограничиваются этим, ферментативные активности, такие как протеолиз, например, протеазная активность (также называемая протеиназной или пептидазной активностью) и эндопептидазные активности, с одной стороны, и активности посредством экзосайтов, такие как, например, распознавание и/или связывание субстрата, например, посредством дезинтегрин–подобного домена, центрального тромбоспондинового типа I–подобного (TS) повтора, цистеин–обогащенного домена, спейсерной области и/или дополнительных TS мотивов. Активности ADAMTS5 включают связывание и/или протеолиз субстратов, таких как гиалуронан–связывающие внеклеточные белки хондроитинсульфат–протеогликанов (CSPG), такие как Аггрекан, Версикан, Бревикан, Нейрокан, Декорин и Вигликан. В контексте настоящей заявки протеолиз представляет собой расщепление белков на более мелкие полипептиды или аминокислоты путем гидролиза пептидных связей, которые связывают аминокислоты вместе в полипептидной цепи.

"MMP13 активности" и "активности MMP13" (эти термины используются взаимозаменяемо в настоящей заявке) включают, но не ограничиваются этим, протеолиз, такой как протеазная активность (также называемая протеиназной или пептидазной активностью) и эндопептидазные активности, с одной стороны, и связывание с субстратом, например посредством Гемопексин–подобного домена и пептидогликан–связывающего домена. MMP13 активности включают связывание и/или протеолиз субстратов, таких как Аггрекан, Коллаген II, Коллаген I, Коллаген III, Коллаген IV, Коллаген IX, Коллаген X, Коллаген XIV и Желатин. В контексте настоящей заявки протеолиз представляет собой расщепление белков на более мелкие полипептиды или аминокислоты путем гидролиза пептидных связей, которые связывают аминокислоты вместе в полипептидной цепи.

В контексте настоящего изобретения “модулирующий” или “модулировать”, как правило, означает изменение активности ADAMTS5 и/или MMP13, измеренное с использованием подходящего in vitro, клеточного или in vivo анализа (такого как анализы, указанные в настоящей заявке). В частности, “модулирующий” или “модулировать” может означать либо снижение или ингибирование активности, либо, альтернативно, повышение активности ADAMTS5 и/или MMP13, измеренное с использованием подходящего in vitro, клеточного или in vivo анализа (например, такого, как анализы, указанные в настоящей заявке), на по меньшей мере 1%, предпочтительно по меньшей мере 5%, например по меньшей мере 10% или по меньшей мере 25%, например по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или 90% или более, по сравнению с активностью ADAMTS5 и/или MMP13 в этом же анализе в таких же условиях, но без присутствия ISVD или полипептида по изобретению.

Соответственно, настоящее изобретение относится к полипептиду, описанному в настоящей заявке, где указанный полипептид модулирует активность ADAMTS5 и/или MMP13, предпочтительно ингибирует активность ADAMTS5 и/или MMP13.

Соответственно, настоящее изобретение относится к полипептиду, описанному в настоящей заявке, где указанный полипептид ингибирует протеазную активность ADAMTS5, например ингибирует протеолиз субстрата, такого как Аггрекан, Версикан, Бревикан, Нейрокан, Декорин, и/или Вигликан.

Соответственно, настоящее изобретение относится к полипептиду, описанному в настоящей заявке, где указанный полипептид блокирует связывание ADAMTS5 с субстратом, таким как Аггрекан, Версикан, Бревикан, Нейрокан, Декорин и/или Вигликан, где указанный субстрат предпочтительно представляет собой Аггрекан.

В одном аспекте изобретение относится к полипептиду, описанному в настоящей заявке, где указанный полипептид блокирует связывание ADAMTS5 с Аггреканом на по меньшей мере 20%, например по меньшей мере 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или даже больше, например, как определено методом ELISA.

В одном аспекте изобретение относится к полипептиду, описанному в настоящей заявке, где указанный полипептид антагонизирует или ингибирует активность ADAMTS5, такую как (i) протеазная активность, предпочтительно расщепление Аггрекана, Версикана, Бревикана, Нейрокана, Декорина и/или Вигликана, предпочтительно расщеплениа Аггрекана; предпочтительно антагонизирует аггреканазную активность ADAMTS5; (ii) связывание субстрата с ADAMTS5, таким как экзосайт ADAMTS5, например дезинтегрин–подобный домен, центральный тромбоспондиновый типа I–подобный (TS) повтор, цистеин–обогащенный домен, спейсерная область или дополнительный TS мотив.

Соответственно, настоящее изобретение относится к полипептиду, описанному в настоящей заявке, где указанный полипептид ингибирует протеазную активность MMP13, например ингибирует протеолиз субстрата, такого как Аггрекан, Коллаген II, Коллаген I, Коллаген III, Коллаген IV, Коллаген IX, Коллаген X, Коллаген XIV и/или Желатин.

Соответственно, настоящее изобретение относится к полипептиду, описанному в настоящей заявке, где указанный полипептид блокирует связывание MMP13 с субстратом, таким как Аггрекан, Коллаген II, Коллаген I, Коллаген III, Коллаген IV, Коллаген IX, Коллаген X, Коллаген XIV и/или Желатин, где указанный Коллаген предпочтительно представляет собой Коллаген II.

В одном аспекте изобретение относится к полипептиду, описанному в настоящей заявке, где указанный полипептид блокирует связывание MMP13 с Коллагеном и/или Аггреканом на по меньшей мере 20%, например по меньшей мере 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или даже больше, например, как определено в конкурентных анализах на основе ELISA (см. Howes et al. 2014 J. Biol. Chem. 289:24091–24101).

В одном аспекте изобретение относится к полипептиду, описанному в настоящей заявке, где указанный полипептид антагонизирует или ингибирует активность MMP13, такую как (i) протеазная активность, предпочтительно расщепление Аггрекана и/или Коллагена, где указанный Коллаген предпочтительно представляет собой Коллаген II; (ii) связывание Коллагена с гемопексин–подобным доменом.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду, описанному в настоящей заявке, где указанный полипептид ингибирует протеазную активность ADAMTS5 и/или MMP13, предпочтительно по меньшей мере на 5%, например 10%, 20%, 30%, 40%, 50% или даже больше, например по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или даже больше, как определено любым подходящим способом, известным из уровня техники, например в конкурентных анализах, или как описано в разделе Примеры.

Хотя ADAM, ADAMTS и MMP имеют общий для них сайт связывания с Аггреканом, который является очень похожим как по последовательности, так и по общей форме, например, каталитические домены ADAMTS4 и ADAMTS5 имеют высокую степень сходства последовательностей, авторы настоящего изобретения смогли идентифицировать ISVD, которые были мишень–специфическими, как продемонстрировано в примерах. Специфичность в отношении мишени также могла бы помочь избежать или по меньшей мере ограничить мышечно–скелетный синдром, который является побочным эффектом, вызываемым ингибиторами широкого спектра действия.

В одном аспекте изобретение относится к ADAMTS5 связывающему агенту, такому как ISVD и полипептид по изобретению, где указанный ADAMTS5 связывающий агент не связывается с ADAMTS4, ADAMTS1, ADAMTS15, MMP1 и/или MMP14 (мембранного типа). Предпочтительно, настоящее изобретение относится к полипептиду, определенному в настоящей заявке, где указанный ISVD, связывающийся с ADAMTS5, не связывается с ADAMTS4, MMP1 или MMP14.

В одном аспекте изобретение относится к MMP13 связывающему агенту, такому как ISVD и полипептид по изобретению, где указанный MMP13 связывающий агент не связывается с MMP1 и/или MMP14 (мембранного типа). Предпочтительно, настоящее изобретение относится к полипептиду, определенному в настоящей заявке, где указанный ISVD, связывающийся с MMP13, не связывается с MMP1 или MMP14.

Если не указано иное, термины “иммуноглобулин” и “последовательность иммуноглобулина” – независимо от того, используются ли они в настоящей заявке как относящиеся к антителу только с тяжелыми цепями или к традиционному 4–цепочечному антителу – используются как общие термины, включающие как полноразмерное антитело, так и его отдельные цепи, а также все их части, домены или фрагменты (включая, но не ограничиваясь этим, антиген–связывающие домены или фрагменты, такие как V_HH домены или V_H/V_L домены, соответственно).

Термин “домен” (полипептида или белка) в контексте настоящей заявки относится к свернутой белковой структуре, которая обладает способностью сохранять свою третичную структуру независимо от остальной части белка. Как правило, домены ответственны за определенные функциональные свойства белков, и во многих случаях могут быть добавлены, удалены или перенесены в другие белки без потери функции остальной части белка и/или домена.

Термин “домен иммуноглобулина” в контексте настоящей заявки относится к глобулярной области цепи антитела (такой как например, цепь традиционного 4–цепочечного антитела или антитела только с тяжелыми цепями) или к полипептиду, который по существу состоит из такой глобулярной области. Домены иммуноглобулинов характеризуются тем, что они сохраняют характерную для иммуноглобулинов укладку молекул антител, которая состоит из двухслойного сэндвича из примерно семи антипараллельных бета–цепей, расположенных в виде двух бета–листов, необязательно стабилизированных консервативной дисульфидной связью.

Термин “вариабельный домен иммуноглобулина” в контексте настоящей заявки означает домен иммуноглобулина по существу состоящий из четырех “каркасных областей”, которые указываются в данной области техники и ниже в настоящей заявке как “каркасная область 1” или “FR1”; как “каркасная область 2” или “FR2”; как“каркасная область 3” или “FR3”; и как “каркасная область 4” или “FR4”, соответственно; при этом указанные каркасные области прерываются тремя “определяющими комплементарность областями” или “CDR”, которые указываются в данной области техники и ниже в настоящей заявке как “определяющая комплементарность область 1” или “CDR1”; как “определяющая комплементарность область 2” или “CDR2”; и как “определяющая комплементарность область 3” или “CDR3”, соответственно. Таким образом, общая структура или последовательность вариабельного домена иммуноглобулина может быть указана следующим образом: FR1 – CDR1 – FR2 – CDR2 – FR3 – CDR3 – FR4. Это вариабельный домен(домены) иммуноглобулина, который сообщает антителу специфичность к антигену, поскольку содержит антиген–связывающий сайт.

Термин “одиночный вариабельный домен иммуноглобулина” (сокращенно указан как "ISVD" или "ISV"), и взаимозаменяемо используемый с “одиночным вариабельным доменом”, означает молекулы, где сайт связывания антигена присутствует на, и образован им, одиночном домене иммуноглобулина. Это отличает одиночные вариабельные домены иммуноглобулинов от “традиционных” иммуноглобулинов или их фрагментов, где два домена иммуноглобулина, в частности два вариабельных домена, взаимодействуют с образованием сайта связывания антигена. Типично, в традиционных иммуноглобулинах вариабельный домен тяжелой цепи (V_H) и вариабельный домен легкой цепи (V_L) взаимодействуют с образованием сайта связывания антигена. В последнем случае определяющие комплементарность области (CDR) обоих V_H и V_L будут вносить свой вклад в сайт связывания антигена, т.е. в общей сложности 6 CDR будут вовлечены в образование сайта связывания антигена.

В соответствии с представленным выше определением, антиген–связывающий домен традиционного 4–цепочечного антитела (такого как молекула IgG, IgM, IgA, IgD или IgE; известного из уровня техники) или Fab фрагмента, F(ab')2 фрагмента, Fv фрагмента, такого как дисульфид–связанный Fv или scFv фрагмент, или диатела (все известны из уровня техники), происходящего из такого традиционного 4–цепочечного антитела, обычно не будет считаться одиночным вариабельным доменом иммуноглобулина, поскольку, в этих случаях, связывание с соответствующим эпитопом антигена обычно происходит не посредством одного (одиночного) домена иммуноглобулина, а пары (ассоциирующихся) доменов иммуноглобулина, таких как вариабельные домены легкой и тяжелой цепи, т.е. посредством V_H–V_L пары доменов иммуноглобулина, которые совместно связываются с эпитопом соответствующего антигена.

В отличие от этого, ISVD способны специфически связываться с эпитопом антигена без спаривания с дополнительным вариабельным доменом иммуноглобулина. Сайт связывания ISVD образован одиночным V_HH, V_H или V_Lдоменом. Следовательно, антиген–связывающий сайт ISVD образован не больше чем тремя CDR.

Таким образом, одиночный вариабельный домен может представлять собой последовательность вариабельного домена легкой цепи (например, V_L–последовательность) или ее подходящий фрагмент; или последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (например, V_H–последовательность или V_HH последовательность) или ее подходящий фрагмент; при условии, что она способна образовывать отдельную антигенсвязывающую единицу (т.е. функциональную антигенсвязывающую единицу, которая по существу состоит из одиночного вариабельного домена, таким образом, чтобы одиночный антигенсвязывающий домен не нуждался во взаимодействии с другим вариабельным доменом для образования функциональной антигенсвязывающей единицы).

В одном варианте осуществления изобретения ISVD представляют собой последовательности вариабельных доменов тяжелых цепей (например, V_H–последовательность); более конкретно, ISVD могут представлять собой последовательности вариабельных доменов тяжелых цепей, которые происходят из традиционного четырехцепочечного антитела, или последовательности вариабельных доменов тяжелых цепей, которые происходят из антитела только с тяжелыми цепями.

Например, ISVD может представлять собой (одно)–доменное антитело (или аминокислоту, которая является подходящей для использования в качестве (одно)–доменного антитела), "dAb" или sdAb (или аминокислоту, которая является подходящей для использования в качестве dAb) или Нанотело (определенное в настоящей заявке и включающее, но не ограничивающееся этим, VHH); другие одиночные вариабельные домены, или любой подходящий фрагмент любого из вышеуказанных.

В частности, ISVD может представлять собой Нанотело® (как определено в настоящей заявке) или его подходящий фрагмент. [Примечание: Нанотело®, Нанотела® и Nanoclone® являются зарегистрированными торговыми марками Ablynx N.V.]. Что касается общего описания нанотел, ссылка делается на представленное ниже дальнейшее описание, а также на предшествующий уровень техники, цитируемый в настоящей заявке, например, WO 08/020079 (стр. 16).

“V_HH домены”, также известные как VHH, V_HH домены, фрагменты VHH антител и VHH антитела, первоначально были описаны как антигенсвязывающий (вариабельный) домен иммуноглобулина “антитела с только тяжелыми цепями” (т.е. “антитела, лишенного легких цепей”; Hamers–Casterman et al. 1993 Nature 363: 446–448). Термин “V_HH домен” выбран, чтобы можно было отличить эти вариабельные домены от вариабельных доменов тяжелых цепей, которые присутствуют в традиционных 4–цепочечных антителах (которые указаны в настоящей заявке как “V_H домены” или “VH домены”), и от вариабельных доменов легких цепей, которые присутствуют в традиционных 4–цепочечных антителах (которые указаны в настоящей заявке как “V_L домены” или “VL домены”). Более подробное описание VHH и Нанотел можно найти в обзорной статье Muyldermans (Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277–302, 2001), а также в следующих патентных заявках, которые указаны как известный уровень техники: WO 94/04678, WO 95/04079 и WO 96/34103 Vrije Universiteit Brussel; WO 94/25591, WO 99/37681, WO 00/40968, WO 00/43507, WO 00/65057, WO 01/40310, WO 01/44301, EP 1134231 и WO 02/48193 Unilever; WO 97/49805, WO 01/21817, WO 03/035694, WO 03/054016 и WO 03/055527 Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB); WO 03/050531 Algonomics N.V. и Ablynx N.V.; WO 01/90190 National Research Council of Canada; WO 03/025020 (= EP 1433793) Institute of Antibodies, а также WO 04/041867, WO 04/041862, WO 04/041865, WO 04/041863, WO 04/062551, WO 05/044858, WO 06/40153, WO 06/079372, WO 06/122786, WO 06/122787 и WO 06/122825 Ablynx N.V. и другие опубликованные патентные заявки Ablynx N.V. Также можно сослаться на другие документы предшествующего уровня техники, указанные в этих заявках, и, в частности, на перечень ссылочных документов на стр. 41–43 международной заявки WO 06/040153, при этом этот перечень и ссылочные документы включены в настоящую заявку посредством ссылки. Как описано в этих ссылочных документах, Нанотела (в частности, VHH последовательности и частично гуманизированные Нанотела) могут, в частности, характеризоваться присутствием одного или более “Уникальных остатков” в одной или более каркасных последовательностях. Более подробное описание Нанотел, включая гуманизацию и/или камелизацию нанотел, а также другие модификации, части или фрагменты, производные или “слияния Нанотел”, мультивалентные конструкции (включая некоторые неограничивающие примеры линкерных последовательностей) и различные модификации для увеличения периода полужизни Нанотел и их препаратов можно найти, например, в WO 08/101985 и WO 08/142164. Также общее описание Нанотел можно найти в предшествующем уровне техники, цитируемом в настоящей заявке, например, описанном в WO 08/020079 (стр. 16).

В частности, каркасные последовательности, присутствующие в связывающих Аггрекан, ADAMTS5 и/или MMP13 агентах по изобретению, таких как ISVD и/или полипептиды по изобретению, могут содержать один или более уникальных остатков (например, как описано в WO 08/020079 (Таблицы A–3 – A–8)), таким образом связывающий аггрекан, ADAMTS5 и/или MMP13 агент по изобретению представляет собой Нанотело. Некоторые предпочтительные, но не ограничивающие примеры (подходящих комбинаций) таких каркасных последовательностей будут понятны из дальнейшего раскрытия, представленного в настоящей заявке (см., например, Таблицу A–2). Как правило, Нанотела (в частности V_HH последовательности и частично гуманизированные Нанотела) могут, в частности, характеризоваться присутствием одного или более “Уникальных остатков” в одной или более каркасных последовательностях (как, например, более подробно описано в WO 08/020079, стр. 61 строка 24 – стр. 98 строка 3). Как используется в настоящей заявке, термин “представленный” в контексте какой–либо SEQ ID NO, эквивалентен “включает или состоит из” указанной SEQ ID NO, и предпочтительно эквивалентен “состоит из” указанной SEQ ID NO.

Более конктерно, изобретение обеспечивает Аггрекан, ADAMTS5 и/или MMP13 связывающие агенты, включающие по меньшей мере один одиночный вариабельный домен иммуноглобулина, который представляет собой аминокислотную последовательность с (общей) структурой:

FR1 – CDR1 – FR2 – CDR2 – FR3 – CDR3 – FR4

в которой FR1 – FR4 относятся к каркасным областям 1–4, соответственно, и в которой CDR1 – CDR3 относятся к определяющим комплементарность областям 1–3, соответственно, и которые:

i) имеют по меньшей мере 80%, более предпочтительно 90%, еще более предпочтительно 95% идентичности аминокислот с по меньшей мере одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2, 3 или 4 (см. Таблицу A–1), где в целях определения степени идентичности аминокислот аминокислотные остатки, которые образуют последовательности CDR, не учитываются. В этой связи, ссылка также делается на Таблицу A–2, в которой перечислены каркасные последовательности 1 (SEQ ID NO: 7), каркасные последовательности 2 (SEQ ID NO: 9, 15 и 20), каркасные последовательности 3 (SEQ ID NO: 11, 17 и 22) и каркасные последовательности 4 (SEQ ID NO: 13) одиночных вариабельных доменов иммуноглобулинов SEQ ID NO: 2, 3 и 4; или

ii) комбинации каркасных последовательностей, которые представлены в таблице A–2;

и в которых:

iii) предпочтительно один или более аминокислотных остатков в положениях 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 и 108 в соответствии с нумерацией Kabat выбраны из Уникальных остатков, например таких, которые указаны в Таблице A–3 –Таблице A–8 WO 08/020079.

Связывающие Аггрекан, ADAMTS5 и/или MMP13 агенты по изобретению, такие как ISVD и/или полипептиды по изобретению, также могут содержать специфические мутации/аминокислотные остатки, описанные в следующих находящихся на одновременном рассмотрении предварительных заявках США, которые все озаглавлены “Improved immunoglobulin variable domains”: US 61/994552 подана 16 мая 2014 г.; US 61/014015 подана 18 июня 2014 г.; US 62/040167 подана 21 августа 2014 г.; и US 62/047560 подана 8 сентября 2014 г. (все принадлежат Ablynx N.V.).

В частности, Аггрекан, ADAMTS5 и/или MMP13 связывающие агенты по изобретению, такие как ISVD и/или полипептиды по изобретению, могут соответственно содержать (i) K или Q в положении 112; или (ii) K или Q в положении 110 в комбинации с V в положении 11; или (iii) T в положении 89; или (iv) L в положении 89 с K или Q в положении 110; или (v) V в положении 11 и L в положении 89; или любую подходящую комбинацию (i) – (v).

Как также описано в указанных находящихся на одновременном рассмотрении предварительных заявках США, когда Аггрекан, ADAMTS5 и/или MMP13 связывающие агенты по изобретению, такие как ISVD и/или полипептиды по изобретению, содержат мутации в соответствии с одним из указанных выше (i) – (v) (или их подходящую комбинацию):

– аминокислотный остаток в положении 11 предпочтительно выбран из L, V или K (и наиболее предпочтительно представляет собой V); и/или

– аминокислотный остаток в положении 14 предпочтительно соответственно выбран из A или P; и/или

– аминокислотный остаток в положении 41 предпочтительно соответственно выбран из A или P; и/или

– аминокислотный остаток в положении 89 предпочтительно соответственно выбран из T, V или L; и/или

– аминокислотный остаток в положении 108 предпочтительно соответственно выбран из Q или L; и/или

– аминокислотный остаток в положении 110 предпочтительно соответственно выбран из T, K или Q; и/или

– аминокислотный остаток в положении 112 предпочтительно соответственно выбран из S, K или Q.

Как описано в указанных находящихся на одновременном рассмотрении предварительных заявках США, указанные мутации эффективны для предотвращения или уменьшения связывания так называемых “предсуществующих антител” с иммуноглобулинами и соединениями по изобретению. Для этой цели связывающие Аггрекан, ADAMTS5 и/или MMP13 агенты по изобретению, такие как ISVD и/или полипептиды по изобретению, также могут содержать (необязательно в комбинации с указанными мутациями) C–концевое удлинение (X)n (где n имеет значение от 1 до 10, предпочтительно от 1 до 5, такое как 1, 2, 3, 4 или 5 (и предпочтительно 1 или 2, такое как 1); и каждый X представляет собой (предпочтительно природный) аминокислотный остаток, который независимо выбран, и предпочтительно независимо выбран из группы, состоящей из аланина (A), глицина (G), валина (V), лейцина (L) или изолейцина (I)), см., например, предварительные заявки США, а также WO 12/175741. В частности, связывающий Аггрекан, ADAMTS5 и/или MMP13 агент по изобретению, такой как ISVD и/или полипептид по изобретению, может содержать такое C–концевое удлинение, когда он образует C–концевую область белка, полипептида или другого соединения, или включающей их конструкции (см. например, указанные предварительные заявки США, а также WO 12/175741).

Связывающий Аггрекан, ADAMTS5 и/или MMP13 агент по изобретению может представлять собой иммуноглобулин, такой как одиночный вариабельный домен иммуноглобулина, полученный любым подходящим способом и из любого подходящего источника, и может, например, представлять собой природные V_HH последовательности (т.е. из подходящего вида верблюдовых) или синтетические или полусинтетические аминокислотные последовательности, включая, но не ограничиваясь этим, “гуманизированные” (как определено в настоящей заявке) Нанотела или VHH последовательности, “камелизированные” (как определено в настоящей заявке) последовательности иммуноглобулинов (и, в частности, камелизированные последовательности вариабельных доменов тяжелых цепей), а также Нанотела, которые получены методами, такими как созревание аффинности (например, исходя из синтетических, рандомизированных или природных последовательностей иммуноглобулинов), CDR–прививка, маскировка поверхностных остатков, объединение фрагментов, происходящих из различных последовательностей иммуноглобулинов, ПЦР–сборка с использованием перекрывающихся праймеров и подобные методы для конструирования последовательностей иммуноглобулинов, хорошо известные квалифицированным специалистам; или с использованием любой подходящей комбинации любых из вышеуказанных, как описано далее в настоящей заявке. Также, когда иммуноглобулин включает V_HH последовательность, указанный иммуноглобулин может быть соответствующим образом гуманизирован, как описано далее в настоящей заявке, для обеспечения одного или более дополнительных (частично или полностью) гуманизированных иммуноглобулинов по изобретению. Подобным образом, когда иммуноглобулин включает синтетическую или полусинтетическую последовательность (такую как частично гуманизированная последовательность), указанный иммуноглобулин необязательно может быть дополнительно соответствующим образом гуманизирован, также как описано в настоящей заявке, также для обеспечения одного или более дополнительных (частично или полностью) гуманизированных иммуноглобулинов по изобретению.

“Доменные антитела”, также известные как “Dab”, “Доменные Антитела” и “dAb” (термины “Доменные Антитела” и “dAb” используются как торговые марки группой компаний GlaxoSmithKline) описаны, например, в EP 0368684, Ward et al. (Nature 341: 544–546, 1989), Holt et al. (Tends in Biotechnology 21: 484–490, 2003) и WO 03/002609, а также, например, в WO 04/068820, WO 06/030220, WO 06/003388 и других опубликованных патентных заявках Domantis Ltd. Доменные антитела по существу соответствуют VH или VL доменам не–верблюдовых млекопитающих, в частности человеческим 4–цепочечным антителам. Для связывания с эпитопом в качестве одиночного антиген–связывающего домена, т.е. без спаривания с V_L или V_H доменом, соответственно, необходим специфический отбор на основании таких антиген–связывающих свойств, например, с использованием библиотек последовательностей человеческих одиночных V_H или V_L доменов. Доменные антитела имеют, подобно V_HHs, молекулярную массу от приблизительно 13 до приблизительно 16 кДа и, если они образованы из полностью человеческих последовательностей, не требуют гуманизации, например, для терапевтического применения для человека.

Также следует отметить, что, хотя и менее предпочтительно в контексте настоящего изобретения, поскольку они происходят не из млекопитающих, одиночные вариабельные домены могут происходить из некоторых видов акул (например, так называемые “IgNAR домены”, см., например, WO 05/18629).

Настоящее изобретение относится, в частности, к ISVD, где указанные ISVD выбраны из группы, состоящей из VHH, гуманизированных VHH и камелизированных VHs.

Аминокислотные остатки VHH домена пронумерованы в соответствии с общей нумерацией для V_H доменов в соответствии с Kabat et al. ("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91), применимой к VHH доменам из верблюдовых, как показано например, на Фиг. 2 в Riechmann and Muyldermans (J. Immunol. Methods 231: 25–38, 1999), как все это известно из уровня техники. Альтернативные способы нумерации аминокислотных остатков V_H доменов, которые также можно применять аналогичным образом к VHH доменам, известны из уровня техники. Однако в настоящем описании, формуле изобретения и чертежах следуют нумерации в соответствии с Kabat, применяемой к VHH доменам, как описано выше, если не указано иное.

Следует отметить, что – как это хорошо известно из уровня техники для V_H доменов и для VHH доменов – общее число аминокислотных остатков в каждой из CDR может варьироваться и может не соответствовать общему количеству аминокислотных остатков, указанному нумерацией по Kabat (т.е. в действительной последовательности одно или более положений в соответствии с нумерацией по Kabat могут быть незанятыми, или действительная последовательность может содержать больше аминокислотных остатков, чем количество, которое является возможным согласно нумерации по Kabat). Это означает, что, как правило, нумерация в соответствии с Kabat может соответствовать или не соответствовать действительной нумерации аминокислотных остатков в действительной последовательности. Общее число аминокислотных остатков в VH домене и VHH домене обычно должно быть в пределах от 110 до 120, часто от 112 до 115. Однако следует отметить, что более короткие и более длинные последовательности также могут быть подходящими для целей, описанных в настоящей заявке.

Что касается CDRs, как хорошо известно из уровня техники, существует множество общепринятых способов для определения и описания CDRs VH или VHH фрагмента, таких как определение по Kabat (которое основано на вариабельности последовательностей и наиболее широко используется) и определение по Chothia (которое основано на локализации структурных петлевых областей). См., например, веб–сайт http://www.bioinf.org.uk/abs/. Для целей настоящего описания и формулы изобретения CDR наиболее предпочтительно определяют на основании Abm определения (которое основано на программе моделирования антител “AbM” Oxford Molecular), поскольку это считается оптимальным компромиссом между определениями Kabat и Chothia (см. http://www.bioinf.org.uk/abs/). В контексте настоящей заявки, FR1 включает аминокислотные остатки в положениях 1–25, CDR1 включает аминокислотные остатки в положениях 26–35, FR2 включает аминокислоты в положениях 36–49, CDR2 включает аминокислотные остатки в положениях 50–58, FR3 включает аминокислотные остатки в положениях 59–94, CDR3 включает аминокислотные остатки в положениях 95–102, и FR4 включает аминокислотные остатки в положениях 103–113.

В контексте настоящего изобретения термин “одиночный вариабельный домен иммуноглобулина” или “одиночный вариабельный домен” включает полипептиды, которые происходят из не–человеческого источника, предпочтительно из верблюдовых, предпочтительно из антитела верблюдовых только с тяжелыми цепями. Они могут быть гуманизированными, как описано в настоящей заявке. Кроме того, термин включает полипептиды, происходящие из не–верблюдовых источников, например, мыши или человека, которые были “камелизированы”, как описано в настоящей заявке.

Следовательно, ISVD, такие как Доменные антитела и Нанотела (включая VHH домены) можно подвергнуть гуманизации. В частности, гуманизированные ISVD, такие как Нанотела (включая VHH домены), могут представлять собой ISVD, которые в общем виде определены в настоящей заявке, но в которых присутствует по меньшей мере один аминокислотный остаток (и, в частности, по меньшей мере в одном из каркасных остатков), который является и/или который соответствует гуманизирующей замене (как определено в настоящей заявке). Потенциально полезные гуманизирующие замены можно определить путем сравнения последовательности каркасных областей природной V_HH последовательности с соответствующей каркасной последовательностью одной или более близкородственных человеческих V_H последовательностей, после чего одну или более потенциально полезных гуманизирующих замен (или их комбинации), определенных таким образом, можно ввести в указанную V_HH последовательность (любым способом, известным per se, как описано далее в настоящей заявке) и полученные гуманизированные V_HH последовательности можно испытать на аффинность в отношении мишени, на стабильность, на легкость и уровень экспрессии и/или на другие желаемые свойства. Таким путем, при ограниченной степени проб и ошибок, специалист в данной области сможет определить другие подходящие гуманизирующие замены (или их подходящие комбинации) на основании раскрытия, представленного в настоящей заявке. Также, на основании вышеизложенного, (каркасные области) ISVD, такого как Нанотело (включая VHH домены), могут быть частично гуманизированными или полностью гуманизированными.

Другой особенно предпочтительный класс ISVD по изобретению включает ISVDs с аминокислотной последовательностью, которая соответствует аминокислотной последовательности природного V_H домена, но которая была “камелизированна”, т.е. путем замены одного или более аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности природного V_H домена из традиционного 4–цепочечного антитела одним или более аминокислотными остатками, которые присутствуют в соответствующем положении(положениях) в V_HH домене антитела только с тяжелыми цепями. Это можно осуществить способом, известным per se, что должно быть понятно квалифицированному специалисту, например, на основании описания, представленного в настоящей заявке. Такие “камелизирующие” замены предпочтительно вводятся в аминокислотных положениях, которые образуют и/или присутствуют на границе раздела V_H–V_L, и/или в положениях так называемых происходящих из Верблюдовых уникальных остатков, как определено в настоящей заявке (см. также например WO 94/04678 и Davies and Riechmann (1994 и 1996)). Предпочтительно, V_H последовательность, которую используют в качестве исходного материала или исходной точки для образования или конструирования камелизированных одиночных вариабельных доменов иммуноглобулинов, предпочтительно представляет собой V_H последовательность из млекопитающего, более предпочтительно V_H последовательность человека, такую как V_H3 последовательность. Однако следует отметить, что такие камелизированные одиночные вариабельные домены иммуноглобулинов по изобретению можно получить любым подходящим способом, известным per se, и, таким образом, они строго не ограничиваются полипептидами, которые получены с использованием полипептида, который включает природный V_H домен, в качестве исходного материала. См. Davies and Riechmann (FEBS 339: 285–290, 1994; Biotechnol. 13: 475–479, 1995; Prot. Eng. 9: 531–537, 1996) и Riechmann and Muyldermans (J. Immunol. Methods 231: 25–38, 1999)

Например, опять же как описано далее в настоящей заявке, как “гуманизацию”, так и “камелизацию” можно осуществить путем обеспечения нуклеотидной последовательности, которая кодирует природный V_HH домен или V_H домен, соответственно, и затем замены способом, известным per se, одного или более кодонов в указанной нуклеотидной последовательности таким образом, чтобы новая нуклеотидная последовательность кодировала “гуманизированный” или “камелизированный” ISVD по изобретению, соответственно. Эту нуклеиновую кислоту затем можно экспрессировать способом, известным per se, чтобы обеспечить желаемые ISVD по изобретению. Альтернативно, на основании аминокислотной последовательности природного V_HH домена или V_H домена, соответственно, аминокислотную последовательность желаемых гуманизированных или камелизированных ISVD по изобретению, соответственно, можно сконструировать и затем синтезировать de novo с использованием методов пептидного синтеза, известных per se. Также, на основании аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности природного V_HH домена или V_H домена, соответственно, нуклеотидную последовательность, кодирующую желаемые гуманизированные или камелизированные ISVD по изобретению, соответственно, можно сконструировать и затем синтезировать de novo с использованием методов синтеза нуклеиновых кислот, известных per se, после чего полученную таким образом нуклеиновую кислоту можно экспрессировать способом, известным per se, чтобы обеспечить желаемые ISVD по изобретению.

ISVD, такие как Доменные антитела и Нанотела (включая VHH домены и гуманизированные VHH домены), также можно подвергнуть созреванию аффинности путем внесения одного или более изменений в аминокислотную последовательность одной или более CDR, где такие изменения приводят к улучшенной аффинности полученного ISVD в отношении его соответствующего антигена, по сравнению с соответствующей исходной молекулой. Молекулы ISVD с созревшей аффинностью по изобретению можно получить способами, известными из уровня техники, например, как описано by Marks et al. (Biotechnology 10:779–783, 1992), Barbas, et al. (Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809–3813, 1994), Shier et al. (Gene 169: 147–155, 1995), Yelton et al. (Immunol. 155: 1994–2004, 1995), Jackson et al. (J. Immunol. 154: 3310–9, 1995), Hawkins et al. (J. Mol. Biol. 226: 889 896, 1992), Johnson and Hawkins (Affinity maturation of antibodies using phage display, Oxford University Press, 1996).

Способ конструирования/выбора и/или получения полипептида, исходя из ISVD, такого как V_H, V_L, V_HH, Доменное антитело или Нанотело, также указан в настоящей заявке как “задание формата” указанного ISVD; и ISVD, который является частью полипептида, указан как “с заданным форматом” или находящийся “в формате” указанного полипептида. Примеры способов, которыми можно задать формат ISVD, и примеры таких форматов будут понятны квалифицированным специалистам на основании раскрытия, представленного в настоящей заявке; и такой одиночный вариабельный домен иммуноглобулина в заданном формате составляет еще один аспект изобретения.

Предпочтительные CDR представлены в Таблице A–2.

В частности, настоящее изобретение относится к полипептиду, описанному в настоящей заявке, где указанный ISVD, специфически связывающийся с MMP13, по существу состоит из 4 каркасных областей (FR1–FR4, соответственно) и 3 определяющих комплементарность областей (CDR1–CDR3, соответственно), в котором

(i) CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 8; и аминокислотные последовательности, которые имеют 1, 2 или 3 аминокислотных отличия от SEQ ID NO: 8;

(ii) CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 10; и аминокислотные последовательности, которые имеют 1, 2 или 3 аминокислотных отличия от SEQ ID NO: 10; и

(iii) CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 12; и аминокислотные последовательности, которые имеют 1, 2 или 3 аминокислотных отличия от SEQ ID NO: 12.

В частности, настоящее изобретение относится к полипептиду, описанному в настоящей заявке, где указанный ISVD, специфически связывающийся с MMP13, по существу состоит из 4 каркасных областей (FR1–FR4, соответственно) и 3 определяющих комплементарность областей (CDR1–CDR3, соответственно), в котором CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 8, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 10 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 12.

В частности, настоящее изобретение относится к ISVD, описанному в настоящей заявке, где указанный ISVD, специфически связывающийся с ADAMTS5, по существу состоит из 4 каркасных областей (FR1–FR4, соответственно) и 3 определяющих комплементарность областей (CDR1–CDR3, соответственно), в котором

(i) CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 14 [GRTVSSYAMG]; и аминокислотные последовательности, которые имеют 1, 2 или 3 аминокислотных отличия от SEQ ID NO: 14;

(ii) CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 16 [GISRSAERTY]; и аминокислотные последовательности, которые имеют 1, 2 или 3 аминокислотных отличия от SEQ ID NO: 16; и

(iii) CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 18 [DLDPNRIFSREEYAY]; и аминокислотные последовательности, которые имеют 1, 2 или 3 аминокислотных отличия от SEQ ID NO: 18.

В частности, настоящее изобретение относится к ISVD, описанному в настоящей заявке, где указанный ISVD, специфически связывающийся с ADAMTS5, по существу состоит из 4 каркасных областей (FR1–FR4, соответственно) и 3 определяющих комплементарность областей (CDR1–CDR3, соответственно), в котором CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 14, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 16 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 18.

В частности, настоящее изобретение относится к ISVD, описанному в настоящей заявке, где указанный ISVD, специфически связывающийся с Аггреканом, по существу состоит из 4 каркасных областей (FR1–FR4, соответственно) и 3 определяющих комплементарность областей (CDR1–CDR3, соответственно), в котором

(i) CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 19; и аминокислотные последовательности, которые имеют 1, 2 или 3 аминокислотных отличия от SEQ ID NO: 19;

(ii) CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 21; и аминокислотные последовательности, которые имеют 1, 2 или 3 аминокислотных отличия от SEQ ID NO: 21; и

(iii) CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 23; и аминокислотные последовательности, которые имеют 1, 2 или 3 аминокислотных отличия от SEQ ID NO: 23.

В частности, настоящее изобретение относится к ISVD, описанному в настоящей заявке, где указанный ISVD, специфически связывающийся с Аггреканом, по существу состоит из 4 каркасных областей (FR1–FR4, соответственно) и 3 определяющих комплементарность областей (CDR1–CDR3, соответственно), в котором CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 19, CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 21 и CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 23.

В частности, настоящее изобретение относится к полипептиду, описанному в настоящей заявке, где указанный ISVD, специфически связывающийся с MMP13, представляет собой SEQ ID NO: 2.

В частности, настоящее изобретение относится к полипептиду, описанному в настоящей заявке, где указанный ISVD, специфически связывающийся с ADAMTS5, представляет собой SEQ ID NO: 3.

В частности, настоящее изобретение относится к полипептиду, описанному в настоящей заявке, где указанный ISVD, специфически связывающийся с Аггреканом, представляет собой SEQ ID NO: 4.

Еще в одном предпочтительном варианте осуществления Аггрекан, ADAMTS5 и/или MMP13 связывающий агент по изобретению включает по меньшей мере две CDR1 последовательности, по меньшей мере две CDR2 последовательности и по меньшей мере две CDR3 последовательности, каждая из которых независимо выбрана из следующей таблицы:

CDR1	CDR2	CDR3
SEQ ID NO: 8(CDR1a)	SEQ ID NO: 10(CDR2a)	SEQ ID NO: 12(CDR3a)
SEQ ID NO: 14(CDR1b)	SEQ ID NO: 16(CDR2b)	SEQ ID NO: 18(CDR3b)
SEQ ID NO: 19(CDR1c)	SEQ ID NO: 21(CDR2c)	SEQ ID NO: 23(CDR3c)

В вышеуказанном Аггрекан, ADAMTS5 и/или MMP13 связывающем агенте порядок последовательностей предпочтительно является следующим CDR1a–CDR2a–CDR3a–Линкер–CDR1b–CDR2b–CDR3b, где Линкер представляет собой полипептид, имеющий длину больше чем 5 аминокислот, который является подходящим для связывания первого ряда CDR (CDR1a–CDR2a–CDR3a) со вторым рядом (CDR1b–CDR2b–CDR3b). Предпочтительно, линкер выбран из Таблицы C ниже, и наиболее предпочтительно представляет собой линкер с аминокислотной последовательностью в соответствии с SEQ ID NO: 35. В более предпочтительном варианте осуществления Аггрекан, ADAMTS5 и/или MMP13 связывающий агент включает все девять CDR последовательностей из таблицы, приведенной выше, где CDR последовательности и линкерные полипептиды расположены в следующем порядке: CDR1a–CDR2a–CDR3a–Линкер1–CDR1b–CDR2b–CDR3b–Линкер2–CDR1c–CDR2c–CDR3c, где Линкер1 и Линкер2 каждый представляет собой полипептид из по меньшей мере 5 аминокислот, и где полипептидные последовательности Линкера1 и Линкера2 идентичны друг другу или не идентичны друг другу. Предпочтительно, Линкер1 и Линкер2 каждый независимо друг от друга выбран из Таблицы C ниже, и наиболее предпочтительно, чтобы по меньшей мере один (предпочтительно оба) из линкеров имел/имели аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 35.

Еще в одном предпочтительном варианте осуществления Аггрекан, ADAMTS5 и/или MMP13 связывающий агент по изобретению предпочтительно включает по меньшей мере CDR последовательности, перечисленные в следующей таблице:

SEQ ID NO: 8 (CDR1a)	SEQ ID NO: 10(CDR2a)	SEQ ID NO: 12(CDR3a)
SEQ ID NO: 14(CDR1b)	SEQ ID NO: 16(CDR2b)	SEQ ID NO: 18(CDR3b)
SEQ ID NO: 19(CDR1c)	SEQ ID NO: 21(CDR2c)	SEQ ID NO: 23(CDR3c)
SEQ ID NO: 19(CDR1d)	SEQ ID NO: 21(CDR2d)	SEQ ID NO: 23(CDR3d)

В вышеуказанном варианте осуществления порядок CDR последовательностей может быть следующим CDR1a–CDR2a–CDR3a–Линкер1–CDR1b–CDR2b–CDR3b–Линкер2–CDR1c–CDR2c–CDR3c–Линкер3–CDR1d–CDR2d–CDR3d; где Линкер1, Линкер2 и Линкер3 каждый представляет собой полипептид из по меньшей мере 5 аминокислот, и где полипептидные последовательности Линкера1, Линкера2 и Линкера 3 идентичны друг другу или не идентичны друг другу. Предпочтительно, Линкер1, Линкер2 и Линкер3 выбраны независимо друг от друга из Таблицы C ниже, и наиболее предпочтительно, чтобы по меньшей мере один (предпочтительно все три) из линкеров имел/имели аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 35. Подразумевается, что в предпочтительных вариантах осуществления, представленных в контексте двух таблиц выше, CDR последовательности могут быть связаны друг с другом через каркасные последовательности, как описано в настоящей заявке, и предпочтительно в этой связи можно использовать каркасные последовательности, раскрытые в Таблице A–2.

Должно быть понятно, что, без ограничения, одиночные вариабельные домены иммуноглобулинов по настоящему изобретению можно использовать в качестве "структурного блока" для получения полипептида, который необязательно содержать один или более дополнительных одиночных вариабельных доменов иммуноглобулинов, которые могут служить в качестве структурного блока.

В данной области существует потребность в эффективной терапии расстройств с поражением хряща в суставах, таких как остеоартрит. Даже при введении интраартикулярно, время удерживания большинства лекарственных средств для лечения пораженного хряща является недостаточным. Без привязки этого к конкретной теории, авторы настоящего изобретения предположили, что эффективность терапевтического лекарственного средства, такого как конструкция, полипептид и ISVD по изобретению, можно модулировать путем сочетания терапевтического лекарственного средства с группой, которая могла бы "заякоривать" лекарственное средство в суставе и, следовательно, увеличивать время удерживания лекарственного средства, но которая не должна препятствовать проявлению эффективности указанного терапевтического лекарственного средства (эта группа в настоящей заявке также указана как "заякоривающийся в хряще белок" или "CAP"). Эта концепция заякоривания могла бы модулировать не только эффективность лекарственного средства, но также функциональную специфичность в отношении больного сустава путем уменьшения токсичности и побочных эффектов, расширяя таким образом количество возможных полезных лекарственных средств.

Предполагается, что формат молекулы для клинического использования включает один или два структурных блока, таких как ISVD, связывающие MMP13 и/или ADAMTS5, и один или более структурных блоков, например ISVD, с таким удерживающим способом действия, и возможно другие компоненты. В настоящем изобретении продемонстрировано, что такие форматы поддерживают как связывание MMP13 и/или ADAMTS5, так и терапевтический эффект, например, ингибиторную активность, а также свойства удерживания. Один или более структурных блоков, таких как ISVD, с удерживающим способом действия могут представлять собой любой структурный блок, обладающий удерживающим эффектом ("CAP структурный блок") в заболеваниях, в которые вовлечен MMP13 и/или ADAMTS5, таких как артритное заболевание, остеоартрит, спондилоэпиметафизарная дисплазия, дегенерация поясничного диска, дегенеративное заболевание суставов, ревматоидный артрит, рассекающий остеохондрит, аггреканопатии.

"CAP структурный блок" используется для направления, заякоривания и/или удерживания другого, например, терапевтического средства, структурных блоков, таких как ISVD, связывающиеся с MMP13 и/или ADAMTS5 на желаемом участке, например, в суставе, где указанный другой, например терапевтическое средство, структурный блок, должен проявлять свой эффект, например связывание и/или ингибирование MMP13 и/или ADAMTS5.

Опять же, не желая связывать это с какой–либо теорией, авторы настоящего изобретения также предположили, что Аггрекан– связывающие агенты, такие как ISVD(s), связывающие Аггрекан, потенциально могут функционировать как такой якорь, хотя Аггрекан сильно гликозилируется и разрушается при различных расстройствах, поражающих хрящ в суставах. Кроме того, учитывая высокие затраты и трудоемкие испытания в различных животных моделях, которые необходимы до того, как лекарственное средство может быть одобрено для клинического применения, такие Аггрекан– связывающие агенты предпочтительно должны обладать широкой перекрестной реактивностью, например, Аггрекан–связывающие агенты должны связываться с Аггреканом из различных видов.

С использованием различных оригинальных способов иммунизации, скрининга и характеризации авторы настоящего изобретения смогли идентифицировать различные Аггрекан–связывающие агенты с превосходными свойствами селективности, стабильности и специфичности, которые обеспечивали возможность пролонгированного удерживания и активности в суставе.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу для уменьшения и/или ингибирования оттока композиции, полипептида или конструкции из сустава, где указанный способ включает введение фармацевтически активного количества по меньшей мере одного полипептида в соответствии с изобретением, конструкции в соответствии с изобретением или композиции в соответствии с изобретением субъекту, нуждающемуся в этом.

В настоящем изобретении термин "уменьшение и/или ингибирование оттока" означает уменьшение и/или ингибирование выходящего потока композиции, полипептида или конструкции из сустава наружу. Предпочтительно, отток уменьшается и/или ингибируется по меньшей мере на 10%, например, по меньшей мере на 20%, 30%, 40% или 50% или даже более, например, по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 90% или даже 100%, по сравнению с оттоком вышеуказанной композиции, полипептида или конструкции из сустава в таких же условиях, но без присутствия Аггрекан–связывающего агента по изобретению, например ISVD(s), связывающего Аггрекан.

Наряду с заболеваниями, в которые вовлечен MMP13 и/или ADAMTS5, такими как артритное заболевание, остеоартрит, спондилоэпиметафизарная дисплазия, дегенерация поясничного диска, дегенеративное заболевание суставов, ревматоидный артрит, рассекающий остеохондрит и аггреканопатии, предполагается, что Аггрекан–связывающий агент по изобретению также можно использовать при других различных заболеваниях, поражающих хрящ, таких как артропатии и хондродистрофии, артритное заболевание (такое как остеоартрит, ревматоидный артрит, подагрический артрит, псориатический артрит, травматический разрыв или отслоение), ахондроплазия, реберный хондрит, спондилоэпиметафизарная дисплазия, межпозвоночная грыжа, дегенерация поясничного диска, дегенеративное заболевание суставов и рецидивирующий полихондрит (в общем виде указаны в настоящей заявке как "Аггрекан–ассоциированные заболевания").

Указанный CAP структурный блок, например, ISVD(s), связывающий Аггрекан, предпочтительно связывается с хрящевой тканью, такой как хрящ и/или мениск. В предпочтительном аспекте CAP структурный блок является перекрестно–реагирующим в отношении других видов и специфически связывается с одним или более из Аггрекана человека (SEQ ID NO: 68), Аггрекана собаки, Аггрекана быка, Аггрекана крысы; Аггрекана свиньи; Аггрекана мыши, Аггрекана кролика; Аггрекана яванского макака и/или Аггрекана макака–резус. Соответствующую информацию о структуре Аггрекана можно найти, например, по номерам доступа (UniProt), показанным в Таблице B–3 выше.

Предпочтительный CAP структурный блок представляет собой ISVD, связывающий Аггрекан, предпочтительно Аггрекан человека, предпочтительно представленный SEQ ID NO: 68, как показано в Таблице B.

Настоящее изобретение, таким образом, относится к полипептиду или конструкции в соответствии с изобретением, дополнительно включающему по меньшей мере один CAP структурный блок.

Настоящее изобретение, таким образом, относится к полипептиду или конструкции в соответствии с изобретением, дополнительно включающим по меньшей мере один ISVD, специфически связывающийся с Аггреканом, предпочтительно указанный ISVD представлен SEQ ID NO: 4.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду, описанному в настоящей заявке, включающему по меньшей мере 2 ISVD, специфически связывающихся с Аггреканом.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду, описанному в настоящей заявке, включающему по меньшей мере 2 ISVD, специфически связывающихся с Аггреканом, где указанные по меньшей мере 2 ISVD, специфически связывающиеся с Аггреканом, могут быть одинаковыми или отличными друг от друга.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду, описанному в настоящей заявке, включающему по меньшей мере 2 ISVD, специфически связывающихся с Аггреканом, где каждый из указанных по меньшей мере 2 ISVD, специфически связывающихся с Аггреканом, представлен SEQ ID NO: 4.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду, описанному в настоящей заявке, включающему ISVD, специфически связывающийся с Аггреканом, где указанный ISVD, специфически связывающийся с Аггреканом, специфически связывается с Аггреканом человека [SEQ ID NO: 68].

В одном аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду, описанному в настоящей заявке, где указанный ISVD, специфически связывающийся с Аггреканом, специфически связывается с Аггреканом человека (SEQ ID NO: 68), Аггреканом собаки, Аггреканом быка, Аггреканом крысы, Аггреканом свиньи, Аггреканом мыши, Аггреканом кролика, Аггреканом яванского макака и/или Аггрекан макака–резус.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду, описанному в настоящей заявке, где указанный ISVD, специфически связывающийся с Аггреканом, предпочтительно связывается с хрящевой тканью, такой как хрящ и/или мениск.

Должно быть понятно, что ISVD, полипептид и конструкция по изобретению предпочтительно являются стабильными. Стабильность полипептида, конструкции или ISVD по изобретению можно измерить при помощи обычных анализов, известных специалистам в данной области. Типичные анализы включают (без ограничения) анализы, в которых определяют активность указанного полипептида, конструкции или ISVD, с последующей инкубацией в синовиальной жидкости в течение желаемого периода времени, после чего снова определяют активность.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к ISVD, полипептиду или конструкции по изобретению со стабильностью в течение по меньшей мере 7 дней, например по меньшей мере в течение 14 дней, 21 дня, 1 месяца, 2 месяцев или даже 3 месяцев в синовиальной жидкости (SF) при 37°C.

Желаемую активность терапевтического структурного блока, например ISVD, связывающего MMP13 и/или ADAMTS5 в мультивалентном полипептиде или конструкции по изобретению можно измерить при помощи обычных анализов, известных специалистам в данной области. Типичные анализы включают (без ограничения) анализы высвобождения GAG, подробно описанные в разделе Примеры.

Полипептид по изобретению (также указанный в настоящей заявке как "конструкция Нанотела") выбран из группы, состоящей из

(a) полипептидов, включающих по меньшей мере 2 одиночных вариабельных домена иммуноглобулина (ISVD), включающих первый ISVD, специфически связывающийся с Аггреканом, и второй ISVD, специфически связывающийся с матриксной металлопротеиназой (MMP);

(b) полипептидов, включающих по меньшей мере 2 ISVD, включающих первый ISVD, специфически связывающийся с Аггреканом, и второй ISVD, специфически связывающийся с А дезинтегрином и металлопротеиназой с мотивами тромбоспондина (ADAMTS); и

(c) полипептидов, включающих по меньшей мере 3 ISVD, включающих первый ISVD, специфически связывающийся с Аггреканом, второй ISVD, специфически связывающийся с ADAMTS, и третий ISVD, специфически связывающийся с MMP.

В полипептиде по изобретению ISVD могут быть непосредственно связаны или связаны через линкер. Еще более предпочтительно, полипептид по изобретению включает C–концевое удлинение. Как будет подробно описано ниже, C–концевое удлинение по существу предотвращает/удаляет связывание предсуществующих антител/факторов в большинстве образцов от субъектов–людей/пациентов. C–концевое удлинение присутствует C–терминально от последнего аминокислотного остатка (обычно серинового остатка) последнего (наиболее C–терминально расположенного) ISVD.

Как более подробно описано ниже, ISVD могут происходить из V_HH, V_H или V_L домена, однако, ISVD выбирают таким образом, чтобы они не образовывали комплементарных пар из V_H и V_L доменов в полипептидах по изобретению. Нанотело, V_HH и гуманизированный V_HH необычны тем, что они происходят из природных верблюдовых антител, которые не содержат легких цепей, и действительно эти домены неспособны к ассоциации с легкими цепями верблюдовых с образованием комплементарных V_HH и V_L пар. Таким образом, полипептиды по настоящему изобретению не включают комплементарные ISVD и/или не образуют комплементарных ISVD пар, таких как, например, комплементарные V_H/V_L пары.

Как правило, полипептиды или конструкции, которые включают или по существу состоят из одного структурного блока, одного ISVD или одного Нанотела, будут указаны как “одновалентные” полипептиды и “одновалентные конструкции”, соответственно. Полипептиды или конструкции, которые включают два или более структурных блоков (таких как, например, ISVD), также будут указаны как “мультивалентные” полипептиды или конструкции, и структурные блоки/ISVD, присутствующие в таких полипептидах или конструкциях, также будут далее указаны как находящиеся в “мультивалентном формате”. Например, “двухвалентный” полипептид может включать два ISVD, необязательно связанных через линкерную последовательность, тогда как “трехвалентный” полипептид может включать три ISVD, необязательно связанные через две линкерные последовательности; тогда как “четырехвалентный” полипептид может включать четыре ISVD, необязательно связанные через три линкерные последовательности, и т.д.

В мультивалентном полипептиде два или более ISVD могут быть одинаковыми или отличными друг от друга и могут быть направлены против одного и того же антигена или антигенной детерминанты (например против одной и той же части(частей) или эпитопа(эпитопов) или против разных частей или эпитопов) или, альтернативно, могут быть направлены против разных антигенов или антигенных детерминант; или могут включать любую подходящую комбинацию вышеуказанного, например, направлены против Аггрекана. Полипептиды и конструкции, которые содержат по меньшей мере два структурных блока (таких как, например, ISVD), в которых по меньшей мере один структурный блок направлен против первого антигена (например, Аггрекана) и по меньшей мере один структурный блок направлен против второго антигена (т.е. отличного от Аггрекана, например, направлен против ADAMTS5), также будут указаны как “мультиспецифические” полипептиды и конструкции, и структурные блоки (такие как, например, ISVD), присутствующие в таких полипептидах и конструкциях, также будут указаны далее как находящиеся в “мультиспецифическом формате”. Таким образом, например, “биспецифический” полипептид по изобретению представляет собой полипептид, который включает по меньшей мере один ISVD, направленный против первого антигена (например, Аггрекана), и по меньшей мере еще один ISVD, направленный против второго антигена (т.е. отличного от Аггрекана, например, направленный против ADAMTS5), тогда как “триспецифический” полипептид по изобретению представляет собой полипептид, который включает по меньшей мере один ISVD, направленный против первого антигена (например, Аггрекана), по меньшей мере еще один ISVD, направленный против второго антигена (т.е. отличного от Аггрекана, например, направленный против ADAMTS5), и по меньшей мере еще один ISVD, направленный против третьего антигена (т.е. отличного и от Аггрекан и от ADAMTS5, например, направленный против MMP); и т.д.

В одном аспекте, настоящее изобретение относится к полипептиду, включающему по меньшей мере 2 ISVD, где по меньшей мере один ISVD специфически связывается с MMP, предпочтительно MMP13, более предпочтительно указанный один ISVD представлен аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду, включающему по меньшей мере 2 ISVD, где по меньшей мере один ISVD специфически связывается с ADAMTS, предпочтительно ADAMTS5, более предпочтительно указанный один ISVD представлен аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду, включающему по меньшей мере 2 ISVD, где по меньшей мере один ISVD специфически связывается с Аггреканом, более предпочтительно указанный один ISVD представлен аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4.

"Мультипаратопные" полипептиды и "мультипаратопные" конструкции, такие как, например, "бипаратопные" полипептиды или конструкции и "трипаратопные" полипептиды или конструкции, включают или по существу состоят из двух или более структурных блоков, каждый из которых имеет разный паратоп.

Один или более ISVD по изобретению можно использовать в качестве структурного блока в таком полипептиде или конструкции для получения одновалентного, мультивалентного или мультипаратопного полипептида или конструкции по изобретению, соответственно, как описано в настоящей заявке.

Настоящее изобретение, таким образом, также относится к полипептиду или конструкции, которые представляют собой мультивалентный полипептид или мультивалентную конструкцию, соответственно, например, двухвалентный или трехвалентный полипептид или конструкцию, включающий или по существу состоящий из двух или более ISVD по изобретению (что касается мультивалентных и мультиспецифических полипептидов, содержащих один или более VHH доменов, и их получения, см. также Conrath et al. (J. Biol. Chem. 276: 7346–7350, 2001), а также, например, WO 96/34103, WO 99/23221 и WO 2010/115998).

В другом аспекте мультивалентный полипептид или конструкция по изобретению может представлять собой биспецифический полипептид или конструкцию по изобретению, включающие первый ISVD, такой как Нанотело, направленное против Аггрекана, и второй ISVD, такой как Нанотело, направленное против второго антигена, такого как, например, ADAMTS5 или MMP13, в которых указанные первый и второй ISVD, такие как Нанотела, необязательно могут быть связаны через линкерную последовательность (как определено в настоящей заявке); тогда как мультивалентный полипептид или конструкция по изобретению также могут представлять собой триспецифический полипептид или конструкцию по изобретению, включающие первый ISVD, такой как Нанотело, направленное против ADAMTS5, второй ISVD, такой как Нанотело, направленное против второго антигена, такого как, например Аггрекан, и третий ISVD, такой как Нанотело, направленное против третьего антигена, такого как, например MMP13, в которых указанный первый, второй и третий ISVD, такие как Нанотела, необязательно могут быть связаны через одну или более и, в частности, две линкерные последовательности.

Изобретение также относится к мультивалентному полипептиду, который включает или (по существу) состоит из по меньшей мере одного ISVD (или его подходящих фрагментов), связывающего ADAMTS5, предпочтительно ADAMTS5 человека, и одного дополнительного ISVD, такого как ISVD, связывающий Аггрекан.

Особенно предпочтительные двухвалентные биспецифические полипептиды или конструкции и четырехвалентные триспецифические полипептиды или конструкции в соответствии с изобретением представляют собой такие, которые показаны в примерах, описанных в настоящей заявке, и в Таблице A–1 (например, SEQ ID NO: 1, 5, 6, 62, 63 или 64).

Два или более ISVD, присутствующих в мультивалентном полипептиде или конструкции по изобретению, могут состоять из последовательности вариабельного домена легкой цепи (например, V_L–последовательности) или последовательности вариабельного домена тяжелой цепи (например, V_H–последовательности); они могут состоять из последовательности вариабельного домена тяжелой цепи, которая происходит из традиционного четырехцепочечного антитела, или из последовательности вариабельного домена тяжелой цепи, которая происходит из антитела только с тяжелыми цепями. В предпочтительном аспекте они состоят из Доменного антитела (или аминокислоты, которая является подходящей для использования в качестве доменного антитела), из однодоменного антитела (или аминокислоты, которая является подходящей для использования в качестве однодоменного антитела), из “dAb” (или аминокислоты, которая является подходящей для использования в качестве dAb), из Нанотела® (включая, но не ограничиваясь этим, V_HH), из гуманизированной V_HH последовательности, из камелизированной V_H последовательности; или из V_HH последовательности, которая получена методом созревания аффинности. Два или более одиночных вариабельных доменов иммуноглобулина могут состоять из частично или полностью гуманизированного Нанотела или частично или полностью гуманизированной VHH.

В особенно предпочтительном аспекте полипептид или конструкция по изобретению включает или по существу состоит из четырех или более ISVD, из которых по меньшей мере два ISVD направлены против Аггрекана. Должно быть понятно, что указанные по меньшей мере два ISVD, направленные против Аггрекана, могут быть одинаковыми или отличными друг от друга, могут быть направлены против одного и того же эпитопа или разных эпитопов Аггрекана, могут принадлежать к одной и той же эпитопной группе или к разным эпитопным группам и/или могут связываются с одним и тем же или с разными доменами Аггрекана.

Относительные аффинности могут зависеть от локализации ISVDs в полипептиде. Должно быть понятно, что порядок ISVDs в полипептиде по изобретению (ориентация) можно выбрать в соответствии с тем, как необходимо специалисту в данной области. Расположение индивидуальных ISVD, а также то, включает полипептид линкер или нет, является вопросом выбора конструкции. Некоторые ориентации, с или без линкеров, могут обеспечивать предпочтительные характеристики связывания по сравнению с другими ориентациями. Например, порядок расположения первого ISVD (например ISVD 1) и второго ISVD (например ISVD 2) в полипептиде по изобретению может быть следующим (от N–конца к C–концу): (i) ISVD 1 (например нанотело 1) – [линкер] – ISVD 2 (например нанотело 2) – [C–концевое удлинение]; или (ii) ISVD 2 (например нанотело 2) – [линкер]– ISVD 1 (например нанотело 1) – [C–концевое удлинение]; (где фрагменты в квадратных скобках, т.е. линкер и C–концевое удлинение, являются необязательными). Все ориентации охватываются изобретением. Полипептиды, которые содержат ориентацию ISVDs, которая обеспечивает желаемые характеристики связывания, легко можно идентифицировать при помощи рутинного скрининга, например, как проиллюстрировано в разделе Примеры.

В предпочтительном порядке ISVD, связывающий Аггрекан, расположен на C–концевой стороне полипептида. Особенно предпочтительный порядок от N–конца к C–концу является следующим: ISVD, связывающий ADAMTS5 – [линкер] – ISVD, связывающий Аггрекан – [C–концевое удлинение], или ISVD, связывающий MMP13 – [линкер] – ISVD, связывающий Аггрекан – [C–концевое удлинение], где фрагменты в квадратных скобках являются необязательными. Еще один особенно предпочтительный порядок от N–конца к C–концу является следующим: ISVD, связывающий ADAMTS5 – [линкер] – ISVD, связывающий Аггрекан – [линкер] – ISVD, связывающий Аггрекан – [C–концевое удлинение], или ISVD, связывающий MMP13 – [линкер] – ISVD, связывающий Аггрекан – [линкер] – ISVD, связывающий Аггрекан – [C–концевое удлинение], где фрагменты в квадратных скобках являются необязательными. Например, предпочтительный порядок от N–конца к C–концу является следующим: ISVD, связывающий MMP13 – [линкер] – ISVD, связывающий ADAMTS5 – [линкер] – ISVD, связывающий Аггрекан – [C–концевое удлинение], где фрагменты в квадратных скобках являются необязательными. Например, особенно предпочтительный порядок от N–конца к C–концу является следующим: ISVD, связывающий MMP13 – [линкер] – ISVD, связывающий ADAMTS5 – [линкер] – ISVD, связывающий Аггрекан – [линкер] – ISVD, связывающий Аггрекан – [C–концевое удлинение], где фрагменты в квадратных скобках являются необязательными.

Еще в одном аспекте изобретение относится к полипептиду, описанному в настоящей заявке, где указанный полипептид имеет по меньшей мере 80%, 90%, 95% или 100% идентичности последовательности с любой из SEQ ID NO: 1, 5, 6, 62, 63 или 64.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду, описанному в настоящей заявке, который выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 (ALX–1011), SEQ ID NO: 5 (MMP13–CAP–CAP), и SEQ ID NO: 6 (ATS5–CAP–CAP), SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 и SEQ ID NO: 64.

В специальном аспекте изобретения конструкция или полипептид по изобретению может содержать фрагмент, придающий такое свойство, как больший период полужизни, по сравнению с соответствующей конструкцией или полипептидом по изобретению без указанного фрагмента. Некоторые предпочтительные, но не ограничивающие примеры таких конструкций и полипептидов по изобретению будут понятны квалифицированному специалисту на основании дальнейшего раскрытия, представленного в настоящей заявке, и, например, включают ISVDs или полипептиды по изобретению, которые были химически модифицированны для увеличения их периода полужизни (например, путем пегилирования); полипептиды или конструкции по изобретению, которые включают по меньшей мере один дополнительный сайт связывания для связывания с белком сыворотки (таким как сывороточный альбумин); или полипептиды по изобретению, которые включают по меньшей мере один ISVD по изобретению, который связан по меньшей мере с одним фрагментом (и, в частности, по меньшей мере одной аминокислотной последовательностью), который увеличивает период полужизни аминокислотной последовательности по изобретению. Примеры конструкций по изобретению и полипептидов по изобретению, включающих такие увеличивающие период полужизни фрагменты или ISVDs, будут понятны квалифицированному специалисту на основании дальнейшего раскрытия, представленного в настоящей заявке; и, например, включают, без ограничения, полипептиды, в которых один или более ISVD по изобретению подходящим образом связаны с одним или более сывороточными белками или их фрагментами (такими как (человеческий) сывороточный альбумин или его подходящие фрагменты) или с одним или более связывающими элементами, которые могут связываться с сывороточными белками (такими как, например, доменные антитела, одиночные вариабельные домены иммуноглобулинов, которые являются подходящими для применения в качестве доменного антитела, однодоменные антитела, ISVD, которые являются подходящими для применения в качестве однодоменного антитела, dAbs, ISVD, которые являются подходящими для применения в качестве dAb, или Нанотела, которые могут связываться с сывороточными белками, такими как сывороточный альбумин (такой как человеческий сывороточный альбумин), сывороточные иммуноглобулины, такие как IgG, или трансферрин; см. дальнейшее описание и указанные в нем ссылки); полипептиды, в которых аминокислотная последовательность по изобретению связана с Fc частью (такой как человеческий Fc) или ее подходящей частью или фрагментом; или полипептиды, в которых один или более одиночных вариабельных доменов иммуноглобулина по изобретению подходящим образом связаны с одним или более небольшими белками или пептидами, которые могут связываться с сывороточными белками, такими как, например, белки и пептиды, описанные в WO 91/01743, WO 01/45746, WO 02/076489, WO2008/068280, WO2009/127691 и PCT/EP2011/051559.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает полипептид и конструкцию по изобретению, где указанная конструкция или указанный полипептид дополнительно включает сывороточный белок–связывающий фрагмент или сывороточный белок. Предпочтительно, указанный сывороточный белок–связывающий фрагмент связывается с сывороточным альбумином, таким как человеческий сывороточный альбумин.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду, описанному в настоящей заявке, включающему ISVD, связывающийся с сывороточным альбумином.

Как правило, конструкции или полипептиды по изобретению с увеличенным периодом полужизни предпочтительно имеют период полужизни, который по меньшей мере в 1,5 раза, предпочтительно по меньшей мере в 2 раза, например по меньшей мере в 5 раз, например по меньшей мере в 10 раз или более чем в 20 раз больше, чем период полужизни соответствующих конструкций или полипептидов по изобретению per se, т.е. без фрагмента, обеспечивающего больший период полужизни. Например, конструкции или полипептиды по изобретению с увеличенным периодом полужизни могут иметь период полужизни, например, у человека, который увеличен больше чем на 1 час, предпочтительно больше чем на 2 часа, более предпочтительно больше чем на 6 часов, например больше чем на 12 часов, или даже больше чем на 24, 48 или 72 часа, по сравнению с соответствующими конструкциями или полипептидами по изобретению per se, т.е. без фрагмента, обеспечивающего больший период полужизни.

В предпочтительном аспекте изобретения конструкции по изобретению и полипептиды по изобретению имеют период полужизни в сыворотке, например, у человека, который увеличен больше чем на 1 час, предпочтительно больше чем на 2 часа, более предпочтительно больше чем на 6 часов, например больше чем на 12 часов или даже больше чем на 24, 48 или 72 часа, по сравнению с соответствующими конструкциями или полипептидами по изобретению per se, т.е. без группы, обеспечивающей больший период полужизни.

В другом предпочтительном аспекте изобретения такие конструкции и полипептиды по изобретению демонстрируют период полужизни в сыворотке человека по меньшей мере около 12 часов, предпочтительно по меньшей мере 24 часа, более предпочтительно по меньшей мере 48 часов, еще более предпочтительно по меньшей мере 72 часа или более. Например, конструкции или полипептиды по изобретению могут иметь период полужизни по меньшей мере 5 дней (например около 5–10 дней), предпочтительно по меньшей мере 9 дней (например около 9–14 дней), более предпочтительно по меньшей мере около 10 дней (например около 10–15 дней) или по меньшей мере около 11 дней (например около 11–16 дней), более предпочтительно по меньшей мере около 12 дней (например около 12 до 18 дней или более) или больше чем 14 дней (например около 14–19 дней).

В особенно предпочтительном аспекте изобретения, изобретение обеспечивает конструкцию по изобретению и полипептид по изобретению, включающие, помимо одного или более структурных блоков, связывающихся с Аггреканом, и одного или более структурных блоков, связывающиеся с ADAMTS5 и/или MMP13, по меньшей мере один структурный блок, связывающийся с сывороточным альбумином, такой как ISVD, связывающийся с сывороточным альбумином, таким как человеческий сывороточный альбумин, как описано в настоящей заявке. Предпочтительно указанный ISVD, связывающийся с сывороточным альбумином, включает или по существу состоит из 4 каркасных областей (FR1 – FR4, соответственно) и 3 определяющих комплементарность областей (CDR1 – CDR3, соответственно), в которых CDR1 представляет собой SFGMS, CDR2 представляет собой SISGSGSDTLYADSVKG и CDR3 представляет собой GGSLSR. Предпочтительно указанный ISVD, связывающийся с человеческим сывороточным альбумином, выбран из группы, состоящей из Alb8, Alb23, Alb129, Alb132, Alb11, Alb11 (S112K)–A, Alb82, Alb82–A, Alb82–AA, Alb82–AAA, Alb82–G, Alb82–GG, Alb82–GGG, Alb92 или Alb223 (см. Таблицу D).

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к конструкции по изобретению, такой как полипептид, включающий фрагмент, связывающийся с сывороточным белком, где указанный фрагмент, связывающийся с сывороточным белком, представляет собой полипептид не на основе антитела.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к конструкции, описанной в настоящей заявке, включающей по меньшей мере один ISVD или полипептид и одну или более других групп, остатков, фрагментов или связывающих элементов. Одна или более других групп, остатков, фрагментов или связывающих элементов предпочтительно выбраны из группы, состоящей из молекулы полиэтиленгликоля, сывороточных белков или их фрагментов, связывающих элементов, которые могут связываться с сывороточными белками, Fc части и небольших белков или пептидов, которые могут связываться с сывороточными белками, других аминокислотных остатков, маркеров или других функциональных фрагментов, например, токсинов, меток, радиохимических веществ и т.д.

В одном варианте осуществления, как указано ниже, настоящее изобретение относится к конструкции по изобретению, такой как полипептид, включающий фрагмент, придающий свойство увеличения периода полужизни, где указанный фрагмент представляет собой ПЭГ. Следовательно, настоящее изобретение относится также конструкции или полипептиду по изобретению, включающему ПЭГ.

Дополнительные аминокислотные остатки могут или не могут изменять, модифицировать или иным образом влиять на другие (биологические) свойства полипептида по изобретению и могут или не могут добавлять дополнительную функциональность полипептиду по изобретению. Например, такие аминокислотные остатки:

a) могут включать N–концевой Met остаток, например в результате экспрессии в гетерологичной клетке–хозяине или организме–хозяине;

b) могут образовывать сигнальную последовательность или лидерную последовательность, которая направляет секрецию полипептида из клетки–хозяина при синтезе (например, для получения пре–, про– или препро– формы полипептида по изобретению, в зависимости от используемой клетки–хозяина для экспрессии полипептида по изобретению). Подходящие секреторные лидерные пептиды будут очевидны квалифицированным специалистам и могут представлять собой такие, которые описаны далее в настоящей заявке. Обычно такая лидерная последовательность будет связана с N–концом полипептида, хотя изобретение в его самом широком смысле не ограничивается этим;

c) могут образовывать “метку”, например аминокислотную последовательность или остаток, который позволяет осуществлять или облегчает очистку полипептида, например, с использованием аффинных методов, направленных против указанной последовательности или остатка. Затем указанную последовательность или остаток можно удалить (например, путем химического или ферментативного расщепления) с получением полипептида (для этой цели метка необязательно может быть связана с аминокислотной последовательностью или последовательностью полипептида через расщепляемую линкерную последовательность или содержать расщепляемый мотив). Некоторые предпочтительные, но не ограничивающие примеры таких остатков представляют собой несколько гистидиновых остатков, глутатионовых остатков и myc–метку, такую как AAAEQKLISEEDLNGAA;

d) может быть один или более аминокислотных остатков, которые были функционализированы и/или которые могут служить в качестве сайта для присоединения функциональных групп. Подходящие аминокислотные остатки и функциональные группы будут очевидны квалифицированному специалисту и включают, но не ограничиваются этим, аминокислотные остатки и функциональные группы, указанные в настоящей заявке для производных полипептидов по изобретению.

Также настоящим изобретением охватываются конструкции, включающие полипептид и/или ISVD по изобретению, которые дополнительно включают другие функциональные фрагменты, например, токсины, метки, радиохимические вещества и т.д.

Другие группы, остатки, фрагменты или связывающие элементы могут, например, представлять собой химические группы, остатки, фрагменты, которые сами могут быть, или могут не быть, биологически и/или фармакологически активными. Например, и без ограничения, такие группы могут быть связаны с одним или более ISVD или полипептидами по изобретению таким образом, чтобы обеспечить “производное” полипептида или конструкции по изобретению.

Соответственно, изобретение в его самом широком смысле также включает конструкции и/или полипептиды, которые являются производными конструкций и/или полипептидов по изобретению. Такие производные, как правило, можно получить путем модификации, и в частности путем химической и/или биологической (например, ферментативной) модификации, конструкций и/или полипептидов по изобретению и/или одного или более аминокислотных остатков, которые образуют полипептид по изобретению.

Примеры таких модификаций, а также примеры аминокислотных остатков в последовательностях полипептидов, которые могут быть модифицированы таким образом (т.е. либо в основной цепи белка, но предпочтительно в боковой цепи), способы и процедуры, которые можно использовать для введения таких модификаций, и потенциальные применения и преимущества таких модификаций будут очевидны квалифицированному специалисту (см. также Zangi et al., Nat Biotechnol 31(10):898–907, 2013).

Например, такая модификация может включать введение (например, путем ковалентного связывания или любым другим подходящим способом) одной или более (функциональных) групп, остатков или фрагментов в или на полипептид по изобретению, в частности, одной или более функциональных групп, остатков или фрагментов, которые придают одно или более желаемых свойств или функциональностей конструкции и/или полипептиду по изобретению. Примеры таких функциональных групп будут очевидны квалифицированному специалисту.

Например, такая модификация может включать введение (например, путем ковалентного связывания или любым другим подходящим способом) одного или более функциональных фрагментов, которые увеличивают период полужизни, растворимость и/или абсорбцию конструкции или полипептида по изобретению, которые уменьшают иммуногенность и/или токсичность конструкции или полипептида по изобретению, которые устраняют или уменьшают любые нежелательные побочные эффекты конструкции или полипептида по изобретению и/или которые придают другие полезные свойства конструкции или полипептиду по изобретению и/или уменьшают их нежелательные свойства; или любую комбинацию из двух или более из вышеуказанных. Примеры функциональных фрагментов и методов их введения будут очевидны квалифицированному специалисту, и они, как правило, включают все функциональные фрагменты и методы, описанные в предшествующем уровне техники, цитируемом в настоящей заявке выше, а также функциональные фрагменты и методы, известные per se для модификации фармацевтических белков и, в частности, для модификации антител или фрагментов антител (включая ScFv и однодоменные антитела), например, см. Remington (Pharmaceutical Sciences, 16^th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1980). Такие функциональные фрагменты, например, могут быть связаны непосредственно (например ковалентно) с полипептидом по изобретению или, необязательно, через подходящий линкер или спейсер, как также будет очевидно квалифицированному специалисту.

Одним конкретным примером является производное полипептида или конструкции по изобретению, где полипептид или конструкция по изобретению были химически модифицированы для увеличения их периода полужизни (например, путем пегилирования). Это один из наиболее широко используемых методов для увеличения периода полужизни и/или уменьшения иммуногенности фармацевтических белков и включает присоединение подходящего фармакологически приемлемого полимера, такого как поли(этиленгликоль) (ПЭГ) или его производных (таких как метоксиполи(этиленгликоль) или мПЭГ). Как правило, можно использовать любую подходящую форму пегилирования, такую как пегилирование, используемое в данной области техники для антител и фрагментов антител (включая, но не ограничиваясь этим, (одно)доменные антитела и ScFv); см., например, Chapman (Nat. Biotechnol. 54: 531–545, 2002), Veronese and Harris (Adv. Drug Deliv. Rev. 54: 453–456, 2003), Harris and Chess (Nat. Rev. Drug. Discov. 2: 214–221, 2003) и WO 04/060965. Различные реагенты для пегилирования белков также являются коммерчески доступными, например от Nektar Therapeutics, USA.

Предпочтительно используют сайт–направленное пегилирование, в частности через цистеиновый остаток (см., например, Yang et al. (Protein Engineering 16: 761–770, 2003). Например, для этой цели ПЭГ можно присоединить к цистеиновому остатку, который естественным образом присутствует в полипептиде по изобретению, конструкцию или полипептид по изобретению можно модифицировать так, чтобы подходящим образом ввести один или более цистеиновых остатков для присоединения ПЭГ, или аминокислотную последовательность, включающую один или более цистеиновых остатков для присоединения ПЭГ, можно слить с N– и/или C–концом конструкции или полипептида по изобретению – во всех случаях с использованием методов белковой инженерии, известных per se квалифицированным специалистам.

Предпочтительно, для конструкций или полипептидов по изобретению используют ПЭГ с молекулярной массой больше чем 5000, такой как больше чем 10000 и меньше чем 200000, такой как меньше чем 100000; например в пределах от 20000–80000.

Еще одна, обычно менее предпочтительная, модификация включает N–связанное или O–связанное гликозилирование, обычно как часть ко–трансляционной и/или посттрансляционной модификации, в зависимости от клетки–хозяина, используемой для экспрессии полипептида по изобретению.

Еще одна модификация может включать введение одной или более обнаруживаемых меток или других генерирующих сигнал групп или фрагментов, в зависимости от предполагаемого применения полипептида или конструкции по изобретению. Подходящие метки и способы их прикрепления, применения и детекции будут понятны специалистам в данной области и, например, включают, но не ограничиваются этим, флуоресцентные метки (такие как флуоресцеин, изотиоцианат, родамин, фикоэритрин, фикоцианин, аллофикоцианин, о–фтальдегид и флуорескамин и флуоресцентные металлы, такие как ¹⁵²Eu или другие металлы из ряда лантаноидов), фосфоресцентные метки, хемилюминесцентные метки или биолюминесцентные метки (такие как люминал, изолюминол, ароматический сложный эфир акридиния, имидазол, соли акридиния, оксалатный эфир, диоксетан или GFP и его аналоги), радиоизотопы (такие как ³H, ¹²⁵I, ³²P, ³⁵S, ¹⁴C, ⁵¹Cr, ³⁶Cl, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe и ⁷⁵Se), металлы, металло–хелаты или металлические катионы (например, металлические катионы, такие как ^99mTc, ¹²³I, ¹¹¹In, ¹³¹I, ⁹⁷Ru, ⁶⁷Cu, ⁶⁷Ga и ⁶⁸Ga, или другие металлы или металлические катионы, которые являются особенно подходящими для применения в in vivo, in vitro или in situ диагностике и визуализации, такие как (¹⁵⁷Gd, ⁵⁵Mn, ¹⁶²Dy, ⁵²Cr и ⁵⁶Fe)), а также хромофоры и ферменты (такие как малатдегидрогеназа, стафилококковая нуклеаза, дельта–V–стероид–изомераза, алкогольдегидрогеназа дрожжей, альфа–глицерофосфатдегидрогеназа, триозофосфатизомераза, биотинавидинпероксидаза, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, глюкозооксидаза, β–галактозидаза, рибонуклеаза, уреаза, каталаза, глюкозо–VI–фосфатдегидрогеназа, глюкоамилаза и ацетилхолинэстераза). Другие подходящие метки будут очевидны специалистам в данной области и, например, включают фрагменты, которые могут быть обнаружены с использованием ЯМР или ЭПР–спектроскопии.

Такие меченные полипептиды и конструкции по изобретению, например, можно использовать для анализов in vitro, in vivo или in situ (включая иммуноанализы, известные per se, такие как ELISA, RIA, EIA и другие “сэндвич–анализы” и т.д.), а также для диагностики и визуализации in vivo, в зависимости от выбора конкретной метки.

Как будет понятно квалифицированному специалисту, другая модификация может включать введение хелатирующей группы, например для хелатирования одного из металлов или металлических катионов, указанных выше. Подходящие хелатирующие группы, например, включают, без ограничения, диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPA) или этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA).

Еще одна модификация может включать введение функционального фрагмента, который является одной частью специфической связывающейся пары, такой как биотин–(стрепт)авидин связывающейся пары. Такой функциональный фрагмент можно использовать для связывания полипептида по изобретению с другим белком, полипептидом или химическим соединением, который связан с другой половиной связывающейся пары, т.е. через образование связывающейся пары. Например, конструкцию или полипептид по изобретению можно конъюгировать с биотином и связать с другим белком, полипептидом, соединением или носителем, конъюгированным с авидином или стрептавидином. Например, такую конъюгированную конструкцию или полипептид по изобретению можно использовать в качестве репортера, например в системе диагностики, где детектируемый сигнал–испускающий агент конъюгирован с авидином или стрептавидином. Такие связывающиеся пары, например, также можно использовать для связывания конструкции или полипептида по изобретению с носителем, в том числе с носителями, подходящими для фармацевтических целей. Одним неограничивающим примером являются липосомальные композиции, описанные Cao и Suresh (Journal of Drug Targeting 8: 257, 2000). Такие связывающиеся пары также можно использовать для связывания терапевтически активного средства с полипептидом по изобретению.

Другие потенциальные химические и ферментативные модификации будут очевидны квалифицированным специалистам. Такие модификации также могут быть введены для исследовательских целей (например, для исследования взаимосвязи функции–активности). Например, см. Lundblad и Bradshaw (Biotechnol. Appl. Biochem. 26: 143–151, 1997).

Предпочтительно конструкции, полипептиды и/или производные являются такими, которые связываются с Аггреканом и ADAMTS5 и/или MMP13 с аффинностью (соответствующим образом измеренной и/или выраженной как K_D–значение (действительное или кажущееся), K_A–значение (действительное или кажущееся), k_on–скорость или скорость ассоциации и/или k_off или скорость диссоциации, или альтернативно как IC₅₀ значение, как описано далее в настоящей заявке), которая является такой, как определено в настоящей заявке (например, как определено для полипептидов по изобретению).

Такие конструкции и/или полипептиды по изобретению и их производные также могут быть в по существу выделенной форме (как определено в настоящей заявке).

В одном аспекте настоящее изобретение относится к конструкции по изобретению, которая включает или по существу состоит из ISVD в соответствии с изобретением или полипептида в соответствии с изобретением и которая дополнительно включает одну или более других групп, остатков, фрагментов или связывающихся элементов, которые необязательно связаны через один или более пептидных линкеров.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к конструкции по изобретению, в которой одна или более других групп, остатков, фрагментов или связывающих элементов выбраны из группы, состоящей из молекулы полиэтиленгликоля, сывороточных белков или их фрагментов, связывающих элементов, которые могут связываться с сывороточными белками, Fc части и небольших белков или пептидов, которые могут связываться с сывороточными белками.

В конструкциях по изобретению, таких как полипептиды по изобретению, два или более структурных блока, например, такие как ISVD, и необязательно одна или более других групп, лекарственных средств, агентов, остатков, фрагментов или связывающих элементов могут быть непосредственно связаны друг с другом (как, например, описано в WO 99/23221) и/или могут быть связаны друг с другом через один или более подходящих спейсеров или линкеров, или любую их комбинацию. Подходящие спейсеры или линкеры для применения в мультивалентных и мультиспецифических полипептидах будут очевидны квалифицированным специалистам и, как правило, могут представлять собой любой линкер или спейсер, используемый в данной области техники для связывания аминокислотных последовательностей. Предпочтительно, указанный линкер или спейсер является подходящим для применения в конструировании конструкций, белков или полипептидов, предполагаемых для фармацевтического применения.

Например, полипептид по изобретению, например, может представлять собой трехвалентный триспецифический полипептид, включающий один структурный блок, такой как ISVD, связывающий Аггрекан, ISVD, связывающий ADAMTS5, и потенциально еще один структурный блок, такой как третий ISVD, связывающий MMP13, в котором указанные первый, второй и третий структурные блоки, такие как ISVD, необязательно могут быть связаны через одну или более и, в частности, 2 линкерные последовательности. Также, настоящее изобретение обеспечивает конструкцию или полипептид по изобретению, включающий первый ISVD, связывающий Аггрекан, и возможно второй ISVD, связывающий Аггрекан, и/или возможно третий ISVD, связывающий ADAMTS5, и/или возможно четвертый ISVD, связывающий MMP13, где указанный первый ISVD и/или указанный второй ISVD, и/или возможно указанный третий ISVD, и/или возможно указанный четвертый ISVD связаны через линкеры, в частности 3 линкера.

Некоторые особенно предпочтительные линкеры включают линкеры, которые используются в данной области для связывания фрагментов антител или доменов антител. Они включают линкеры, описанные в общем уровне техники, указанном выше, а также, например, линкеры, которые используются в данной области для конструирования диател или ScFv фрагментов (в этой связи, однако, следует отметить, что, в то время как в диателах и в ScFv фрагментах используемая линкерная последовательность должна иметь длину, степень гибкости и другие свойства, которые позволяют соответствующим V_H и V_L доменам объединяться для образования полного антигенсвязывающего сайта, нет никаких конкретных ограничений, что касается длины или гибкости линкера, используемого в полипептиде по изобретению, поскольку каждый ISVD, такой как Нанотела, сам как таковой образует полный антигенсвязывающий сайт)

Например, линкер может представлять собой подходящую аминокислотную последовательность и, в частности, аминокислотные последовательности из 1–50, предпочтительно 1–30, например 1–10 аминокислотных остатков. Некоторые предпочтительные примеры таких аминокислотных последовательностей включают gly–ser линкеры, например типа (gly_xser_y)₂, такие как (например (gly₄ser)₃ или (gly₃ser₂)₃, как описано в WO 99/42077, и GS30, GS15, GS9 и GS7 линкеры, описанные в заявках Ablynx, указанных выше (см., например, WO 06/040153 и WO 06/122825), а также шарнир–подобные области, такие как шарнирные области природных антител, состоящих только из тяжелых цепей, или подобные последовательности (такие как описанные в WO 94/04678). Предпочтительные линкеры представлены в Таблице C.

Некоторые особенно предпочтительные линкеры представляют собой GS9 (см. также SEQ ID NO: 84 в WO 06/122825) и GS35, а также полиаланин (такой как AAA) и линкер GS30 (см. также SEQ ID NO: 85 в WO 06/122825).

Другие подходящие линкеры, как правило, включают органические соединения или полимеры, в частности, которые являются подходящими для использования в белках для фармацевтического применения. Например, поли(этиленгликолевые) фрагменты используются для связывания доменов антител, см., например, WO 04/081026.

Объемoм настоящего изобретения охватывается то, что длина, степень гибкости и/или другие свойства используемого линкера(линкеров) (хотя они не являются критическими, как обычно бывает для линкеров, используемых в ScFv фрагментах) могут иметь некоторое влияние на свойства готовой конструкции по изобретению, такой как полипептид по изобретению, включая, но не ограничиваясь этим, аффинность, специфичность или авидность в отношении хемокина или в отношении одного или более других антигенов. На основании раскрытия, представленного в настоящей заявке, специалист в данной области сможет определить оптимальный линкер(линкеры) для применения в конкретной конструкции по изобретению, такой как полипептид по изобретению, необязательно после нескольких ограниченных рутинных экспериментов.

Например, в мультивалентных полипептидах по изобретению, которые включают структурные блоки, ISVD или Нанотела, направленные против Аггрекана и другой мишени, такой как например, ADAMTS5 и/или MMP13, длина и гибкость линкера предпочтительно являются такими, которые позволяют каждому структурному блоку, такому как ISVD по изобретению, присутствующему в полипептиде, связываться с его родственной мишенью, например, антигенной детерминантой на каждой из мишеней. Также, на основании раскрытия, представленного в настоящей заявке, специалист в данной области сможет определить оптимальный линкер(линкеры) для применения в конкретной конструкции по изобретению, такой как полипептид по изобретению, необязательно после нескольких ограниченных рутинных экспериментов.

Объемoм настоящего изобретения также охватывается то, что используемый линкер(линкеры) придает одно или более других полезных свойств или функциональностей конструкциям по изобретению, таким как полипептиды по изобретению, и/или обеспечивает один или более участков для образования производных и/или для присоединения функциональных групп (например, как описано в настоящей заявке для производных ISVDs по изобретению). Например, линкеры, содержащие один или более заряженных аминокислотных остатков, могут обеспечить улучшенные гидрофильные свойства, тогда как линкеры, которые образуют или содержат небольшие эпитопы или метки, можно использовать для целей детекции, идентификации и/или очистки. И в этом случае также на основании раскрытия, представленного в настоящей заявке, специалист в данной области сможет определить оптимальные линкеры для применения в конкретном полипептиде по изобретению, необязательно после нескольких ограниченных рутинных экспериментов.

Конечно, когда два или более линкеров используют в конструкциях, таких как полипептиды по изобретению, эти линкеры могут быть одинаковыми или отличными друг от друга. И в этом случае также на основании раскрытия, представленного в настоящей заявке, специалист в данной области сможет определить оптимальные линкеры для применения в конкретной конструкции или полипептиде по изобретению, необязательно после нескольких ограниченных рутинных экспериментов.

Обычно, чтобы обеспечить более легкую экспрессию и продуцирование, конструкция по изобретению, такая как полипептид по изобретению, может представлять собой линейный полипептид. Однако изобретение в его самом широком смысле не ограничивается этим. Например, когда конструкция по изобретению, такая как полипептид по изобретению, включает три или более структурных блоков, ISVD или Нанотел, их можно связать при помощи линкера с тремя или более “ответвлениями”, где каждое “ответвление” связывается со структурным блоком, ISVD или Нанотелом, чтобы обеспечить “звездообразную” конструкцию. Также можно, хотя обычно менее предпочтительно, использовать кольцеобразные конструкции.

Соответственно, настоящее изобретение относится к конструкции по изобретению, такой как полипептид по изобретению, где указанные ISVD непосредственно связаны друг с другом или связаны через линкер.

Соответственно, настоящее изобретение относится к конструкции по изобретению, такой как полипептид по изобретению, где первый ISVD и/или второй ISVD и/или возможно ISVD, связывающийся с сывороточным альбумином, связаны через линкер.

Соответственно, настоящее изобретение относится к конструкции по изобретению, такой как полипептид по изобретению, где указанный линкер выбран из группы, состоящей из линкеров 9GS, 35GS, 3A, 5GS, 7GS, 10GS, 15GS, 18GS, 20GS, 25GS, 30GS, поли–A, 8GS, 40GS, G1 шарнир, 9GS–G1 шарнир, верхняя длинная шарнирная область ламы и G3 шарнир, таких как, например, показанные в Таблице C (SEQ ID NO: 28, 35, 24–27, 29–34 и 36–40).

Соответственно, настоящее изобретение относится к конструкции по изобретению, такой как полипептид по изобретению, где указанный полипептид выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 62–64, 1, 5 и 6.

Изобретение также относится к способам для получения конструкций, полипептидов, ISVD, нуклеиновых кислот, клеток–хозяев и композиций, описанных в настоящей заявке.

Мультивалентные полипептиды по изобретению, как правило, можно получить способом, который включает по меньшей мере стадию связывания подходящим образом ISVD и/или одновалентного полипептида по изобретению с одним или более другими ISVD, необязательно через один или более подходящих линкеров, чтобы обеспечить мультивалентный полипептид по изобретению. Полипептиды по изобретению также можно получить способом, который, как правило, включает по меньшей мере стадии обеспечения нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид по изобретению, экспрессии указанной нуклеиновой кислоты подходящим способом и выделения экспрессированного полипептида по изобретению. Это можно осуществить способом, известным per se, что должно быть понятно квалифицированному специалисту, например, на основании способов и процедур, описанных далее в настоящей заявке.

Способ для получения мультивалентных полипептидов по изобретению может включать по меньшей мере стадии связывания двух или более ISVD по изобретению и, например, одного или более линкеров вместе подходящим способом. ISVDs по изобретению (и линкеры) можно связать любым способом, известным из уровня техники, и как описано далее в настоящей заявке. Предпочтительные способы включают связывание нуклеиновокислотных последовательностей, которые кодируют ISVDs по изобретению (и линкеры) с получением генетической конструкции, которая экспрессирует мультивалентный полипептид. Способы связывания аминокислот или нуклеиновых кислот будут очевидны квалифицированному специалисту, и в этом случае также можно сделать ссылку на справочники, такие как Sambrook et al. и Ausubel et al., указанные выше, а также Примеры, представленные ниже.

Соответственно, настоящее изобретение также относится к применению ISVD по изобретению для получения мультивалентного полипептида по изобретению. Способ получения мультивалентного полипептида будет включать связывание ISVD по изобретению с по меньшей мере одним дополнительным ISVD по изобретению, необязательно через один или более линкеров. ISVD по изобретению затем используют в качестве связывающего домена или структурного блока для обеспечения и/или получения мультивалентного полипептида, включающего 2 (например, в двухвалентном полипептиде), 3 (например, в трехвалентном полипептиде), 4 (например, в четырехвалентном) или более (например, в мультивалентном полипептиде) структурных блоков. В этой связи, ISVD по изобретению можно использовать в качестве связывающего домена или связывающего элемента для обеспечения и/или получения мультивалентного, такого как двухвалентный, трехвалентный или четырехвалентный, полипептида по изобретению, включающего 2, 3, 4 или более структурных блоков.

Соответственно, настоящее изобретение также относится к применению ISVD полипептида по изобретению (как описано в настоящей заявке) для получения мультивалентного полипептида. Способ получения мультивалентного полипептида будет включать связывание ISVD по изобретению с по меньшей мере одним другим ISVD по изобретению, необязательно через один или более линкеров.

Полипептиды и нуклеиновые кислоты по изобретению можно получить способом, известным per se, как будет понятно квалифицированному специалисту из представленного ниже описания. Например, полипептиды по изобретению можно получить любым способом, известным per se для получения антитела и, в частности, для получения фрагментов антител (в том числе, но не ограничиваясь этим, (одно)доменных антител и ScFv фрагментов). Некоторые предпочтительные, но не ограничивающие способы для получения полипептидов и нуклеиновых кислот включают способы и процедуры, описанные в настоящей заявке.

Способ получения полипептида по изобретению может включать следующие стадии: экспрессию, в подходящей клетке–хозяине или организме–хозяине (также указан в настоящей заявке как “хозяин по изобретению”), или в другой подходящей системе экспрессии нуклеиновой кислоты, которая кодирует указанный полипептид по изобретению (также указана в настоящей заявке как “нуклеиновая кислота по изобретению”); необязательно с последующим выделением и/или очисткой полипептида по изобретению, полученного таким образом.

В частности, такой способ может включать следующие стадии: культивирование и/или поддержание хозяина по изобретению в условиях, которые являются такими, чтобы указанный хозяин по изобретению экспрессировал и/или продуцировал по меньшей мере один полипептид по изобретению; необязательно с последующим выделением и/или очисткой полипептида по изобретению, полученного таким образом.

Соответственно, настоящее изобретение также относится к нуклеиновой кислоте или нуклеотидной последовательности, которая кодирует полипептид, ISVD или конструкцию по изобретению (также указана как “нуклеиновая кислота по изобретению”).

Нуклеиновая кислота по изобретению может быть в форме одно– или двухцепочечной ДНК или РНК. В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения, нуклеиновая кислота по изобретению находится в по существу выделенной форме, как определено в настоящей заявке. Нуклеиновая кислота по изобретению также может быть в форме вектора, может присутствовать в векторе и/или быть частью вектора, например вектора экспрессии, такого как, например, плазмида, космида или YAC, который также может быть в по существу выделенной форме. Соответственно, настоящее изобретение также относится к вектору экспрессии, включающему нуклеиновую кислоту или нуклеотидную последовательность по изобретению.

Нуклеиновые кислоты по изобретению могут быть изготовлены или получены способом, известным per se, на основании информации по полипептидам по изобретению, представленной в настоящей заявке, и/или они могут быть выделены из подходящего природного источника. Также, как будет понятно квалифицированному специалисту, чтобы получить нуклеиновую кислоту по изобретению, также несколько нуклеотидных последовательностей, например, по меньшей мере две нуклеиновые кислоты, кодирующие ISVD по изобретению, и, например, нуклеиновые кислоты, кодирующие один или более линкеров, можно связать вместе подходящим способом. Способы для получения нуклеиновых кислот по изобретению будут очевидны квалифицированному специалисту, и они могут, например, включать, но не ограничиваются этим, автоматический синтез ДНК; сайт–направленный мутагенез; объединение двух или более природных и/или синтетических последовательностей (или двух или более их частей), введение мутаций, которые приводят к экспрессии усеченного продукта экспрессии; введение одного или более рестрикционных сайтов (например, для создания кассет и/или областей, которые легко можно расщепить и/или лигировать с использованием подходящих рестрикционных ферментов), и/или введение мутаций путем ПЦР с использованием одного или более “ошибочно спаренных” праймеров. Эти и другие методы будут очевидны квалифицированному специалисту, и в этом случае снова можно сослаться на справочники, такие как Sambrook et al. и Ausubel et al., указанные выше, а также на представленные ниже Примеры.

В предпочтительном, но не ограничивающем варианте осуществления, генетическая конструкция по изобретению включает

a) по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту по изобретению;

b) функционально связанную с одним или более регуляторными элементами, такими как промотор и, необязательно, подходящий терминатор; и необязательно также

c) один или более дополнительных элементов генетических конструкций, известных per se;

где термины “регуляторный элемент”, “промотор”, “терминатор” и “функционально связанный” имеют свое обычное значение в данной области техники.

Генетические конструкции по изобретению, как правило, можно получить путем связывания подходящим образом нуклеотидной последовательности(последовательностей) по изобретению с одним или более другими элементами, описанными выше, например с использованием методов, описанных в общих справочниках, таких как Sambrook et al. и Ausubel et al., указанных выше.

Нуклеиновые кислоты по изобретению и/или генетические конструкции по изобретению можно использовать для трансформирования клетки–хозяина или организма–хозяина, т.е. для экспрессии и/или продукции полипептида по изобретению. Подходящие хозяева или клетки–хозяева будут очевидны квалифицированному специалисту, и могут, например, представлять собой любую подходящую грибковую, прокариотическую или эукариотическую клетку или клеточную линию или любой подходящий грибковый, прокариотический или (не человеческий) эукариотический организм, а также все другие клетки–хозяева или (отличные от человека) хозяева, известные per se для экспрессии и продукции антител и фрагментов антител (включая, но не ограничиваясь этим, (одно)доменные антитела и ScFv фрагменты), что должно быть понятно квалифицированному специалисту. См. также ссылку на известный уровень техники, приведенную выше, а также, например, WO 94/29457; WO 96/34103; WO 99/42077; Frenken et al. (Res Immunol. 149: 589–99, 1998); Riechmann and Muyldermans (1999), supra; van der Linden (J. Biotechnol. 80: 261–70, 2000); Joosten et al. (Microb. Cell Fact. 2: 1, 2003); Joosten et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 66: 384–92, 2005); и другие ссылочные документы, указанные в настоящей заявке. Кроме того, полипептиды по изобретению также могут экспрессироваться и/или продуцироваться в бесклеточных системах экспрессии, и подходящие примеры таких систем будут очевидны квалифицированным специалистам. Подходящие методы трансформирования хозяина или клетки–хозяина по изобретению будут очевидны квалифицированному специалисту и могут зависеть от предполагаемой клетки–хозяина/организма–хозяина и генетической конструкции, которую используют. См. также справочники и патентные заявки, указанные выше. Трансформированная клетка–хозяин (которая может быть в форме стабильной клеточной линии) или организмы–хозяева (которые могут быть в форме стабильной мутантной линии или штамма) составляют другие аспекты настоящего изобретения. Соответственно, настоящее изобретение относится к хозяину или клетке–хозяину, включающему нуклеиновую кислоту в соответствии с изобретением или вектор экспрессии в соответствии с изобретением. Предпочтительно, эти клетки–хозяева или организмы–хозяева являются такими, которые экспрессируют, или (по меньшей мере) способны экспрессировать (например, в подходящих условиях), полипептид по изобретению (и в случае организма–хозяина: в по меньшей мере одной его клетке, части, ткани или органе). Изобретение также включает дальнейшие поколения, потомство и/или дочерние продукты клетки–хозяина или организма–хозяина по изобретению, которые, например, можно получить клеточным делением или половым или бесполым размножением.

Для получения/достижения экспрессии полипептидов по изобретению трансформированную клетку–хозяин или трансформированный организм–хозяин обычно можно хранить, поддерживать и/или культивировать в условиях, в которых (желательный) полипептид по изобретению экспрессируется/продуцируется. Подходящие условия будут очевидны специалистам в данной области и обычно зависят от используемой клетки–хозяина/организма–хозяина, а также от регуляторных элементов, которые контролируют экспрессию (соответствующей) нуклеотидной последовательности по изобретению. Опять же, делается ссылка на справочники и патентные заявки, указанные выше в параграфах, раскрывающих генетические конструкции по изобретению.

Затем полипептид по изобретению может быть выделен из клетки–хозяина/организма–хозяина и/или из среды, в которой культивировали указанную клетку–хозяин или организм–хозяин, с использованием методов выделения и/или очистки белка, известных per se, таких как, (препаративная) хроматография и/или электрофорез, методы дифференциального осаждения, аффинные методы (например, с использованием специфической расщепляемой аминокислотной последовательности, слитой с полипептидом по изобретению) и/или препаративные иммунологические методы (т.е. использование антител против подлежащего выделению полипептида)

В одном аспекте изобретение относится к способу получения конструкции, полипептида или ISVD в соответствии с изобретением, включающему по меньшей мере следующие стадии: (a) экспрессия, в подходящей клетке–хозяине или организме–хозяине, или в другой подходящей системе экспрессии, последовательности нуклеиновой кислоты в соответствии с изобретением; необязательно с последующим (b) выделением и/или очисткой конструкции, полипептида или ISVD в соответствии с изобретением.

В одном аспекте изобретение относится к композиции, включающей конструкцию, полипептид, ISVD или нуклеиновую кислоту в соответствии с изобретением.

Как указано выше, все еще остается потребность в безопасных и эффективных лекарственных средствах для лечения OA. Во–первых, авторы настоящего изобретения идентифицировали очень эффективные закрепляющиеся в хряще белки, т.е. ISVD, связывающиеся с Аггреканом, которые используют в качестве структурных блоков для конструирования молекул, которые также связываются с ADAMTS5 и/или MMP13. Полученные молекулы имеют повышенный период удерживания в организме субъекта, и их можно вводить системно, поддерживая при этом активность. Авторы настоящего изобретения затем продемонстрировали, что комбинация как ингибиторов ADAMTS5, так и ингибиторов MMP13 была более эффективной для облегчения OA, чем ингибирование любой из мишеней отдельно. Кроме того, полипептиды и конструкции по изобретению также продемонстрировали значительно более высокую эффективность по сравнению с соединениями предшеструющего уровня техники.

Настоящее изобретение, таким образом, обеспечивает композиции, конструкции и/или полипептиды с улучшенными профилактическими, терапевтическими и/или фармакологическими свойствами, включая более безопасный профиль по сравнению с аминокислотными последовательностями и антителами предшествующего уровня техники.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики заболеваний или расстройств у индивидуума, например, которые связаны с активностью ADAMTS5 и/или MMP13, при этом способ включает введение указанному индивидууму композиции, полипептида и/или конструкции в соответствии с изобретением в количестве, эффективном для лечения или профилактики (симптома) указанного заболевания или расстройства.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к композиции в соответствии с изобретением, полипептиду в соответствии с изобретением и/или конструкции в соответствии с изобретением для применения в качестве лекарственного средства.

В другом аспекте изобретение относится к применению композиции, полипептида и/или конструкции в соответствии с изобретением для получения фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения по меньшей мере ADAMTS5 и/или MMP13–ассоциированного заболевания, такого как OA; и/или для применения в одном или более способах лечения, указанных в настоящей заявке.

Изобретение также относится к применению композиции, полипептида и/или конструкции в соответствии с изобретением для получения фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения по меньшей мере одного заболевания или расстройства, котор можно предотвратить и/или лечить путем модуляции активности ADAMTS, предпочтительно путем ингибирования активности ADAMTS5.

Изобретение также относится к применению композиции, полипептида и/или конструкции в соответствии с изобретением для получения фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения по меньшей мере одного заболевания или расстройства, которое можно предотвратить и/или лечить путем модуляции активности MMP, предпочтительно ингибирования активности MMP13.

Изобретение также относится к применению ISVD, полипептида, композицит и/или конструкцит по изобретению для получения фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения по меньшей мере одного заболевания, расстройства или состояния, которое можно предотвратить и/или лечить путем введения пациенту ISVD, полипептида, композиции и/или конструкции по изобретению.

Изобретение также относится к ISVD, композиции, полипептиду и/или конструкции по изобретению, или к фармацевтической композиции, включающей их, для применения в профилактике и/или лечении по меньшей мере ADAMTS5–ассоциированного заболевания и/или MMP13–ассоциированного заболевания.

Предполагается, что ADAMTS5–связывающие агенты по изобретению можно использовать при различных заболеваниях, поражающих хрящ, таких как артропатии и хондродистрофии, артритное заболевание, такое как остеоартрит, ревматоидный артрит, подагрический артрит, псориатический артрит, травматический разрыв или отслоение, ахондроплазия, реберный хондрит, спондилоэпиметафизарная дисплазия, межпозвоночная грыжа, дегенерация поясничного диска, дегенеративное заболевание суставов и рецидивирующий полихондрит, рассекающий остеохондрит и аггреканопатии, и при неалкогольном стеатогепатите (NASH) (обобщенно указаны в настоящей заявке как "ADAMTS5–ассоциированные заболевания"), предпочтительно OA.

Предполагается, что MMP13–связывающие агенты по изобретению можно использовать при различных заболеваниях, поражающих хрящ, таких как артропатии и хондродистрофии, артритное заболевание, такое как остеоартрит, ревматоидный артрит, подагрический артрит, псориатический артрит, травматический разрыв или отслоение, ахондроплазия, реберный хондрит, спондилоэпиметафизарная дисплазия, межпозвоночная грыжа, дегенерация поясничного диска, дегенеративное заболевания суставов, рецидивирующий полихондрит, рассекающий остеохондрит, аггреканопатии, хронический периодонтит и аневризма брюшной аорты (обобщенно указаны в настоящей заявке как "MMP13–ассоциированные заболевания"), предпочтительно OA.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, ISVD, полипептиду и/или конструкции в соответствии с изобретением для применения в лечении или профилактике симптома ADAMTS5–ассоциированного заболевания и/или MMP13–ассоциированного заболевания, такого как, например, артропатии и хондродистрофии, артритное заболевание, такое как остеоартрит, ревматоидный артрит, подагрический артрит, псориатический артрит, травматический разрыв или отслоение, ахондроплазия, реберный хондрит, спондилоэпиметафизарная дисплазия, межпозвоночная грыжа, дегенерация поясничного диска, дегенеративное заболевание суставов, рецидивирующий полихондрит, рассекающий остеохондрит, аггреканопатии, NASH, хронический периодонтит и аневризма брюшной аорты, предпочтительно OA.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу профилактики или лечения артропатий и хондродистрофий, артритного заболевания, такого как остеоартрит, ревматоидный артрит, подагрический артрит, псориатический артрит, травматического разрыва или отслоения, ахондроплазии, реберного хондрита, спондилоэпиметафизарной дисплазии, межпозвоночной грыжи, дегенерации поясничного диска, дегенеративного заболевания суставов, рецидивирующего полихондрита, NASH, хронического периодонтита и аневризмы брюшной аорты, предпочтительно OA, где указанный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, фармацевтически активного количества по меньшей мере композиции, иммуноглобулина, полипептида и/или конструкции в соответствии с изобретением.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к применению ISVD, полипептида, композиции и/или конструкции в соответствии с изобретением для получения фармацевтической композиции для лечения или профилактики заболевания или расстройства, такого как артропатии и хондродистрофии, артритное заболевание, такое как остеоартрит, ревматоидный артрит, подагрический артрит, псориатический артрит, травматический разрыв или отслоение, ахондроплазия, реберный хондрит, спондилоэпиметафизарная дисплазия, межпозвоночная грыжа, дегенерация поясничного диска, дегенеративное заболевание суставов, рецидивирующий полихондрит, рассекающий остеохондрит, аггреканопатии, NASH, хронический периодонтит и аневризма брюшной аорты, предпочтительно OA.

Также ожидается, что связываясь с Аггреканом, ISVD, конструкции и/или полипептиды по изобретению могут снижать или ингибировать активность члена семейства сериновых протеаз, катепсинов, матриксных металлопротеиназ (MMP, отличных от MMP13), таких как например MMP20, но также ADAMTS4 (Аггреканаза–1) и/или ADAMTS11, связанную с разрушением Аггрекана.

В контексте настоящего изобретения термин “профилактика и/или лечение” включает не только профилактику и/или лечение заболевания, но также обычно включает предотвращение возникновения заболевания, замедление или изменение хода заболевания, предотвращение или замедление возникновение одного или более симптомов, связанных с заболеванием, уменьшение и/или ослабление одного или более симптомов, связанных с заболеванием, уменьшение тяжести и/или продолжительности заболевания и/или любых симптомов, связанных с ним, и/или предотвращение дальнейшего усиления тяжести заболевания и/или любых связанных с ним симптомов, предотвращение, уменьшение или реверсию любого физиологического повреждения, вызванного заболеванием, и, как правило, любое фармакологическое действие, которое полезно для пациента, которого лечат.

Схема введения должна определяться лечащим врачом и клиническими факторами. Как хорошо известно в медицине, дозировка для любого пациента зависит от многих факторов, включая размер, массу тела, площадь поверхности тела, возраст пациента, конкретное вводимое соединение, активность используемого полипептида (включая антитела), время и путь введения, общее состояние здоровья и комбинацию с другими терапиями или лечениями. Белковое фармацевтически активное вещество может присутствовать в количествах между 1 г и 100 мг/кг массы тела на дозу; однако, также предусматриваются дозы ниже или выше этого приведенного в качестве примера диапазона. Если используют непрерывную инфузию, количество может быть в пределах от 1 пг до 100 мг на килограмм массы тела в минуту.

ISVD, полипептид или конструкцию по изобретению можно использовать при концентрации, например, 0,01, 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20 или 50 пг/мл для ингибирования и/или нейтрализации активности ADAMTS5 и/или MMP13 по меньшей мере на около 50%, предпочтительно 75%, более предпочтительно 90%, 95% или вплоть до 99%, и наиболее предпочтительно приблизительно 100% (по существу полностью), как определяют способами, хорошо известными из уровня техники.

Как правило, схема лечения будет включать введение одного или более полипептидов и/или конструкций по изобретению, или одной или более включающей их композиций, в одном или более фармацевтически эффективных количествах или дозах. Конкретные вводимые количества или дозы может определить клиницист, опять же на основании факторов, перечисленных выше. Полезные дозы композиций, конструкций и/или полипептидов по изобретению можно определить путем сравнения их in vitro активности и in vivo активности в животных моделях. Способы экстраполяции эффективных доз с мышей и других животных на человека известны из уровня техники; например, см. US 4938949.

Как правило, в зависимости от конкретного заболевания, расстройства или состояния, подлежащего лечению, активности конкретного используемого полипептида и/или конструкции по изобретению, конкретного пути введения и конкретного используемого фармацевтического состава или композиции, клиницист сможет определить подходящую схему введения.

Количество композиций, конструкций и/или полипептидов по изобретению, необходимое для применения в лечении, будет варьироваться не только в зависимости от конкретной композиции, полипептида и/или конструкции, но также от пути введения, природы состояния, подлежащего лечению, и возраста и состояния пациента, и в конечном счете это будет определять лечащий врач или клиницист. Также дозировка композиций, конструкций и/или полипептидов по изобретению варьируется в зависимости от клетки–мишени, ткани или органа.

Желаемая доза может удобно предоставляться в виде одной дозы или, что менее предпочтительно, в виде дробных доз, вводимых через соответствующие интервалы, например, в виде двух, трех, четырех или более субдоз в день. Саму субдозу далее можно разделить, например, на несколько отдельных свободно распределенных введений.

Схема введения может включать долгосрочное ежедневное лечение. Под “долгосрочным” подразумевается, по меньшей мере, две недели, а предпочтительно несколько недель, месяцев или лет. Необходимые модификации в этом диапазоне доз могут быть определены специалистом в данной области с использованием только рутинного экспериментирования, с учетом настоящего раскрытия. См. Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed. 4), Mack Publishing Co., Easton, PA. Дозировка также может быть скорректирована лечащим врачом в случае каких–либо осложнений. Было показано, что композиции, полипептиды и конструкции чрезвычайно стабильны и остаются эффективными в течение продолжительных периодов времени.

Обычно, в описанном выше способе можно использовать композицию, полипептид и/или конструкцию по изобретению. Однако объемом изобретения охватывается использование двух или более композиций, полипептидов и/или конструкций по изобретению в комбинации, такой как, например, комбинация SEQ ID NO: 5 и 6, SEQ ID NO: 63 и 64, SEQ ID NO: 5 и 64 или SEQ ID NO:s 63 и 6.

Композиции, полипептиды и/или конструкции по изобретению можно использовать в комбинациии с одним или более другими фармацевтически активными соединениями или активными веществами, т.е. в виде комбинированной схемы лечения, которая может привести или не привести к синергетическому эффекту.

Фармацевтическая композиция также может включать по меньшей мере еще одно активное вещество, например, одно или более других антител или их антиген–связывающих фрагментов, пептидов, белков, нуклеиновых кислот, органических и неорганических молекул.

И в этом случае также клиницист сможет выбрать такие другие соединения или активные вещества, а также подходящую комбинированную схему лечения на основании факторов, перечисленных выше, и его экспертного заключения.

В частности, композиции, полипептиды и/или конструкции по изобретению можно использовать в комбинации с другими фармацевтически активными соединениями или активными веществами, которые предназначены или которые можно использовать для профилактики и/или лечения заболеваний, расстройств и состояний, перечисленных в настоящей заявке, в результате чего может достигаться или не достигаться синергетический эффект. Примеры таких соединений и активных веществ, а также пути, способы и фармацевтические составы или композиции для их введения будут очевидны клиницисту.

Когда два или более веществ или активных начал, таких как например (композиция, включающая) полипептид, включающий ISVD, ингибирующий ADAMTS5, и другой полипептид, включающий ISVD, ингибирующий MMP13, используют как часть комбинированной схемы лечения, такой как, например, комбинация SEQ ID NO: 5 и 6, SEQ ID NO: 63 и 64, SEQ ID NO: 5 и 64 или SEQ ID NO: 63 и 6, их можно вводить одним и тем же путем введения или разными путями введения, по существу одновременно или в разное время (например, по существу одновременно, последовательно или в чередующемся режиме). Когда вещества или активные начала можно вводить одновременно одним и тем же путем введения, их можно вводить в виде разных фармацевтических составов или композиций или части комбинированного фармацевтического состава или композиции, как будет понятно квалифицированному специалисту.

Также, когда два или более активных веществ или активных начал используют в виде части комбинированной схемы лечения, такой как, например (композиция, включающая) полипептид, включающий ISVD, ингибирующий ADAMTS5, и другой полипептид, включающий ISVD, ингибирующий MMP13, каждое из веществ или активных начал можно вводить в таком же количестве и в соответствии с такой же схемой введения, которые используются при введении соединения или активного начала как такового, и такое комбинированное введение может приводить или не приводить к синергетическому эффекту. Однако, когда комбинированное использование двух или более активных веществ или активных начал приводит к синергетическому эффекту, тогда можно будет уменьшить количество одного, нескольких или всех веществ или активных начал, которые следует вводить, с достижением при этом желаемого терапевтического действия. Это может, например, быть полезным для предотвращения, ограничения или уменьшения любых нежелательных побочных эффектов, которые связаны с использованием одного или более веществ или активных начал, когда они используются в их обычных количествах, при одновременном получении желаемого фармацевтического или терапевтического эффекта.

Эффективность схемы лечения, используемой в соответствии с изобретением, можно определить и/или отследить любым способом, известным per se для заболевания, расстройства или состояния, как будет понятно клиницисту. Клиницист также сможет, при необходимости и в каждом конкретном случае, изменять или модифицировать конкретную схему лечения, чтобы достичь желаемого терапевтического эффекта, чтобы избежать, ограничить или уменьшить нежелательные побочные эффекты, и/или чтобы достичь подходящего баланса между достижением желаемого терапевтического эффекта, с одной стороны, и предотвращением, ограничением или уменьшением нежелательных побочных эффектов, с другой стороны.

Как правило, схема лечения должна соблюдаться до тех пор, пока не будет достигнут желаемый терапевтический эффект, и/или до тех пор, пока должен поддерживаться желаемый терапевтический эффект. Опять же, это может определить лечащий врач.

Таким образом, еще в одном аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, которая содержит по меньшей мере одну конструкцию по изобретению или по меньшей мере один полипептид по изобретению и по меньшей мере один подходящий носитель, разбавитель или эксципиент (т.е. подходящий для фармацевтического применения) и, необязательно, одно или более дополнительных активных веществ. В конкретном аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, которая включает по меньшей мере одну композицию, конструкцию или полипептид в соответствии с изобретением, предпочтительно по меньшей мере одну из SEQ ID NO: 1 и 62, или комбинацию SEQ ID NO: 5 и 6, SEQ ID NO: 63 и 64, SEQ ID NO: 5 и 64 или SEQ ID NO: 63 и 6, и по меньшей мере один подходящий носитель, разбавитель или эксципиент (т.е. подходящий для фармацевтического применения) и, необязательно, одно или более дополнительных активных веществ.

Субъектом, подлежащим лечению, может быть любое теплокровное животное, но, в частности, млекопитающее и, в частности, человек. При применениях в ветеринарии субъект, подлежащий лечению, включает любое животное, выращенное в коммерческих целях или содержащееся в качестве домашнего животного. Как будет понятно специалисту в данной области, субъектом, подлежащим лечению, будет, в частности, человек, страдающий или подверженный риску заболеваний, расстройств и состояний, указанных в настоящей заявке. Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления изобретения фармацевтические композиции, включающие полипептид по изобретению, предназначены для применения в лечении или диагностике. Предпочтительно, фармацевтические композиции предназначены для применения в медицине, но они также могут использоваться в ветеринарии.

Опять же, в такой фармацевтической композиции одну или более композиций, полипептидов и/или конструкций по изобретению, или нуклеотид, кодирующий их, и/или фармацевтическую композицию, включающую их, также можно подходящим образом объединить с одним или более другими активными веществами, такими как указанные в настоящей заявке.

Изобретение также относится к композиции (такой как, без ограничения, фармацевтическая композиция или препарат, как далее описано в настоящей заявке) для применения либо in vitro (например, в анализе in vitro или клеточном анализе), либо in vivo (например, в отдельной клетке или многоклеточном организме, и, в частности, для млекопитающего и, более конкретно, человека, такого как человек, который имеет риск развития или страдает от заболевания, расстройства или состояния по настоящему изобретению).

Следует понимать, что ссылка на лечение включает как лечение установленных симптомов, так и профилактическое лечение, если прямо не указано иное.

Как правило, для фармацевтического применения композиции, конструкции, полипептиды и/или ISVD по изобретению могут быть сформулированы в виде фармацевтического препарата или композиции, включающей по меньшей мере одну конструкцию, полипептид и/или ISVD по изобретению и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент и/или адъювант и, необязательно, один или более фармацевтически активных полипептидов и/или соединений. В качестве неограничивающих примеров, такая композиция может быть в форме, подходящей для перорального введения, для парентерального введения (например, посредством интраартикулярной, внутривенной, внутримышечной или подкожной инъекции или внутривенной инфузии), для местного введения, для введения посредством ингаляции, при помощи кожного пластыря, имплантата, суппозитория и т.д., при этом парентеральное введение является предпочтительным. Такие подходящие формы введения, которые могут быть твердыми, полутвердыми или жидкими, в зависимости от способа введения, а также способы и носители для использования при их получении, будут понятны специалисту в данной области и далее описаны в настоящей заявке. Такой фармацевтический препарат или композиция в общем виде будут указаны как “фармацевтическая композиция”.

В качестве примеров эксципиентов могут быть указаны разрыхлители, связующие, наполнители и смазывающие вещества. Примеры разрыхлителей включают агар–агар, альгины, карбонат кальция, целлюлозу, коллоидный диоксид кремния, камеди, алюмосиликат магния, метилцеллюлозу и крахмал. Примеры связующих включают микрокристаллическую целлюлозу, гидроксиметилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу и поливинилпирролидон. Примеры наполнителей включают карбонат кальция, фосфат кальция, трехосновный сульфат кальция, кальций карбоксиметилцеллюлозу, целлюлозу, декстрин, декстрозу, фруктозу, лактит, лактозу, карбонат магния, оксид магния, мальтит, мальтодекстрины, мальтозу, сорбит, крахмал, сахарозу, сахар и ксилит. Примеры смазывающих веществ включают агар, этилолеат, этиллаурат, глицерин, глицерилпальмитостеарат, гидрированное растительное масло, оксид магния, стеараты, маннит, полоксамер, гликоли, бензоат натрия, лаурилсульфат натрия, стеарил натрия, сорбит и тальк. Обычные стабилизаторы, консерванты, смачивающие вещества и эмульгаторы, улучшающие консистенцию агенты, улучшающие вкус вещества, соли для изменения осмотического давления, буферные вещества, солюбилизаторы, разбавители, смягчающие вещества, красители и маскирующие агенты и антиоксиданты рассматриваются в качестве фармацевтических адъювантов.

Подходящие носители включают, но не ограничиваются этим, карбонат магния, стеарат магния, тальк, сахар, лактозу, пектин, декстрин, крахмал, желатин, трагакант, метилцеллюлозу, натрий карбоксиметилцеллюлозу, низкоплавкий воск, масло какао, воду, спирты, полиолы, глицерин, растительные масла и т.п.

Как правило, конструкции, полипептиды и/или ISVD по изобретению можно сформулировать в композицию и вводить любым подходящим способом, известным per se. См., например, известный уровень техники, указанный выше (и, в частности, WO 04/041862, WO 04/041863, WO 04/041865, WO 04/041867 и WO 08/020079), а также справочники, такие как Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18^th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990), Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Lippincott Williams and Wilkins (2005); или the Handbook of Therapeutic Antibodies (S. Dubel, Ed.), Wiley, Weinheim, 2007 (см., например, стр. 252–255).

В специальном аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, которая включает по меньшей мере композицию, конструкцию, полипептид, ISVD или нуклеиновую кислоту в соответствии с изобретением, и которая дополнительно включает по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент и/или адъювант и, необязательно, включает один или более дополнительных фармацевтически активных полипептидов и/или конструкций.

Композиции, конструкции, полипептиды и/или ISVD по изобретению можно сформулировать в композицию и вводить любым известным способом для обычных антител и фрагментов антител (включая ScFv и диатела) и других фармацевтически активных белков. Такие композиции и способы их получения будут понятны специалистам и, например, включают препараты, предпочтительные для парентерального введения (например, интраартикулярного, внутривенного, интраперитонеального, подкожного, внутримышечного, интралюминального, интраартериального, интратекального, интраназального или интрабронхиального введения), но также для местного (т.е. трансдермального или интрадермального) введения.

Препараты для парентерального введения могут, например, представлять собой стерильные растворы, суспензии, дисперсии или эмульсии, которые подходят для инфузии или инъекции. Подходящие носители или разбавители для таких препаратов, например, включают, без ограничения, те, которые указаны на странице 143 WO 08/020079. Обычно водные растворы или суспензии будут предпочтительными.

Композиции, конструкции, полипептиды и/или ISVD по изобретению также можно вводить с использованием генно–терапевтических способов доставки, см., например, патент США № 5399346, который включен в качестве ссылки, что касается генно–терапевтических способов доставки. При использовании генно–терапевтического способа доставки первичные клетки, трансфицированные геном, кодирующим конструкцию, полипептид и/или ISVD по изобретению, могут быть дополнительно трансфицированы тканеспецифическими промоторами для нацеливания на конкретные органы, ткани, трансплантаты, опухоли или клетки и могут быть дополнительно трансфицированы сигнальными и стабилизирующими последовательностями для субклеточно локализованной экспрессии.

В соответствии с другими аспектами изобретения, композиции, конструкции и/или полипептид по изобретению можно использовать в дополнительных применениях in vivo и in vitro. Например, композиции, конструкции и/или полипептиды по изобретению можно использовать для диагностических целей, например в анализах, предназначенных для детекции и/или количественного определения присутствия ADAMTS5 и/или MMP13 и/или для очистки ADAMTS5 и/или MMP13. Композиции, полипептиды и/или конструкции также могут быть испытаны на животных моделях конкретных заболеваний и в испытаниях для оценки токсичности, безопасности и дозировки.

Наконец, изобретение относится к набору, включающему по меньшей мере одну композицию, полипептид или конструкцию по изобретению, по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую указанные компоненты, вектор или векторную систему по изобретению и/или клетку–хозяин в соответствии с изобретением. Предполагается, что набор может быть представлен в различных формах, например в виде диагностического набора.

Далее изобретение будет дополнительно описано при помощи следующих неограничивающих предпочтительных аспектов, примеров и чертежей.

Полное содержание всех ссылок (включая ссылки на литературу, выданные патенты, опубликованные патентные заявки и находящиеся на рассмотрении патентные заявки), процитированных в настоящей заявке, явным образом включено в настоящую заявку посредством ссылки, в частности, что касается основополагающих ссылок, указанных выше.

Последовательности раскрыты в основной части описания и в отдельном перечне последовательностей в соответствии со стандартом WIPO ST.25. SEQ ID с указанием конкретного номера должен быть одинаковым в основной части описания и в отдельном перечне последовательностей. В качестве примера, SEQ ID №: 1 должен определять одну и ту же последовательность как в основной части описания, так и в отдельном перечне последовательностей. В случае несоответствия между определением последовательности в основном тексте описания и отдельном перечне последовательностей (если, например, SEQ ID №: 1 в основном тексте описания ошибочно соответствует SEQ ID №: 2 в отдельном перечне последовательностей), ссылку на конкретную последовательность в заявке, в частности на конкретные варианты осуществления, следует понимать как ссылку на последовательность в основном тексте заявки, а не на отдельный перечень последовательностей. Другими словами, несоответствие между определением/обозначением последовательности в основной части описания и в отдельном перечне последовательностей должно быть устранено путем исправления отдельного перечня последовательностей в соответствии с последовательностями и их обозначениями, раскрытыми в основной части заявки, которая включает описание, примеры, чертежи и формулу изобретения.

6. ПРИМЕРЫ

Без привязки этого к конкретной теории, авторы настоящего изобретения предположили, что ингибирование обоих ADAMTS5 и MMP13 потенциально могло бы быть более эффективным, поскольку

(1) могло бы происходить ингибирование более широкого спектра OA–индуцирующих и поддерживающих протеаз;

(2) можно было бы направленно воздействовать на более широкий спектр пациентов, например, без необходимости разделения пациентов на разные группы; и

(3) можно было бы лечить более широкий спектр развивающихся заболеваний.

Для удобства пациентов ингибиторы предпочтительно удерживаются и активны в суставах в течение длительных периодов времени.

Соответственно, авторы изобретения поставили себе целью выделить и охарактеризовать ISVD, специфически связывающие MMP13, ISVD, специфически связывающие ADAMTS5, а также ISVD, специфически связывающие Аггрекан. Впоследствии, ISVD были объединены в различных форматах и испытаны в различных моделях in vitro, ex vivo и in vivo.

Пример 1 MMP13 ISVD

1.1 анти–MMP13 ISVD 62C02

После скрининга более чем 10E7 клонов MMP13–специфический ISVD 62C02 идентифицировали в анализе с использованием флуорогенных пептидов, коллагенолитических анализов и анализов флуорогенного коллагена.

Вкратце, схема флуорогенных пептидных анализов MMP13 человека, яванского макака, крысы, собаки и быка, а также флуорогенных пептидных анализов MMP1 и MMP14 человека является следующей. Активированный MMP инкубировали с флуорогенным пептидным субстратом Mca–PLGL–Dpa–AR–NH2 (R&D Systems # ES001) и 1/5 разведением периплазматического экстракта или серией разведений очищенного Нанотела/положительного контроля (общий объем=20 мкл в аналитическом буфер 50 мМ Трис, рН 7,5, 100 мМ NaCl, 10 мМ CaCl2, 0,01% Твин 20) в течение 2 ч при 37°С. Линейное увеличение флуоресценции (v0– между 15 и 45 мин инкубации) использовали в качестве показателя ферментативной активности, и % ингибирования рассчитывали по формуле 100–100 (v0 в присутствии испытываемого Нанотела/v0 в присутствии отрицательного контрольного Нанотела (Cablys)).

Краткое описание процедуры коллагенолитического анализа: 250 нг/мл человеческого коллагена II для иммунизации (Chondrex # 20052) инкубировали с 5 нМ активированного MMP13 в 100 мкл буфера для анализа (50 мМ Tris–Cl pH 7,5, 100 мМ NaCl 10 мМ CaCl2, 0,01% Твин–20). После 1,5 ч инкубации при 35°С реакцию нейтрализовали при помощи EDTA (10 мкл 30 мМ исходного раствора). MMP13–расщепленный коллаген дополнительно расщепляли эластазой в течение 20 мин при 38°C, чтобы избежать повторного отжига разрушенного Коллагена II (10 мкл 1/3 разбавленного исходного раствора, предоставленного в наборе для детекции Коллагена типа II (Chondrex # 6009)). Оставшийся неповрежденным Коллаген определяли методом ELISA (реагенты, предоставленные в наборе для детекции Коллагена типа II (Chondrex # 6009))

Схема флуорогенного анализа коллагена по существу следующая: 100 мкг/мл DQ™ Коллагена типа I из бычьей кожи (конъюгат с флуоресцеином; Molecular Probes #D–12060 партия 1149062) инкубировали с 10 нМ активированного MMP13 и серией разведений очищенного Нанотела/положительного контроля в течение 2 ч при 37°С в 40 мкл буфера для анализа (50 мМ Трис–Cl, рН 7,5, 100 мМ NaCl, 10 мМ CaCl2, 0,01% Твин–20). Линейное увеличение флуоресценции (v0– между 15 и 45 мин инкубации) использовали в качестве показателя ферментативной активности, и % ингибирования рассчитывали по формуле 100–100 (v0 в присутствии испытываемого Нанотела/v0 в присутствии отрицательного контрольного Нанотела (Cablys)).

Чтобы дополнительно охарактеризовать ISVD 62CO2, этот ISVD повторно клонировали в вектор pAX129, трансформировали в E.coli и экспрессировали и очищали в соответствии со стандартными протоколами (например, Maussang et al. 2013 J Biol Chem 288: 29562–72). Затем этот ISVD подвергали различным функциональным анализам in vitro. TIMP–2, который является неселективным ингибитором ММР, использовали в качестве положительного контроля в этих анализах. В качестве положительного контроля использовали низкомолекулярное лекарственное средство MSC2392891A. Обзор активностей в ферментных анализах приведен в Таблице 1.1

Таблица 1.1
IC50 [нМ]
клон	анализ флуорогенного пептида, человек	анализ флуорогенного пептида, крыса	анализ флуорогенного пептида, собака	анализ флуорогенного пептида, бык	анализ флуорогенного пептида, яванский макак	коллагенолитический анализ, человек	анализ флуорогенного коллагена, человек
TIMP–2	0,5	0,4	0,9	1,1	0,4	0,4	2,4
62C02	1,4	1,1	1,0	3,1	1,4	1,4	8,3
MSC2392891A	3,7	0,7	0,7	8,5	3,0	4,7	частичное ингибирование

Подводя итоги, ISVD 62C02 был лучше во всех анализах по сравнению с препаратом сравнения MSC2392891A.

1.2 анти–MMP13 ISVD 62C02 является селективным

Для определения селективности ISVD 62C02 в отношении MMP13 использовали флуорогенные пептидные анализы для MMP1 и MMP14. MMP1 и MMP14 являются двумя близкородственными членами MMP семейства. TIMP–2 использовали в качестве положительного контроля в этих анализах. Использовали такую же схему анализа, как описано в Примере 1.1.

Было продемонстрировано, что ISVD 62C02 был высокоселективным, не показав никакого ингибирования MMP1 или MMP14 (данные не показаны).

Пример 2 ADAMTS5 ISVD

2.1 анти–ADAMTS5 ISVD 02F03

Также и в этом случае скринировали более чем 10E7 клонов для идентификации ISVD 02F03, который специфически связывается с ADAMTS5. ISVD 02F03 далее был охарактеризован на ингибирование ADAMTS5–опосредованного расщепления Аггрекана в FRET и AlphaLISA анализах.

Вкратце, периплазматический экстракт ISVD 02F03 испытывали на связывание с рекомбинантным ADAMTS5 человека в анализе связывания ELISA. Затем было подтверждено, что ISVD 02F03 был способен предотвращать ADAMTS5–опосредованное расщепление Аггрекана в ферментативном анализе человеческого ADAMTS5 на основе FRET. После FRET анализа осуществляли AlphaLISA (Perkin Elmer, Waltham, MA, US) анализ человеческого ADAMTS5 с биотинилированным 43–мерным олигопептидом Аггрекана в качестве субстрата. При ADAMTS5 расщеплении этого субстрата высвобождается биотинилированный ARGSV неоэпитопный продукт, и его можно определить с использованием стрептавидин–AlphaScreen донорных шариков и антитела против α–неоэпитопа ("ARGSV"), захваченного на анти–мышиный IgG–покрытых акцепторных шариках AlphaLISA, что обеспечивает генерацию люминесцентного AlphaScreen сигнала при лазерном возбуждении. Для определения способности ISVD 02F03 предотвращать ADAMTS5–опосредованное расщепление субстрата анализировали уменьшение сигнала в зависимости от концентрации ISVD 02F03 и рассчитывали IC₅₀ значения.

Низкомолекулярный MSC2310852A, который ингибирует как активность ADAMTS4, так и активность ADAMTS5, использовали в качестве положительного контроля.

Результаты представлены в Таблице 2.1.1.

Таблица 2.1.1 Активность (IC₅₀) и % ингибирования человеческого ADAMTS5 для ISVD 02F03 и контрольных соединений в FRET и AlphaLISA ферментативных анализах
Соединение ID	FRET, человек		AlphaLISA, человек
Соединение ID	IC50 [M]	Ингибирование, %	IC50 [M]	Ингибирование, %
mAb 12F4 H4L0	1,0E–09	75	6,5E–11	100
02F03	1,8E–09	89	7,5E–11	100
MSC2310852A	6,0E–08	100	1,4E–07	99

Будучи сопоставимым с двухвалентным mAb 12F4, ISVD 02F03 продемонстрировал лучшую активность по сравнению с низкомолекулярным MSC2310852A.

Кроме того, ISVD 02F03 дополнительно оценивали на его способность блокировать разрушение хряща в анализе ex vivo, в котором субстрат представлен в состоянии, более близком к физиологическому состоянию по сравнению с биохимическими анализами. Вкратце, чипы бычьего хрящевого эксплантата (диаметром 4 мм) получали свежими из коленных суставов коровы и инкубировали в 96–луночных планшетах в присутствии IL–1α для индукции разрушения хряща. В качестве показателя разрушения хряща/Аггрекана определяли высвобождение гликозаминогликана (GAG) в супернатанте после 5 дней инкубации (37°C, 7,5% CO2) с использованием метахроматического красителя 1,9–диметилметиленового синего (эмиссия при 633 нм). Хондроитинсульфат включали в качестве стандарта для анализа. Эффективность определяли с использованием IL–1α–индуцированных контролей без соединения (0%) и в присутствии MSC2310852A (100% эффект).

Результаты представлены в Таблице 2.1.2.

Таблица 2.1.2 IC₅₀ значение для ISVD 02F03 в анализе бычьего эксплантата
ID	IC50 [M]
mAb 12F4 H4L0	3,2E–06
02F03	1,4E–08

В этом ex vivo анализе ISVD 02F03 показал более высокую эффективность, чем двухвалентное mAb 12F4, т.е. IC₅₀ примерно в 50 раз меньше.

Межвидовую перекрестную реактивность первоначально оценивали при помощи SPR анализа скорости диссоциации на устройстве Biacore T100. Полипептиды испытывали на связывание с ADAMTS5 человека, яванского макака ("cyno"), морской свинки, мыши и быка. Для этого рекомбинантный ADAMTS5 был иммобилизован на CM5 чипе через связывание амина с использованием EDC и NHS. Очищенный ISVD 02F03 инжектировали в течение 2 минут при концентрации 100 нМ и давали возможность диссоциировать в течение 15 мин при скорости потока 45 мкл/мин. Скорость диссоциации для каждого индивидуального ADAMTS5 определяли путем подгонки модели взаимодействия 1:1 (модель Langmuir) на индивидуальных кривых диссоциации с использованием программы BIA Evaluation. В качестве контроля, скорости диссоциации на человеческом ADAMTS5 определяли в каждом эксперименте.

Результаты представлены в Таблице 2.1.3.

Таблица 2.1.3 Обзор данных межвидовой перекрестной реактивности ISVD 02F03
Нанотело ID	Скорость диссоциации, определенная методом SPR, kd (1/сек) на ADAMTS–5
	Эксперимент 1			Эксперимент 2		Эксперимент 3
	Человек	Cyno	Морская свинка	Человек	Мышь	Человек	Бык
02F03	3,3E–05	2,2E–05	3,4E–05	6,5E–05	2,9E–04	9,7E–05	4,3E–05

ISVD 02F03 показал сопоставимые скорости диссоциации (перекрестная реактивность) с ADAMTS5 человека, яванского макака(cyno), морской свинки и быка.

2.2 Селективность ISVD 02F03

Для подтверждения селективности ISVD 02F03 в отношении ADAMTS5, ингибирование ферментативной активности MMP1, MMP14 и ADAMTS4 оценивали в анализах на основе FRET и в AlphaLISA анализе человеческого ADAMTS4 с использованием соответствующих ферментов.

Активированный человеческий MMP1 или MMP14 инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре с 10 мкл серии разведений ISVD 02F03. После инкубации добавляли 20 мкл соответственно 5 мкМ или 2,5 мкМ флуорогенного пептидного субстрата (Mca–PLGL–Dpa–AR–NH2 Флуорогенный MMP Субстрат (R&D Systems cat #ES001)). Способность ISVD 02F03 предотвращать MMP1– и MMP14–опосредованное расщепление контролировали каждую минуту в течение 2 часов при 37°C на планшет–ридере Tecan Infinite M1000.

В то время как природные ингибиторы TIMP2 и TIMP3 ингибировали активность MMP1 и MMP14, ISVD 02F03 не показал никакого ингибирования (данные не показаны).

Для оценки ингибирования человеческого ADAMTS4 осуществляли анализ, подобный AlphaLISA анализу человеческого ADAMTS5, по существу как описано в Примере 2.1, но с использованием человеческого ADAMTS4 (R&D Systems, Minneapolis, US; cat # 4307–AD). Для определения способности ISVD 02F03 предотвращать человеческий ADAMTS4–опосредованное расщепление субстрата анализировали уменьшение сигнала в зависимости от концентрации ISVD 02F03 и рассчитывали IC₅₀ значения.

В то время как низкомолекулярный MSC2310852A ингибировал активность человеческого ADAMTS4, ISVD 02F03 или mAb 12F4 не показал никакой ингибиторной активности (данные не показаны). Моноклональное антитело mAb 12F4 (H4L0) было описано как селективное в отношении ADAMTS4 в WO 2011/002968.

Пример 3 Аггрекан ISVD

3.1 анти–Аггрекан ISVD 114F08

Аггрекан–специфический ISVD 114F08 выделяли и охарактеризовывали после широкомаштабного скрининга. Ламы были иммунизированы рекомбинантным Аггреканом человека (G1–IGD–G2 домены, R&D Systems # 1220–PG) и показывали специфические и высокие сывороточные титры. Однако только очень небольшая фракция выделенных Нанотел удовлетворяла двум требованиям, таким как связывание с G1–доменом Аггрекана и демонстрация широкой межвидовой перекрестной реактивности. После трудных попыток были идентифицированы различные члены семейства, показывающие по существу подобные характеристики (см. Таблицу 31A – Таблицу 3.1C вариабельность последовательностей в CDR). В результате был выбран ISVD 114F08 ("C0101PMP114F08") для дальнейшей характеризации.

Данные картирования доменов и межвидовой перекрестной реактивности представлены в Таблице 3.1.1.

Таблица 3.1.1
		Периплазматический экстракт, ELISA. OD 450 нМ
Картирование	Клон	G1–IGD–G2 человека	G1–IGD–G2 Cyno	G1–IGD–G2 крысы	G1–IGD–G2 собаки	G1–IGD–G2 быка
G1	114F08	2,38	2,32	2,05	1,90	1,18

После первичного скрининга, первоначальной оценки связывания методом ELISA, определения скорости диссоциации и межвидовой перекрестной реактивности ISVD 114F08 был далее охарактеризован.

Вариабельность последовательностей в CDR членов семейства ISVD 114F08 представлена в Таблицах 3.1A, 3.1B и 3.1C ниже. Аминокислотные последовательности CDR клона 114F08 использовали в качестве эталона, с которыми сравнивали CDR всех других членов семейства (CDR1 начинается в положении 26 по системе Kabat, CDR2 начинается в положени 50 по Kabat, и CDR3 начинается в положени 95 по Kabat).

Таблица 3.1A
114F08	CDR1*
Нумерация по системе Kabat	26	27	28	29	30	31	32	33	34	35
Абсолютная нумерация	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Последовательность дикого типа	G	S	T	F	I	I	N	V	V	R
Мутации							S		M
* До 2 CDR1 мутаций в одном клоне

Таблица 3.1B
114F08	CDR2*
Нумерация по системе Kabat	50	51	52	53	54	55	56	57	58
Абсолютная нумерация	1	2	3	4	5	6	7	8	9
Последовательность дикого типа	T	I	S	S	G	G	N	A	N
Мутации	A		R	T				T	D
* До 5 CDR2 мутаций в одном клоне

Таблица 3.1C
114F08	CDR3*
Нумерация по системе Kabat	95	96	97	98	99	100	100a	100b	100c	100d	100e	100f	100g
Абсолютная нумерация	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13
Последовательность дикого типа	P	T	T	H	Y	G	G	V	Y	Y	G	P	Y
Мутации	.	.	.	R	.	.	.	D	.	.	.	.	.
* До 2 CDR3 мутаций в одном клоне

3.2 Удерживание в бычьем хряще ex vivo

Поскольку нет никакого установленного анализа для оценки удерживания в хряще, авторы настоящего изобретения разработали анализ удерживания в хряще ex vivo с использованием бычьего хряща.

Определяли способность полипептидов, включающих ISVD 114F08, удерживаться в хряще в течение продолжительного периода времени после относительно короткого воздействия полипептида на хрящ (что можно ожидать при интраартикулярной инъекции). Анализ типично осуществляли с 4 хрящевыми дисками на образец Нанотела; 2 диска анализировали сразу после инкубации с полипептидом (t₀) для определения начального количества связанного полипептида; 2 диска анализировали после промывки (t_{1–5 дней}). Степень удерживания определяли как относительное количество полипептида, определенное при t_{1–5 дней} и t_0.Определение этого количества осуществляли путем визуального контроля вестерт–блотов, используя балльную оценку от 0 до 6, где 0 означает отсутствие удерживания, а 6 означает полное удерживание. Имитационная конструкция C0101030 ("30"), состоящая из 2 неактивных ISVD ALB26, не показала никакого связывания.

Результаты показаны в Таблице 3.2.

Таблица 3.2.
Мишень	Конструкция	Описание	Удерживание в хряще *
G1	118	ALB26–114F08–114F08	6,0
G1	54	114F08–ALB26	5,0
Имитация	30	ALB26–ALB26	0,0

Таблица 3.2: Удерживание в хряще анти–Аггрекан ISVD 114F08 в формате ALB26. *Оценки представляют собой средние оценки от 1–4 независимых ex vivo анализов удерживания в бычьем хряще по шкале от 0 до 6: 0 означает отсутствие удерживания, а 6 означает полное удерживание.

Было обнаружено, что полипептиды, включающие ISVD 114F08, очень хорошо удерживались (оценки 5–6) в хряще. Это включало конструкции, включающие как один, так и два связывающих элемента ISVD 114F08.

3.3 Характеристики связывания – ELISA

На основании данных удерживания в бычьем хряще ex vivo, ISVD 114F08 далее был охарактеризован в ELISA на рекомбинантной G1–IGD–G2 области из Аггрекана человека, яванского макака, крысы, собаки и быка для определения его межвидовой перекрестной реактивности (см. также Пример 3.1) и на рекомбинантном человеческом Нейрокане и Бревикане для определения его селективности. Определенные EC₅₀ значения представлены в Таблице 3.3.

Таблица 3.3 Характеризация анти–Аггрекан ISVD 114F08 в формате ALB26 методом ELISA
		EC50 (M)
Конструкция	Описание	Человек	Cyno	Крыса	Собака	Бык	Нейрокан	Бревикан
54	114F08–ALB26	6.0E–09	4.4E–09	7.6E–09	3.0E–09	5.6E–09	Отсутствие связывания	Отсутствие связывания
118	ALB26–114F08–114F08	1.1E–10	7.6E–11	1.9E–10	2.4E–10	3.7E–10	Отсутствие связывания	Отсутствие связывания
Имитация	ALB26–ALB26	Отсутствие связывания	Отсутствие связывания	Отсутствие связывания	Отсутствие связывания	Отсутствие связывания	Отсутствие связывания	Отсутствие связывания

3.4 Тканеспецифичность

Выше было продемонстрировано, что полипептиды по изобретению специфически связываются с Аггреканом in vitro и с хрящом ex vivo. Кроме того, эти полипептиды также должны связываться предпочтительно с хрящом сустава, не связываясь или в меньшей степени связываясь с другими тканями в суставе.

Связывание полипептидов, включающих ISVD 114F08, с синовиальной мембраной, сухожилием и эпимизием оценивали с использованием такой же схемы анализа, как для анализа связывания с хрящом ex vivo. Выделение полипептида и вестерн–блот анализ осуществляли после быстрой промывки тканей (30 мин) после инкубации с полипептидами в течение ночи.

Результаты представлены в Таблице 3.4.

Таблица 3.4
Конструкция	Описание	Хрящ	Синовиальная мембрана	Сухожилие	Эпимизий
054	114F08–ALB26	6	1	1	1
118	ALB26–114F08–114F08	6	1	1	1
Имитация	ALB26–ALB26	1	1	1	0

Таблица 3.4: Тканеспецифичность. Связывание анти–Аггреканового ISVD 114F08 в формате ALB26 с суставным хрящом, синовиальной мембраной, сухожилием и эпимизием. Оценки по шкале от 0 до 6, где 0 означает отсутствие связывания, а 6 означает максимально наблюдаемое связывание.

Результаты показывают, что полипептиды, включающие либо один, либо два связывающих элемента ISVD 114F08, показывают преимущественное связывание с хрящом по сравнению с другими тканями, присутствующими в суставе.

3.5 Стабильность Нанотела в синовиальной жидкости быка

По различным причинам, включая удобство и безопасность для пациента, предпочтительно, чтобы полипептиды оставались стабильными в течение более долгих периодов времени в синовиальном слое.

Соответственно, стабильность полипептидов, включающих ISVD 114F08, в синовиальной жидкости (SF) оценивали путем инкубации полипептидов в SF быка вплоть до 7 дней при 37^oC.

Результаты представлены в Таблице 3.5.

Таблица 3.5
Конструкция	Описание	Стабильность в SF быка, 37 ^o C
054	114F08–ALB26	> 7 дней
118	ALB26–114F08–114F08	> 7 дней
Имитация	ALB26–ALB26	> 7 дней

Таблица 3.5: Стабильность полипептидов, включающих ISVD 114F08 в SF быка.

Никакого разрушения какой–либо из конструкций не наблюдалось.

Пример 4 Полипептиды

Полипептид 754 конструировали путем генетического связывания анти–MMP13 ISVD 62C02 и двух анти–Аггрекан ISVD 114F08 с использованием 35GS линкеров (M–C–C). Полипептид 754–9 был подобен полипептиду 754, но в данном случае использовали 9GS линкеры. Полученные аминокислотные последовательности показаны в Таблице A–1 как SEQ ID NO: 5 и 63, соответственно.

Полипептид 954 конструировали путем генетического связывания анти–ADAMTS5 ISVD 2F03 и двух анти–Аггрекановых ISVD 114F08 с использованием 35GS линкеров (A–C–C). Полипептид 954–9 (см. "973") был подобен полипептиду 954, но в данном случае использовали 9GS линкеры. Полученные аминокислотные последовательности показаны в Таблице A–1 как SEQ ID NO: 6 и 64, соответственно.

Полипептид 949 конструировали путем генетического связывания анти–MMP13 ISVD 62C02, анти–ADAMTS5 ISVD 2F03 и двух анти–Аггрекановых ISVD 114F08 с использованием 35GS линкеров (M–A–C–C). Полипептид 949–9 был подобен полипептиду 949, но в данном случае использовали 9GS линкеры. Полученные аминокислотные последовательности показаны в Таблице A–1 как SEQ ID NO: 1 и 62, соответственно.

Пример 5 Аффинность полипептидов к ADAMTS5, MMP13 и Аггрекану из различных видов

5.1 Аффинность полипептида 949 к ADAMTS5 человека, яванского макака и крысы

Аффинность полипептида 949 к ADAMTS5 человека, яванского макака и крысы определяли в растворе с использованием метода KinExA. Фиксированную концентрацию 20 пМ (конечная концентрация) полипептида 949 уравновешивали в течение 24 часов с использованием 16–точечной кривой доза–ответ с 1/2,2 серийным разведением ADAMTS5 человека, яванского макака или крысы, каждый раз начиная с 20 нМ, при этом последняя точка является контрольной (= без ADAMTS5). Все разведения получали в буфере для образца (PBS+0,1% BSA+0,02% NaN₃). Для испытания на интерференцию Аггрекана рекомбинантный Аггрекан G1–IGD–G2 добавляли к этой предварительной инкубации в выбранных экспериментах при концентрации 2 нМ (= более 100x его K_D для полипептида 949, см. ниже).

Затем предварительно инкубированные смеси (ADAMTS5 DRC+20 пМ полипептида 949 ± Аггрекан G1–IGD–G2) вводили через автодозатор KinExA в колонку с конъюгированными с человеческим ADAMTS5 полиметилметакрилатными (PMMA) шариками для захвата свободных конструкций Нанотел на шариках. Захваченные конструкции Нанотел определяли с использованием инструмента Alexa Fluor (AF) 647–меченного анти–Нанотела, распознающего полипептид 949. Процент свободной конструкции Нанотел наносили на график как функцию концентрации ADAMTS5 и использовали программу KinExA Pro v3.6.5 для определения K_D.

Результаты, представленные в Таблице 5.1, показывают, что аффинность полипептида 949 к человеческому ADAMTS5 составляет 32,69 пМ в отсутствие G1–IGD–G2 и 26,56 пМ в присутствии Аггрекана. На основании того, что CI перекрываются с K_D значениями, присутствие Аггрекана не влияло на аффинность полипептида 949 в отношении ADAMTS5. Аффинности к ADAMTS5 яванского макака и крысы составляли 24,35 пМ и 25,17 пМ, соответственно, демонстрируя связывающую перекрестную реактивность полипептида 949 в отношении обоих видов, поскольку оба K_D значения соответствовали CI K_D человека.

Таблица 5.1: Аффинность полипептида 949 в отношении человеческого ADAMTS5 в отсутствие или в присутствии Аггрекана G1–IGD–G2, и в отношении ADAMTS5 яванского макака и крысы

Таблица 5.1
	N	Среднее значение K _D (пМ)	95% CI для K _D (пМ)
Человеческий – Аггрекан	3	32,69	16,35–65,38
Человеческий + Аггрекан	3	26,56	16,38–58,46
Яванский макак	1	24,35	9,25–66,27
Крыса	1	25,17

5.2 Функциональное ингибирование ADAMTS5 человека, яванского макака и крысы полипептидом 949

Функциональное ингибирование ADAMTS5 человека, яванского макака и крысы посредством C010100949 исследовали с использованием кинетического анализа на основе FRET. Этот анализ осуществляли с использованием буфера для FRET анализа (50 мМ HEPES pH 7,5, 100 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2∙2H₂0, 5% глицерина, 0,1% CHAPS в MilliQ). Фиксированную концентрацию 10 нМ (конечная концентрация) ADAMTS5 из соответствующего вида смешивали и уравновешивали с использованием 11–точечной (12^–я=контроль) DRC 1/1,7 серийного разведения полипептида 949, начиная с 50 нМ (конечная концентрация). Затем добавляли 30 мкМ (конечная концентрация) видоспецифического флуорогенного ADAMTS5 субстрата. Этот субстрат, пептид Аггрекана, меченный гасителем (2,4–динитрофенил, Dnp) и флуорохромом (аминобензойная кислота, Abz) ферментативно расщепляли посредством ADAMTS5 и флуоресценцию (длина волны возбуждения 340 нм/длина волны эмиссии 430 нм) кинетически измеряли каждую минуту в течение 2 часов с использованием считывающего устройства для микропланшетов Tecan F200. Полученные кривые процесса (флуоресцентный сигнал в зависимости от времени реакции) анализировали с использованием программы GraphPad Prism путем совмещения линейной части каждой кривой процесса с прямой линией (Y=угол наклона * X+Y–отсекаемый на оси отрезок). Полученные углы наклона или скорости реакций (v_i) нормализовали относительно среднего угла наклона всех контрольных образцов (неингибированная скорость реакции, v₀), наносили на график как функцию концентрации полипептида 949 и подгоняли с использованием подбора несимметричной 5–параметрической логистической кривой (5PL) для получения кривых ингибирования.

Результаты представлены на Фиг. 1, которая представляет собой репрезентативную графическую иллюстрацию результатов. Результаты показывают дозозависимое и полное ингибирование ферментативной активности ADAMTS5 из всех испытываемых видов полипептидом 949 ("C010100949"), демонстрируя, что они все были полностью функционально ингибированы конструкцией Нанотела.

5.3 Аффинность полипептида 949 в отношении MMP13 человека, яванского макака и крысы

Функциональные активности, а также константы ингибирования фермента (K_I) полипептида 949 в отношении MMP13 из разных видов исследовали с использованием кинетического анализа на основе FRET. Все разведения получали в аналитическом буфере (50 мМ Tris (pH 7,5), 100 мМ NaCl, 10 мМ CaCl₂∙2H₂0, 0,01% Tween20). 11–точечную DRC (12^–я=контроль) 1/3 серийного разведения полипептида 949, начиная с 9 мкМ (конечная концентрация), уравновешивали постоянной концентрацией 0,2 нМ каталитического домена (cd) MMP–13 или 0,2–20 нМ активированного про–MMP13 (номинальная концентрация) каждого вида. Затем во все лунки добавляли постоянную концентрацию 22 мкМ (конечная концентрация) флуорогенного MMP субстрата. Этот субстрат на основе коллагена содержит типичную последовательность расщепления MMP Пролин–Лейцин–Глицин–Лейцин (PLGL) и помечен флуорохром, Mca и Dpa гасителем. Активный фермент (не связанный конструкцией Нанотела) способен расщеплять субстрат, приводя к высвобождению флуорохрома и приводя к флуоресцентному сигналу (длина волны возбуждения 320 нм/длина волны эмиссии 405 нм), тогда как нейтрализованный (связанный конструкцией Нанотела) фермент не способен. Начиная в течение одной минуты после добавления субстрата, флуоресценцию измеряли кинетически каждую минуту в течение всех 120 циклов (2 часа) с использованием планшет–ридера Tecan F200.

Полученные кривые процесса (флуоресцентный сигнал в зависимости от времени реакции) анализировали с использованием программы GraphPad Prism путем совмещения линейной части каждой кривой процесса с прямой линией (Y=угол наклона * X+Y–отсекаемый на оси отрезок). Полученные углы наклона или скорости реакций (v_i) нормализовали относительно среднего угла наклона всех контрольных образцов (неингибированная скорость реакции, v₀), наносили на график как функцию концентрации полипептида 949 и подгоняли с использованием подбора несимметричной 5–параметрической логистической кривой (5PL) для получения кривых ингибирования.

В этих условиях анализа полученное IC₅₀значение равняется константе ингибирования K_I.

Результаты количественного анализа представлены в Таблице 5.3. Два–шесть независимых экспериментов повторяли в расчете на взаимодействие. На основании 6 независимых повторных экспериментов, константа ингибирования полипептида 949 в отношении человеческого cdMMP13 была определена как равная 27,86 нМ (95% CI: 25,67–30,23 нМ). На основании 3 независимых повторных экспериментов, K_I для активированного человеческого про–MMP13 была определена как равная 2,92 нМ (95% CI: 0,61–14,02 нМ). K_Iзначения для MMP13 яванского макака и крысы в высокой степени соответствует человеческим K_I для каталитического домена(cd), а также активированного про–MMP13 (pro), что говорит о перекрестной реактивности полипептида 949 в отношении MMP13 яванского макака и крысы.

Таблица 5.3 Обзор результатов определения аффинности полипептида 949 в отношении каталитического домена MMP13 и активированнго про–MMP13 человека, яванского макака и крысы

Таблица 5.3
	MMP13 форма	N	Среднее значение K _I (нМ)	CV (%)	95% CI для K _I (нМ)
Человек	cd	6	27,86	7,7	25,67–30,23
Человек	pro	3	2,92	52,7	0,61–14,02
Яванский макак	cd	3	20,21	1,6	19,43–21,03
Яванский макак	pro	2	3,72	5,5	2,27–6,11
Крыса	cd	3	26,59	9,2	21,19–33,36
Крыса	pro	2	13,02	31,9	0,70–241,59

Средние K_I значения, а также 95% доверительные интервалы (CI) рассчитывали путем определения суммарных средних значений. Cd: каталитический домен; pro: активированный про–MMP13; CV: коэффициент вариаций.

Функциональное ингибирование cdMMP13 человека, яванского макака и крысы, а также активированного про–MMP13 полипептидом 949 оценивали одновременно в экспериментах, которые осуществляли для измерения K_I (см. выше). Фиг. 2 является репрезентативной графической иллюстрацией результатов. Эти результаты демонстрируют дозозависимое и полное функциональное ингибирование ферментативной активности cdMMP13 и про–MMP13 форм всех испытанных видов конструкцией Нанотела 949.

5.4 Аффинность полипептида 949 к Аггрекану G1–IGD–G2 человека, яванского макака и крысы

Определение аффинности полипептида 949 по отношению к рекомбинантному Аггрекану G1–IGD–G2 человека, яванского макака и крысы осуществляли с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR) на устройстве ProteOn XPR36 для анализа множества различных взаимодействий (BioRad, серийный номер 670BR6176). Вкратце, рекомбинантный Аггрекан G1–IGD–G2 (“лиганд”) был иммобилизован на лигандных дорожках сенсорного чипа GLC (Biorad cat # 176–5011) путем аминного связывания при концентрации 10 мкг/мл в 10 мМ ацетата pH 4,5 и скорости потока 100 мкл/мин с целью иммобилизации на уровне 400 резонансных единиц (RU). Полипептид 949 (“C010100949”; ‘аналит’) инжектировали вдоль полос аналита сенсорного чипа при непрерывном потоке 45 мкл/мин в течение 2 минут при различных концентрациях (0,5–1–2–4–6–10 нМ) в 1x HBS–P+pH 7,4 в качестве рабочего буфера (GE Healthcare cat#R–1006–71). Время диссоциации составило 10 мин. После каждого введения образца поверхности восстанавливали с использованием 10 мМ глицина, рН 1,5. Взаимодействие между Аггреканом G1–IGD–G2 и полипептидом 949 определяли как увеличение коэффициента преломления, которое происходит в результате изменений массы на чипе вследствие связывания полипептида 949 с Аггреканом. Это изменение коэффициента преломления вызывает изменение интенсивности и угла отраженного света, которое количественно измеряют в реальном времени и отображают на сенсограмме как единицы отклика (RU) в зависимости от времени. Кинетические константы рассчитывали по полученным сенсограммам с использованием программы ProteOn Manager 3.1.0 версии 3.1.0.6 и ‘кинетической k_a/k_d одновременной’ модели Ленгмюра.

Результаты представлены в Таблице 5.4. На основании 2–4 независимых повторных экспериментов средние значения аффинности связывания (K_D) полипептида 949 в отношении захваченного Аггрекана G1–IGD–G2 были определены как составляющие 14,0 пМ, 16,0 пМ и 16,6 пМ для Аггрекана человека, яванского макака и крысы, соответственно.

Поскольку способ действия (МоА) структурных блоков CAP полипептида 949 основан исключительно на связывании с Аггреканом, что непосредственно отражается в определении сродства на основе SPR, дальнейший функциональный анализ структурных блоков CAP не имеет значения. Из этих данных SPR можно сделать вывод, что полипептид 949 демонстрирует полную перекрестную реактивность в отношении Аггрекана яванского макака и крысы без разницы в аффинности по сравнению с человеческим.

Таблица 5.4 Обзор результатов определения аффинности 949 в отношении Аггрекана G1–IGD–G2 человека, яванского макака и крысы.

Таблица 5.4
	N	Среднее значение K _D (пМ)	95% CI для K _D (пМ)
Человек	4	14,0	5,9–33,7
Яванский макак	2	16,0	NC (*)
Крыса	3	16,6	7,0–39,5

Средние K_D значения, а также 95% доверительные интервалы (CI) рассчитывали путем определения суммарных средних значений. N: количество независимых экспериментов; K_D: константа диссоциации; NC: не рассчитывали. (*) Для яванского макака 2 независимых эксперимента показали одинаковый результат 16,0 пМ, следовательно, никакой CI нельзя было рассчитать, поскольку программа ProteOn не представила никакой информации о стандартных ошибках для K_D.

Пример 6 Ингибирование разрушения хряща ex vivo в модели бычьего эксплантата

Полипептид 949 (M–A–C–C: 62C02–2F03–114F08–114F08) испытывали в анализах эксплантата бычьего хряща на ингибирование разрушения хряща.

Вкратце, полипептид инкубировали с эксплантатами бычьего хряща, которые культивировали в течение 5 дней с IL–1α, чтобы вызвать ОА–подобный процесс разрушения хряща. В течение 5 дней происходит разрушение главным образом Аггрекана, тогда как разрушение Коллагена происходит только примерно через две недели, то есть после прекращения экспериментов, описанных в настоящей заявке. В конце эксперимента количественно определяли GAG (преимущественно из Аггрекана), который высвобождался из разрушающегося хряща в культуральный супернатант. Эффективность ингибирования высвобождения GAG полипептидом рассчитывали по сравнению с эталонным низкомолекулярным ингибитором, который в этих условиях полностью ингибировал IL–1α–стимулированное высвобождение GAG.

Результаты представлены на Фиг. 3.

Можно видеть, что полипептид 949 (NB949 на Фиг.) полностью ингибирует разрушение бычьего хряща дозозависимым образом.

Пример 7 Ингибирование разрушения хряща ex vivo в модели человеческого эксплантата

Полипептид 949 (M–A–C–C: 62C02–2F03–114F08–114F08) испытывали в анализах эксплантата человеческого хряща на ингибирование разрушения хряща. Вкратце, полипептид инкубировали с эксплантатами человеческого хряща, которые культивировали в течение 7 дней с IL–1β+Онкостатин M (OSM). В течение 7 дней происходит разрушение главным образом Аггрекана, тогда как разрушение Коллагена происходит только примерно через две недели, то есть после прекращения экспериментов, описанных в настоящей заявке. В конце эксперимента количественно определяли GAG (преимущественно из Аггрекана), который высвобождался из разрушающегося хряща в культуральный супернатант. IC50 рассчитывали на основании уровня отрицательного контроля (= высвобождению GAG из эксплантатов без дополнительного стимула) и IL–1 β+OSM уровня, как показателя максимальной потери GAG. GAG показан как высвобождение GAG (в мкг) на мг хряща каждого индивидуального эксплантата.

Результаты представлены на Фиг. 4.

Данные показывают, что конструкция Нанотела ингибирует высвобождение GAG из человеческого OA хряща дозозависимым образом, с рассчитанным IC₅₀ значением 0,03724 мкМ.

Пример 8 CAP продлевает ex vivo эффективность полипептидов, ингибирующих разрушение хряща

Чтобы оценить эффект CAP фрагмента, который функционирует для закрепления полипептида в хряще, описанный выше анализ бычьего эксплантата модифицировали, включив в него стадии промывки после стадии инкубации (1ч) хрящевого эксплантата с полипептидами (см. Фиг. 5, верхняя панель). После стадий промывки инициировали разрушение хряща добавлением IL–1α. После 7 дней дополнительной инкубации высвобождение GAG в культуральный супернатант определяли количественно. В качестве контроля был включен ингибирующий ADAMTS5 полипептид 581, который не содержит CAP–связывающего фрагмента (SEQ ID NO: 65).

Результаты показаны на Фиг. 5.

Эксперимент показывает, что контрольный полипептид 581, то есть полипептид, не содержащий CAP–связывающего фрагмента, почти не проявляет эффективности в ингибировании ADAMTS5. Это сильно отличается от анализов, в которых стадии промывки отсутствовали. С другой стороны, полипептид 949 оставался эффективным даже после интенсивной промывки. Учитывая, что высвобождение GAG обусловлено ADAMTS5, а не MMP13 в настоящих условиях анализа, этот результат является убедительным свидетельством того, что CAP–связывающий фрагмент действительно функционирует для закрепления полипептидов в хряще, и что CAP–связывающий фрагмент не влияет на эффективность ADAMTS5 ISVD.

Пример 9 Эффект полипептида 949 в системе ко–культивирования синовиального слоя бычьего хряща

Зная, что ОА затрагивает не только хрящ, полипептид 949 также испытывали в бычьей модели, состоящей из синовиальной мембраны (синовиального слоя) и эксплантатов из суставного хряща. Вкратце, эксплантаты хряща и синовиальный слой в соотношении 1/1 совместно культивировали в течение 28 дней с регулярной заменой среды. На еженедельной основе в супернатанте совместных культур определяли С2М (разложение Col II) и С3М (разложение Col III).

Результаты (в виде AUC=площадь под кривой) представлены на Фиг. 6.

Данные показывают, что совместная инкубация хрящевых эксплантов с синовиальным слоем индуцирует высвобождение С2М (левый график) и С3М (правый график). Полипептид 949 инкубировали в 3 различных концентрациях (1 нМ, 10 нМ, 100 нМ). Эффект полипептида 949 оценивали по сравнению с эталонной молекулой Wyeth (MSC2310852A–1). Данные показывают, что иллюстративный полипептид 949, а также эталонное соединение сильно ингибируют высвобождение С2М и С3М.

Пример 10 Исследования удерживания в хряще

Чтобы определить удерживание конструкций Нанотела in vivo, было проведено исследование удерживания в хряще крысы с использованием типичного полипептида 949. Поскольку полипептид 949 имеет 4 структурных блока (MACC), предполагается, что полипептиды 754 и 954, каждый с двумя Аггрекан–связующими и одним мишень–специфическим ISVD, ведут себя по существу аналогично.

Анализ связывания лиганда на основе ELISA был разработан для количественного определения локальных концентраций конструкции Нанотела в хряще крысы, в то время как анализ связывания лиганда (MSD платформа) был разработан для количественного определения конструкции Нанотела в кровотоке.

Результаты показаны на Фиг. 7.

В заключение, иллюстративный полипептид 949 удерживается в хряще in vivo до 112 дней после и/а введения, в то время как системные концентрации (низкий пг/мл диапазон) были обнаружены только в первой точке времени отбора проб (2 часа после и/а введения) у здоровых крыс, при этом никакой полипептид нельзя было обнаружить в более поздние моменты времени (14 дней и более).

Следовательно, конструкции, включающие анти–Аггрекан ISVD 114F08 являются стабильными и удерживаются в моделях in vivo.

Пример 11 Исследование 1 на крысах in vivo ММT DMOAD

Чтобы продемонстрировать in vivo эффективность полипептида 754 (М–С–С; "Нанотело 754"), полипептида 954 (A–C–C; "Нанотело 954") и полипептида 949 (M–A–C–C, "Нанотело 949"), использовали модель хирургически–индуцированного разрыва медиального мениска (MMT) у крыс. Вкратце, крыс оперировали на одном колене, чтобы вызвать ОА–подобные симптомы. Лечение начали через 3 дня после операции путем введения одной и/а инъекции. Через 3 дня после операции животным вводили следующие дозы: носитель (буфер), полипептид 754 (300 мкг/крыса), полипептид 949 (4, 40 или 400 мкг/крыса) и полипептид 954 (300 мкг/крыса).

Гистопатологию осуществляли на 42 день после операции. Определяли ширину дегенерации медиального большеберцового хряща и общую дегенерацию медиального большеберцового хряща, а также процент снижения дегенерации хряща. Использовали по 20 животных на группу.

Результаты определения ширины дегенерации медиального большеберцового хряща показаны на Фиг. 8.

Результаты демонстрируют, что ширина медиального большеберцового хряща существенно уменьшалась при использовании всех конструкций Нанотела через 42 дня по сравнению с носителем. Эти результаты дополнительно предполагают, что

(а) CAP–фрагмент не оказывает негативного влияния на активность конструкций;

(b) CAP–фрагмент обеспечивает возможность удерживания конструкций;

(c) все конструкции имеют положительный эффект на ширину хряща; а также

(d) комбинация ингибитора ADAMTS5 и ингибитора MMP13 демонстрирует наибольший общий эффект, как продемонстрировано полипептидом 949.

Пример 12 Подтверждающее исследование 2 на крысах in vivo ММT DMOAD

Исследования эффективности in vivo, описанные в Примере 11 (DMOAD исследование 1), по существу повторяли с другой схемой введения. Кроме того, в DMOAD исследовании 1 присутствовал только ОА легкой степени через 3 дня после операции. Следовательно, полипептиды теперь оценивали на более поздней стадии ОА в модели ММТ, при этом лечение начинали через 7 дней после операции. Вкратце, ширину дегенерации медиального большеберцового хряща в мкм измеряли на 42 день после операции. Опять же, полипептид 949 использовали для иллюстрации комбинированного эффекта ингибиторов ADAMTS5 и MMP13.

В первой серии экспериментов, состоящей из 20 животных в группе, каждая группа получала одну и/а инъекцию (400 мкг, 800 мкг, носитель) через 7 дней после операции. В конце лечения группа, получавшая 400 мкг полипептида 949, показала снижение ширины дегенерации медиального большеберцового хряща на 21%, тогда как группа 800 мкг показала снижение на 16% (см. Фиг. 9). Эти результаты подтверждают эффективность конструкций.

Во второй серии экспериментов, снова состоящих из 20 животных в группе, каждая группа получала две и/а инъекции в день 7 и день 10 после операции (200 мкг, 400 мкг, 800 мкг, носитель). В конце лечения группа, получавшая 200 мкг полипептида 949, показала уменьшение ширины большеберцовой кости на 14%, группа 800 мкг показала уменьшение на 31%, а группа 400 мкг показала уменьшение на 35% (Фиг. 9).

Пример 13 Симптоматическая польза in vivo

Чтобы оценить способность полипептидов обеспечивать симптоматическую пользу, использовали крысиную модель хирургического ОА. Вкраце, крыс подвергали ACLt и tMx операции для индукции ОА в день 0. В ACLt и tMx хирургической модели (рассечение передней крестообразной связки с удалением медиального мениска) конструкции вводили и/а на 1–й и 8–й неделях в различных концентрациях (100 мкг, 400 мкг и 1000 мкг). Одной группе крыс вводили путем и/а инъекции Танезумаб (Pfizer), mAb против фактора роста нервов (NGF), который был включен в качестве положительного контроля для облегчения симптомов в исследовании. В недели 2, 5, 9 и 13 определяли симптоматическую пользу посредством анализа походки (на CatWalk), а также уменьшение диаметра сустава.

Результаты показаны на Фиг. 10.

Интраартикулярное лечение полипептидами приводило к симптоматическому эффекту до 43%.

Пример 14 Удерживание CAP связующих у здоровых крыс и крыс с остеоартритом одинаково in vivo

В Примере 10 в исследовании удерживания в хряще у здоровых крыс было продемонстрировано, что полипептиды по изобретению можно измерить в хряще вплоть до 112 дней после интраартикулярной (и/а) инъекции. Поскольку состав хряща может оказывать влияние на связывание в хряще и абсорбцию в системном кровотоке, фармакокинетику полипептидов по изобретению сравнивали у больных остеоартритом и здоровых крыс in vivo, отслеживая уровни в сыворотке полипептидов с течением времени.

В частности, использовали хирургически индуцированную модель разрыва медиального мениска (MMT) у крыс, как описано в Примере 10, но с некоторыми модификациями. Вкратце, полипептиды по изобретению связывали с анти–MMP13ISV и анти–ADAMTS5 ISV (обозначены как “949”, “0949” или “C010100949” Нанотела). Крыс оперировали на одном колене для индукции ОА–подобных симптомов (ОА–группа). Каждая группа лечения (здоровые и ОА) состояла из 15 животных и получала одну и/а инъекцию 400 мкг/30 мкл Нанотела в день 7 (здоровые) или через 7 дней после операции (MMT). Образцы сыворотки собирали у анестезированных крыс в день 0, в день 7 (в 0 часов=образец до введения дозы), в день 8 (в разное время после обработки до 24 часов), в день 9 (48 часов после обработки), день 10 (3 дня после обработки), день 14 (7 дней после обработки), день 21 (14 дней после обработки) и день 42 (35 дней после обработки). Собранные образцы сыворотки использовали для определения концентраций полипептида в электрохемолюминесцентном PK–анализе (ECL), с последующим некомпартментным анализом.

Удерживание полипептидов в сыворотке здоровых и ОА крыс показано на Фиг. 11.

Результаты демонстрируют, что не наблюдается очевидных различий в концентрациях полипептидов в сыворотке у здоровых крыс и крыс с ОА. Следовательно, эти результаты подтверждают, что разрушение хряща никак не влияет на фармакокинетику полипептидов по изобретению.

Таблица A–1 Название и краткое описание ("ID"), SEQ ID NO: ("SEQ") и аминокислотные последовательности полипептидов по изобретению
ID	SEQ	Последовательность
ALX–1011 949	1	EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFAFSAAYMSWVRQAPGKGLEWVSSISDDGSKTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCNTGYGATTTRPGRYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGRTVSSYAMGWFRQAPGKEREFVAGISRSAERTYYVDSLKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAADLDPNRIFSREEYAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSTFIINVVRWYRRAPGKQRELVATISSGGNANYVDSVRGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCNVPTTHYGGVYYGPYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSTFIINVVRWYRRAPGKQRELVATISSGGNANYVDSVRGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCNVPTTHYGGVYYGPYWGQGTLVTVSSA
62C02 MMP13	2	EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFAFSAAYMSWVRQAPGKGLEWVSSISDDGSKTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCNTGYGATTTRPGRYWGQGTLVTVSS
2F03 ATS5	3	EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGRTVSSYAMGWFRQAPGKEREFVAGISRSAERTYYVDSLKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAADLDPNRIFSREEYAYWGQGTLVTVSS
114F08 CAP	4	EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSTFIINVVRWYRRAPGKQRELVATISSGGNANYVDSVRGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCNVPTTHYGGVYYGPYWGQGTLVTVSS
MCC 754	5	EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFAFSAAYMSWVRQAPGKGLEWVSSISDDGSKTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCNTGYGATTTRPGRYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSTFIINVVRWYRRAPGKQRELVATISSGGNANYVDSVRGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCNVPTTHYGGVYYGPYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSTFIINVVRWYRRAPGKQRELVATISSGGNANYVDSVRGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCNVPTTHYGGVYYGPYWGQGTLVTVSSA
ACC 954	6	EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGRTVSSYAMGWFRQAPGKEREFVAGISRSAERTYYVDSLKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAADLDPNRIFSREEYAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSTFIINVVRWYRRAPGKQRELVATISSGGNANYVDSVRGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCNVPTTHYGGVYYGPYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSTFIINVVRWYRRAPGKQRELVATISSGGNANYVDSVRGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCNVPTTHYGGVYYGPYWGQGTLVTVSSA
114F08–Alb "054"	41	EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSTFIINVVRWYRRTPGKQRELVATISSGGNANYVDSVRGRFSISRDGAKNAVDLQMNGLKPEDTAVYYCNVPTTHYGGVYYGPYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSAVMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS
Alb–114F08 –114F08 "118"	42	EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSAVMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSTFIINVVRWYRRTPGKQRELVATISSGGNANYVDSVRGRFSISRDGAKNAVDLQMNGLKPEDTAVYYCNVPTTHYGGVYYGPYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSTFIINVVRWYRRTPGKQRELVATISSGGNANYVDSVRGRFSISRDGAKNAVDLQMNGLKPEDTAVYYCNVPTTHYGGVYYGPYWGQGTLVTVSS
Alb–Alb "030"	43	EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSAVMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSAVMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS
949–9GS “973”	62	EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFAFSAAYMSWVRQAPGKGLEWVSSISDDGSKTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCNTGYGATTTRPGRYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGRTVSSYAMGWFRQAPGKEREFVAGISRSAERTYYVDSLKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAADLDPNRIFSREEYAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSTFIINVVRWYRRAPGKQRELVATISSGGNANYVDSVRGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCNVPTTHYGGVYYGPYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSTFIINVVRWYRRAPGKQRELVATISSGGNANYVDSVRGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCNVPTTHYGGVYYGPYWGQGTLVTVSSA
754–9GS	63	EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFAFSAAYMSWVRQAPGKGLEWVSSISDDGSKTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCNTGYGATTTRPGRYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSTFIINVVRWYRRAPGKQRELVATISSGGNANYVDSVRGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCNVPTTHYGGVYYGPYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSTFIINVVRWYRRAPGKQRELVATISSGGNANYVDSVRGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCNVPTTHYGGVYYGPYWGQGTLVTVSSA
954–9GS	64	EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGRTVSSYAMGWFRQAPGKEREFVAGISRSAERTYYVDSLKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAADLDPNRIFSREEYAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSTFIINVVRWYRRAPGKQRELVATISSGGNANYVDSVRGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCNVPTTHYGGVYYGPYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSTFIINVVRWYRRAPGKQRELVATISSGGNANYVDSVRGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCNVPTTHYGGVYYGPYWGQGTLVTVSSA
pp 581	65	DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGRTVSSYAMGWFRQAPGKEREFVAGISRSAERTYYVDSLKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAADLDPNRIFSREEYAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA

Таблица B Прочие аминокислотные последовательности: Название и краткое описание ("ID"), SEQ ID NO: ("SEQ") и аминокислотные последовательности ("последовательности")
ID	SEQ	Последовательность
MMP13 человека	66	MHPGVLAAFLFLSWTHCRALPLPSGGDEDDLSEEDLQFAERYLRSYYHPTNLAGILKENAASSMTERLREMQSFFGLEVTGKLDDNTLDVMKKPRCGVPDVGEYNVFPRTLKWSKMNLTYRIVNYTPDMTHSEVEKAFKKAFKVWSDVTPLNFTRLHDGIADIMISFGIKEHGDFYPFDGPSGLLAHAFPPGPNYGGDAHFDDDETWTSSSKGYNLFLVAAHEFGHSLGLDHSKDPGALMFPIYTYTGKSHFMLPDDDVQGIQSLYGPGDEDPNPKHPKTPDKCDPSLSLDAITSLRGETMIFKDRFFWRLHPQQVDAELFLTKSFWPELPNRIDAAYEHPSHDLIFIFRGRKFWALNGYDILEGYPKKISELGLPKEVKKISAAVHFEDTGKTLLFSGNQVWRYDDTNHIMDKDYPRLIEEDFPGIGDKVDAVYEKNGYIYFFNGPIQFEYSIWSNRIVRVMPANSILWC
ADAMTS5 человека	67	MLLGWASLLLCAFRLPLAAVGPAATPAQDKAGQPPTAAAAAQPRRRQGEEVQERAEPPGHPHPLAQRRRSKGLVQNIDQLYSGGGKVGYLVYAGGRRFLLDLERDGSVGIAGFVPAGGGTSAPWRHRSHCFYRGTVDGSPRSLAVFDLCGGLDGFFAVKHARYTLKPLLRGPWAEEEKGRVYGDGSARILHVYTREGFSFEALPPRASCETPASTPEAHEHAPAHSNPSGRAALASQLLDQSALSPAGGSGPQTWWRRRRRSISRARQVELLLVADASMARLYGRGLQHYLLTLASIANRLYSHASIENHIRLAVVKVVVLGDKDKSLEVSKNAATTLKNFCKWQHQHNQLGDDHEEHYDAAILFTREDLCGHHSCDTLGMADVGTICSPERSCAVIEDDGLHAAFTVAHEIGHLLGLSHDDSKFCEETFGSTEDKRLMSSILTSIDASKPWSKCTSATITEFLDDGHGNCLLDLPRKQILGPEELPGQTYDATQQCNLTFGPEYSVCPGMDVCARLWCAVVRQGQMVCLTKKLPAVEGTPCGKGRICLQGKCVDKTKKKYYSTSSHGNWGSWGSWGQCSRSCGGGVQFAYRHCNNPAPRNNGRYCTGKRAIYRSCSLMPCPPNGKSFRHEQCEAKNGYQSDAKGVKTFVEWVPKYAGVLPADVCKLTCRAKGTGYYVVFSPKVTDGTECRLYSNSVCVRGKCVRTGCDGIIGSKLQYDKCGVCGGDNSSCTKIVGTFNKKSKGYTDVVRIPEGATHIKVRQFKAKDQTRFTAYLALKKKNGEYLINGKYMISTSETIIDINGTVMNYSGWSHRDDFLHGMGYSATKEILIVQILATDPTKPLDVRYSFFVPKKSTPKVNSVTSHGSNKVGSHTSQPQWVTGPWLACSRTCDTGWHTRTVQCQDGNRKLAKGCPLSQRPSAFKQCLLKKC
Аггрекан человека	68	MTTLLWVFVTLRVITAAVTVETSDHDNSLSVSIPQPSPLRVLLGTSLTIPCYFIDPMHPVTTAPSTAPLAPRIKWSRVSKEKEVVLLVATEGRVRVNSAYQDKVSLPNYPAIPSDATLEVQSLRSNDSGVYRCEVMHGIEDSEATLEVVVKGIVFHYRAISTRYTLDFDRAQRACLQNSAIIATPEQLQAAYEDGFHQCDAGWLADQTVRYPIHTPREGCYGDKDEFPGVRTYGIRDTNETYDVYCFAEEMEGEVFYATSPEKFTFQEAANECRRLGARLATTGHVYLAWQAGMDMCSAGWLADRSVRYPISKARPNCGGNLLGVRTVYVHANQTGYPDPSSRYDAICYTGEDFVDIPENFFGVGGEEDITVQTVTWPDMELPLPRNITEGEARGSVILTVKPIFEVSPSPLEPEEPFTFAPEIGATAFAEVENETGEATRPWGFPTPGLGPATAFTSEDLVVQVTAVPGQPHLPGGVVFHYRPGPTRYSLTFEEAQQACPGTGAVIASPEQLQAAYEAGYEQCDAGWLRDQTVRYPIVSPRTPCVGDKDSSPGVRTYGVRPSTETYDVYCFVDRLEGEVFFATRLEQFTFQEALEFCESHNATATTGQLYAAWSRGLDKCYAGWLADGSLRYPIVTPRPACGGDKPGVRTVYLYPNQTGLPDPLSRHHAFCFRGISAVPSPGEEEGGTPTSPSGVEEWIVTQVVPGVAAVPVEEETTAVPSGETTAILEFTTEPENQTEWEPAYTPVGTSPLPGILPTWPPTGAETEESTEGPSATEVPSASEEPSPSEVPFPSEEPSPSEEPFPSVRPFPSVELFPSEEPFPSKEPSPSEEPSASEEPYTPSPPEPSWTELPSSGEESGAPDVSGDFTGSGDVSGHLDFSGQLSGDRASGLPSGDLDSSGLTSTVGSGLTVESGLPSGDEERIEWPSTPTVGELPSGAEILEGSASGVGDLSGLPSGEVLETSASGVGDLSGLPSGEVLETTAPGVEDISGLPSGEVLETTAPGVEDISGLPSGEVLETTAPGVEDISGLPSGEVLETTAPGVEDISGLPSGEVLETTAPGVEDISGLPSGEVLETAAPGVEDISGLPSGEVLETAAPGVEDISGLPSGEVLETAAPGVEDISGLPSGEVLETAAPGVEDISGLPSGEVLETAAPGVEDISGLPSGEVLETAAPGVEDISGLPSGEVLETAAPGVEDISGLPSGEVLETAAPGVEDISGLPSGEVLETAAPGVEDISGLPSGEVLETAAPGVEDISGLPSGEVLETAAPGVEDISGLPSGEVLETTAPGVEEISGLPSGEVLETTAPGVDEISGLPSGEVLETTAPGVEEISGLPSGEVLETSTSAVGDLSGLPSGGEVLEISVSGVEDISGLPSGEVVETSASGIEDVSELPSGEGLETSASGVEDLSRLPSGEEVLEISASGFGDLSGVPSGGEGLETSASEVGTDLSGLPSGREGLETSASGAEDLSGLPSGKEDLVGSASGDLDLGKLPSGTLGSGQAPETSGLPSGFSGEYSGVDLGSGPPSGLPDFSGLPSGFPTVSLVDSTLVEVVTASTASELEGRGTIGISGAGEISGLPSSELDISGRASGLPSGTELSGQASGSPDVSGEIPGLFGVSGQPSGFPDTSGETSGVTELSGLSSGQPGVSGEASGVLYGTSQPFGITDLSGETSGVPDLSGQPSGLPGFSGATSGVPDLVSGTTSGSGESSGITFVDTSLVEVAPTTFKEEEGLGSVELSGLPSGEADLSGKSGMVDVSGQFSGTVDSSGFTSQTPEFSGLPSGIAEVSGESSRAEIGSSLPSGAYYGSGTPSSFPTVSLVDRTLVESVTQAPTAQEAGEGPSGILELSGAHSGAPDMSGEHSGFLDLSGLQSGLIEPSGEPPGTPYFSGDFASTTNVSGESSVAMGTSGEASGLPEVTLITSEFVEGVTEPTISQELGQRPPVTHTPQLFESSGKVSTAGDISGATPVLPGSGVEVSSVPESSSETSAYPEAGFGASAAPEASREDSGSPDLSETTSAFHEANLERSSGLGVSGSTLTFQEGEASAAPEVSGESTTTSDVGTEAPGLPSATPTASGDRTEISGDLSGHTSQLGVVISTSIPESEWTQQTQRPAETHLEIESSSLLYSGEETHTVETATSPTDASIPASPEWKRESESTAAAPARSCAEEPCGAGTCKETEGHVICLCPPGYTGEHCNIDQEVCEEGWNKYQGHCYRHFPDRETWVDAERRCREQQSHLSSIVTPEEQEFVNNNAQDYQWIGLNDRTIEGDFRWSDGHPMQFENWRPNQPDNFFAAGEDCVVMIWHEKGEWNDVPCNYHLPFTCKKGTVACGEPPVVEHARTFGQKKDRYEINSLVRYQCTEGFVQRHMPTIRCQPSGHWEEPRITCTDATTYKRRLQKRSSRHPRRSRPSTAH

Таблица C Различные линкерные последовательности (“ID” относится к SEQ ID NO, как используется в таблице)
Название	ID	Аминокислотная последовательность
A3	24	AAA
5GS линкер	25	GGGGS
7GS линкер	26	sggsggs
8GS линкер	27	Gggggggs
9GS линкер	28	GGGGSGGGS
10GS линкер	29	GGGGSGGGGS
15GS линкер	30	GGGGSGGGGSGGGGS
18GS линкер	31	GGGGSGGGGSGGGGGGGS
20GS линкер	32	GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
25GS линкер	33	GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
30GS линкер	34	GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
35GS линкер	35	GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
40GS линкер	36	GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
G1 шарнирный участок	37	EPKSCDKTHTCPPCP
9GS–G1 шарнирный участок	38	GGGGSGGGSEPKSCDKTHTCPPCP
Верхняя длинная шарнирная область ламы	39	epktpkpqpaaa
G3 шарнирный участок	40	ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP

Таблица A–2
Последовательности для CDR и каркасных областей, плюс предпочтительные комбинации, как представлено в формуле I, а именно FR1–CDR1–FR2–CDR2–FR3–CDR3–FR4 (следующие термины: “ID” относится к представленной SEQ ID NO)

ID

нанотело

ID

FR1

ID

CDR1

ID

FR2

ID

CDR2

ID

FR3

ID

CDR3

ID

FR4

2

62C02 MMP13

7

EVQLVE SGGGVV QPGGSL RLSCAAS

8

GFAFSA AYMS

9

WVRQAPG KGLEWVS

10

SISDDG SKTY

11

YADSVKGRF TISRDNSKN TVYLQMNSL RPEDTALYY CNT

12

GYGATTTR PGRY

13

WGQGTLV TVSS

3

02F03 ATS5

7

EVQLVE SGGGVV QPGGSL RLSCAAS

14

GRTVSS YAMG

15

WFRQAPG KEREFVA

16

GISRSA ERTY

17

YVDSLKGRFT ISRDNSKNTV YLQMNSLRPE DTALYYCAA

18

DLDPNRIFS REEYAY

13

WGQGTLV TVSS

4

114F08 Аггрекан–CAP

7

EVQLVE SGGGVV QPGGSL RLSCAAS

19

GSTFII NVVR

20

WYRRAPG KQRELVA

21

TISSGG NAN

22

YVDSVRGRFT ISRDNSKNTV YLQMNSLRPE DTALYYCNV

23

PTTHYGGVY YGPY

13

WGQGTLV TVSS

Таблица D Связывающиеся с сывороточным альбумином последовательности ISVD (“ID” относится к SEQ ID NO, используемому в таблице), включая последовательности CDR
Название	ID	Аминокислотная последовательность
Alb8	44	EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS
Alb23	45	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS
Alb129	46	EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTATYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA
Alb132	47	EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTATYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA
Alb11	48	EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS
Alb11 (S112K)–A	49	EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVKVSSA
Alb82	50	EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS
Alb82–A	51	EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA
Alb82–AA	52	EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSAA
Alb82–AAA	53	EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSAAA
Alb82–G	54	EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSG
Alb82–GG	55	EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGG
Alb82–GGG	56	EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGG
Alb92	57	EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS
Alb223	58	EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA
ALB CDR1	59	SFGMS
ALB CDR2	60	SISGSGSDTLYADSVKG
ALB CDR3	61	GGSLSR

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Merck Patent GmbH

Ablynx N.V.

<120> Полипептиды, связывающиеся с ADAMTS5, MMP13 и Аггреканом

<130> MEPAT.0105

<150> EP17174404.8

<151> 2017-06-02

<160> 68

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 593

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ala Ala

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Asp Asp Gly Ser Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Thr Gly Tyr Gly Ala Thr Thr Thr Arg Pro Gly Arg Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu

145 150 155 160

Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu

165 170 175

Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Val Ser Ser Tyr Ala Met Gly Trp

180 185 190

Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Gly Ile Ser

195 200 205

Arg Ser Ala Glu Arg Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Leu Lys Gly Arg Phe

210 215 220

Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn

225 230 235 240

Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Leu

245 250 255

Asp Pro Asn Arg Ile Phe Ser Arg Glu Glu Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln

260 265 270

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

275 280 285

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

290 295 300

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val

305 310 315 320

Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser

325 330 335

Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ile Ile Asn Val Val Arg Trp Tyr

340 345 350

Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Ser Ser

355 360 365

Gly Gly Asn Ala Asn Tyr Val Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile

370 375 380

Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

385 390 395 400

Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Asn Val Pro Thr Thr His

405 410 415

Tyr Gly Gly Val Tyr Tyr Gly Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

420 425 430

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

435 440 445

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

450 455 460

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly

465 470 475 480

Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

485 490 495

Gly Ser Thr Phe Ile Ile Asn Val Val Arg Trp Tyr Arg Arg Ala Pro

500 505 510

Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ala

515 520 525

Asn Tyr Val Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

530 535 540

Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp

545 550 555 560

Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Asn Val Pro Thr Thr His Tyr Gly Gly Val

565 570 575

Tyr Tyr Gly Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

580 585 590

Ala

<210> 2

<211> 121

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ala Ala

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Asp Asp Gly Ser Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Thr Gly Tyr Gly Ala Thr Thr Thr Arg Pro Gly Arg Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 3

<211> 124

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 3

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ser Arg Ser Ala Glu Arg Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Leu

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Leu Asp Pro Asn Arg Ile Phe Ser Arg Glu Glu Tyr Ala

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 4

<211> 121

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 4

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ile Ile Asn

20 25 30

Val Val Arg Trp Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ala Asn Tyr Val Asp Ser Val Arg

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Val Pro Thr Thr His Tyr Gly Gly Val Tyr Tyr Gly Pro Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 5

<211> 434

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 5

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ala Ala

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Asp Asp Gly Ser Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Thr Gly Tyr Gly Ala Thr Thr Thr Arg Pro Gly Arg Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu

145 150 155 160

Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu

165 170 175

Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ile Ile Asn Val Val Arg Trp

180 185 190

Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Ser

195 200 205

Ser Gly Gly Asn Ala Asn Tyr Val Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr

210 215 220

Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser

225 230 235 240

Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Asn Val Pro Thr Thr

245 250 255

His Tyr Gly Gly Val Tyr Tyr Gly Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

260 265 270

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

275 280 285

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

290 295 300

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly

305 310 315 320

Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala

325 330 335

Ser Gly Ser Thr Phe Ile Ile Asn Val Val Arg Trp Tyr Arg Arg Ala

340 345 350

Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asn

355 360 365

Ala Asn Tyr Val Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp

370 375 380

Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu

385 390 395 400

Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Asn Val Pro Thr Thr His Tyr Gly Gly

405 410 415

Val Tyr Tyr Gly Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

420 425 430

Ser Ala

<210> 6

<211> 437

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 6

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ser Arg Ser Ala Glu Arg Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Leu

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Leu Asp Pro Asn Arg Ile Phe Ser Arg Glu Glu Tyr Ala

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

145 150 155 160

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser

165 170 175

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ile Ile Asn Val

180 185 190

Val Arg Trp Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala

195 200 205

Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ala Asn Tyr Val Asp Ser Val Arg Gly

210 215 220

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln

225 230 235 240

Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Asn Val

245 250 255

Pro Thr Thr His Tyr Gly Gly Val Tyr Tyr Gly Pro Tyr Trp Gly Gln

260 265 270

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

275 280 285

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

290 295 300

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val

305 310 315 320

Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser

325 330 335

Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ile Ile Asn Val Val Arg Trp Tyr

340 345 350

Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Ser Ser

355 360 365

Gly Gly Asn Ala Asn Tyr Val Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile

370 375 380

Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

385 390 395 400

Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Asn Val Pro Thr Thr His

405 410 415

Tyr Gly Gly Val Tyr Tyr Gly Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

420 425 430

Thr Val Ser Ser Ala

435

<210> 7

<211> 25

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 8

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 8

Gly Phe Ala Phe Ser Ala Ala Tyr Met Ser

1 5 10

<210> 9

<211> 14

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 9

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

1 5 10

<210> 10

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 10

Ser Ile Ser Asp Asp Gly Ser Lys Thr Tyr

1 5 10

<210> 11

<211> 39

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 11

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser

1 5 10 15

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

20 25 30

Ala Leu Tyr Tyr Cys Asn Thr

35

<210> 12

<211> 12

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 12

Gly Tyr Gly Ala Thr Thr Thr Arg Pro Gly Arg Tyr

1 5 10

<210> 13

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 13

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 14

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 14

Gly Arg Thr Val Ser Ser Tyr Ala Met Gly

1 5 10

<210> 15

<211> 14

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 15

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala

1 5 10

<210> 16

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 16

Gly Ile Ser Arg Ser Ala Glu Arg Thr Tyr

1 5 10

<210> 17

<211> 39

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 17

Tyr Val Asp Ser Leu Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser

1 5 10 15

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

20 25 30

Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Ala

35

<210> 18

<211> 15

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 18

Asp Leu Asp Pro Asn Arg Ile Phe Ser Arg Glu Glu Tyr Ala Tyr

1 5 10 15

<210> 19

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 19

Gly Ser Thr Phe Ile Ile Asn Val Val Arg

1 5 10

<210> 20

<211> 14

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 20

Trp Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala

1 5 10

<210> 21

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 21

Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ala Asn

1 5

<210> 22

<211> 39

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 22

Tyr Val Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser

1 5 10 15

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

20 25 30

Ala Leu Tyr Tyr Cys Asn Val

35

<210> 23

<211> 13

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 23

Pro Thr Thr His Tyr Gly Gly Val Tyr Tyr Gly Pro Tyr

1 5 10

<210> 24

<400> 24

000

<210> 25

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 25

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 26

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 26

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

1 5

<210> 27

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 27

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 28

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 28

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 29

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 29

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 30

<211> 15

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 30

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 31

<211> 18

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 31

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser

<210> 32

<211> 20

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 32

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 33

<211> 25

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 33

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

20 25

<210> 34

<211> 30

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 34

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

20 25 30

<210> 35

<211> 35

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 35

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Ser

35

<210> 36

<211> 40

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 36

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

35 40

<210> 37

<211> 15

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 37

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

<210> 38

<211> 24

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 38

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

1 5 10 15

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

20

<210> 39

<211> 12

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 39

Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Ala Ala Ala

1 5 10

<210> 40

<211> 62

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 40

Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys

1 5 10 15

Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro

20 25 30

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu

35 40 45

Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro

50 55 60

<210> 41

<211> 271

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 41

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ile Ile Asn

20 25 30

Val Val Arg Trp Tyr Arg Arg Thr Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ala Asn Tyr Val Asp Ser Val Arg

50 55 60

Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Gly Ala Lys Asn Ala Val Asp Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Gly Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Val Pro Thr Thr His Tyr Gly Gly Val Tyr Tyr Gly Pro Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu

145 150 155 160

Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu

165 170 175

Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ala Val Met Ser Trp

180 185 190

Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser

195 200 205

Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe

210 215 220

Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn

225 230 235 240

Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly

245 250 255

Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

260 265 270

<210> 42

<211> 427

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 42

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ala

20 25 30

Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

165 170 175

Ser Thr Phe Ile Ile Asn Val Val Arg Trp Tyr Arg Arg Thr Pro Gly

180 185 190

Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ala Asn

195 200 205

Tyr Val Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Gly Ala

210 215 220

Lys Asn Ala Val Asp Leu Gln Met Asn Gly Leu Lys Pro Glu Asp Thr

225 230 235 240

Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Val Pro Thr Thr His Tyr Gly Gly Val Tyr

245 250 255

Tyr Gly Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly

260 265 270

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

275 280 285

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

290 295 300

Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala

305 310 315 320

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ile

325 330 335

Ile Asn Val Val Arg Trp Tyr Arg Arg Thr Pro Gly Lys Gln Arg Glu

340 345 350

Leu Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ala Asn Tyr Val Asp Ser

355 360 365

Val Arg Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Gly Ala Lys Asn Ala Val

370 375 380

Asp Leu Gln Met Asn Gly Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

385 390 395 400

Cys Asn Val Pro Thr Thr His Tyr Gly Gly Val Tyr Tyr Gly Pro Tyr

405 410 415

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

420 425

<210> 43

<211> 265

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 43

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ala

20 25 30

Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

165 170 175

Phe Thr Phe Ser Ser Ala Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

180 185 190

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr

195 200 205

Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

210 215 220

Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp

225 230 235 240

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser

245 250 255

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

260 265

<210> 44

<211> 115

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 44

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 45

<211> 115

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 45

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 46

<211> 116

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 46

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala

115

<210> 47

<211> 116

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 47

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala

115

<210> 48

<211> 115

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 48

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 49

<211> 116

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 49

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Lys

100 105 110

Val Ser Ser Ala

115

<210> 50

<211> 115

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 50

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 51

<211> 116

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 51

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala

115

<210> 52

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 52

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ala

115

<210> 53

<211> 118

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 53

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ala Ala

115

<210> 54

<211> 116

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 54

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly

115

<210> 55

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 55

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly Gly

115

<210> 56

<211> 118

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 56

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly Gly Gly

115

<210> 57

<211> 115

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 57

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 58

<211> 116

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 58

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala

115

<210> 59

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 59

Ser Phe Gly Met Ser

1 5

<210> 60

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 60

Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 61

<211> 6

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 61

Gly Gly Ser Leu Ser Arg

1 5

<210> 62

<211> 515

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 62

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ala Ala

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Asp Asp Gly Ser Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Thr Gly Tyr Gly Ala Thr Thr Thr Arg Pro Gly Arg Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro

130 135 140

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Val Ser

145 150 155 160

Ser Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu

165 170 175

Phe Val Ala Gly Ile Ser Arg Ser Ala Glu Arg Thr Tyr Tyr Val Asp

180 185 190

Ser Leu Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

195 200 205

Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr

210 215 220

Tyr Cys Ala Ala Asp Leu Asp Pro Asn Arg Ile Phe Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly

245 250 255

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly

260 265 270

Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

275 280 285

Gly Ser Thr Phe Ile Ile Asn Val Val Arg Trp Tyr Arg Arg Ala Pro

290 295 300

Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ala

305 310 315 320

Asn Tyr Val Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

325 330 335

Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp

340 345 350

Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Asn Val Pro Thr Thr His Tyr Gly Gly Val

355 360 365

Tyr Tyr Gly Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

370 375 380

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser

385 390 395 400

Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

405 410 415

Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ile Ile Asn Val Val Arg Trp Tyr Arg Arg

420 425 430

Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly

435 440 445

Asn Ala Asn Tyr Val Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

450 455 460

Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro

465 470 475 480

Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Asn Val Pro Thr Thr His Tyr Gly

485 490 495

Gly Val Tyr Tyr Gly Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

500 505 510

Ser Ser Ala

515

<210> 63

<211> 382

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 63

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ala Ala

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Asp Asp Gly Ser Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Thr Gly Tyr Gly Ala Thr Thr Thr Arg Pro Gly Arg Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro

130 135 140

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ile

145 150 155 160

Ile Asn Val Val Arg Trp Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu

165 170 175

Leu Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ala Asn Tyr Val Asp Ser

180 185 190

Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val

195 200 205

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr

210 215 220

Cys Asn Val Pro Thr Thr His Tyr Gly Gly Val Tyr Tyr Gly Pro Tyr

225 230 235 240

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

245 250 255

Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val

260 265 270

Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr

275 280 285

Phe Ile Ile Asn Val Val Arg Trp Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gln

290 295 300

Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ala Asn Tyr Val

305 310 315 320

Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn

325 330 335

Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu

340 345 350

Tyr Tyr Cys Asn Val Pro Thr Thr His Tyr Gly Gly Val Tyr Tyr Gly

355 360 365

Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

370 375 380

<210> 64

<211> 385

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 64

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ser Arg Ser Ala Glu Arg Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Leu

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Leu Asp Pro Asn Arg Ile Phe Ser Arg Glu Glu Tyr Ala

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val

130 135 140

Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser

145 150 155 160

Thr Phe Ile Ile Asn Val Val Arg Trp Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Lys

165 170 175

Gln Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ala Asn Tyr

180 185 190

Val Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys

195 200 205

Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala

210 215 220

Leu Tyr Tyr Cys Asn Val Pro Thr Thr His Tyr Gly Gly Val Tyr Tyr

225 230 235 240

Gly Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly

245 250 255

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly

260 265 270

Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

275 280 285

Gly Ser Thr Phe Ile Ile Asn Val Val Arg Trp Tyr Arg Arg Ala Pro

290 295 300

Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ala

305 310 315 320

Asn Tyr Val Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

325 330 335

Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp

340 345 350

Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Asn Val Pro Thr Thr His Tyr Gly Gly Val

355 360 365

Tyr Tyr Gly Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

370 375 380

Ala

385

<210> 65

<211> 275

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 65

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ser Arg Ser Ala Glu Arg Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Leu

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Leu Asp Pro Asn Arg Ile Phe Ser Arg Glu Glu Tyr Ala

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

145 150 155 160

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn Ser

165 170 175

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly

180 185 190

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

195 200 205

Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys

210 215 220

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu

225 230 235 240

Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Thr

245 250 255

Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

260 265 270

Ser Ser Ala

275

<210> 66

<211> 471

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 66

Met His Pro Gly Val Leu Ala Ala Phe Leu Phe Leu Ser Trp Thr His

1 5 10 15

Cys Arg Ala Leu Pro Leu Pro Ser Gly Gly Asp Glu Asp Asp Leu Ser

20 25 30

Glu Glu Asp Leu Gln Phe Ala Glu Arg Tyr Leu Arg Ser Tyr Tyr His

35 40 45

Pro Thr Asn Leu Ala Gly Ile Leu Lys Glu Asn Ala Ala Ser Ser Met

50 55 60

Thr Glu Arg Leu Arg Glu Met Gln Ser Phe Phe Gly Leu Glu Val Thr

65 70 75 80

Gly Lys Leu Asp Asp Asn Thr Leu Asp Val Met Lys Lys Pro Arg Cys

85 90 95

Gly Val Pro Asp Val Gly Glu Tyr Asn Val Phe Pro Arg Thr Leu Lys

100 105 110

Trp Ser Lys Met Asn Leu Thr Tyr Arg Ile Val Asn Tyr Thr Pro Asp

115 120 125

Met Thr His Ser Glu Val Glu Lys Ala Phe Lys Lys Ala Phe Lys Val

130 135 140

Trp Ser Asp Val Thr Pro Leu Asn Phe Thr Arg Leu His Asp Gly Ile

145 150 155 160

Ala Asp Ile Met Ile Ser Phe Gly Ile Lys Glu His Gly Asp Phe Tyr

165 170 175

Pro Phe Asp Gly Pro Ser Gly Leu Leu Ala His Ala Phe Pro Pro Gly

180 185 190

Pro Asn Tyr Gly Gly Asp Ala His Phe Asp Asp Asp Glu Thr Trp Thr

195 200 205

Ser Ser Ser Lys Gly Tyr Asn Leu Phe Leu Val Ala Ala His Glu Phe

210 215 220

Gly His Ser Leu Gly Leu Asp His Ser Lys Asp Pro Gly Ala Leu Met

225 230 235 240

Phe Pro Ile Tyr Thr Tyr Thr Gly Lys Ser His Phe Met Leu Pro Asp

245 250 255

Asp Asp Val Gln Gly Ile Gln Ser Leu Tyr Gly Pro Gly Asp Glu Asp

260 265 270

Pro Asn Pro Lys His Pro Lys Thr Pro Asp Lys Cys Asp Pro Ser Leu

275 280 285

Ser Leu Asp Ala Ile Thr Ser Leu Arg Gly Glu Thr Met Ile Phe Lys

290 295 300

Asp Arg Phe Phe Trp Arg Leu His Pro Gln Gln Val Asp Ala Glu Leu

305 310 315 320

Phe Leu Thr Lys Ser Phe Trp Pro Glu Leu Pro Asn Arg Ile Asp Ala

325 330 335

Ala Tyr Glu His Pro Ser His Asp Leu Ile Phe Ile Phe Arg Gly Arg

340 345 350

Lys Phe Trp Ala Leu Asn Gly Tyr Asp Ile Leu Glu Gly Tyr Pro Lys

355 360 365

Lys Ile Ser Glu Leu Gly Leu Pro Lys Glu Val Lys Lys Ile Ser Ala

370 375 380

Ala Val His Phe Glu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Leu Phe Ser Gly Asn

385 390 395 400

Gln Val Trp Arg Tyr Asp Asp Thr Asn His Ile Met Asp Lys Asp Tyr

405 410 415

Pro Arg Leu Ile Glu Glu Asp Phe Pro Gly Ile Gly Asp Lys Val Asp

420 425 430

Ala Val Tyr Glu Lys Asn Gly Tyr Ile Tyr Phe Phe Asn Gly Pro Ile

435 440 445

Gln Phe Glu Tyr Ser Ile Trp Ser Asn Arg Ile Val Arg Val Met Pro

450 455 460

Ala Asn Ser Ile Leu Trp Cys

465 470

<210> 67

<211> 930

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 67

Met Leu Leu Gly Trp Ala Ser Leu Leu Leu Cys Ala Phe Arg Leu Pro

1 5 10 15

Leu Ala Ala Val Gly Pro Ala Ala Thr Pro Ala Gln Asp Lys Ala Gly

20 25 30

Gln Pro Pro Thr Ala Ala Ala Ala Ala Gln Pro Arg Arg Arg Gln Gly

35 40 45

Glu Glu Val Gln Glu Arg Ala Glu Pro Pro Gly His Pro His Pro Leu

50 55 60

Ala Gln Arg Arg Arg Ser Lys Gly Leu Val Gln Asn Ile Asp Gln Leu

65 70 75 80

Tyr Ser Gly Gly Gly Lys Val Gly Tyr Leu Val Tyr Ala Gly Gly Arg

85 90 95

Arg Phe Leu Leu Asp Leu Glu Arg Asp Gly Ser Val Gly Ile Ala Gly

100 105 110

Phe Val Pro Ala Gly Gly Gly Thr Ser Ala Pro Trp Arg His Arg Ser

115 120 125

His Cys Phe Tyr Arg Gly Thr Val Asp Gly Ser Pro Arg Ser Leu Ala

130 135 140

Val Phe Asp Leu Cys Gly Gly Leu Asp Gly Phe Phe Ala Val Lys His

145 150 155 160

Ala Arg Tyr Thr Leu Lys Pro Leu Leu Arg Gly Pro Trp Ala Glu Glu

165 170 175

Glu Lys Gly Arg Val Tyr Gly Asp Gly Ser Ala Arg Ile Leu His Val

180 185 190

Tyr Thr Arg Glu Gly Phe Ser Phe Glu Ala Leu Pro Pro Arg Ala Ser

195 200 205

Cys Glu Thr Pro Ala Ser Thr Pro Glu Ala His Glu His Ala Pro Ala

210 215 220

His Ser Asn Pro Ser Gly Arg Ala Ala Leu Ala Ser Gln Leu Leu Asp

225 230 235 240

Gln Ser Ala Leu Ser Pro Ala Gly Gly Ser Gly Pro Gln Thr Trp Trp

245 250 255

Arg Arg Arg Arg Arg Ser Ile Ser Arg Ala Arg Gln Val Glu Leu Leu

260 265 270

Leu Val Ala Asp Ala Ser Met Ala Arg Leu Tyr Gly Arg Gly Leu Gln

275 280 285

His Tyr Leu Leu Thr Leu Ala Ser Ile Ala Asn Arg Leu Tyr Ser His

290 295 300

Ala Ser Ile Glu Asn His Ile Arg Leu Ala Val Val Lys Val Val Val

305 310 315 320

Leu Gly Asp Lys Asp Lys Ser Leu Glu Val Ser Lys Asn Ala Ala Thr

325 330 335

Thr Leu Lys Asn Phe Cys Lys Trp Gln His Gln His Asn Gln Leu Gly

340 345 350

Asp Asp His Glu Glu His Tyr Asp Ala Ala Ile Leu Phe Thr Arg Glu

355 360 365

Asp Leu Cys Gly His His Ser Cys Asp Thr Leu Gly Met Ala Asp Val

370 375 380

Gly Thr Ile Cys Ser Pro Glu Arg Ser Cys Ala Val Ile Glu Asp Asp

385 390 395 400

Gly Leu His Ala Ala Phe Thr Val Ala His Glu Ile Gly His Leu Leu

405 410 415

Gly Leu Ser His Asp Asp Ser Lys Phe Cys Glu Glu Thr Phe Gly Ser

420 425 430

Thr Glu Asp Lys Arg Leu Met Ser Ser Ile Leu Thr Ser Ile Asp Ala

435 440 445

Ser Lys Pro Trp Ser Lys Cys Thr Ser Ala Thr Ile Thr Glu Phe Leu

450 455 460

Asp Asp Gly His Gly Asn Cys Leu Leu Asp Leu Pro Arg Lys Gln Ile

465 470 475 480

Leu Gly Pro Glu Glu Leu Pro Gly Gln Thr Tyr Asp Ala Thr Gln Gln

485 490 495

Cys Asn Leu Thr Phe Gly Pro Glu Tyr Ser Val Cys Pro Gly Met Asp

500 505 510

Val Cys Ala Arg Leu Trp Cys Ala Val Val Arg Gln Gly Gln Met Val

515 520 525

Cys Leu Thr Lys Lys Leu Pro Ala Val Glu Gly Thr Pro Cys Gly Lys

530 535 540

Gly Arg Ile Cys Leu Gln Gly Lys Cys Val Asp Lys Thr Lys Lys Lys

545 550 555 560

Tyr Tyr Ser Thr Ser Ser His Gly Asn Trp Gly Ser Trp Gly Ser Trp

565 570 575

Gly Gln Cys Ser Arg Ser Cys Gly Gly Gly Val Gln Phe Ala Tyr Arg

580 585 590

His Cys Asn Asn Pro Ala Pro Arg Asn Asn Gly Arg Tyr Cys Thr Gly

595 600 605

Lys Arg Ala Ile Tyr Arg Ser Cys Ser Leu Met Pro Cys Pro Pro Asn

610 615 620

Gly Lys Ser Phe Arg His Glu Gln Cys Glu Ala Lys Asn Gly Tyr Gln

625 630 635 640

Ser Asp Ala Lys Gly Val Lys Thr Phe Val Glu Trp Val Pro Lys Tyr

645 650 655

Ala Gly Val Leu Pro Ala Asp Val Cys Lys Leu Thr Cys Arg Ala Lys

660 665 670

Gly Thr Gly Tyr Tyr Val Val Phe Ser Pro Lys Val Thr Asp Gly Thr

675 680 685

Glu Cys Arg Leu Tyr Ser Asn Ser Val Cys Val Arg Gly Lys Cys Val

690 695 700

Arg Thr Gly Cys Asp Gly Ile Ile Gly Ser Lys Leu Gln Tyr Asp Lys

705 710 715 720

Cys Gly Val Cys Gly Gly Asp Asn Ser Ser Cys Thr Lys Ile Val Gly

725 730 735

Thr Phe Asn Lys Lys Ser Lys Gly Tyr Thr Asp Val Val Arg Ile Pro

740 745 750

Glu Gly Ala Thr His Ile Lys Val Arg Gln Phe Lys Ala Lys Asp Gln

755 760 765

Thr Arg Phe Thr Ala Tyr Leu Ala Leu Lys Lys Lys Asn Gly Glu Tyr

770 775 780

Leu Ile Asn Gly Lys Tyr Met Ile Ser Thr Ser Glu Thr Ile Ile Asp

785 790 795 800

Ile Asn Gly Thr Val Met Asn Tyr Ser Gly Trp Ser His Arg Asp Asp

805 810 815

Phe Leu His Gly Met Gly Tyr Ser Ala Thr Lys Glu Ile Leu Ile Val

820 825 830

Gln Ile Leu Ala Thr Asp Pro Thr Lys Pro Leu Asp Val Arg Tyr Ser

835 840 845

Phe Phe Val Pro Lys Lys Ser Thr Pro Lys Val Asn Ser Val Thr Ser

850 855 860

His Gly Ser Asn Lys Val Gly Ser His Thr Ser Gln Pro Gln Trp Val

865 870 875 880

Thr Gly Pro Trp Leu Ala Cys Ser Arg Thr Cys Asp Thr Gly Trp His

885 890 895

Thr Arg Thr Val Gln Cys Gln Asp Gly Asn Arg Lys Leu Ala Lys Gly

900 905 910

Cys Pro Leu Ser Gln Arg Pro Ser Ala Phe Lys Gln Cys Leu Leu Lys

915 920 925

Lys Cys

930

<210> 68

<211> 2415

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность

<400> 68

Met Thr Thr Leu Leu Trp Val Phe Val Thr Leu Arg Val Ile Thr Ala

1 5 10 15

Ala Val Thr Val Glu Thr Ser Asp His Asp Asn Ser Leu Ser Val Ser

20 25 30

Ile Pro Gln Pro Ser Pro Leu Arg Val Leu Leu Gly Thr Ser Leu Thr

35 40 45

Ile Pro Cys Tyr Phe Ile Asp Pro Met His Pro Val Thr Thr Ala Pro

50 55 60

Ser Thr Ala Pro Leu Ala Pro Arg Ile Lys Trp Ser Arg Val Ser Lys

65 70 75 80

Glu Lys Glu Val Val Leu Leu Val Ala Thr Glu Gly Arg Val Arg Val

85 90 95

Asn Ser Ala Tyr Gln Asp Lys Val Ser Leu Pro Asn Tyr Pro Ala Ile

100 105 110

Pro Ser Asp Ala Thr Leu Glu Val Gln Ser Leu Arg Ser Asn Asp Ser

115 120 125

Gly Val Tyr Arg Cys Glu Val Met His Gly Ile Glu Asp Ser Glu Ala

130 135 140

Thr Leu Glu Val Val Val Lys Gly Ile Val Phe His Tyr Arg Ala Ile

145 150 155 160

Ser Thr Arg Tyr Thr Leu Asp Phe Asp Arg Ala Gln Arg Ala Cys Leu

165 170 175

Gln Asn Ser Ala Ile Ile Ala Thr Pro Glu Gln Leu Gln Ala Ala Tyr

180 185 190

Glu Asp Gly Phe His Gln Cys Asp Ala Gly Trp Leu Ala Asp Gln Thr

195 200 205

Val Arg Tyr Pro Ile His Thr Pro Arg Glu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys

210 215 220

Asp Glu Phe Pro Gly Val Arg Thr Tyr Gly Ile Arg Asp Thr Asn Glu

225 230 235 240

Thr Tyr Asp Val Tyr Cys Phe Ala Glu Glu Met Glu Gly Glu Val Phe

245 250 255

Tyr Ala Thr Ser Pro Glu Lys Phe Thr Phe Gln Glu Ala Ala Asn Glu

260 265 270

Cys Arg Arg Leu Gly Ala Arg Leu Ala Thr Thr Gly His Val Tyr Leu

275 280 285

Ala Trp Gln Ala Gly Met Asp Met Cys Ser Ala Gly Trp Leu Ala Asp

290 295 300

Arg Ser Val Arg Tyr Pro Ile Ser Lys Ala Arg Pro Asn Cys Gly Gly

305 310 315 320

Asn Leu Leu Gly Val Arg Thr Val Tyr Val His Ala Asn Gln Thr Gly

325 330 335

Tyr Pro Asp Pro Ser Ser Arg Tyr Asp Ala Ile Cys Tyr Thr Gly Glu

340 345 350

Asp Phe Val Asp Ile Pro Glu Asn Phe Phe Gly Val Gly Gly Glu Glu

355 360 365

Asp Ile Thr Val Gln Thr Val Thr Trp Pro Asp Met Glu Leu Pro Leu

370 375 380

Pro Arg Asn Ile Thr Glu Gly Glu Ala Arg Gly Ser Val Ile Leu Thr

385 390 395 400

Val Lys Pro Ile Phe Glu Val Ser Pro Ser Pro Leu Glu Pro Glu Glu

405 410 415

Pro Phe Thr Phe Ala Pro Glu Ile Gly Ala Thr Ala Phe Ala Glu Val

420 425 430

Glu Asn Glu Thr Gly Glu Ala Thr Arg Pro Trp Gly Phe Pro Thr Pro

435 440 445

Gly Leu Gly Pro Ala Thr Ala Phe Thr Ser Glu Asp Leu Val Val Gln

450 455 460

Val Thr Ala Val Pro Gly Gln Pro His Leu Pro Gly Gly Val Val Phe

465 470 475 480

His Tyr Arg Pro Gly Pro Thr Arg Tyr Ser Leu Thr Phe Glu Glu Ala

485 490 495

Gln Gln Ala Cys Pro Gly Thr Gly Ala Val Ile Ala Ser Pro Glu Gln

500 505 510

Leu Gln Ala Ala Tyr Glu Ala Gly Tyr Glu Gln Cys Asp Ala Gly Trp

515 520 525

Leu Arg Asp Gln Thr Val Arg Tyr Pro Ile Val Ser Pro Arg Thr Pro

530 535 540

Cys Val Gly Asp Lys Asp Ser Ser Pro Gly Val Arg Thr Tyr Gly Val

545 550 555 560

Arg Pro Ser Thr Glu Thr Tyr Asp Val Tyr Cys Phe Val Asp Arg Leu

565 570 575

Glu Gly Glu Val Phe Phe Ala Thr Arg Leu Glu Gln Phe Thr Phe Gln

580 585 590

Glu Ala Leu Glu Phe Cys Glu Ser His Asn Ala Thr Ala Thr Thr Gly

595 600 605

Gln Leu Tyr Ala Ala Trp Ser Arg Gly Leu Asp Lys Cys Tyr Ala Gly

610 615 620

Trp Leu Ala Asp Gly Ser Leu Arg Tyr Pro Ile Val Thr Pro Arg Pro

625 630 635 640

Ala Cys Gly Gly Asp Lys Pro Gly Val Arg Thr Val Tyr Leu Tyr Pro

645 650 655

Asn Gln Thr Gly Leu Pro Asp Pro Leu Ser Arg His His Ala Phe Cys

660 665 670

Phe Arg Gly Ile Ser Ala Val Pro Ser Pro Gly Glu Glu Glu Gly Gly

675 680 685

Thr Pro Thr Ser Pro Ser Gly Val Glu Glu Trp Ile Val Thr Gln Val

690 695 700

Val Pro Gly Val Ala Ala Val Pro Val Glu Glu Glu Thr Thr Ala Val

705 710 715 720

Pro Ser Gly Glu Thr Thr Ala Ile Leu Glu Phe Thr Thr Glu Pro Glu

725 730 735

Asn Gln Thr Glu Trp Glu Pro Ala Tyr Thr Pro Val Gly Thr Ser Pro

740 745 750

Leu Pro Gly Ile Leu Pro Thr Trp Pro Pro Thr Gly Ala Glu Thr Glu

755 760 765

Glu Ser Thr Glu Gly Pro Ser Ala Thr Glu Val Pro Ser Ala Ser Glu

770 775 780

Glu Pro Ser Pro Ser Glu Val Pro Phe Pro Ser Glu Glu Pro Ser Pro

785 790 795 800

Ser Glu Glu Pro Phe Pro Ser Val Arg Pro Phe Pro Ser Val Glu Leu

805 810 815

Phe Pro Ser Glu Glu Pro Phe Pro Ser Lys Glu Pro Ser Pro Ser Glu

820 825 830

Glu Pro Ser Ala Ser Glu Glu Pro Tyr Thr Pro Ser Pro Pro Glu Pro

835 840 845

Ser Trp Thr Glu Leu Pro Ser Ser Gly Glu Glu Ser Gly Ala Pro Asp

850 855 860

Val Ser Gly Asp Phe Thr Gly Ser Gly Asp Val Ser Gly His Leu Asp

865 870 875 880

Phe Ser Gly Gln Leu Ser Gly Asp Arg Ala Ser Gly Leu Pro Ser Gly

885 890 895

Asp Leu Asp Ser Ser Gly Leu Thr Ser Thr Val Gly Ser Gly Leu Thr

900 905 910

Val Glu Ser Gly Leu Pro Ser Gly Asp Glu Glu Arg Ile Glu Trp Pro

915 920 925

Ser Thr Pro Thr Val Gly Glu Leu Pro Ser Gly Ala Glu Ile Leu Glu

930 935 940

Gly Ser Ala Ser Gly Val Gly Asp Leu Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu

945 950 955 960

Val Leu Glu Thr Ser Ala Ser Gly Val Gly Asp Leu Ser Gly Leu Pro

965 970 975

Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Thr Ala Pro Gly Val Glu Asp Ile Ser

980 985 990

Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Thr Ala Pro Gly Val Glu

995 1000 1005

Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Thr Ala Pro

1010 1015 1020

Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr

1025 1030 1035 1040

Thr Ala Pro Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val

1045 1050 1055

Leu Glu Thr Thr Ala Pro Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser

1060 1065 1070

Gly Glu Val Leu Glu Thr Ala Ala Pro Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly

1075 1080 1085

Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Ala Ala Pro Gly Val Glu Asp

1090 1095 1100

Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Ala Ala Pro Gly

1105 1110 1115 1120

Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Ala

1125 1130 1135

Ala Pro Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu

1140 1145 1150

Glu Thr Ala Ala Pro Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly

1155 1160 1165

Glu Val Leu Glu Thr Ala Ala Pro Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu

1170 1175 1180

Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Ala Ala Pro Gly Val Glu Asp Ile

1185 1190 1195 1200

Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Ala Ala Pro Gly Val

1205 1210 1215

Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Ala Ala

1220 1225 1230

Pro Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu

1235 1240 1245

Thr Ala Ala Pro Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu

1250 1255 1260

Val Leu Glu Thr Ala Ala Pro Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro

1265 1270 1275 1280

Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Thr Ala Pro Gly Val Glu Glu Ile Ser

1285 1290 1295

Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Thr Ala Pro Gly Val Asp

1300 1305 1310

Glu Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Thr Ala Pro

1315 1320 1325

Gly Val Glu Glu Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr

1330 1335 1340

Ser Thr Ser Ala Val Gly Asp Leu Ser Gly Leu Pro Ser Gly Gly Glu

1345 1350 1355 1360

Val Leu Glu Ile Ser Val Ser Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro

1365 1370 1375

Ser Gly Glu Val Val Glu Thr Ser Ala Ser Gly Ile Glu Asp Val Ser

1380 1385 1390

Glu Leu Pro Ser Gly Glu Gly Leu Glu Thr Ser Ala Ser Gly Val Glu

1395 1400 1405

Asp Leu Ser Arg Leu Pro Ser Gly Glu Glu Val Leu Glu Ile Ser Ala

1410 1415 1420

Ser Gly Phe Gly Asp Leu Ser Gly Val Pro Ser Gly Gly Glu Gly Leu

1425 1430 1435 1440

Glu Thr Ser Ala Ser Glu Val Gly Thr Asp Leu Ser Gly Leu Pro Ser

1445 1450 1455

Gly Arg Glu Gly Leu Glu Thr Ser Ala Ser Gly Ala Glu Asp Leu Ser

1460 1465 1470

Gly Leu Pro Ser Gly Lys Glu Asp Leu Val Gly Ser Ala Ser Gly Asp

1475 1480 1485

Leu Asp Leu Gly Lys Leu Pro Ser Gly Thr Leu Gly Ser Gly Gln Ala

1490 1495 1500

Pro Glu Thr Ser Gly Leu Pro Ser Gly Phe Ser Gly Glu Tyr Ser Gly

1505 1510 1515 1520

Val Asp Leu Gly Ser Gly Pro Pro Ser Gly Leu Pro Asp Phe Ser Gly

1525 1530 1535

Leu Pro Ser Gly Phe Pro Thr Val Ser Leu Val Asp Ser Thr Leu Val

1540 1545 1550

Glu Val Val Thr Ala Ser Thr Ala Ser Glu Leu Glu Gly Arg Gly Thr

1555 1560 1565

Ile Gly Ile Ser Gly Ala Gly Glu Ile Ser Gly Leu Pro Ser Ser Glu

1570 1575 1580

Leu Asp Ile Ser Gly Arg Ala Ser Gly Leu Pro Ser Gly Thr Glu Leu

1585 1590 1595 1600

Ser Gly Gln Ala Ser Gly Ser Pro Asp Val Ser Gly Glu Ile Pro Gly

1605 1610 1615

Leu Phe Gly Val Ser Gly Gln Pro Ser Gly Phe Pro Asp Thr Ser Gly

1620 1625 1630

Glu Thr Ser Gly Val Thr Glu Leu Ser Gly Leu Ser Ser Gly Gln Pro

1635 1640 1645

Gly Val Ser Gly Glu Ala Ser Gly Val Leu Tyr Gly Thr Ser Gln Pro

1650 1655 1660

Phe Gly Ile Thr Asp Leu Ser Gly Glu Thr Ser Gly Val Pro Asp Leu

1665 1670 1675 1680

Ser Gly Gln Pro Ser Gly Leu Pro Gly Phe Ser Gly Ala Thr Ser Gly

1685 1690 1695

Val Pro Asp Leu Val Ser Gly Thr Thr Ser Gly Ser Gly Glu Ser Ser

1700 1705 1710

Gly Ile Thr Phe Val Asp Thr Ser Leu Val Glu Val Ala Pro Thr Thr

1715 1720 1725

Phe Lys Glu Glu Glu Gly Leu Gly Ser Val Glu Leu Ser Gly Leu Pro

1730 1735 1740

Ser Gly Glu Ala Asp Leu Ser Gly Lys Ser Gly Met Val Asp Val Ser

1745 1750 1755 1760

Gly Gln Phe Ser Gly Thr Val Asp Ser Ser Gly Phe Thr Ser Gln Thr

1765 1770 1775

Pro Glu Phe Ser Gly Leu Pro Ser Gly Ile Ala Glu Val Ser Gly Glu

1780 1785 1790

Ser Ser Arg Ala Glu Ile Gly Ser Ser Leu Pro Ser Gly Ala Tyr Tyr

1795 1800 1805

Gly Ser Gly Thr Pro Ser Ser Phe Pro Thr Val Ser Leu Val Asp Arg

1810 1815 1820

Thr Leu Val Glu Ser Val Thr Gln Ala Pro Thr Ala Gln Glu Ala Gly

1825 1830 1835 1840

Glu Gly Pro Ser Gly Ile Leu Glu Leu Ser Gly Ala His Ser Gly Ala

1845 1850 1855

Pro Asp Met Ser Gly Glu His Ser Gly Phe Leu Asp Leu Ser Gly Leu

1860 1865 1870

Gln Ser Gly Leu Ile Glu Pro Ser Gly Glu Pro Pro Gly Thr Pro Tyr

1875 1880 1885

Phe Ser Gly Asp Phe Ala Ser Thr Thr Asn Val Ser Gly Glu Ser Ser

1890 1895 1900

Val Ala Met Gly Thr Ser Gly Glu Ala Ser Gly Leu Pro Glu Val Thr

1905 1910 1915 1920

Leu Ile Thr Ser Glu Phe Val Glu Gly Val Thr Glu Pro Thr Ile Ser

1925 1930 1935

Gln Glu Leu Gly Gln Arg Pro Pro Val Thr His Thr Pro Gln Leu Phe

1940 1945 1950

Glu Ser Ser Gly Lys Val Ser Thr Ala Gly Asp Ile Ser Gly Ala Thr

1955 1960 1965

Pro Val Leu Pro Gly Ser Gly Val Glu Val Ser Ser Val Pro Glu Ser

1970 1975 1980

Ser Ser Glu Thr Ser Ala Tyr Pro Glu Ala Gly Phe Gly Ala Ser Ala

1985 1990 1995 2000

Ala Pro Glu Ala Ser Arg Glu Asp Ser Gly Ser Pro Asp Leu Ser Glu

2005 2010 2015

Thr Thr Ser Ala Phe His Glu Ala Asn Leu Glu Arg Ser Ser Gly Leu

2020 2025 2030

Gly Val Ser Gly Ser Thr Leu Thr Phe Gln Glu Gly Glu Ala Ser Ala

2035 2040 2045

Ala Pro Glu Val Ser Gly Glu Ser Thr Thr Thr Ser Asp Val Gly Thr

2050 2055 2060

Glu Ala Pro Gly Leu Pro Ser Ala Thr Pro Thr Ala Ser Gly Asp Arg

2065 2070 2075 2080

Thr Glu Ile Ser Gly Asp Leu Ser Gly His Thr Ser Gln Leu Gly Val

2085 2090 2095

Val Ile Ser Thr Ser Ile Pro Glu Ser Glu Trp Thr Gln Gln Thr Gln

2100 2105 2110

Arg Pro Ala Glu Thr His Leu Glu Ile Glu Ser Ser Ser Leu Leu Tyr

2115 2120 2125

Ser Gly Glu Glu Thr His Thr Val Glu Thr Ala Thr Ser Pro Thr Asp

2130 2135 2140

Ala Ser Ile Pro Ala Ser Pro Glu Trp Lys Arg Glu Ser Glu Ser Thr

2145 2150 2155 2160

Ala Ala Ala Pro Ala Arg Ser Cys Ala Glu Glu Pro Cys Gly Ala Gly

2165 2170 2175

Thr Cys Lys Glu Thr Glu Gly His Val Ile Cys Leu Cys Pro Pro Gly

2180 2185 2190

Tyr Thr Gly Glu His Cys Asn Ile Asp Gln Glu Val Cys Glu Glu Gly

2195 2200 2205

Trp Asn Lys Tyr Gln Gly His Cys Tyr Arg His Phe Pro Asp Arg Glu

2210 2215 2220

Thr Trp Val Asp Ala Glu Arg Arg Cys Arg Glu Gln Gln Ser His Leu

2225 2230 2235 2240

Ser Ser Ile Val Thr Pro Glu Glu Gln Glu Phe Val Asn Asn Asn Ala

2245 2250 2255

Gln Asp Tyr Gln Trp Ile Gly Leu Asn Asp Arg Thr Ile Glu Gly Asp

2260 2265 2270

Phe Arg Trp Ser Asp Gly His Pro Met Gln Phe Glu Asn Trp Arg Pro

2275 2280 2285

Asn Gln Pro Asp Asn Phe Phe Ala Ala Gly Glu Asp Cys Val Val Met

2290 2295 2300

Ile Trp His Glu Lys Gly Glu Trp Asn Asp Val Pro Cys Asn Tyr His

2305 2310 2315 2320

Leu Pro Phe Thr Cys Lys Lys Gly Thr Val Ala Cys Gly Glu Pro Pro

2325 2330 2335

Val Val Glu His Ala Arg Thr Phe Gly Gln Lys Lys Asp Arg Tyr Glu

2340 2345 2350

Ile Asn Ser Leu Val Arg Tyr Gln Cys Thr Glu Gly Phe Val Gln Arg

2355 2360 2365

His Met Pro Thr Ile Arg Cys Gln Pro Ser Gly His Trp Glu Glu Pro

2370 2375 2380

Arg Ile Thr Cys Thr Asp Ala Thr Thr Tyr Lys Arg Arg Leu Gln Lys

2385 2390 2395 2400

Arg Ser Ser Arg His Pro Arg Arg Ser Arg Pro Ser Thr Ala His

2405 2410 2415

<---

Claims

1. Полипептид для ингибирования опосредованного А дезинтегрином и металлопротеиназой с мотивами тромбоспондина 5 (ADAMTS5) расщепления аггрекана,

где указанный полипептид включает по меньшей мере 3 ISVD, в котором первый ISVD специфически связывается с матриксной металлопротеиназой 13 (MMP13), второй ISVD специфически связывается с ADAMTS5, а третий ISVD специфически связывается с аггреканом,

где указанный ISVD, специфически связывающийся с MMP13, содержит 3 определяющие комплементарность области (CDR1-CDR3, соответственно), в котором

(i) CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 8;

(ii) CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 10 и

(iii) CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 12;

и где указанный ISVD, специфически связывающийся с ADAMTS5, содержит 3 определяющие комплементарность области (CDR1-CDR3, соответственно), в котором

(i) CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 14 [GRTVSSYAMG];

(ii) CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 16 [GISRSAERTY] и

(iii) CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 18 [DLDPNRIFSREEYAY]; и

содержит 3 определяющие комплементарность области (CDR1-CDR3, соответственно), в котором

(i) CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 19 или аминокислотную последовательность, которая имеет до 2 аминокислотных отличий от SEQ ID NO: 19;

(ii) CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 21 или аминокислотную последовательность, которая имеет до 3 аминокислотных отличий от SEQ ID NO: 21; и

(iii) CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 23 или аминокислотную последовательность, которая имеет до 2 аминокислотных отличий от SEQ ID NO: 23.

2. Полипептид по п. 1, где указанный полипептид содержит четвертый ISVD, специфически связывающийся с аггреканом.

3. Полипептид по п. 1 или 2, где указанный ISVD, специфически связывающийся с MMP13, включает или состоит из SEQ ID NO: 2.

4. Полипептид по любому из пп. 1-3, где указанный ISVD, специфически связывающийся с ADAMTS5, включает или состоит из SEQ ID NO: 3.

5. Полипептид по любому из пп. 1-4, где указанный ISVD, специфически связывающийся с аггреканом, включает или состоит из SEQ ID NO: 4.

6. Полипептид по любому из предшествующих пунктов, где последовательности указанных третьего и четвертого ISVD являются одинаковыми.

7. Полипептид по любому из пп. 1–5, где указанные ISVD связаны друг с другом через линкер.

8. Полипептид по п. 7, где указанный линкер выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 24–40, предпочтительно SEQ ID NO: 28 [9GS] или SEQ ID NO: 35 [35GS].

9. Полипептид по п. 1, в котором указанный первый ISVD специфически связывается с MMP13, указанный второй ISVD специфически связывается с ADAMTS5, указанный третий ISVD специфически связывается с аггреканом и указанный четвертый ISVD специфически связывается с аггреканом, и где указанный полипептид включает или состоит из SEQ ID NO: 1 или 62, или включает или состоит из полипептида, который имеет по меньшей мере 95% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1 или 62.

10. Полипептид по любому из предшествующих пунктов, где

(i) указанный ISVD, специфически связывающийся с MMP13, по существу состоит из 4 каркасных областей (FR1–FR4, соответственно) и указанных 3 определяющих комплементарность областей CDR1–CDR3; и/или

(ii) указанный ISVD, специфически связывающийся с ADAMTS5, по существу состоит из 4 каркасных областей (FR1–FR4, соответственно) и указанных 3 определяющих комплементарность областей CDR1–CDR3; и/или

(iii) указанный ISVD, специфически связывающийся с аггреканом, по существу состоит из 4 каркасных областей (FR1–FR4, соответственно) и указанных 3 определяющих комплементарность областей CDR1–CDR3.

11. Конструкция для ингибирования опосредованного ADAMTS5 расщепления аггрекана, где указанная конструкция включает полипептид по любому из предшествующих пунктов и где указанная конструкция дополнительно включает одну или более других групп, которые выбраны из группы, состоящей из сывороточного белка или его фрагмента, части Fc и белка или пептида, которые могут связываться с сывороточными белками.

12. Конструкция для ингибирования опосредованного ADAMTS5 расщепления аггрекана, где указанная конструкция включает полипептид по любому из предшествующих пунктов и где указанная конструкция дополнительно включает одну или более других групп, которые выбраны из группы, состоящей из молекулы полиэтиленгликоля, маркера, токсина, метки и радиохимического вещества.

13. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по любому из пп. 1–10 или конструкцию по п. 11.

14. Вектор экспрессии, включающий нуклеиновую кислоту по п. 13.

15. Клетка–хозяин для получения полипептида по любому из пп. 1-10, включающая нуклеиновую кислоту по п. 13 или вектор экспрессии по п. 14.

16. Фармацевтическая композиция для лечения по меньшей мере одного ADAMTS5–ассоциированного заболевания, включающая эффективное количество полипептида по любому из пп. 1-10, или конструкции по п. 11 или 12, или нуклеиновой кислоты по п. 13.

17. Способ получения полипептида по любому из пп. 1–10, по меньшей мере включающий стадии:

a) экспрессии в подходящей клетке–хозяине, организме–хозяине или подходящей системе экспрессии нуклеиновой кислоты по п. 13; необязательно с последующим

b) выделением и/или очисткой полипептида по любому из пп. 1–10.

18. Фармацевтическая композиция по п. 16, которая дополнительно включает по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент и/или адъювант и необязательно включает один или более дополнительных фармацевтически активных полипептидов и/или соединений.

19. Применение композиции по п. 16 или 18, полипептида по любому из пп. 1–10 или конструкции по п. 11 или 12 в качестве лекарственного средства.

20. Применение композиции по п. 16 или 18, полипептида по любому из пп. 1–10 или конструкции по п. 11 или 12 для профилактики симптома или лечения заболевания, выбранного из группы, состоящей из артропатий и хондродистрофий, артритного заболевания, такого как остеоартрит, ревматоидный артрит, подагрический артрит, псориатический артрит, травматического разрыва или отслоения, ахондроплазии, реберного хондрита, спондилоэпиметафизарной дисплазии, межпозвоночной грыжи, дегенерации поясничного диска, дегенеративного заболевания суставов, рецидивирующего полихондрита, рассекающего остеохондрита, аггреканопатий, NASH, хронического периодонтита и аневризм брюшной аорты.

21. Способ профилактики симптома или лечения заболевания или расстройства у индивидуума, включающий введение полипептида по любому из пп. 1–10, конструкции по п. 11 или 12 или композиции по любому из пп. 16 или 18 указанному индивидууму, где указанные заболевание или расстройство выбраны из группы, состоящей из артропатии, хондродистрофии, артритного заболевания, такого как остеоартрит, ревматоидный артрит, подагрический артрит, псориатический артрит, травматического разрыва или отслоения, ахондроплазии, реберного хондрита, спондилоэпиметафизарной дисплазии, межпозвоночной грыжи, дегенерации поясничного диска, дегенеративного заболевания суставов, рецидивирующего полихондрита, рассекающего остеохондрита, аггреканопатий, NASH, хронического периодонтита и аневризм брюшной аорты.