CN110923240B - 一种昆虫成虫盘生长因子的功能及其dsRNA的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种昆虫成虫盘生长因子(IDGF)的功能及其dsRNA的应用，它可协助昆虫抵御病菌入侵，当其被dsRNA沉默后，昆虫抵抗力下降导致死亡。对小地老虎的成虫盘生长因子基因进行克隆、测序后，得到的序列为SEQ ID NO：1；在此基础上选择序列为SEQ ID NO：2的片段，用于双链RNA(dsRNA)的合成。将该dsRNA注入昆虫的体腔后，昆虫的发育过程中表现抵抗力下降，易感染病菌，出现黑化等现象，死亡率大大上升。本发明为害虫防治提供新的靶标。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种昆虫成虫盘生长因子(IDGF)的功能及其dsRNA的应用。
背景技术
农业害虫是威胁着我国粮食安全生产。目前长期施用化学杀虫剂防治，导致昆虫抗药性出现；间接致使农药用量越来越大，产生了环境污染、威胁人类身体健康等一系列问题。随着我国化肥农药减施等行动的开展，迫切需要新型的害虫防治方法和策略。
RNA干扰（RNAi）应用于害虫防治，近年来成为热门，并正在高速发展。该方法具有专一防治、绿色安全等优势。研究昆虫基因的功能可为基于RNAi害虫防治提供更广阔的舞台。针对昆虫特有功能基因设计害虫防治方案，即安全可靠，又高效除害，同时减少化学农药的施用。
昆虫对外来入侵病菌主要依靠体液免疫，若能发现关键基因在体液免疫的功能，针对其设计防治方法，就可降低免疫力，使得害虫在自然界死亡率上升，从而达到农药减施的目的。昆虫成虫盘生长因子(imaginal disk growth factor ,IDGF)是昆虫特有的类几丁质酶基因，其虽然有几丁质酶的保守结构域，但无几丁质酶固有的作用，其功能有待研究。有研究表明，IDGF可影响赤拟谷盗翅发育。本研究中首次发现IDGF在体液免疫时起到关键作用，利用其重要生物学功能来进行害虫防治，省时省力，安全高效。
发明内容
本发明的目的提供一种昆虫成虫盘生长因子的功能及其dsRNA的应用。
本发明提供的一种昆虫成虫盘生长因子基因，其核苷酸序列是SEQ ID NO：1。该序列是通过对小地老虎转录组的搜索，得到1条小地老虎成虫盘生长因子基因片段，通过进一步克隆获得全长cDNA序列。该序列长1610bp，包含1302 bp开放阅读框，编码434个氨基酸。其功能为可提高昆虫体液免疫，防止病菌感染。
本发明提供的一种小地老虎成虫盘生长因子基因片段，其核苷酸序列是SEQ IDNO：2 ，是根据SEQ ID NO：1设计上游引物SEQ ID NO：3和下游引物SEQ ID NO：4，通过PCR扩增获得SEQ ID NO：2，其含有T7启动子。进一步利用试剂盒合成dsRNA。
SEQ ID NO：2合成的dsRNA的害虫防治中的应用：注射上述dsRNA到昆虫体腔，结果表明：SEQ ID NO：2合成的dsRNA可以特异性地沉默小地老虎成虫盘生长因子基因AiIDGF的mRNA表达，并导致小地老虎因病菌感染而死亡。
附图说明
图1：6龄小地老虎注射SEQ ID NO：2合成的dsRNA后出现病菌感染而死亡的表型，左侧为注射dsGFP的对照，右侧为注射SEQ ID NO：2合成的dsRNA。
图2：小地老虎注射SEQ ID NO：2合成的dsRNA 24小时后，成虫盘生长因子AiIDGF的mRNA沉默情况，β-actin做为内参基因。**P<0.01。
实施例1
小地老虎成虫盘生长因子基因AiIDGF的序列的获得
（1）小地老虎成虫盘生长因子基因AiIDGF的序列在小地老虎转录组数据库的搜索
基于小地老虎转录组数据库，采用生物信息学方法对小地老虎成虫盘生长因子基因AiIDGF的序列进行搜索，经过序列分析及比对后，共获得1条飞小地老虎成虫盘生长因子基因AiIDGF的序列。
（2）小地老虎成虫盘生长因子基因AiIDGF的序列的验证
基于已获得小地老虎成虫盘生长因子基因AiIDGF的序列，采用primerpremier5.0 软件设计引物验证其全长mRNA序列。所用引物均由上海生工生物有限公司合成。提取小地老虎6龄若虫总RNA，反转录为cDNA模板，用于序列调取。经PCR后，将得到产物纯化，克隆转化到大肠杆菌中，送去测序。结果分析后，验证了小地老虎成虫盘生长因子基因AiIDGF的序列，其序列为SEQ ID NO：1。
实施例2
小地老虎成虫盘生长因子基因dsRNA合成
（1）小地老虎成虫盘生长因子基因dsRNA引物的设计
基于本研究所得到小地老虎成虫盘生长因子基因的序列SEQ ID NO：1 ，采用primer premier5.0 软件设计。设计dsRNA引物，其序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。所用引物均由上海生工生物有限公司合成。
（2）小地老虎成虫盘生长因子基因dsRNA的合成
上述dsRNA引物合成PCR产物，经Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）试剂盒纯化后按照T7 RiboMAX™ Express RNAi System（Promega）试剂盒说明体外转录合成dsRNA。dsRNA浓度采用酶标仪SpectraMax 190测定，并浓缩至终浓度为3μg/μl。
实施例3
小地老虎成虫盘生长因子基因dsRNA在害虫防治的应用
（1）小地老虎成虫盘生长因子基因dsRNA注射
将5μL（15μg）的dsRNA用25μL规格微量注射器注射到6龄小地老虎第2日龄幼虫七、八腹节之间，共注射30只，雌雄各半。注射相同体积浓度的dsGFP至对照组体内。将注射后小地老虎置于27℃恒温生化培养箱中饲养，并于1日后添加土壤基质。
（2）小地老虎成虫盘生长因子基因沉默效率检测
6龄小地老虎dsRNA注射后，选择注射后24h沉默效率检测，整虫虫体作为RNA 提取对象，每组设置3 个生物学重复。提取各样品的总RNA 并反转录成第一链cDNA，Real-timePCR 检测目的基因（AiIDGF）和管家基因（β-actin）的相对表达量，以计算目的基因的沉默效率。由图2可知，24小时小地老虎成虫盘生长因子基因沉默效率可达87.4%。
（3）注入dsRNA后6龄小地老虎表型的观察
6龄小地老虎幼虫经注射dsRNA 1日后，对照组与处理组均发育良好，无显著不适症状。添加土壤基质后，dsGFP对照组幼虫均可于6日前后开始预蛹，并成功化蛹。但dsRNA处理组添加土壤基质后，30头若虫出现病菌感染逐日增多，至6日时，已有17头幼虫出现发育迟缓，体色出现黑化，并逐步死去图（2），最终只有8头幼虫成功化蛹。基因沉默后，幼虫死亡率提升了73.3%。
Claims (3)
1.一种昆虫成虫盘生长因子基因，其特征在于核苷酸序列为SEQ ID NO：1。
2.一种dsRNA，其特征在于，所述dsRNA是由核苷酸序列是SEQ ID NO：2的昆虫成虫盘生长因子基因片段合成的。
3.如权利要求2所述的dsRNA在防治小地老虎中的应用。
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