CN102482700A - 多肽和治疗方法 - Google Patents

Abstract

本文中提供了分离的抗原结合蛋白，其包含至少一个能够结合人ADAMTS5的第一免疫球蛋白可变域。还提供了为单克隆抗体的本发明抗原结合蛋白、包含所述抗原结合蛋白的药物组合物和治疗方法。

Description

多肽和治疗方法

发明领域

本发明涉及用于抑制聚集蛋白聚糖酶，特别是ADAMTS5，由此降低软骨中聚集蛋白聚糖(aggrecan)分解的方法。

发明背景

软骨是由称作软骨细胞的专门化细胞建立的一种无血管组织，软骨细胞响应各种机械和生化刺激。软骨存在于关节衬里，间隙结缔组织，和基底膜中，而且由胞外基质构成，胞外基质由数种基质成分构成，包括II型胶原，蛋白聚糖，纤连蛋白和层粘连蛋白。

在正常软骨中，胞外基质合成被胞外基质降解抵消，导致正常基质周转。根据接收到的信号，随之发生的响应可以是同化的(导致基质生成和/或修复)或者是异化的(导致基质降解，细胞凋亡，功能丧失，和疼痛)。

响应有害压迫和/或炎性介导物(例如炎性细胞因子)暴露，软骨细胞降低基质生成并提高多种基质降解酶生成。基质降解酶的例子包括聚集蛋白聚糖酶(ADAMTS)和基质金属蛋白酶(MMP)。这些酶的活性导致软骨基质降解。聚集蛋白聚糖酶(ADAMTS)，连同MMP，降解聚集蛋白聚糖，即存在于关节软骨中的一种聚集性蛋白聚糖。在骨关节炎(OA)关节软骨中，在早期OA中的浅表区带中和在中度至重度OA中的软骨侵蚀区域附近观察到蛋白聚糖染色的丧失。

由聚集蛋白聚糖酶介导的聚集蛋白聚糖异化发生于聚集蛋白聚糖中的某些保守位点。已经显示了人ADAMTS4(在图5中显示为SEQ ID NO：44)和ADAMTS5(在图4中显示为SEQ ID NO：43)在氨基酸E373和A374之间切割聚集蛋白聚糖，产生尼奥表位(neoepitope)ARGSVIL(SEQ ID NO：1)。

胞外基质的过度降解涉及许多疾病和状况的发病机理，包括疼痛，慢性疼痛，神经性疼痛，手术后疼痛疼痛，类风湿性关节炎，骨关节炎，运动损伤，侵蚀性关节炎，强直性脊椎炎，神经痛，神经病，痛觉，神经损伤，缺血，神经变性，软骨降解，中风，失禁，炎性病症，肠易激综合征，牙周病，异常血管发生，肿瘤侵入和转移，角膜溃疡，和糖尿病并发症。

如此，需要能够抑制聚集蛋白聚糖酶活性和软骨降解的化合物。

发明概述

本发明提供了分离的多肽，其包含至少一个能够结合和/或中和人ADAMTS5的可变域。

还提供了分离的多核苷酸，其编码本发明的多肽。

还有，提供了药物组合物，其包含至少一种本发明的多肽。

本文中提供了用本发明的药物组合物来治疗罹患软骨疾病的患者的方法。

附图简述

图1：ADAMTS5单抗对ARGSVIL(SEQ ID NO：1)尼奥表位生成的体外抑制。

图2：7B4.1E11鼠单抗对ARGSVIL(SEQ ID NO：1)尼奥表位生成的体外浓度依赖性抑制。

图3：体内用选定ADAMTS5抗体或对照处理的小鼠的平均关节总分。

图4：人ADAMTS5的氨基酸序列(SEQ ID NO：43)。

图5：人ADAMTS4的氨基酸序列(SEQ ID NO：44)。

图6：人源化抗ADAMTS5抗体对重组抗原的结合。

图7：人源化抗ADAMTS5抗体对重组抗原的结合。

图8：人源化抗ADAMTS5抗体对重组抗原的结合。

图9：人源化抗ADAMTS5抗体对重组抗原的结合。

图10：ADAMTS5活性的百分比抑制。

图11：ADAMTS5活性的百分比抑制。

图12：纯化的抗ADAMTS5抗体对重组抗原的结合。

图13：结构建模预测抗原/抗体相互作用位点。

发明详述

“多核苷酸”一般指任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸，其抗原是未修饰的RNA或DNA或者是经修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不限于单链和双链DNA，为单链和双链区混合物的DNA，单链和双链RNA，和为单链和双链区混合物的RNA，包含可以为单链或更通常的双链或单链和双链区混合物的DNA和RNA的杂合分子。另外，“多核苷酸”指包含RNA或DNA或RNA和DNA二者的三链区。术语多核苷酸还包括含有一种或多种经修饰碱基的DNA或RNA和主链为稳定性或为其它原因经修饰的DNA或RNA。“经修饰”碱基包括例如三苯甲基化碱基和非常见碱基诸如肌苷。已经对DNA和RNA进行了多种修饰；如此，“多核苷酸”涵盖在自然界中通常找到的多核苷酸的化学，酶促或代谢修饰形式，以及病毒和细胞特征性的DNA和RNA的化学形式。“多核苷酸”还涵盖相对较短的多核苷酸，常常称作寡核苷酸。

“多肽”指包含两个或更多个通过肽键或经修饰肽键(即肽电子等排体)彼此连接的氨基酸的任何肽或蛋白质。“多肽”指短链(通常称作肽，寡肽或寡聚物)和较长链(一般称作蛋白质)二者。多肽可含有20种由基因编码的氨基酸以外的氨基酸。“多肽”包括通过天然过程诸如翻译后过程或通过本领域公知的化学修饰技术经修饰的氨基酸序列。此类修饰较好地描述于基础教科书中，而且更详细地描述于专著以及多卷研究文献中。修饰可发生于多肽中的任何地方，包括肽主链，氨基酸侧链和氨基或羧基末端。会领会，相同类型的修饰可以以相同或不同程度存在于给定多肽中的数个位点。还有，给定多肽可含有多种类型的修饰。多肽可以因遍在蛋白化而分支，而且它们可以是环状的，有或无分支。环状的，分支的和分支环状的多肽可源自翻译后天然过程，或者可以通过合成方法来生成。修饰包括乙酰化，酰化，ADP-核糖基化，酰胺化，黄素的共价附着，血红素模块的共价附着，核苷酸或核苷酸衍生物的共价附着，脂质或脂质衍生物的共价附着，磷脂酰肌醇的共价附着，交联，环化，二硫键形成，脱甲基，共价交联形成，半胱氨酸形成，焦谷氨酸形成，甲酰化，γ-羧化，糖基化，GPI锚形成，羟化，碘化，甲基化，肉豆蔻酰化，氧化，蛋白水解加工，磷酸化，异戊烯化，外消旋，硒化，硫酸化，tRNA介导的氨基酸向蛋白质的添加诸如精氨酰化，和遍在蛋白化。参见例如PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES，2ndEd.，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York，1993和Wold，F.，Posttranslational Protein Modifications：Perspectives and Prospects，pgs.1-12inPOSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，1983；Seifter，et al.，“Analysis forprotein modifications and nonprotein cofactors”，Meth.Enzymol.(1990)182：626-646和Rattan，et al.，“Protein Synthesis：Posttranslational Modificationsand Aging”，Ann NY Acad Sci(1992)663：48-62。

如术语在本文中是使用的，“变体”为分别与参照多核苷酸或多肽不同，但保留本质特性的多核苷酸或多肽。多核苷酸的一种典型变体在核苷酸序列方面与另一种参照多核苷酸不同。变体的核苷酸序列中的变化可改变或不改变由参照多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。核苷酸变化可导致由参照序列编码的多肽中的氨基酸替代，添加，删除，融合和截短，如下文所讨论的。多肽的一种典型变体在氨基酸序列方面与另一种参照多肽不同。一般地，差异是有限的，使得参照多肽和变体的序列总体上密切相似，而且在许多区域中相同。变体和参照多肽在氨基酸序列方面可因一处或多处任意组合的替代，添加，删除而不同。替代或插入的氨基酸残基可以是或不是由遗传密码编码的。多核苷酸或多肽的变体可以是天然发生的，诸如等位变体，或者它可以是不知道天然发生的变体。多核苷酸和多肽的非天然发生变体可通过诱变技术或通过直接合成来生成。

“分离的”意味着“人为地”自其天然状态改变，即如果它存在于自然界中的话，它已经自其初始环境变化或移除，或二者。例如，天然存在于活生物体中的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存材料分开的相同多核苷酸或多肽是“分离的”，包括但不限于当将此类多核苷酸或多肽导入回细胞中时。

“分离的”或“基本上纯的”核酸或多核苷酸(例如RNA，DNA或混合聚合物)是基本上与在其天然宿主细胞中天然伴随天然多核苷酸的其它细胞成分，例如与其天然联合的核糖体，聚合酶和基因组序列分开的。术语涵盖如下的核酸或多核苷酸：(1)已经自其天然发生环境移除，(2)不与在自然界中在其中找到“分离的多核苷酸”的多核苷酸整个或部分联合，(3)可操作连接在自然界中不连接的多核苷酸，或(4)不存在于自然界中。术语“分离的”或“基本上纯的”还可用于提及重组或克隆的DNA分离物，化学合成的多核苷酸类似物，或由异源系统生物合成的多核苷酸类似物。

然而，“分离的”不必然要求所述核酸或多核苷酸自身已经自其天然环境物理移除。例如，如果将异源序列放置在内源核酸序列附近，使得此内源核酸序列的表达改变，例如升高，降低或消除的话，生物体基因组中的内源核酸序列在本文中视为是“分离的”。在此语境中，异源序列为不是天然在内源核酸序列附近的序列，无论异源序列自身是内源的(源自相同宿主细胞或其后代)或是外源的(源自不同宿主细胞或其后代)。举例而言，启动子序列可替代(例如通过同源重组)宿主细胞的基因组中基因的天然启动子，使得此基因具有改变的表达样式。此基因现在会变成“分离的”，因为它与天然在其侧翼的序列的至少一些分开。

如果核酸含有不是天然发生于基因组中的对应核酸的任何修饰的话，它也认为是“分离的”。例如，如果内源编码序列含有人工(例如通过人干预)引入的插入，删除或点突变的话，它认为是“分离的”。“分离的核酸”还包括在异源位点处整合入宿主细胞染色体中的核酸和作为附加体存在的核酸构建物。此外，“分离的核酸”可以基本上没有其它细胞材料，或在通过重组技术生成时基本上没有培养基，或在化学合成时基本上没有化学前体或其它化学品。

如本文中所使用的，“炎性介导物”包括能够触发炎性过程的任何化合物。术语炎症一般指血管化活组织对损伤反应的过程。此过程包括但不限于升高的血流，升高的血管通透性，和白细胞渗出。因为募集入炎性反应的白细胞能释放有力的酶和氧自由基(即炎性介导物)，所以炎性应答能够介导客观的组织损害。炎性介导物的例子包括但不限于前列腺素(例如PGE2)，白三烯(例如LTB4)，炎性细胞因子，诸如肿瘤坏死因子α(TNFα)，白介素1(IL-1)，和白介素6(IL-6)；一氧化氮(NO)，金属蛋白酶，和热休克蛋白。

如本文中所使用的，“基质蛋白”包括自细胞释放，以形成软骨胞外基质的蛋白质。软骨的胞外基质由属于数个不同蛋白聚糖家族的蛋白聚糖组成。这些包括但不限于串珠蛋白聚糖(perlecan)和透明凝集聚糖(hyalectan)，例如聚集蛋白聚糖和多能蛋白聚糖(versican)，和小的富含亮氨酸的蛋白聚糖家族，包括饰胶蛋白聚糖(decorin)，双糖链蛋白聚糖(biglycan)和纤调蛋白(fibromodulin)。胞外基质还包括由三种胶原同种型，即II型，IX型，和XI型胶原组成的杂合胶原纤维，连同辅助蛋白诸如软骨寡聚基质蛋白(COMP)，连接蛋白，和纤连蛋白。软骨还含有透明质素(hyaluronin)，其与透明凝集素(hyalectin)形成非共价联合。另外，专门化胞周基质围绕软骨细胞，其由蛋白聚糖，VI型胶原和胶原受体蛋白，诸如锚蛋白组成。

如本文中所使用的，“基质降解酶”指能够切割胞外基质蛋白的酶。软骨胞外基质周转受基质金属蛋白酶(MMP)调节，基质金属蛋白酶作为潜在酶原合成，需要活化来降解软骨胞外基质蛋白。认为三类酶调节胞外基质蛋白的周转，即负责天然胶原纤维降解的胶原酶(包括但不限于MMP-13)，降解蛋白聚糖和IX型胶原的溶基质蛋白酶(包括但不限于MMP-3)，和降解变性胶原的明胶酶(包括但不限于MMP-2和MMP-9)。在OA中的软骨降解方面表现最相关的基质降解酶组包括称作ADAMTS的金属蛋白酶亚组，因为它们在它们的结构中拥有解联蛋白和金属蛋白酶域和血小板反应蛋白基序。已经报告了ADAMTS4(聚集蛋白聚糖酶-1)在OA关节中升高，而且连同ADAMTS-5(聚集蛋白聚糖酶-2)，已经显示了在人骨关节炎软骨中表达。这些酶表现出负责聚集蛋白聚糖降解，没有MMP参与。

如本文中所使用的，“降低”聚集蛋白聚糖酶活性指与至少一种天然发生聚集蛋白聚糖酶，包括但不限于ADAMTS4和ADAMTS5有关的任何和/或所有活性的降低。例如，“降低”至少一种ADAMTS5活性指与天然发生ADAMTS5有关的任何和/或所有活性的降低。举例而言，降低哺乳动物中的ADAMTS5活性可在将至少一种能够结合ADAMTS5的多肽施用于受试者之后测量，并与相同受试者中在施用能够结合ADAMTS5的多肽之前的ADAMTS5活性比较或与施用安慰剂的第二受试者比较。如本文中所使用的，“降低”至少一种ADAMTS5(活性)包括至少一种或多种酶活性的降低。至少一种ADAMTS5活性的降低包括至少一种ADAMTS5(活性)的完全消除。此定义内还包括量降低的至少一种酶活性。就是，ADAMTS5可具有超过一种得到维持的活性，而相同酶的第二活性得到降低。

如本文中所使用的，“与软骨降解有关的疾病”包括但不限于癌症，疼痛，慢性疼痛，神经性疼痛，手术后疼痛疼痛，骨关节炎，运动损伤，侵蚀性关节炎，类风湿性关节炎，银屑病关节炎，莱姆关节炎，幼年型关节炎，强直性脊椎炎，神经痛，神经病，痛觉，神经损伤，缺血，神经变性，炎性疾病，软骨降解，影响喉，气管，耳道，椎间盘，韧带，腱，关节囊或骨发育的疾病，椎间盘降解，骨质减少，或牙周病，急性关节损伤，和/或涉及关节破坏的疾病。

如本文中所使用的，“共施用”，如本文中所使用的，指将两种或更多种化合物施用于相同患者。此类化合物的共施用可以是同时的或大致相同时间的(例如在相同小时内)或者可以彼此在数个小时或天内。例如，第一化合物可以一周一次施用，而第二化合物每天共施用。

如本文中所使用的，“削弱”指在暴露于异化刺激之后，由细胞生成和/或释放的基质降解酶，炎性介导物，或基质蛋白的量的规范化(即升高或降低)。例如，在暴露于IL-1之后，基质蛋白，诸如蛋白聚糖的软骨细胞生成降低，而基质降解酶(例如MMP-13，ADAMTS4)和反应性氧种类(例如NO)生成升高。削弱指这些各种应答向在异化刺激缺失下观察到的水平的标准化。

“域抗体”或“dAb”可认为与能够结合抗原的“单可变域”相同。单可变域可以是人抗体可变域，但是也包括来自其它物种诸如啮齿动物(例如WO 00/29004中披露的)，绞口鲨和骆驼科动物VHH dAb的单抗体可变域。骆驼科动物VHH为自生成天然没有轻链的重链抗体的物种包括骆驼(camel)，美洲驼(llama)，羊驼(alpaca)，单峰骆驼(dromedary)，和骆马(guanaco)衍生的免疫球蛋白单可变域多肽。此类VHH域可依照本领域可得的标准技术来人源化，而且此类域认为是“域抗体”。如本文中所使用的，VH包括骆驼科动物VHH域。

短语“单可变域”指不依赖不同可变区或域，特异性结合抗原或表位的抗原结合蛋白可变域(例如VH，VHH，VL)。

如本文中所使用的，术语“抗原结合蛋白”指能够结合抗原的抗体，抗体片段和其它蛋白质构建物，诸如域，但不限于可变域和域抗体。

抗体的抗原结合域包含两个分开的区：重链可变域(VH)和轻链可变域(VL：其可以是Vκ或Vλ)。抗原结合位点自身由六个多肽环形成：三个来自VH域的(H1，H2和H3)和三个来自VL域的(L1，L2和L3)。

对抗体结构和序列的分析显示了六个抗原结合环中的五个(H1，H2，L1，L2，L3)拥有有限数目的主链构象或规范结构(Chothia and Lesk(1987)J.Mol.Biol.，196：901；Chothia et al.(1989)Nature，342：877)。主链构象由下述各项决定：(i)抗原结合环的长度，和(ii)抗原结合环和抗体框架中某些关键位置处的特定残基，或残基类型。对环长度和关键残基的分析使得我们能够预测由大多数人抗体序列编码的H1，H2，L1，L2和L3的主链构象(Chothia et al.(1992)J.Mol.Biol.，227：799；Tomlinson et al.(1995)EMBO J.，14：4628；Williams etal.(1996)J.Mol.Biol.，264：220)。虽然H3区就序列，长度和结构而言多样得多(由于D区段的使用)，但是对于短环长度，它也形成有限数目的主链构象，这取决于长度和环中关键位置处特定残基或残基类型的存在和抗体框架(Martin et al.(1996)J.Mol.Biol.，263：800；Shirai et al.(1996)FEBS Letters，399：1)。

包含互补VH和VL区对的双特异性抗体是本领域已知的。这些双特异性抗体必须包含两对VH和VL，每对VH/VL结合单个抗原或表位。所述方法涉及杂合杂交瘤(Milstein & Cuello AC，Nature 305：537-40)，迷你抗体(minibody)(Hu et al.，(1996)Cancer Res 56：3055-3061)，双抗体(Holliger et al.，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，6444-6448；WO 94/13804)，螯合重组抗体(CRAb；Neri et al.，(1995)J.Mol.Biol.246，367-373)，biscFv(例如Atwell etal.，(1996)Mol.Immunol.33，1301-1312)，“隆突入空穴”(knobs in holes)稳定化抗体(Carter et al.，(1997)Protein Sci.6，781-788))。在每一种情况中，每一种抗体种类包含两个抗原-结合位点，每一个的样式为一对互补的VH和VL域。每一种抗体由此在同一时间能够结合两种不同抗原或表位，其中对每一种抗原或表位的结合由VH及其互补VL域介导。每一种这些技术呈现其特定缺点；例如在杂合杂交瘤的情况中，无活性VH/VL对可大大降低双特异性IgG的分数。另外，大多数双特异性办法依赖于不同VH/VL对的联合或VH和VL链的联合来创建两种不同VH/VL结合位点。因此不可能控制装配分子中针对每一种抗原或表位的结合位点的比例，因此许多装配分子会结合一种抗原或表位但不结合另一种。在一些情况中，有可能在亚基界面处改造重链或轻链(Carter et al.，1997)以增加具有针对两种抗原或表位的结合位点的分子的数目，但是这从未导致所有分子具有针对两种抗原或表位的结合。

有一些证据证明两种不同抗体结合特异性可掺入相同结合位点中，但是这些一般呈现对应于结构相关抗原或表位或者对应于广泛交叉反应性抗体的两种或更多种特异性。例如，交叉反应性抗体已有记载，通常其中两种抗原在序列和结构方面是相关的，诸如鸡卵清溶菌酶和火鸡溶菌酶(McCaffertyet al.，WO 92/01047)或游离的半抗原和缀合至载体的半抗原(Griffiths AD et al.EMBO J 199413：143245-60)。在又一个例子中，WO 02/02773(AbbottLaboratories)记载了具有“双重特异性”的抗体分子。所述抗体分子是针对多种抗原生成或选择的抗体，使得它们的特异性跨越超过一种抗原。WO02/02773的抗体中的每一个互补VH/VL对规定针对两种或更多种结构相关抗原的单结合特异性；此类互补对中的VH和VL域不是每一个拥有不同的特异性。抗体如此具有广泛的单特异性，其涵盖两种结构相关的抗原。另外，已经记载了天然自身抗体是多反应性的(Casali & Notkins，Ann.Rev.Immunol.7，515-531)，与至少两种(通常更多种)不同的结构不相关的抗原或表位反应。还已经显示了在单克隆抗体上使用噬菌体展示技术选择随机肽全集会鉴定一系列适合抗原结合位点的肽序列。一些序列是高度相关的，适合共有序列，而其它序列是非常不同的且称作模拟位(mimotope)(Lane & Stephen，CurrentOpinion in Immunology，1993，5，268-271)。因此清楚了包含联合且互补的VH和VL域的天然四链抗体有潜力结合多种来自大量已知抗原全体的不同抗原。不太清楚如何在同一抗体中创建针对两种给定抗原的结合位点，特别是那些不必然结构相关的。

已经提出蛋白质工程方法在这个方面有关系。例如，还已经提出可以创建如下的催化性抗体，其经由一个可变域具有针对金属离子的结合活性，且经由与金属离子的接触和互补可变域具有针对半抗原(底物)的结合活性(Barbas et al.，1993Proc.Natl.Acad.Sci USA 90，6385-6389)。然而，在此情况中，提出对底物(第一抗原)的结合和催化需要对金属离子(第二抗原)的结合。如此，VH/VL配对的结合涉及单一但多成分的抗原。

已经记载了用于自骆驼抗体重链单域创建双特异性抗体的方法，其中在一个可变域中创建一种抗原的结合接触，且在第二免疫球蛋白可变域中创建第二抗原的结合接触。然而，可变域不是互补的。如此，选择针对第一抗原的第一重链可变域和针对第二抗原的第二重链可变域，然后在同一条链上将这两个域连接到一起以给出双特异性抗体片段(Conrath et al.，J.Biol.Chem.270，27589-27594)。然而，骆驼重链单域通常是它们衍生自没有轻链且重链单域确实不能与骆驼轻链联合以形成互补VH和VL对的天然骆驼抗体。

还已经记载了衍生自通常与轻链(来自单克隆抗体的或来自域全集的；参见EP-A-0368684)联合的天然抗体的单重链可变域。已经显示了这些重链可变域与一种或多种相关抗原特异性相互作用，但是未与其它重链或轻链可变域组合以创建具有针对两种或更多种不同抗原的特异性的配体。另外，已经显示了这些单域具有很短的体内半衰期。因此，此类域的治疗价值有限。

已经提出通过将不同特异性的重链可变域连接到一起(如上所述)来生成双特异性抗体片段。这种办法的缺点是分离的抗体可变域可能具有疏水性界面，其通常与轻链进行相互作用且暴露于溶剂且可能是“粘的”，容许单域结合疏水性表面。另外，在配偶轻链缺失下，两种或更多种不同重链可变域可能经由其疏水性表面的组合及其联合可能阻止它们结合它们分开时(inisolation)能够结合的两种配体中的一种但不是两种。此外，在此情况中，重链可变域不会与互补轻链可变域联合，因此可能不太稳定且易于解折叠(Wom & Pluckthun，1998Biochemistry 37，13120-7)。

如本文中所使用的，术语“抗体”包括包含通过二硫键相互连接的四条多肽链，即两条重(H)链和两条轻(L)链的免疫球蛋白分子。每条重链包含重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个域，即CH1，CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区。基于其恒定域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白s)的轻链可指派至两种截然不同的型之一，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。κ轻链的可变区在本文中称作VK。如本文中所使用的，表述VL意图包括来自κ型轻链(VK)和来自λ型轻链的可变区二者。轻链恒定区包含一个域，即CL。VH和VL区包括称作互补决定区(CDR)的高度变异性的区域，与称作框架区(FR)的更加保守的区域一起散布。每个VH和VL包含三个CDR和四个FRs，自氨基末端至羧基末端以如下次序排列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

根据其重链恒定域的氨基酸序列，抗体可指派至不同类。有五大类完整抗体：IgA，IgD，IgE，IgG，和IgM，而且这些中的数个可进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA，和IgA2。与抗体的不同类对应的重链恒定域分别称作α，δ，ε，γ，μ。不同类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是公知的。本发明包括任何上述类或亚类(同种型)的抗体。

如本文中所使用的，术语“抗体”还意图涵盖抗体，其消化片段，规定部分和变体，包括抗体模拟物或包含抗体中模拟抗体或其规定片段或部分的结构和/或功能的部分，包括单链抗体及其片段；每一种包含至少一个CDR。功能性片段包括结合ADAMTS5抗原的抗原结合片段。例如，本发明涵盖能够结合ADAMTS5或其部分的抗体片段，包括但不限于Fab(例如通过木瓜蛋白酶消化)，facb(例如通过纤溶酶消化)，pFc′(例如通过胃蛋白酶或纤溶酶消化)，Fd(例如通过胃蛋白酶消化，部分还原和再聚集)，Fv或scFv(例如通过分子生物学技术)片段。抗体片段还意图包括例如域删除抗体，双抗体，线性抗体，单链抗体分子，和自抗体片段形成的多特异性抗体。

如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”指自基本上同质的抗体群体获得的抗体，例如构成群体的抗体个体基本上相同，只是可能有可能存在的天然发生突变或次要翻译后变异。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原位点。另外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物不同，每一种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”指明抗体自基本上同质的抗体群体获得的特征，不应解释为需要通过任何特定方法来生成抗体。本发明的单克隆抗体优选通过重组DNA方法来生成，或者通过本文中别处描述的筛选方法来获得。

如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与自特定物种衍生的或属于特定抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而链的剩余部分与自另一物种(例如小鼠或大鼠)衍生的或属于另一抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现期望的生物学活性(Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。本文中感兴趣的嵌合抗体包括“灵长类化”抗体，其包含自非人灵长类动物(例如，旧世界猴，诸如狒狒，恒河猴或猕猴)衍生的可变域抗原结合序列和人恒定区序列(美国专利No.5,693,780)。

如此，本发明包括例如包含嵌合重链和/或嵌合轻链的嵌合单克隆抗体。嵌合重链可包含任何本文所述重链可变(VH)区或其突变体或变体，其与非人或人抗体的重链恒定区融合。嵌合轻链可包含任何本文所述轻链可变(VL)区或其突变体或变体，其与非人或人抗体的轻链恒定区融合。

如本文中所使用的，术语“人抗体”包括具有与Kabat等人所述人种系免疫球蛋白序列对应的可变和恒定区的抗体(参见Kabat，et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Departmentof Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)。本发明的人抗体可包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR中，突特别是在CDR3中。人抗体可具有至少一个用不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基，例如活性增强性氨基酸残基置换的位置。在本发明的语境中，人抗体可具有多至20个用不是人种系免疫球蛋白序列一部分的氨基酸残基置换的位置。在其它实施方案中，置换多至10个，多至5个，多至3个或多至2个位置。然而，如本文中所使用的，术语“人抗体”并非意图包括其中已经将自另一哺乳动物物种，诸如小鼠的种系衍生的CDR序列嫁接到人框架序列上的抗体。

短语“重组人抗体”包括通过重组手段制备，表达，创建或分离的人抗体，诸如使用转染入宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体，自重组，组合人抗体文库分离的抗体，自对于人免疫球蛋白基因而言转基因的动物分离的抗体，或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至DNA序列的任何其它手段制备的，表达的，创建的或分离的抗体。此类重组人抗体具有自人种系免疫球蛋白序列衍生的可变和恒定区(参见Kabat，E.A.，et al.(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health andHuman Services，NIH Publication No.91-3242)。依照本发明，重组人抗体包括如下人种系免疫球蛋白序列，其已经进行过体外诱变(或当使用对于人Ig序列而言转基因的动物时，体内体细胞诱变)，因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是虽然衍生自且涉及人种系VH和VL序列，但是可能不是天然存在于体内人抗体种系全集内的序列。在某些实施方案中，然而，此类重组抗体是选择性诱变办法或回复突变或二者的结果。

本发明的抗体可以是分离的抗体。如本文中所使用的，“分离的抗体”包括基本上没有具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体。此外，分离的抗体可以基本上没有其它细胞材料和/或化学品。

完整抗体包括包含至少两条重链和轻链的异多聚体糖蛋白。在IgM之外，完整抗体通常是大约150Kda的异四聚体糖蛋白，包含两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链。通常，每条轻链通过一个共价二硫键连接至重链，而二硫化物连接的数目不同免疫球蛋白同种型的重链之间有变化。每条重链和轻链还具有链内二硫桥。每条重链在一端具有可变域(VH)，接着是一些恒定区。每条轻链在其另一端具有可变域(VL)和恒定区；轻链的恒定区与重链的第一恒定区一起排列，且轻链可变域与重链的可变域一起排列。基于恒定区的氨基酸序列，来自大多数脊椎动物物种的抗体的轻链可指派称作κ和λ的两种型之一。根据其重链恒定区的氨基酸序列，人抗体可指派五种不同的类，即IgA，IgD，IgE，IgG和IgM。IgG和IgA可进一步细分成亚类，即IgG1，IgG2，IgG3和IgG4；及IgA1和IgA2。小鼠和大鼠的物种变体至少有IgG2a，IgG2b。抗体的可变域以称作互补决定区(CDR)的展示特定变异性的某些区赋予抗体以结合特异性。可变区中更加保守的部分称作框架区(FR)。完整重链和轻链的可变域每一个包含通过三个CDR连接的四个FR。每一条链中的CDR由FR区极其接近地保持在一起，并与来自另一条链的CDR一起促成抗体的抗原结合位点的形成。恒定区不直接涉及抗体对抗原的结合，但是展现多种效应器功能诸如参与抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，经由对Fcγ受体的结合的吞噬，经由新生儿Fc受体(FcRn)的半衰期/清除速率和经由补体级联的C1q成分的补体依赖性细胞毒性。

人抗体可通过本领域技术人员已知的多种方法来生成。人抗体可使用人骨髓瘤或小鼠-人异源骨髓瘤细胞系通过杂交瘤方法来生成(参见KozborJ.Immunol 133，3001，(1984)and Brodeur，Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications，pp51-63(Marcel Dekker Inc，1987))。备选方法包括使用噬菌体文库或转基因小鼠，二者都利用人V区全集(参见Winter G，(1994)，Annu.Rev.Immunol 12，433-455，Green LL(1999)，J.Immunol.methods231，11-23)。

现在可得转基因小鼠的数个品系，其中它们的小鼠免疫球蛋白基因座已经用人免疫球蛋白基因区段替换(参见Tomizuka K，(2000)PNAS 97，722-727；Fishwild D.M(1996)Nature Biotechnol.14，845-851，Mendez MJ，1997，NatureGenetics，15，146-156)。在抗原攻击时，此类小鼠能够生成人抗体全集，从中可选择感兴趣抗体。要特别注意Trimera^TM系统(参见Eren R et al，(1998)Immunology 93：154-161)，其中将人淋巴细胞移植入经照射小鼠中，选定淋巴细胞抗体系统(SLAM，参见Babcook et al，PNAS(1996)93：7843-7848)，其中使人(或其它物种)淋巴细胞有效通过大量合并体外抗体生成规程，接着是解卷积(deconvulated)有限稀释和选择规程和Xenomouse II^TM(Abgenix Inc)。一种使用Morphodoma^TM技术的备选办法可得自Morphotek Inc。

噬菌体展示技术可用于生成人抗体(及其片段)，参见McCafferty；Nature，348，552-553(1990)和Griffiths AD et al(1994)EMBO 13：3245-3260。依照此技术，以符合读码框的方式将抗体V域基因克隆入丝状噬菌体诸如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因并在噬菌体颗粒的表面上展示(通常借助辅助噬菌体)为功能性抗体片段。基于抗体功能特性的选择导致对编码展现那些特性的抗体的基因的选择。噬菌体展示技术可用于自文库选择抗原特异性抗体，其中文库自取自罹患上文所述疾病或病症的个体或未免疫人供体的人B细胞构建(参见Marks；J.Mol.Bio.222，581-597，1991)。在想要包含Fc域的完整人抗体的情况中，有必要将噬菌体展示衍生片段再克隆入包含期望恒定区的哺乳动物表达载体中并建立稳定表达细胞系。

亲和力成熟技术(Marks；Bio/technol 10，779-783(1992))可用于改进结合亲和力，其中通过用天然发生变体序贯置换H和L链V区并基于改善的结合亲和力进行选择来改进初级人抗体的亲和力。现在还可得此技术的变体诸如“表位印记”，参见WO 93/06213。还可参见Waterhouse；Nucl.Acids Res 21，2265-2266(1993)。

在某些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白具有通过结合常数(Ka)测量的至少约5×10⁴升/摩尔，1×10⁵升/摩尔，5×10⁵升/摩尔，或1×10⁶升/摩尔的亲和力。在另一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白以小于约5×10^-4升/秒，1×10^-5升/秒，5×10^-5升/秒，或1×10^-6升/秒的解离常数(Kd)结合人ADAMTS5的中和性表位。

完整非人抗体在治疗人疾病或病症中的使用有可能引起现在完全确立的免疫原性问题，即患者的免疫系统可能将非人完整抗体识别为非自身的并发起中和应答。这种反应在将非人抗体多次施用于人患者时特别明显。多年来已经开发了多种技术来克服这些问题，而且一般涉及降低完整抗体中非人氨基酸序列的组成，同时保留相对容易自经免疫动物例如小鼠，大鼠或家兔获得非人抗体。泛泛而言，已经使用两种办法来实现这一点。第一种是嵌合抗体，其一般包含非人(例如啮齿动物诸如小鼠)可变域，其与人恒定区融合。因为抗体的抗原结合位点位于可变区内，所以嵌合抗体保留其对抗原的结合亲和力，但是获得人恒定区的效应器功能且因此能够实施效应器功能诸如上文所述。嵌合抗体通常使用重组DNA方法来生成。使用常规规程对编码抗体的DNA(例如cDNA)分离并测序(例如通过使用能够特异性结合编码本发明抗体H和L链的基因，例如编码上文所述SEQ.ID.NO 2，3，4，5，6和7的DNA的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞充当此类DNA的一种典型来源。一旦分离，将DNA放置入表达载体中，然后转染入在其它情况中不生成免疫球蛋白蛋白的宿主细胞诸如大肠杆菌，COS细胞，CHO细胞或骨髓瘤细胞中以获得抗体的合成。可通过用人L和H链的编码序列替代对应的非人(例如鼠)H和L恒定区来修饰DNA，参见例如Morrison；PNAS 81，6851(1984)。

第二种办法涉及生成人源化抗体，其中通过人源化可变区来减少抗体的非人内容。人源化抗体可通过CDR嫁接来生成。CDR构建接近抗体N端的环，在那里它们形成在由框架区提供的支架中安装的表面。抗体的抗原结合特异性主要由其CDR表面的拓扑学和化学特征来限定。这些特征继而由各个CDR的构象，CDR的相对部署，和构成CDR的残基的侧链的性质和部署来决定。通过仅仅将非人(例如鼠)抗体(“供体”抗体)的CDR嫁接到人框架(“受体框架”)和恒定区上可实现免疫原性的大大降低(参见Jones et al(1986)Nature321，522-525and Verhoeyen M et al(1988)Science 239，1534-1536)。然而，CDR嫁接本身可能不导致抗原结合特性的完全保留，而且常常发现如果要恢复显著的抗原结合亲和力的话，需要在人源化分子中保留供体抗体的一些框架残基(有时称作“回复突变”)(参见Queen C et al(1989)PNAS 86，10，029-10，033，Co，M et al(1991)Nature 351，501-502)。在此情况中，自数据库选择显示与非人供体抗体的最大序列同源性的人V区以提供人框架(FR)。人FR的选择可自人共有或人个体抗体进行。在必要时，将来自供体抗体的关键残基替代入人受体框架中以保留CDR构象。抗体的计算机建模可用于帮助鉴定此类结构重要残基，参见WO99/48523。

或者，人源化可通过“镶饰”(veneering)的方法来实现。对独特人和鼠免疫球蛋白重链和轻链可变区的统计分析揭示了暴露残基的精确样式在人和鼠抗体中不同，而且大多数各个表面位置对少数不同残基具有强烈偏爱(参见Padlan E.A.et al；(1991)Mol.Immunol.28，489-498and Pedersen J.T.et al(1994)J.Mol.Biol.235；959-973)。因此，有可能通过置换其框架区中与在人抗体中找到的不同的暴露残基来降低非人Fv的免疫原性。因为蛋白质抗原性可能与表面可及性有关联，所以表面残基的置换可能足以使得小鼠可变区对于人免疫系统是“看不见的”(还可参见Mark G.E.et al(1994)in Handbook ofExperimental Pharmacology vol.113：The pharmacology of monoclonalAntibodies，Springer-Verlag，pp105-134)。这种人源化规程称作“镶饰”，因为只改变抗体的表面，支持性残基保持不变。

如此，本发明提供分离的抗原结合蛋白，其包含至少一个能够结合聚集蛋白聚糖酶的第一免疫球蛋白可变域。在一个实施方案中，所述聚集蛋白聚糖酶是人ADAMTS5。在一些情况中，所述抗原结合蛋白是抗体或其片段。在一些情况中，所述抗体特异性结合ADAMTS5。所述抗体可以是单克隆抗体或其片段。在一些情况中，本发明的单克隆抗体或其片段是小鼠的，嵌合的，人源化的，或完全人的。

在另一个实施方案中，所述抗原结合蛋白包含至少一个互补决定区。在一些情况中，本发明的抗原结合蛋白是单克隆抗体，其包含重链和轻链，重链包含CDRH1，CDRH2和CDRH3，轻链包含CDRL1，CDRL2和CDRL3，其中重链的互补决定区(CDR)重链选自下组：

与氨基酸序列DAWMD(SEQ ID NO：2)具有至少约80％序列同一性的CDRH1；

与氨基酸序列EIRHKANDHAIFYXESVKG(SEQ ID NO：3)具有至少约70，75，80，85，90，95，或98％序列同一性的CDRH2；和

与氨基酸序列TYYYGSSYGYCDV(SEQ ID NO：4)或PFAY(SEQ ID NO：5)具有至少约70，75，80，85，90，95，或98％序列同一性的CDRH3；且

轻链的互补决定区选自下组：

与氨基酸序列KASQSVGTTIV(SEQ ID NO：6)或RTSENIYSYLA(SEQID NO：7)具有至少约70，75，80，85，90，95，或98％序列同一性的CDRL1；与氨基酸序列NAKTLAE(SEQ ID NO：8)或SASNRXT(SEQ ID NO：9)具有至少约70，75，80，85，90，95，或98％序列同一性的CDRL2；和

与氨基酸序列QQYSSYPFT(SEQ ID NO：10)或QHHYGTPWT((SEQ IDNO：11)具有至少约70，75，80，85，90，95，或98％序列同一性的CDRL3。

在一个实施方案中，CDRH2与选自EIRHKANDHAIFYAESVKG(SEQ IDNO：12)，EIRNKANNHARHYAESVKG(SEQ ID NO：13)，EIRHKANDYAIFYDESVKG(SEQ ID NO：14)，EIRHKANDHAIFYDESVKG(SEQ ID NO：15)，DIRNTANNHATFYAESVKG(SEQ ID NO：16)，和EIRHKANDHAIFYDESVKG(SEQ ID NO：17)的氨基酸序列具有至少约70，75，80，85，90，95，或98％序列同一性。在一个实施方案中，CDRH3包含氨基酸序列PFAY(SEQ ID NO：5)。

在又一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白是单克隆抗体，其包含重链和轻链，重链包含CDRH1，CDRH2和CDRH3，轻链包含CDRL1，CDRL2和CDRL3，其中重链的互补决定区(CDR)重链选自：

CDRH1是氨基酸序列DAWMD(SEQ ID NO：2)；

CDRH2选自氨基酸序列EIRHKANDHAIFYAESVKG(SEQ ID NO：12)，EIRNKANNHARHYAESVKG(SEQ ID NO：13)，EIRHKANDYAIFYDESVKG(SEQ ID NO：14)，EIRHKANDHAIFYDESVKG(SEQ ID NO：15)，DIRNTANNHATFYAESVKG(SEQ ID NO：16)，或EIRHKANDHAIFYDESVKG(SEQ ID NO：17)；和CDRH3是TYYYGSSYGYCDV(SEQ ID NO：18)或PFAY(SEQ ID NO：5)；且

轻链的互补决定区选自：

CDRL1选自氨基酸序列KASQSVGT TIV(SEQ ID NO：19)，RTSENIYSYLA(SEQ ID NO：20)，或KASQNVGTAVV(SEQ ID NO：21)；

CDRL2选自氨基酸序列NAKTLAE(SEQ ID NO：22)，SASNRHT(SEQ IDNO：23)，SASTRYT(SEQ ID NO：24)，或SASNRYT(SEQ ID NO：25)；和

CDRL3选自氨基酸序列QQYSSYPFT(SEQ  ID  NO：26)，QHHYGTPWT(SEQ ID NO：27)，QQYVNYPFT(SEQ ID NO：28)，或QQYTSYPFT(SEQ ID NO：29)。

如此，在本发明的一个实施方案中，提供包含六个CDR的分离的单克隆抗体，其中CDRH1是DAWMD(SEQ ID NO：2)，CDRH2是EIRNKANNHARHYAESVKG(SEQ ID NO：13)，且CDRH3是TYYYGSSYGYCDV(SEQ ID NO：18)且CDRL1是RTSENIYSYLA(SEQ IDNO：20)，CDRL2是NAKTLAE(SEQ  ID NO：22)，且CDRL3是QHHYGTPWT(SEQ ID NO：27)。在本发明的另一个实施方案中，提供包含六个CDR的分离的单克隆抗体，其中CDRH1是DAWMD(SEQ ID NO：2)，CDRH2是EIRHKANDHAIFYDESVKG(SEQ ID NO：15)，且CDRH3是PFAY(SEQ ID NO：5)且CDRL1是KASQSVGTTIV(SEQ ID NO：19)，CDRL2是SASNRHT(SEQ ID NO：23)，且CDRL3是QQYTSYPFT(SEQ ID NO：29)。

在又一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白是单克隆抗体，其包含重链和轻链，重链包含CDRH1，CDRH2和CDRH3，轻链包含CDRL1，CDRL2和CDRL3，其中重链的互补决定区(CDR)选自：

CDRH1是氨基酸序列DAWMD(SEQ ID NO：2)，其中在一个位置处SEQID NO：2的任何氨基酸用选自组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，苏氨酸，色氨酸，缬氨酸，丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸，胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，鸟氨酸，脯氨酸，丝氨酸，牛磺酸，和酪氨酸的氨基酸替代；

CDRH2选自氨基酸序列EIRHKANDHAIFYAESVKG(SEQ ID NO：12)，EIRNKANNHARHYAESVKG(SEQ ID NO：13)，EIRHKANDYAIFYDESVKG(SEQ ID NO：14)，EIRHKANDHAIFYDESVKG(SEQ ID NO：15)，DIRNTANNHATFYAESVKG(SEQ ID NO：16)，或EIRHKANDHAIFYDESVKG(SEQ ID NO：17)，其中在一个位置处SEQ IDNO：12-17的任何氨基酸用选自组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，苏氨酸，色氨酸，缬氨酸，丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸，胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，鸟氨酸，脯氨酸，丝氨酸，牛磺酸，和酪氨酸的氨基酸替代；且

CDRH3是TYYYGSSYGYCDV(SEQ ID NO：18)或PFAY(SEQ ID NO：5)，其中在一个位置处SEQ ID NO：18和5的任何氨基酸用选自组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，苏氨酸，色氨酸，缬氨酸，丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸，胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，鸟氨酸，脯氨酸，丝氨酸，牛磺酸，和酪氨酸的氨基酸替代；且

轻链的互补决定区选自：

CDRL1选自氨基酸序列KASQSVGTTIV(SEQ ID NO：19)，RTSENIYSYLA(SEQ ID NO：20)，或KASQNVGTAVV(SEQ ID NO：21)，其中在一个位置处SEQ ID NO：19-21的任何氨基酸用选自组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，苏氨酸，色氨酸，缬氨酸，丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸，胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，鸟氨酸，脯氨酸，丝氨酸，牛磺酸，和酪氨酸的氨基酸替代；

CDRL2选自氨基酸序列NAKTLAE(SEQ ID NO：22)，SASNRHT(SEQ IDNO：23)，SASTRYT(SEQ ID NO：24)，或SASNRYT(SEQ ID NO：25)，其中在一个位置处SEQ ID NO：22-25的任何氨基酸用选自组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，苏氨酸，色氨酸，缬氨酸，丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸，胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，鸟氨酸，脯氨酸，丝氨酸，牛磺酸，和酪氨酸的氨基酸替代；且

CDRL3选自氨基酸序列QQYSSYPFT(SEQ ID NO：26)，QHHYGTPWT(SEQ ID NO：27)，QQYVNYPFT(SEQ ID NO：28)，或QQYTSYPFT(SEQ ID NO：29)，其中在一个位置处SEQ ID NO：26-29的任何氨基酸用选自组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，苏氨酸，色氨酸，缬氨酸，丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸，胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，鸟氨酸，脯氨酸，丝氨酸，牛磺酸，和酪氨酸的氨基酸替代。

在某些实施方案中，NAKTLAE(SEQ ID NO：22)的Thr4是亮氨酸，异亮氨酸或甲硫氨酸。在某些实施方案中，QHHYGTPWT(SEQ ID NO：27)的His3是缬氨酸。在某些实施方案中，QHHYGTPWT(SEQ ID NO：27)的Gly5是色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸，或甲硫氨酸。在某些实施方案中，EIRNKANNHARHYAESVKG(SEQ ID NO：13)的His9是苯丙氨酸或酪氨酸。在某些实施方案中，TYYYGSSYGYCDV(SEQ ID NO：18)的Ser6是苯丙氨酸或酪氨酸。

CDR L1，L2，L3，H1和H2趋于在结构上展示有限数目的主链构象之一。CDR的特定规范结构类由CDR的长度和环填充二者来限定，由位于CDR和框架区二者中关键位置的残基来决定(结构决定残基或SDR)。Martin和Thornton(1996；J Mol Biol 263：800-815)已经生成了一种自动化方法来限定“关键残基”规范模板。使用簇分析来限定CDR套组的规范类，然后通过分析埋藏的疏水性，成氢键残基，和保守甘氨酸和脯氨酸来鉴定规范模板。通过将序列与关键残基模板比较并使用同一性或相似性矩阵为每一种模板打分，可将抗体序列的CDR指派至规范类。

下文给出了本发明范围内的CDR规范的例子。使用的氨基酸编号方式是Kabat。

SEQ ID NO：144中所列CDRH1或其变体的规范的例子是：Ala 32替代为Ile，His，Tyr，Phe，Thr，Asn，Cys，Glu或Asp；Trp 33替代为Tyr，Ala，Gly，Thr，Leu或Val；Met 34替代为Ile，Val或Trp；及Asp 35替代为His，Glu，Asn，Gln，Ser，Tyr或Thr。

SEQ ID NO：144中所列CDRH2，或其变体的规范的例子是：Glu 50替代为Arg或Gln；及Ile 51替代为Leu，Val，Thr，Ser或Asn.，

SEQ ID NO：144中所列CDRH3，或其变体的规范的例子是：Tyr102替代为His，Val，Ile，Ser，Asp或Gly。

SEQ ID NO：146中所列CDRL1，或其变体的规范的例子是：Ser 28替代为Asn，Asp，Thr或Glu；Val 29替代为Ile；Gly 30替代为Asp，Leu，Tyr，Val，Ile，Ser，Asn，Phe，His或Thr；Thr 31替代为Ser，Asn，Lys或Gly；Thr 32替代为Phe，Tyr，Asn，Ala，His，Ser或Arg；Ile 33替代为Met，Leu，Val或Phe；及Val 34替代为Ala，Gly，Asn，Ser，His或Phe。

SEQ ID NO：146中所列CDRL3，或其变体的规范的例子是：Gln 89替代为Ser，Gly，Phe或Leu；Gln 90替代为Asn或His；Tyr 91替代为Asn，Phe，Gly，Ser，Arg，Asp，His，Thr或Val；Thr 92替代为Asn，Tyr，Trp，Ser，Arg，Gln，His，Ala或Asp；Ser 93替代为Gly，Asn，Thr，Arg，Glu，Ala或His；Tyr 94替代为Asp，Thr，Val，Leu，His，Asn，Ile，Trp，Pro或Ser；及Phe 96替代为Pro，Leu，Tyr，Arg，Ile或Trp。

在其它方面，所述抗原结合蛋白是Fab或F(ab)₂片段。在另一个实施方案中，所述第一免疫球蛋白可变域是单链可变域。

在本发明的一个实施方案中，有提供依照本文所述发明的且包含恒定域区使得抗体具有降低的ADCC和/或互补活化或效应器功能性的抗体。在一个此类实施方案中，恒定域可包含IgG2或IgG4同种型的天然失能恒定区或突变型IgG1恒定域。合适修饰的例子记载于EP0307434。一个例子包含位置235和237(EU索引编号方式)处的丙氨酸残基的替代。在一个实施方案中，此类抗体包含SEQ ID NO：158的重链。

在一个实施方案中，抗原结合蛋白或其片段包含抗体VH域，抗体VH域包含选自SEQ ID NO：76，80，116，118，120，122，124，126，128，136，138，140，142，和144的氨基酸序列。

在一个实施方案中，抗原结合蛋白或其片段包含抗体VL域，抗体VL域包含选自SEQ ID NO：78，82，130，132，134，和146的氨基酸序列。

在一个实施方案中，抗原结合蛋白或其片段包含抗体VH域和VL域，抗体VH域包含选自SEQ ID NO：76，80，116，118，120，122，124，126，128，136，138，140，142，和144的氨基酸序列，VL域包含选自SEQ ID NO：78，82，130，132，134，和146的氨基酸序列。

在一个实施方案中，抗原结合蛋白或其片段包含抗体VH域和VL域，抗体VH域包含SEQ ID NO：76，VL域包含SEQ ID NO：78。

在一个实施方案中抗原结合蛋白或其片段包含抗体VH域和VL域，抗体VH域包含SEQ ID NO：80，VL域包含SEQ ID NO：82。

在一个实施方案中，抗原结合蛋白或其片段包含抗体VH域和VL域，抗体VH域包含选自SEQ ID NO：116，118，120，122，124，126，和128的氨基酸序列，VL域包含选自SEQ ID NO：130，132，和134的氨基酸序列。

在一个实施方案中，抗原结合蛋白或其片段包含抗体VH域和VL域，抗体VH域包含选自SEQ ID NO：136，138，140，142，和144的氨基酸序列，VL域包含SEQ ID NO：146。

在一个实施方案中，抗原结合蛋白或其片段包含抗体重链，抗体重链包含选自SEQ ID NO：68，72，84，86，88，90，92，94，96，104，106，108，110，112，和158的氨基酸序列。

在一个实施方案中，抗原结合蛋白或其片段包含抗体轻链，抗体轻链包含选自SEQ ID NO：70，74，98，100，102，和114的氨基酸序列。

在一个实施方案中，抗原结合蛋白或其片段包含抗体重链和抗体轻链，抗体重链包含选自SEQ ID NO：68，72，84，86，88，90，92，94，96，104，106，108，110，112，和158的氨基酸序列，抗体轻链包含选自SEQ ID NO：70，74，98，100，102，和114的氨基酸序列。

在一个实施方案中，抗原结合蛋白或其片段包含抗体重链和抗体轻链，抗体重链包含SEQ ID NO：68，抗体轻链包含SEQ ID NO：70。

在一个实施方案中，抗原结合蛋白或其片段包含抗体重链和抗体轻链，抗体重链包含SEQ ID NO：72，抗体轻链包含SEQ ID NO：74。

在一个实施方案中，抗原结合蛋白或其片段包含抗体重链和抗体轻链，抗体重链包含选自SEQ ID NO：84，86，88，90，92，94，和96的氨基酸序列，抗体轻链包含选自SEQ ID NO：98，100，和102的氨基酸序列。

在一个实施方案中，抗原结合蛋白或其片段包含抗体重链和抗体轻链，抗体重链包含选自SEQ ID NO：104，106，108，110，112，和158的氨基酸序列，抗体轻链包含SEQ ID NO：114。

本发明的另一个方面包括与表3所列任一种抗体竞争对ADAMTS5的结合的抗体。这些包括抗体1G10.1C9，2D3.1D4，3A12.1D7，5F10.1H6，11F12.1D12，12F4.1H7，和7B4.1E11。

在又一个实施方案中，抗原结合蛋白进一步包含能够结合第二抗原的第二免疫球蛋白可变域。第二免疫球蛋白可变域可结合在施用抗原结合肽时可以起载体作用的抗原。例如，第二免疫球蛋白可变域可结合血液蛋白质，诸如但不限于人血清清蛋白或运铁蛋白。另外，第二免疫球蛋白可变域可结合哺乳动物在与疼痛调控有关的抗原，诸如但不限于神经生长因子(NGF)，血管活性肠肽(VIP)，和/或TRPV1或其它血管非炎性蛋白样(vannilloid)受体。另外，第二免疫球蛋白可变域可结合与炎性应答和/或自身免疫病有关的细胞因子或细胞因子受体，诸如但不限于制瘤素M(OSM)，TNF-α，IL-6，TRPV4，RANKL和IL-1。第二抗原也可结合第二聚集蛋白聚糖酶，诸如但不限于ADAMTS4和/或ADAMTS5，和/或ADAMTS5和/或多种金属蛋白酶诸如但不限于MMP-13上的第二表位。第二免疫球蛋白可变域也可结合聚集蛋白聚糖，胶原II，蛋白聚糖或与软骨有关的其它分子。在本发明的一个方面，第二免疫球蛋白可变域结合选自下组的抗原：人血清清蛋白，ADAMTS4，NGF，OSM，TNF-α，IL-6，VIP，TRPV1，TRPV4，ADAMTS1，聚集蛋白聚糖，胶原II，RANKL，粘结蛋白聚糖(Syndecan)4，Hedgehog，和/或IL-1。

Delgado，et al.Nature Med.7，563-568报告了VIP处理遏制促炎性介导物生成，以及金属蛋白酶明胶酶(MMP-2)表达。认为MMP-2促成关节炎小鼠的爪中的关节破坏。体外研究指示VIP可直接作用于滑膜细胞，尽管间接作用也可经由增强的Th2细胞因子生成来介导。无论如何，VIP表现出在CIA小鼠模型中在多个水平影响滑膜功能。该肽遏制Th1功能但提高Th2功能，可能“再平衡”免疫系统。此外，VIP对巨噬细胞和滑膜细胞具有直接和间接影响，导致降低的IL-1，TNF-α，趋化因子和基质降解酶表达，保护关节完整性。Firestein Nature Medicine 7，537-538(2001)。

血管活性肠肽(VIP)是几乎20年前在关节炎患者的滑液中鉴定的，而且此项研究的目的是检查VIP是否涉及OA疼痛的生成。使用后肢承重作为关节疼痛的测量，而应用于同侧后爪跖面的von Frey毛发痛觉计量测试继发机械痛觉过敏。关节内注射VIP入正常大鼠膝关节引起有利于对侧未注射后肢的承重的显著偏移以及引起同侧爪撤回阈降低。这些疼痛应答通过共施用VPAC受体拮抗剂被阻断。抑制VIP活性的拮抗剂可证明在缓解OA疼痛方面是有益的。McDougall，et al.Pain 2006Jul；123(1-2)：98-105。

神经生长因子(NGF)是第一种鉴定出的神经营养蛋白，而且它在周围和中枢神经元二者发育和存活中的作用已经较好表征。已经显示了NGF是周围交感神经元和胚胎感觉神经元和基础前脑胆碱能神经元发育中的一种至关重要的存活和维持因子。Smeyne et al.，Nature 368：246-249(1994)andCrowley et al.，Cell 76：1001-1011(1994)。NGF上调感觉神经元中神经肽的表达(Lindsay and Harmer，Nature 337：362-364(1989))，而且它的活性经由两种不同膜结合受体，即TrkA受体和p75共同神经营养蛋白受体(有时分别称作“高亲和力”和“低亲和力”NGF受体)来介导。Chao et al.，Science 232：518-521(1986)。关于NGF的综述参见Huang et al.，Annu.Rev.Neurosci.24：677-736(2001)；Bibel et al.，Genes Dev.14：2919-2937(2000)。与trkA受体的复合物中NGF和NGF的晶体结构已经测定。参见Nature 254：411(1991)；Nature401：184-188(1996)。

制瘤素M是一种28KDa糖蛋白，属于白介素6(IL-6)细胞因子家族，该家族包括IL-6，白血病抑制因子(LIF)，睫状节神经营养因子(CNTF)，心肌营养蛋白-1(CT-1)和心肌营养蛋白-1样细胞因子(参见Kishimoto T et al(1995)Blood 86：1243-1254)，它们分享gp130跨膜信号传导受体(参见Taga T andKishimoto T(1997)Annu.Rev.Immunol.15：797-819)。OSM最初是通过它抑制黑素瘤细胞系A375生长的能力而发现的(参见Malik N(1989)et al Mol CellBiol 9：2847-2853)。随后，发现了更多的效果，而且发现它是一种多功能介导物，就像IL-6家族的其它成员。OSM由多种细胞类型生成，包括巨噬细胞，活化的T细胞(参见Zarling JM(1986)PNAS(USA)83：9739-9743)，多形核嗜中性细胞(参见Grenier A et al(1999)Blood 93：1413-1421)，嗜曙红细胞(参见Tamura S et al(2002)Dev.Dyn.225：327-31)，树突细胞(参见Suda T et al(2002)Cytokine 17：335-340)。它也在胰腺，肾，睾丸，脾胃和脑(参见Znoyko I et al(2005)Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol 283：182-186)，和骨髓(参见Psenak O et al(2003)Acta Haematol 109：68-75)中表达。它的主要生物学效果包括内皮的激活(参见Brown TJ et al(1993)Blood 82：33-7)，急性期应答的激活(参见Benigni F et al(1996)Blood 87：1851-1854)，细胞增殖或分化的诱导，炎性介导物释放和血细胞生成的调控(参见Tanaka M et al(2003)102：3154-3162)，骨的重塑(参见de Hooge ASK(2002)Am J Pathol 160：1733-1743)，和血管发生(参见Vasse M et al(1999)Arterioscler Thromb VascBiol 19：1835-1842)和伤口愈合的促进。

称作肿瘤坏死因子-α的细胞因子(TNFα；也称作恶病质素)是一种主要由单核细胞和巨噬细胞响应内毒素或其它刺激像17kD蛋白亚基的可溶性同三聚体分泌的蛋白质(Smith，R.A.et al.，J.Biol.Chem.262：6951-6954(1987))。还已经记载了TNF的膜结合26kD前体形式(Kriegler，M.et al.，Cell 53：45-53(1988))。

越来越多的证据指明TNF是一种具有多效生物学活性的调节性细胞因子。这些活性包括：抑制脂蛋白脂肪酶合成(“恶病质素”活性)(Beutler，B.etal.，Nature 316：552(1985))，激活多形核白细胞(Klebanoff，S.J.et al.，J.Immunol.136：4220(1986)；Perussia，B.，et al.，J.Immunol.138：765(1987))，抑制细胞生长或刺激细胞生长(Vilcek，J.et al.，J.Exp.Med.163：632(1986)；Sugarman，B.J.et al.，Science 230：943(1985)；Lachman，L.B.et al.，J.Immunol.138：2913(1987))，对某些经转化细胞类型的细胞毒性作用(Lachman，L.B.etal.，supra；Darzynkiewicz，Z.et al.，Canc.Res.44：83(1984))，抗病毒活性(Kohase，M.et al.，Cell 45：659(1986)；Wong，G.H.W.et al.，Nature 323：819(1986))，刺激骨再吸收(Bertolini，D.R.et al.，Nature 319：516(1986)；Saklatvala，J.，Nature 322：547(1986))，刺激胶原酶和前列腺素E2生成(Dayer，J.-M.et al.，J.Exp.Med.162：2163(1985))；和免疫调节作用，包括激活T细胞(Yokota，S.et al.，J.Immunol.140：531(1988))，B细胞(Kehrl，J.H.et al.，J.Exp.Med.166：786(1987))，单核细胞(Philip，R.et al.，Nature 323：86(1986))，胸腺细胞(Ranges，G.E.et al.，J.Exp.Med.167：1472(1988))，和刺激主要组织相容性复合物(MHC)I类和II类分子的细胞表面表达(Collins，T.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：446(1986)；Pujol-Borrel，R.et al.，Nature 326：304(1987))。

白介素-6(IL-6)是一种22至27kDa分泌型糖蛋白，其展现生长刺激想和促炎性活性。IL-6也称作干扰素-β2(IFN-β2)，IL-1可诱导26-kDa蛋白，肝细胞刺激因子，细胞毒性T-细胞分化因子，和B-细胞刺激因子(Trikha et al.，Clin.Cancer Res.9：4653-4665(2003))。IL-6由多种细胞类型分泌。IL-6经由结合高亲和力受体复合物来发挥其活性，该复合物由以低亲和力结合IL-6的膜糖蛋白：80kDa成分受体(IL-6R)和自身不结合IL-6但复合物的IL-6高亲和力结合需要的130kDa信号转导成分(gp130)组成。IL-6R能被跨膜金属蛋白酶切割以生成可溶性IL-6R。

RANK是TNF受体超家族的一个成员；它在胞外区中最密切类似CD40。与CD40相似，RANK联合TRAF2和TRAF3(通过基本上如Rothe et al.，Cell83：1243，1995所述的免疫共沉淀测定法确定的)。TRAF在调节免疫和炎性应答中是至关重要的。经由它们与TNF受体超家族的各种成员的联合，将信号转导至细胞。该信号导致细胞增殖，分化或凋亡，这取决于触发哪种/哪些受体和哪种/哪些TRAF联合受体；经各种信号传导事件的协调，可将不同信号转导至细胞。如此，经由这个家族的一个成员转导的信号可以是增殖性的，分化性的或凋亡性的，这取决于转导至细胞的其它信号和/或细胞的分化状态。这种增殖/凋亡途径的此类精巧调节是形成和维持针对病原体的保护所必需的；不平衡可导致自身免疫病。

RANK在上皮细胞，一些B细胞系，和活化的T细胞上表达。然而，它在活化的T细胞上的表达较晚，在活化之后约4天。表达的这种时间过程符合Fas，一种已知的凋亡剂的表达。RANK可以起抗凋亡信号的作用，挽救表达RANK的细胞免于凋亡(已知CD40那样做)。或者，RANK可在适宜情况下确认凋亡信号，再次与CD40相似。RANK及其配体有可能在调节免疫和炎性应答中发挥整体作用。

称作RANKL的配体是一种2型跨膜蛋白，有小于约50个氨基酸的胞内域，跨膜域和约240至250个氨基酸的胞外域。与它所属TNF家族的其它成员相似，RANKL具有跨膜域和受体结合域之间的“间隔物”区，它不是受体结合必需的。因而，RANKL的可溶性形式可包含整个胞外域或其包括受体结合区的片段。

TRPV4通道受体是血管非炎性蛋白样(vanilloid)瞬时受体潜在通道家族的六个已知成员之一，而且在核苷酸水平与TRPV1，即辣椒素受体分享51％同一性。编码人血管非炎性蛋白样受体各形式，包括来自人的TRPV4通道受体的多肽和多核苷酸的例子可见于EP 1170365以及WO 00/32766。像其它家族成员一样，TRPV4通道受体是Ca²⁺可透过的，非选择性的，配体门控阳离子通道，其负责各种刺激，诸如降低的摩尔渗透压浓度，升高的温度，和小分子配体。参见例如Voets，et al.，J.Biol.Chem.(2002)277 33704-47051；Watanabe，et al.，J.Biol.Chem.(2002)277：47044-47051；Watanabe，et al.，J.Biol.Chem.(2002)277：13569-47051；Xu，et al.，J.Biol.Chem.(2003)278：11520-11527。根据对身体组织的筛选，人TRPV4通道受体在软骨中最显著表达。对原代和克隆细胞培养物的筛选显示仅在软骨细胞中的显著表达。

共享共同血管非炎性蛋白样模块的辣椒素结构类似物也引起此类应答。一种此类类似物是仙人掌毒素(RTX)，即大戟属(Euphorbia)植物的一种天然产物。术语血管非炎性蛋白样受体(VR)用来描述辣椒素和此类相关刺激性化合物的神经元膜识别位点。辣椒素应答受到另一种辣椒素类似物，即抗辣椒碱竞争性抑制(并由此拮抗)，而且也受到非选择性阳离子通道阻断剂钌红抑制。这些拮抗剂以不超过中等的亲和力(通常以不低于140μM的Ki值)结合VR。

最近，自背根神经节细胞克隆了辣椒素的大鼠和人受体。此类受体还已经称作VR1，而且术语“VR1”和“辣椒素受体”在本文中可互换使用，指这种类型的大鼠和/或人受体，以及哺乳动物同系物。已经使用没有这种受体的小鼠确认了VR1在疼痛感觉中的作用，该小鼠不展现血管非炎性蛋白样引起的疼痛行为，且展现受损的对热和炎症的应答。辣椒素受体是一种非选择性阳离子通道，打开阈响应升高的温度，较低的pH，和辣椒素受体激动剂而降低。例如，该通道通常在温度高于约45℃时打开。打开辣椒素受体通道一般继以自表达该受体的神经元和其它附近神经元释放炎性肽，提高疼痛应答。在由辣椒素初始活化之后，辣椒素受体经由cAMP依赖性蛋白质激酶进行的磷酸化经历快速脱敏。

本发明的抗原结合蛋白可通过对人ADAMTS5等于或小于约9.0×10^-9M的解离常数来表征，在一些情况中它小于或等于约2.5×10^-10M。抗原结合蛋白对靶物诸如人ADAMTS5的亲和力可通过表面等离振子共振来测量，诸如但不限于BIACORE或Octet。BIAcore动力学分析可用于测定抗体或其片段对ADAMTS5抗原的结合上和下速率。BIAcore动力学分析包括分析ADAMTS5抗原对在其表面上有固定化抗体或其片段的芯片的结合和解离(参见下文实施例部分)。

本发明还提供阻断和/或降低ADAMTS5的至少一种活性的抗原结合蛋白。在一些情况中，本发明的抗原结合蛋白阻断和/或降低ADAMTS5对聚集蛋白聚糖在Glu373-Ala374切割位点处的切割。在一些方面，本发明的抗原结合蛋白能够渗透软骨，甚至在通过非关节施用路径施用时。例如，本发明的抗原结合蛋白可静脉内，肌肉内，关节内，皮下，口服，鼻内，和/或通过腹膜施用来施用。

本发明中还提供编码本发明抗原结合蛋白的分离的多核苷酸。

在一个实施方案中，分离的多核苷酸编码如下的抗原结合蛋白或其片段，其包含抗体VH域，抗体VH域包含选自SEQ ID NO：76，80，116，118，120，122，124，126，128，136，138，140，142，和144的氨基酸序列。在一个实施方案中，分离的多核苷酸选自SEQ ID NO：75，79，115，117，119，121，123，125，127，135，137，139，141，143，和159。在一个实施方案中，多肽是自表达选自SEQ ID NO：75，79，115，117，119，121，123，125，127，135，137，139，141，143，和159的多核苷酸的细胞生成的抗体。

在一个实施方案中，分离的多核苷酸编码如下的抗原结合蛋白或其片段，其包含抗体VL域，抗体VL域包含选自SEQ ID NO：78，82，130，132，134，和146的氨基酸序列。在一个实施方案中，分离的多核苷酸选自SEQ IDNO：77，81，129，131，133，和145。在一个实施方案中，多肽是自表达选自SEQ ID NO：77，81，129，131，133，和145的多核苷酸的细胞生成的抗体。

在一个实施方案中，分离的多核苷酸编码如下的抗原结合蛋白或其片段，其包含抗体重链，抗体重链包含选自SEQ ID NO：68，72，84，86，88，90，92，94，96，104，106，108，110，112，和158的氨基酸序列。在一个实施方案中，分离的多核苷酸选自SEQ ID NO：67，71，83，85，87，89，91，93，95，103，105，107，109，111，和159。在一个实施方案中，多肽是自表达选自SEQ ID NO：67，71，83，85，87，89，91，93，95，103，105，107，109，111，和159的多核苷酸的细胞生成的抗体。

在一个实施方案中，分离的多核苷酸编码如下的抗原结合蛋白或其片段，其包含抗体轻链，抗体轻链包含选自SEQ ID NO：70，74，98，100，102，和114的氨基酸序列。在一个实施方案中，分离的多核苷酸选自SEQ IDNO：69，73，97，99，101，和115。在一个实施方案中，多肽是自表达选自SEQ ID NO：69，73，97，99，101，和115的多核苷酸的细胞生成的抗体。

还提供了包含编码本发明抗原结合蛋白的多核苷酸的宿主细胞和自所述宿主细胞表达抗原结合蛋白的方法。另外，提供了用于生成本发明的抗原结合蛋白的方法。

生成本发明载体，宿主细胞和抗体的方法包括使用如下生成的常规表达载体或重组质粒，即将抗体的编码序列放置成与能够控制宿主细胞中复制和表达和/或自宿主细胞分泌常规调节调控序列处于可操作联合。调节序列包括启动子序列，例如CMV启动子，和信号序列，其可衍生自其它已知抗体。类似地，可生成第二表达载体，其具有编码互补抗体轻链或重链的DNA序列。优选地，此第二表达载体与第一相同，除了在编码序列和选择标志方面，从而确保尽可能功能性表达每一种多肽链。或者，改变的抗体的重链和轻链编码序列可位于单一载体上。

通过常规技术用第一和第二载体共转染(或仅仅用单一载体转染)选定宿主细胞以创建本发明的经转染宿主细胞，其包含重组或合成轻链和重链二者。然后通过常规技术培养经转染细胞以生成本发明的工程化抗体。通过适宜测定法，诸如ELISA或RIA自培养物筛选包括重组重链和/或轻链二者联合的抗体。可采用类似的常规技术来构建其它改变的抗体和分子。

适合于本发明方法中采用的克隆和亚克隆步骤和组合物构建的载体可由本领域技术人员来选择。例如，可使用常规pUC系列克隆载体。一种载体，pUC19，可购自供货商，诸如Amersham(Buckinghamshire，United Kingdom)或Pharmacia(Uppsala，Sweden)。另外，能够容易复制，具有丰富的克隆位点和选择基因(例如抗生素抗性)，且易于操作的任何载体可用于克隆。如此，克隆载体的选择不是本发明的限制因素。

类似地，用于表达抗体的载体可由本领域技术人员自任何常规载体选择。载体还含有指导异源DNA序列在选定宿主细胞中复制和表达的选定调节序列(诸如CMV或RSV启动子)。这些载体含有上文所述编码抗体的DNA序列或改变的免疫球蛋白编码区。另外，载体可掺入通过为了易于操作插入期望限制性位点而修饰的选定免疫球蛋白序列。

表达载体的特征也可为适合于扩大异源DNA序列表达的基因，例如哺乳动物二氢叶酸还原酶基因(DHFR)。其它优选载体序列包括聚A信号序列，诸如来自牛生长激素(BGH)和β珠蛋白启动子序列(betaglopro)。可用于本文的表达载体可通过本领域技术人员公知的技术来合成。

此类载体的成分，例如复制子，选择基因，增强子，启动子，信号序列等等，可得自商业或天然来源，或通过用于指导重组DNA产物在选定宿主中表达和/或分泌的已知规程来合成。也可为此目的选择本领域知道的可用于哺乳动物，细菌，昆虫，酵母，和真菌表达的众多类型的其它适宜表达载体。

本发明还涵盖经含有抗体或其改变免疫球蛋白分子编码序列的重组质粒转染的细胞系。可用于这些克隆载体的克隆和其它操作的宿主细胞也是常规的。然而，最想要的是，使用来自各种大肠杆菌菌株的细胞来进行本发明改变抗体的构建中的克隆载体复制和其它步骤。

适合于表达本发明抗体的宿主细胞或细胞系优选是哺乳动物细胞，诸如NS0，Sp2/0，CHO(例如DG44)，COS，成纤维细胞细胞(例如3T3)，和骨髓瘤细胞，更优选CHO或骨髓瘤细胞。可使用人细胞，如此能够用人糖基化样式修饰分子。或者，可采用其它真核细胞系。合适哺乳动物宿主细胞的选择和用于转染，培养，扩增，筛选和产物生成和纯化的方法是本领域已知的。参见例如Sambrook et al.，上文引用。

细菌细胞可证明可用作适合于表达本发明重组Fab的宿主细胞(参见例如，Plückthun，A.，Immunol.Rev.，130：151-188(1992))。然而，由于在细菌细胞中表达的蛋白质趋于未折叠或不正确折叠形式或非糖基化形式，在细菌细胞中生成的任何重组Fab会不得不筛选抗原结合能力的保留。如果由细菌细胞表达的分子是以正确折叠的形式生成的话，该细菌细胞会是想要的宿主。例如，用于表达的多种大肠杆菌菌株公知是生物技术领域中的宿主细胞。枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，链霉菌属(Streptomyce)，其它杆菌等等的各种菌株也可用于此方法。

在想要时，作为宿主细胞，可用本领域技术人员已知的酵母细胞株，以及昆虫细胞，例如果蝇属(Drosophila)和鳞翅目(Lepidoptera)和病毒表达系统。参见例如Miller et al.，Genetic Engineering，8：277-298，Plenum Press(1986)及其中引用的参考文献。

构建载体的一般方法，生成本发明宿主细胞需要的转染方法，和自此类宿主细胞生成本发明抗体必需的培养方法都是常规技术。通常，本发明的培养方法是无血清培养方法，通常通过无血清悬浮培养细胞。同样地，一旦生成，可依照本领域标准规程自细胞培养内容物纯化本发明的抗体，包括硫酸铵沉淀，亲和柱，柱层析，凝胶电泳等等。此类技术在本领域技术内且不限制本发明。例如，改变的抗体的制备记载于WO 99/58679和WO 96/16990。

表达抗体的有一种方法可利用转基因动物中的表达，诸如记载于美国专利No.4,873,316。这涉及使用动物酪蛋白启动子的表达系统，其在转基因掺入哺乳动物中时允许雌性在其乳汁中生成期望的重组蛋白。

在本发明的又一个方面，有提供生成本发明抗体的方法，该方法包括培养经编码本发明抗体轻链和/或重链的载体转化或转染的宿主细胞和回收由此生成的抗体的步骤。

在一个方面，本发明提供一种通过提供同时结合催化和解联蛋白域二者的分子来抑制ADAM和ADAMTS活性的方法。在某些实施方案中，ADAMTS是ADAMTS4或ADAMTS5。使用ADAMTS5和ADAMTS5单抗12F4.1H7和7B4.1E11的分开晶体结构的计算机结构“最佳拟合”(bestf fit)计算建模提示ADAMTS5的催化和解联蛋白域二者之间的同时抗体/抗原相互作用。ADAM和ADAMTS蛋白酶的催化和解联蛋白域由铰链区分开，其赋予该等域之间的柔性，可以起调节功能或容许底物定位至催化位点的作用。在跨越表位的此域处观察到的高亲和力单抗结合可能一起“锁定”ADAMTS5的催化和解联蛋白域，由此中和酶促活性。在一个实施方案中，所述分子是同时结合解联蛋白和催化域二者的抗体。在另一个实施方案中，所述分子是本发明的抗体或抗体片段。在另一个实施方案中，本发明关注中和AMAMTS5的酶促活性的抗体，且其中所述抗体以通过BiaCore或Octet QK测量的小于约1×10^-9或2×10^-10的KD同时结合催化和解联蛋白域。

在本发明的另一个实施方案中，提供包含至少一种本文所述抗原结合蛋白的药物组合物。本发明还提供至少一种针对ADAMTS5的抗原结合蛋白在制造用于在人中降低至少一种ADAMTS5活性的药物中的用途。本发明提供至少一种针对ADAMTS5的抗原结合蛋白用于在人中降低至少一种ADAMTS5活性的用途，包括对有所需要的患者施用包含至少一种针对ADAMTS5的抗原结合蛋白的组合物。

本发明的药物组合物可进一步包含第二抗原结合蛋白。在一些情况中，第二抗原结合蛋白可以是单克隆抗体。在一个实施方案中，第二单克隆抗体结合至少一种选自下组的抗原：ADAMTS4，ADAMTS5，NGF，OSM，TNF-α，IL-6，VIP，TRPV1，TRPV4，ADAMTS1，聚集蛋白聚糖，胶原II，RANKL，和/或IL-1。举例而言，本发明的药物组合物可包含第一抗原结合蛋白和第二单克隆抗体，第一抗原结合蛋白可以是针对ADAMTS5的单克隆抗体，第二单克隆抗体也可以结合ADAMTS5。又例如，本发明的药物组合物可包含第一抗原结合蛋白和第二抗原结合蛋白，第一抗原结合蛋白是结合ADAMTS5的单克隆抗体，第二抗原结合蛋白是结合下述之一的单克隆抗体：ADAMTS4，NGF，OSM，TNF-α，IL-6，VIP，TRPV1，TRPV4，ADAMTS1，聚集蛋白聚糖，胶原II，RANKL，和/或IL-1。

还提供治疗有所需要的患者的方法，包括施用至少一剂本发明的药物组合物。在一些方面，患者罹患软骨疾病。患者可罹患一种或多种选自下组的疾病：癌症，疼痛，慢性疼痛，神经性疼痛，手术后疼痛疼痛，骨关节炎，运动损伤，侵蚀性关节炎，类风湿性关节炎，银屑病关节炎，莱姆关节炎，幼年型关节炎，强直性脊椎炎，神经痛，神经病，痛觉，神经损伤，缺血，神经变性，炎性疾病，软骨降解，影响喉，气管，耳道，椎间盘，韧带，腱，关节囊或骨发育的疾病，椎间盘降解，骨质减少，或牙周病，急性关节损伤，和/或涉及关节破坏的疾病。在一些情况中，患者罹患骨关节炎。

在另一个实施方案中，施用至少一剂所述药物组合物在所述患者中降低软骨降解。在另一个实施方案中，施用至少一剂所述药物组合物在所述患者中抑制和/或降低聚集蛋白聚糖切割。

本文中还提供药物组合物，其能够治疗与软骨降解有关的疾病或减轻由此生成的症状且为本文所述方法和用途而进行配制。本发明提供ADAMTS5抗体，其用于治疗软骨疾病，单独或与至少一种其它治疗剂，包括但不限于至少一种类固醇和/或止痛剂组合施用。本发明的抗原结合蛋白可以在同一剂中或分开地与其它治疗剂共施用。本发明还提供ADAMTS5抗体或其片段，其用于本文所述所有方法和用途。

如本文中所使用的，“患者”指人或其它动物。

如本文中所使用的，“治疗”意味着：(1)改善或预防所治疗的状况或所治疗的状况的一种或多种生物学表现，(2)干预(a)导致或负责所治疗的状况的生物学级联中的一个或多个点或(b)所治疗的状况的一种或多种生物学表现，或(3)缓解一种或多种与所治疗的状况有关的症状或效应。熟练技术人员会领会“预防”不是一个绝对术语。在医学中，“预防”理解为指实质性降低状况或其生物学表现的可能性或严重性，或延迟此类状况或其生物学表现的发作的药物的防范性施用。

如本文中所使用的，“安全且有效量”意味着在合理医学判断的范围内至少一种抗原结合蛋白足以在要治疗的状况中实质性诱导积极改变但低得足以避免严重副作用(以合理的好处/风险比)的量。至少一种本发明抗原结合蛋白的安全且有效量会随选择的特定化合物(例如考虑化合物的效力，功效，和半衰期)；选择的施用路径；所治疗的状况；所治疗的状况的严重性；所治疗的患者的年龄，体型，重量，和体格状况；要治疗的患者的医学史；治疗的持续时间；并行疗法的性质；期望的治疗效果；等等因素变化，但是无论如何可以由熟练技术人员常规确定。

本发明的抗原结合蛋白可通过任何合适施用路径来施用，包括系统施用和表面施用二者。系统施用包括口服施用，胃肠外施用，经皮施用，直肠施用，和通过吸入的施用。胃肠外施用指肠以外的施用路径，经皮，或通过吸入，而且通常是通过注射或输注。胃肠外施用包括静脉内，肌肉内，和皮下注射或输注，包括关节内施用。吸入指施用入患者的肺，或是经由口或是经由鼻道吸入。表面施用包括应用于皮肤以及眼内，耳，阴道内，和鼻内施用。

本发明的抗原结合蛋白可一次性或依照剂量给药方案施用，其中对于给定时间段以不同时间间隔施用多剂。例如，可以每天施用一次，两次，三次，或四次剂量。可以施用剂量直至实现期望的治疗效果，或无限期地以维持期望的治疗效果。适合于本发明抗原结合蛋白的剂量给药方案取决于该化合物的药动学特性，诸如吸收，分布，和半衰期，这些可以由熟练技术人员来测定。另外，根据所治疗的状况，所治疗的状况的严重性，所治疗的患者的年龄和体格状况，要治疗的患者的医学史，并行疗法的性质，期望的治疗效果，熟练技术人员知识和经验内的等等因素，对本发明的化合物施用合适的剂量给药方案，包括此类方案的持续时间。此类熟练技术人员会进一步理解，鉴于患者个体对剂量给药方案的响应或患者个体的需要随时间变化，合适的剂量给药方案可能需要调整。

在某些实施方案中，抗体用于将药物投递至软骨。此类药物可以是聚集蛋白聚糖酶抑制剂，抗炎药，类固醇或涉及疼痛管理的药物。因而，在一个方面，本发明是将药物投递至软骨的方法，包含将药物连接至本发明的抗体。此类投递可以在体外，离体，或在体内进行。

在另一个实施方案中，抗体用于将会促进新软骨生长的生长因子投递至软骨。此类生长因子包括骨形态发生蛋白，特别是BMP-7。此类投递可以在体外，离体，或在体内进行。

实施例

下述实施例例示本发明的各个方面。

实施例1-针对人ADAMTS4和人ADAMTS5的单抗的生成

在经转染CHO细胞和/或BacMam经转导HEK293细胞中生成人ADAMTS5和ADAMTS4蛋白，并通过常规层析方法来分离。

给SJL小鼠共免疫纯化的ADAMTS4(全长的)和ADAMTS5(截短的，全长的，Cat，Cat/dis域)。在来自连续采血的血清上测试免疫原性。

分离脾细胞和淋巴结，并使用P3X63/Ag8.653衍生融合配偶与小鼠骨髓瘤细胞。生成永生化抗体生成细胞。使用HAT选择来取消未融合的骨髓瘤细胞。

对来自活性培养物的所得杂交瘤上清液筛选对重组人ADAMTS5和ADAMTS4的特异性结合和中和。对命中鉴定，确认并通过有限稀释或半固体培养基中的生长克隆至单克隆性。

在液体培养中扩大具有期望特征的单克隆抗体，并通过标准层析方法纯化抗体。然后对所得纯化的抗体克隆进一步表征结合亲和力和功能效力。

实施例2-鼠抗体表征

使用体外聚集蛋白聚糖底物切割测定法对ADAMTS5单抗表征中和效力(表1)。使用Octet QK(表1)和BiaCore(可比较的，但未显示)技术二者对ADAMTS5单抗标准亲和力。还通过celTRF和Octet QK对抗体测试对人ADAMTS 1，ADAMTS4，ADAMTS 13，MMP1，MMP3，MMP9和MMP13的交叉反应性，都是阴性的(未显示)。还通过针对小鼠，犬，和猕猴ADAMTS5的结合和中和对所有单抗评估直向同源交叉反应性(表1)。还检测针对大鼠ADAMTS5的结合(未显示)。Octet QK上抗人ADAMTS5单抗的鼠和嵌合形式的亲和力比较汇总于表2。

表1：纯化的抗人ADAMTS5单克隆抗体的表征。

表2：纯化的鼠和嵌合抗人ADAMTS5单抗的直接比较

实施例3-序列

根据实施例2中鉴定的特征，鉴定出六种单克隆抗体。对这些抗体的可变区测序。比对显示于下文(表3)。共有(大多数)重链可变区和轻链可变区呈现于下文SEQ ID NO：30和31。单抗编号12F4.1H7，1G10.1C9，2D3.1D4，3A12.1D7，5F10.1H6，和7B4.1E11的重链可变区分别呈现于SEQ ID NO：32-37，而且分别由SEQ ID NO：147，157，151，153，155，和149编码。单抗编号2D3.1D4，3A12.1D7，5F10.1H6，7B4.1E11和12F4.1H7的轻链可变区分别呈现于SEQ ID NO：38-42，而且分别由SEQ ID NO：152，154，156，150，和148编码。

表3：抗ADAMTS5单抗CDR序列比对

实施例4-人OA软骨外植体

供体人OA软骨得自膝置换手术。软骨加工自骨并切成3mm直径片。将片随机化并在96孔板中培养。为了离体软骨降解，容许组织中的内源疾病因素发展。用下述各项处理样品：匹配的对照IgG同种型，选定抗ADAMTS 5抗体(命名为7B4.1E11和12F4.1H7)，选定抗ADAMTS 4抗体(命名为7E8.1E3)，或一种已知聚集蛋白聚糖酶/MMP抑制剂，下文显示为GSK571949(CAS编号329040-94-0)。在每一个供体板上以8份重复测试每一种处理条件。在贯穿实验过程的多个点对每一份样品测量对ARGSVIL(SEQ ID NO：1)尼奥表位释放的抑制。

GSK571949

如先前所述，聚集蛋白聚糖酶对聚集蛋白聚糖的切割通常发生于聚集蛋白聚糖的球间域内的一个保守区。酶切割会产生一个含有尼奥表位的释放片段，尼奥表位具有来自聚集蛋白聚糖的N端氨基酸序列(ARGSVIL)。此切割尼奥表位可使用特异性结合切割形式，但不结合完整聚集蛋白聚糖的单克隆抗体来检测和量化。ADAMTS5抗体和ADAMTS5抑制剂都显示比对照和ADAMTS4抗体显著更大的对ARGSVIL释放的抑制。ARGSVIL释放的百分比抑制的汇总显示于图1。结果证明了与小分子测定对照化合物相比，对于2-3周评估期，ADAMTS5特异性单抗能够以大约70％的比率抑制降解。这些结果在许多供体个体样品内和间是一致的。

实施例5-ADAMTS5抗体在人OA软骨外植体中的剂量应答

如实施例4所述测试对ARGSVIL释放的百分比抑制以获得选定抗ADAMTS5抗体的剂量应答(见图2)。以下述剂量测试鼠抗体7B4.1E11：1340nM，670nM，335，nM，81.25nM。还使用对照聚集蛋白聚糖酶/MMP抑制剂。百分比ARGSVIL释放在抗ADAMTS5的最高剂量时最低，而且在用较低剂量处理时下降。使用匹配同种型对照抗体处理剂量(未显示)来测定0％抑制，并使用GSK571949的有效单剂来计算100％抑制。此单抗处理展现了表现为在670nM剂量时达到最大效应的剂量应答(图2)。然而，应当注意670nM剂量点代表较多供体(n＝22)，而其它剂量包括较少的(n≤5)。

实施例6-体内研究DMM

使用失稳化内侧半月板(DMM)模型在小鼠中诱发OA来评估抗ADAMTS5抗体功效(见图3)。显示了两项分开的实验。在手术DMM之前3天，给小鼠施用0.5mg/剂下述抗体之一：抗ADAMTS5(7B4.1E11)，抗ADAMTS5(12F4.1H7)，或IgG同种型。对照组包括进行DMM手术的未处理小鼠，进行伪手术的小鼠和正常小鼠。给药之后6天，处死小鼠并由不知情的调查人员实施组织病理学，自此对每一个评估的小鼠膝给出关节得分。抗ADAMTS5抗体显示出与IgG1同种型对照相比显著更好的关节得分均值。另外，伪手术膝和正常膝具有与未处理膝和IgG同种型相比显著更好的关节得分均值。

实施例7-单克隆抗体在体外和在体内渗入软骨

治疗性抗体渗入组织并到达疾病部位及其特定靶物的能力对于功效是至关重要的。虽然归类为分泌蛋白，但是已经显示了聚集蛋白聚糖酶优先定位于软骨基质内软骨细胞的胞周区。因此，为了使治疗性单抗到达聚集蛋白聚糖酶靶物，可能需要穿过软骨基质的渗透。

首先，评估单抗渗透人软骨的能力是使用具有多种特异性的单抗，包括选定抗ADAMTS5单抗对离体组织实施的。在具有对位于软骨细胞表面上的人蛋白的特异性的小鼠单克隆抗体或非特异性同种型对照存在下将来自膝置换手术标本的跨越滑膜表面至软骨下骨的全厚度软骨栓在组织培养中放置限定持续时间。在每一个时间点结束时，将组织加工供全厚度评估，切片并使用经FITC标记的抗小鼠检测抗体染色。渗透由软骨组织内软骨细胞染色的深度和强度来定义。不管靶物特异性，观察到单抗渗透是浓度和时间依赖性过程，主要源自软骨的滑膜表面并根据浓度在3-4天内发展至全厚度渗透(未显示)。对用同种型对照单抗处理的软骨栓没有观察到染色(未显示)。

使用近红外(NIR)染料标记的单克隆抗体，包括ADAMTS4，ADAMTS5和同种型对照的选择性单抗实施软骨渗透的体内评估。将NIR标记的单抗系统(腹膜内)使用(0.5mg剂量)于在6周前经历手术诱发骨关节炎(DMM)的小鼠。使用Licor Odyssey系统在施用之后的多个时间点监测整个动物中单抗的生物分布。单抗施用之后4天，处死小鼠并在Odyssey上实施膝关节成像。然后将膝关节加工并切片，供配备有滤光片和照相机(用于NIR检测)的显微镜上的高分辨率分析。在系统单抗施用之后4天内，对抗ADAMTS5和抗ADAMTS4单抗能观察到全厚度软骨渗透，而对同种型对照单抗没有观察到特异性染色(未显示)。对ADAMTS5和ADAMTS4特异性单抗观察到特征性胞周软骨细胞染色样式(未显示)。

实施例8-抗体人源化-杂交瘤可变区的克隆

自7B4.1E11和12F4.1H7杂交瘤细胞提取总RNA，然后通过逆转录和聚合酶链式反应(RT-PCR)生成重链和轻链可变域cDNA序列。用于RT-PCR的正向引物是对鼠免疫球蛋白基因前导序列特异性的简并引物的混合物，而反向引物是对抗体恒定区特异性的，在此情况中是用于7B4.1E11的同种型IgG1和用于12F4.1H7的IgG2。引物是基于Jones和Bendig(Bio/Technology 9：88，1991)描述的策略来设计的。对两个V区序列进行RT-PCR以能够随后验证正确的V区序列。克隆通过RT-PCR生成的V区产物(Invitrogen TA克隆试剂盒)并获得序列数据。

实施例9-抗体人源化-嵌合物的克隆

通过组装包括用于克隆入哺乳动物表达载体的限制性位点以及人信号序列的交叠寡核苷酸来从头制备编码嵌合抗体的DNA表达构建物。引入HindIII和SpeI限制性位点以搭建含有信号序列(SEQ ID NO：45)的VH域，供克隆入含有人γ1恒定区的哺乳动物表达载体。引入HindIII和BsiWI限制性位点以搭建含有信号序列(SEQ ID NO：45)的VL域，供克隆入含有人κ恒定区的哺乳动物表达载体。

实施例10-抗体人源化-人源化变体的克隆

通过组装包括用于克隆入哺乳动物表达载体的限制性位点以及人信号序列的交叠寡核苷酸来从头制备编码人源化抗体变体的DNA表达构建物。引入HindIII和SpeI限制性位点以搭建含有信号序列(SEQ ID NO：45)的VH域，供克隆入含有人γ1恒定区的哺乳动物表达载体。引入HindIII和BsiWI限制性位点以搭建含有信号序列(SEQ ID NO：45)的VL域，供克隆入含有人κ恒定区的哺乳动物表达载体。

表4：抗体变体

实施例11-抗体人源化-重组抗体的表达(包括抗体量化)

将分别编码重链和轻链的表达质粒瞬时共转染入HEK 293 6E细胞并以小规模表达以生成抗体。还表达7B4和12F4嵌合抗体和无关对照抗体的重链和轻链。通过ELISA来量化抗体。ELISA板用抗人IgG(Sigma I3382)以1μg/ml包被，并用封闭溶液(含4％BSA的Tris缓冲盐水)封闭。添加组织培养上清液的各种稀释液并将板于室温温育1小时。还将已知标准抗体的稀释液添加至板。在TBST中清洗板并如下检测结合，即以封闭溶液中的1/1000稀释度添加经过氧化物酶标记的抗人κ轻链抗体(Sigma A7164)。将板于室温温育1小时，之后在TBST中清洗。通过添加OPD底物(Sigma P9187)使板显色，并通过添加2M H₂SO₄终止显色。于490nm测量吸光度并使用已知标准稀释液的数据来绘制标准曲线。使用标准曲线来估算组织培养上清液中的抗体浓度。

实施例12-ADAMTS5结合ELISA

进行结合ELISA来测试在细胞培养物上清液中表达的抗体对重组ADAMTS5的结合。ELISA板用重组人ADAMTS5以0.2μg/ml包被，并用封闭溶液(含4％BSA的Tris缓冲盐水)封闭。添加组织培养上清液的各种稀释液并将板于室温温育1小时，之后在TBST中清洗。如下检测结合，即以封闭溶液中的1/1000稀释度添加经过氧化物酶标记的抗人κ轻链抗体(Sigma A7164)。将板于室温温育1小时，之后在TBST中清洗。通过添加OPD底物(Sigma P9187)使板显色，并通过添加2M H₂SO₄终止显色。用读板仪于490nm测量吸光度并将吸光度均值针对浓度绘图。

图6-9显示人源化抗ADAMTS5抗体对重组抗原的结合。

实施例13-BIAcore

通过伯胺偶联在CM5芯片上固定化抗人IgG(BiacoreTM，BR-1008-39)。然后使用此表面来捕捉人源化抗体，然后以单一浓度64nM使ADAMTS5(R&D Systems 2198-AD)通过捕获的抗体，使用100mM磷酸接着用3M MgCl₂进行再生。结合曲线用缓冲液注射(即0nM)双重参照，并使用1∶1模型将数据拟合T100分析软件。于25℃进行运行，使用HBS-EP作为运行缓冲液。得到的数据显示于表5。所有抗体自组织培养物上清液捕捉，除非另有规定。

表5：对人ADAMTS5的结合的动力学

样品	ka(1/Ms)	kd(1/s)	KD(nM)
				BPC1623(纯化的)	6.463E+05	4.700E-05	0.07273
BPC1622(纯化的)	8.723E+05	1.056E-03	1.211
				BPC1622	1.159E+06	1.305E-03	1.125
BPC1623	6.234E+05	4.823E-05	0.07737
				BPC1634	5.538E+05	4.811E-04	0.8687
BPC1635	7.041E+05	8.258E-04	1.173
				BPC1636	1.073E+06	8.963E-04	0.8357
BPC1637	1.119E+06	9.625E-04	0.8604
				BPC1638	8.749E+05	8.309E-04	0.9497
BPC1639	9.271E+05	8.937E-04	0.9639
				BPC1640	7.870E+05	8.492E-04	1.079
BPC1641	7.144E+05	9.453E-04	1.323
				BPC1642	8.874E+05	1.210E-03	1.364
BPC1643	1.362E+06	1.434E-03	1.053
				BPC1644	1.491E+06	1.572E-03	1.054
BPC1645	1.119E+06	1.159E-03	1.036
				BPC1646	1.788E+06	1.843E-03	1.031
BPC1647	1.485E+06	1.453E-03	0.9784
				BPC1648	7.875E+05	9.512E-04	1.208
BPC1649	1.023E+06	1.297E-03	1.267
				BPC1650	3.140E+06	3.427E-03	1.091
BPC1651	2.653E+06	3.150E-03	1.188
				BPC1652	1.963E+06	2.122E-03	1.081
BPC1653	2.236E+06	2.597E-03	1.161
				BPC1654	1.040E+06	1.137E-03	1.094
BPC1655	无	结合	可见
				BPC1656	6.327E+05	3.950E-04	0.6243
BPC1657	5.850E+05	7.540E-05	0.1289
				BPC1658	4.483E+05	1.398E-04	0.3119
BPC1659	4.894E+05	4.147E-05	0.08475

实施例14-鼠，嵌合和人源化ADAMTS5单抗的比较亲和力

以两种方式对单抗评估亲和力(抗原在传感器上，Octet QK和抗体在传感器上，Biacore)(表6)。由于在体内酶的天然发生细胞关联形式，会代表细胞靶物的Octet QK方式的关联性是关于ADAMTS5的。然而，由于ADAMTS5也可见分泌形式，所以我们还使用Biacore在抗体在传感器上的方式评估亲和力。在Octet和Biacore分析之间观察到的差异可能代表方式变化(即Octet QK中的抗原在传感器上和Biacore中的单抗在传感器上)和该等系统之间的技术差异。然而，在以相同方式运行时，该等系统在这些单抗的总体KD方面显著相似。观察到Kd和Ka中的差异，可能是由于仪器设计差异。

人源化CS单抗(12F4H4L0)展现在Octet QK系统中以抗原下方式测量的38.3pM的总体亲和力(KD)。12F4H4L0单抗在Biacore系统中以单抗下形式展现出85pM的KD。为参照而显示的7B4H0L0在Octet QK和Biacore系统中分别展现出205和869pM的KD。此处为参照而显示了每一种单抗的鼠和嵌合形式的亲和力值以证明亲和力在人源化后得到保留。所以单抗在此实验中含有完全功能性的Fc部分(即不是Fc失能的)。

表6：鼠，嵌合和人源化ADAMTS5单抗的比较亲和力

实施例15-人OA软骨外植体实验人源化12F4 H4L0剂量范围

以剂量应答形式在此系统中评估人源化12F4 H4L0 Fc失能单抗，对比适宜的Fc失能同种型和其它阳性和阴性对照并与单一剂量的亲本鼠12F4.1H7型式比较。在此研究中个别评估了多名供体(n＝4)，并汇编结果以生成跨越OA患者群间的抑制得分均值。以单一浓度(2uM)使用GSK571949作为测定对照以设置最大抑制水平。结果展示清楚的12F4 H4L0剂量应答，其中与一定剂量范围的无关人源化同种型对照单抗相比，在最高剂量(1333nM)时实现最大应答(图10)。在最高剂量(2uM)时实现了相当于GSK571949几乎完全的对ARGS尼奥表位的抑制。另外，证明了在这些供体中12F4 H4L0的抑制水平大于12F4.1H7，提示功效在人源化后得到保留。虽然单抗的人源化型式的功效水平较大，但是不清楚这是真实的升高或者是由于单抗制备物的差异。应当注意，在别的OA供体的其它实验中对单抗的12F4.1H7型式观察的功效水平(图1)大于此处观察到的。考虑到此系统对人疾病和观察到的功效的关联性，此数据强烈支持此办法和这些单抗的有效性。

实施例16-人OA软骨外植体治疗剂加追踪实验

此实验如实施例15那样设计，但是遵循单抗或化合物的5天处理持续时间以容许系统饱和，移除处理及用没有处理的新鲜培养基替换。测定继续4周，定期对培养液采样以随后评估软骨降解标志物。在每一次采样之后，样品中取出的相同体积用新鲜培养基来替换。此型式设计用来解决治疗效果的效力和持续时间及间接提示组织内的ADAMTS5周转速率。所示结果汇编自使用4名不同人OA供体的相同实验(图11)。这些结果提供证据证明人OA软骨中ADAMTS5单抗应答的持续时间延长，甚至在晚期疾病状态中(即在关节置换时)。另外，这些结果提供证据证明疾病状态中ADAMTS5的低周转速率。

实施例17-Fc失能人源化抗体

将编码人源化12F4 H4VH域的基因克隆到经修饰人γ1恒定区，IgG1m(AA)上。IgG1m(AA)恒定区含有CH2域中位置L235和G237(EU索引编号方式)处的两处丙氨酸替代。这些突变使得使得抗体不能结合必需的Fc受体或补体成分C1q，因此使其诱导抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)的能力失能。

表7

在HEK细胞中表达编码抗体BPC1623(12F4嵌合物)，BPC1659(12F4H4L0 IgG1wt)和BPC1661(12F4 H4L0 IgG1m(AA))的重链和轻链的表达质粒。抗体通过蛋白A亲和层析来纯化并通过分光光度法来量化。

进行结合ELISA来比较纯化的抗体对ADAMTS5的结合。包括IgG1wt同种型的无关抗体和Fc失能抗体作为阴性对照。简言之，将板用重组人ADAMTS5以0.2ug/ml包被并用封闭溶液(含4％BSA的Tris缓冲盐水)封闭。添加各种浓度的纯化的抗体并将板于室温温育1小时，之后用TBST(Tris缓冲盐水+0.05％Tween 20)清洗。如下检测结合，即以封闭溶液中的1/1000稀释度添加经过氧化物酶标记的抗人κ轻链抗体(Sigma A7164)。将板于室温温育1小时，之后在TBST中清洗。通过添加OPD底物(Sigma P9187)使板显色，并通过添加2M H₂SO₄终止显色。用读板仪于490nm测量吸光度并将吸光度均值针对浓度绘图。

图12显示纯化的抗ADAMTS5抗体对重组抗原的结合。

实施例18-Fc失能抗体的Biacore

通过伯胺偶联在CM5生物传感器芯片上固定化蛋白A。使用此表面来捕捉Fc失能抗ADAMTS5抗体，12F4 H4L0IgG1m(AA)(BPC1661)，(CHO和HEK表达材料)。以64nM，16nM，4nM，1nM，0.25nM和0.0625nM使用重组人ADAMTS5(R&D Systems 2198-AD)作为分析物，使用缓冲液注射(即0nM)来作为结合曲线的双重参照。捕捉表面的再生(即捕获抗体的移除)用50mMNaOH进行。运行缓冲液是HBS-EP，并在Biacore T100上于25℃进行运行。将数据拟合机器分析软件固有的1∶1模型。结果显示了在不同细胞系中生成的材料之间在结合亲和力方面没有差异。

结果

构建物	ka	kd	KD(nM)
				12F4 H4L0 IgG1m(AA)(HEK表达的)	9.43E+05	6.98E-05	0.074
12F4 H4L0 IgG1m(AA)(CHO表达的)	8.30E+05	5.85E-05	0.070

实施例19-抗原-抗体相互作用的结晶学结构建模-表位和MOA的暗 示

使用ADAMTS5和ADAMTS5单抗12F4.1H7的分开晶体结构进行的计算机结构“最佳拟合”计算建模提示ADAMTS5的催化和解联蛋白域二者之间的同时抗体/抗原相互作用。ADAM和ADAMTS蛋白酶的催化和解联蛋白域由铰链区分开，其赋予该等域之间的柔性，可以起调节功能或容许底物定位至催化位点的作用。在跨越表位的此域处观察到的高亲和力单抗结合可能一起“锁定”ADAMTS5的催化和解联蛋白域，由此中和酶促活性。图13显示ADAMTS5与12F4.1H7和7B4.1E11单抗之间相互作用的预测氨基酸位点。

Claims (59)

1.一种分离的抗原结合蛋白，其包含至少一个能够结合人ADAMTS5的第一免疫球蛋白可变域。

2.权利要求1的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是抗体或其片段。

3.权利要求1或2的抗原结合蛋白，其中所述抗体是单克隆抗体或其片段。

4.权利要求3的抗原结合蛋白，其中所述单克隆抗体或其片段是小鼠的，嵌合的，人源化的，或完全人的。

5.权利要求1至4任一项的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含至少一个互补决定区。

6.权利要求1至5任一项的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是包含重链和轻链的单克隆抗体，重链包含CDRH1，CDRH2和CDRH3，轻链包含CDRL1，CDRL2和CDRL3，其中重链的互补决定区(CDR)选自下组：

a)与氨基酸序列DAWMD具有至少约80％序列同一性的CDRH1；

b)与氨基酸序列EIRHKANDHAIFYXESVKG具有至少约70％序列同一性的CDRH2；和

c)与氨基酸序列TYYYGSSYGYCDV或PFAY具有至少约70％序列同一性的CDRH3；且

轻链的互补决定区选自下组：

d)与氨基酸序列KASQSVGTTIV或RTSENIYSYLA的具有至少约70％序列同一性的CDRL1；

e)与氨基酸序列NAKTLAE或SASNRXT具有至少约70％序列同一性的CDRL2；和

f)与氨基酸序列QQYSSYPFT或QHHYGTPWT具有至少约70％序列同一性的CDRL3。

7.权利要求1至5任一项的抗原结合蛋白，其中所述多肽是包含重链和轻链的单克隆抗体，重链包含CDRH1，CDRH2和CDRH3，轻链包含CDRL1，CDRL2和CDRL3，其中重链的互补决定区(CDR)选自：

(a)CDRH1是氨基酸序列DAWMD；

(b)CDRH2选自氨基酸序列EIRHKANDHAIFYAESVKG，EIRNKANNHARHYAESVKG，EIRHKANDYAIFYDESVKG，EIRHKANDHAIFYDESVKG，或DIRNTANNHATFYAESVKG，EIRHKANDHAIFYDESVKG；和

(c)CDRH3是TYYYGSSYGYCDV或PFAY；且

轻链的互补决定区选自：

(d)CDRL1选自氨基酸序列KASQSVGTTIV，RTSENIYSYLA，或KASQNVGTAVV；

(e)CDRL2选自氨基酸序列NAKTLAE，SASNRHT，SASTRYT，或SASNRYT；和

(f)CDRL3选自氨基酸序列QQYSSYPFT，QHHYGTPWT，QQYVNYPFT，或QQYTSYPFT。

8.权利要求1至7任一项的抗原结合蛋白，其中CDRH3包含氨基酸序列PFAY。

9.权利要求1至8任一项的抗原结合蛋白，其中所述多肽是Fab或F(ab)₂片段。

10.权利要求1的抗原结合蛋白，其中所述第一免疫球蛋白可变域是单链可变域。

11.权利要求1至10任一项的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白进一步包含能够结合第二抗原的第二免疫球蛋白可变域。

12.权利要求11的抗原结合蛋白，其中所述第二免疫球蛋白可变域结合至少一种选自下组的抗原：人血清清蛋白，ADAMTS4，NGF，OSM，TNF-α，IL-6，VIP，TRPV1，TRPV4，ADAMTS1，聚集蛋白聚糖，胶原II，RANKL，粘结蛋白聚糖4，Hedgehog，和/或IL-1。

13.权利要求1至12任一项的抗原结合蛋白，其特征在于对人ADAMTS5的解离常数KD(下)等于或小于约2.5×10^-10M。

14.权利要求1至13任一项的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白阻断和/或降低ADAMTS5的至少一种活性。

15.权利要求1至14任一项的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白阻断和/或降低ADAMTS5对聚集蛋白聚糖在Glu373-Ala374切割位点处的切割。

16.权利要求1至15任一项的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白在施用于动物时能够渗透软骨。

17.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1至16任一项的抗原结合蛋白。

18.一种宿主细胞，其包含权利要求17的多核苷酸。

19.一种药物组合物，其包含至少一种权利要求1至16任一项的抗原结合蛋白。

20.一种药物组合物，其包含权利要求1至16任一项的第一抗原结合蛋白和第二单克隆抗体。

21.权利要求20的药物组合物，其中所述第二单克隆抗体结合选自下组的抗原：ADAMTS4，ADAMTS5，NGF，OSM，TNF-α，IL-6，VIP，TRPV1，TRPV4，ADAMTS1，聚集蛋白聚糖，胶原II，RANKL，和/或IL-1。

22.一种治疗有所需要的患者的方法，包括将至少一剂权利要求19至21任一项的药物组合物施用于所述患者。

23.权利要求22的方法，其中所述患者罹患软骨疾病。

24.权利要求23的方法，其中所述患者罹患至少一种选自下组的疾病：癌症，疼痛，慢性疼痛，神经性疼痛，手术后疼痛，骨关节炎，运动损伤，侵蚀性关节炎，类风湿性关节炎，银屑病关节炎，莱姆关节炎，幼年型关节炎，强直性脊椎炎，神经痛，神经病，痛觉，神经损伤，缺血，神经变性，炎性疾病，软骨降解，影响喉，气管，耳道，椎间盘，韧带，腱，关节囊或骨发育的疾病，椎间盘降解，骨质减少，或牙周病，急性关节损伤，和/或涉及关节破坏的疾病。

25.权利要求24的方法，其中所述患者罹患骨关节炎。

26.权利要求22至25任一项的方法，其中施用至少一剂所述药物组合物降低所述患者中的软骨降解。

27.权利要求22至26任一项的方法，其中施用至少一剂所述药物组合物抑制和/或降低所述患者中的聚集蛋白聚糖切割。

28.权利要求22至27任一项的方法，其中所述药物组合物静脉内，肌肉内，关节内，皮下，口服，鼻内，和/或经呼吸吸入器施用。

29.一种分离的单克隆抗体，其包含六个CDR，其中CDRH1是DAWMD(SEQ ID NO：2)，CDRH2是EIRNKANNHARHYAESVKG(SEQ IDNO：13)，且CDRH3是TYYYGSSYGYCDV(SEQ ID NO：18)且CDRL1是RTSENIYSYLA(SEQ ID NO：20)，CDRL2是NAKTLAE(SEQ ID NO：22)，且CDRL3是QHHYGTPWT(SEQ ID NO：27)。

30.一种分离的单克隆抗体，其包含六个CDR，其中CDRH1是DAWMD(SEQ ID NO：2)，CDRH2是EIRHKANDHAIFYDESVKG(SEQ IDNO：15)，且CDRH3是PFAY(SEQ ID NO：5)且CDRL1是KASQSVGTTIV(SEQID NO：19)，CDRL2是SASNRHT(SEQ ID NO：23)，且CDRL3是QQYTSYPFT(SEQ ID NO：29)。

31.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与权利要求29或权利要求30的抗体竞争性结合人ADAMTS5。

32.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以通过结合常数(Ka)测量的至少约5×10⁴升/摩尔的亲和力结合人ADAMTS5的中和性表位。

33.权利要求29至31任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含人恒定区。

34.权利要求1的抗体或抗原结合片段，其属于免疫球蛋白IgG1，IgG2，IgG3，IgG4或IgM类。

35.权利要求29至34任一项的抗原结合片段，其中所述片段选自下组：Fab，Fab′，F(ab′)₂和Fv。

36.一种抗原结合蛋白或其片段，其包含抗体VH域，抗体VH域包含选自SEQ ID NO：76，80，116，118，120，122，124，126，128，136，138，140，142，和144的氨基酸序列。

37.一种抗原结合蛋白或其片段，其包含抗体VL域，抗体VL域包含选自SEQ ID NO：78，82，130，132，134，和146的氨基酸序列。

38.一种抗原结合蛋白或其片段，其包含权利要求36的抗体VH域和权利要求37的VL域。

39.权利要求38的抗原结合蛋白或其片段，其包含抗体VH域和VL域，VH域包含SEQ ID NO：76，VL域包含SEQ ID NO：78。

40.权利要求38的抗原结合蛋白或其片段，其包含抗体VH域和VL域，VH域包含SEQ ID NO：80，VL域包含SEQ ID NO：82。

41.权利要求38的抗原结合蛋白或其片段，其包含抗体VH域和VL域，VH域包含选自SEQ ID NO：116，118，120，122，124，126，和128的氨基酸序列，VL域包含选自SEQ ID NO：130，132，和134的氨基酸序列。

42.权利要求38的抗原结合蛋白或其片段，其包含抗体VH域和VL域，VH域包含选自SEQ ID NO：136，138，140，142，和144的氨基酸序列，VL域包含SEQ ID NO：146。

43.一种抗原结合蛋白或其片段，其包含抗体重链，抗体重链包含选自SEQ ID NO：68，72，84，86，88，90，92，94，96，104，106，108，110，112，和158的氨基酸序列。

44.一种抗原结合蛋白或其片段，其包含抗体轻链，抗体轻链包含选自SEQ ID NO：70，74，98，100，102，和114的氨基酸序列。

45.一种抗原结合蛋白或其片段，其包含权利要求43的抗体重链和权利要求44的抗体轻链，所述重链包含选自SEQ的氨基酸序列。

46.权利要求45的抗原结合蛋白或其片段，其包含抗体重链和抗体轻链，抗体重链包含SEQ ID NO：68，抗体轻链包含SEQ ID NO：70。

47.权利要求45的抗原结合蛋白或其片段，其包含抗体重链和抗体轻链，抗体重链包含SEQ ID NO：72，抗体轻链包含SEQ ID NO：74。

48.权利要求45的抗原结合蛋白或其片段，其包含抗体重链和抗体轻链，抗体重链包含选自SEQ ID NO：84，86，88，90，92，94，和96的氨基酸序列，抗体轻链包含选自SEQ ID NO：98，100，和102的氨基酸序列。

49.权利要求45的抗原结合蛋白或其片段，其包含抗体重链和抗体轻链，抗体重链包含选自SEQ ID NO：104，106，108，110，112，和158的氨基酸序列，抗体轻链包含SEQ ID NO：114。

50.一种分离的多核苷酸，其编码抗体VH域，抗体VH域包含选自SEQ IDNO：76，80，116，118，120，122，124，126，128，136，138，140，142，和144的氨基酸序列。

51.权利要求50的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸选自SEQ ID NO：75，79，115，117，119，121，123，125，127，135，137，139，141，143，和159。

52.一种分离的多核苷酸，其编码抗体VL域，抗体VL域包含选自SEQ IDNO：78，82，130，132，134，和146的氨基酸序列。

53.权利要求52的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸选自SEQ ID NO：77，81，129，131，133，和145。

54.一种分离的多核苷酸，其编码抗体重链，抗体重链包含SEQ ID NO：68，72，84，86，88，90，92，94，96，104，106，108，110，112，和158的氨基酸序列。

55.权利要求54的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸选自SEQ ID NO：67，71，83，85，87，89，91，93，95，103，105，107，109，111，和159。

56.一种分离的多核苷酸，其编码抗体轻链，抗体轻链包含选自SEQ IDNO：70，74，98，100，102，和114的氨基酸序列。

57.权利要求56的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸选自SEQ ID NO：69，73，97，99，101，和115。

58.一种治疗有所需要的患者的方法，包括将至少一种权利要求1至16任一项的抗原结合蛋白施用于所述患者。

59.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以小于约5×10^-4升/秒的解离常数(Kd)结合人ADAMTS5的中和性表位。

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