CN110204605B - 转录因子C/EBPα作为ACOX1启动子区的转录因子的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种转录因子C/EBPα作为ACOX1启动子区的转录因子的应用，具体地，从牛基因组DNA中克隆了5条ACOX1启动子缺失片段，连接至双荧光素酶报告载体pGL3‑Basic中构建了5个重组的双荧光素酶报告载体，分别与C/EBPα过表达载体共转染，结果显示5个载体的荧光活性均显著降低，表明转录因子C/EBPα抑制了ACOX1基因的转录，从而明确了转录因子C/EBPα对ACOX1的转录调控作用。结合生物信息学分析与定点突变技术，结果显示‑1142～‑1129为C/EBPα转录因子位点。本发明为ACOX1的表达调控运用于家畜肉质遗传改良分子调控机制的研究提供依据。

Description

转录因子C/EBPα作为ACOX1启动子区的转录因子的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种转录因子C/EBPα作为 ACOX1启动子区的转录因子的应用。

背景技术

肌内脂肪含量影响着肉质的感官品质性状(多汁性、嫩度和风味)，同时与胴体品质有很强的关联性，所以在实际生产中肌内脂肪含量也常被用作肉质遗传改良的一个重要依据(Liu and Ngadi，2014)。在牛上，肌内脂肪所呈现出的大理石花纹(雪花牛肉)更是衡量牛肉质量等级的重要指标(Mannen， 2011)。与其他部位脂肪相比，牛肌内脂肪含有更高水平的多不饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸(Troy et al.，2016)。雪花牛肉不仅口感好，而且含有大量人体所需的脂肪酸，并且随着牛肉内脂肪含量的增高，胆固醇的含量反而降低了，营养价值显著高于普通牛肉。此外，随着人们物质基础和生活水平的提高，健康的饮食观念越来越受到重视，而牛肉作为一种高蛋白、低脂肪的优良肉类食品刚好迎合了大众的消费观念，同时也对牛肉品质提出了更高的要求。目前，如何增强肉牛肌内脂肪沉积，提高大理石花纹的比例是肉牛产业关注的焦点。

高等生物基因的表达受到细胞内外环境的精细调控，因而具有严格的时间及空间有序性。基因的表达调控是一个复杂且有序的过程，由多阶段调控水平共同完成，这主要包括转录前、转录、转录后、翻译、翻译后五个水平。其中转录水平的调控是最关键的环节。启动子是转录水平上一个重要的调控元件，发挥着类似“开关”的作用。启动子本质是一段位于结构基因5’端上游区域的 DNA序列，其本身不具备调控基因的功能，而是与众多的特定转录因子相互作用，特异的调控基因的表达。启动子功能研究使我们更深入的了解生物生长发育的调控机制，对于研究功能基因的表达调控具有重要意义。

ACOX1是过氧化物酶体脂肪酸β-氧化第一步脱氢反应的限速酶，它主要在过氧化物酶体增殖物中被激活并且氧化中长链的直链脂肪酸(Wang et al.， 2014)。已有文献报道ACOX1基因与牛肉质等级和大理石花纹指标相连(Jiao et al.，2011；Lee et al.，2010)，而且我们前期的研究结果也初步表明ACOX1 基因能够促进前脂肪细胞的脂肪沉积。

因此，找出对ACOX1的启动子区具有转录调控作用的转录因子，将会为 ACOX1的表达调控运用于家畜肉质遗传改良分子调控机制的研究提供依据。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了转录因子C/EBPα作为 ACOX1启动子区的转录因子的应用。明确了转录因子C/EBPα对ACOX1的转录调控作用，既明确了二者之间的直接靶向关系又丰富了ACOX1的调控网络，为ACOX1的表达调控运用于家畜肉质遗传改良分子调控机制的研究提供依据。

本发明是这样实现的：

本发明目的之一在于提供转录因子C/EBPα作为ACOX1启动子区的转录因子的应用。

本发明的目的之二在于提供转录因子C/EBPα在抑制ACOX1的表达中的应用。

本发明的目的之三在于提供C/EBPα的靶基因牛ACOX1的结合位点。

本发明的验证过程及结果如下：

1、本发明人分离克隆了牛ACOX1基因启动子区域的不同片段，构建得到了5个ACOX1缺失片段载体。具体地：以牛基因组DNA为模板，通过逐级缺失的方法分别扩增获得了1235bp、1012bp、714bp、551bp、263bp共5个不同长度的启动子缺失片段，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-5所示，将这些缺失片段分别融合到双荧光素酶报告载体pGL3-Basic中，构建5个重组的双荧光素酶报告载体ACOX1-P1至ACOX1-P5，将5个重组载体分别转染3T3-L1细胞，24h后通过双荧光素酶报告系统分析测定细胞内双荧光素酶的活性。结果如图4所示，与对照组pGL3-Basic相比，5个缺失片段的荧光活性均有极显著上升，并且随着片段长度的增加，荧光活性整体呈现上升的趋势，通过所述 ACOX1缺失片段载体鉴定了ACOX1基因的启动子区，且为后续C/EBPα对 ACOX1转录活性的影响的检测提供了基础。

2、为了检测C/EBPα对ACOX1转录活性的影响，本发明人将ACOX1的5 个缺失片段载体分别与过表达载体pcDNA-C/EBPα、空载体pcDNA-3.1(+)共转染于3T3-L1细胞中，24h后收集细胞裂解液，测定双荧光素酶活性。结果如图 5所示，与对照组pcDNA-3.1(+)相比，过表达C/EBPα后5个缺失片段载体的活性均有显著或极显著降低，表明转录因子C/EBPα抑制了ACOX1基因的转录，从而明确了转录因子C/EBPα对ACOX1的转录调控作用。

3、为了找出转录因子C/EBPα与ACOX1的结合位点，本发明人利用 MatInspector、gene-regulation等在线预测软件发现在ACOX1基因的启动子区 -1142bp～-1129bp、-831bp～-826bp、-303bp～-298bp存在3个潜在的C/EBPα结合位点。利用定点突变技术，将3个结合结合位点分别进行突变，分别构建了3个C/EBPα转录结合位点定点突变载体(mut1、mut2和mut3)；

将ACOX1-P1野生型质粒与3个突变型质粒(mut1、mut2和mut3)分别转染3T3-L1细胞，24h后收集细胞裂解液，测定双荧光素酶活性。结果如图 6所示，与野生型(wt)质粒相比，mut1的荧光活性极显著上升，而mut2和 mut3的活性极显著降低。

此外，将野生型质粒与突变型质粒(mut1、mut2和mut3)分别与C/EBPα过表达载体共转染3T3-L1细胞，24h后收集细胞裂解液，测定双荧光素酶活性。结果同样显示mut1的荧光活性极显著上升，而mut2和mut3的活性极显著降低(图7)。

上述图6和图7的结果均表明C/EBPα可通过第一个结合位点靶向ACOX1 启动子区，进而抑制ACOX1的转录。

综上可知，所述结合位点位于ACOX1基因的启动子上游的-1142bp～1129 bp；且所述结合位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明鉴定了ACOX1基因的启动子区，为基因工程和分子育种提供了新的启动子资源，具有灵敏度高、速度快和费用低等优点。

2、本发明明确了转录因子C/EBPα对ACOX1的转录调控作用，为ACOX1 的表达调控带来了更深层次的认知，运用于家畜肉质遗传改良分子调控机制的研究，具有较好的应用前景。

附图说明

图1为pGL3-Basic载体的结构图谱；

图2为内参pRL-TK载体的结构图谱；

图3为5个启动子缺失片段荧光载体双酶切鉴定图；

图4为ACOX1-P1、ACOX1-P2、ACOX1-P3、ACOX1-P4、ACOX1-P5分别转染3T3-L1细胞24h后相对荧光素酶活性检测结果，**P<0.01；***P<0.001。

图5为ACOX1-P1、ACOX1-P2、ACOX1-P3、ACOX1-P4、ACOX1-P5分别与C/EBPα过表达载体pcDNA-C/EBPα共转染3T3-L1细胞24h后相对荧光素酶活性检测结果，*P<0.05，**P<0.01。

图6为3个潜在C/EBPα结合位点突变型载体mut1、mut2、mut3与野生型载体wt(ACOX1-P1)分别转染3T3-L1细胞24h后相对荧光素酶活性检测结果， **P<0.01。

图7为mut1、mut2、mut3与野生型载体wt分别与C/EBPα过表达载体 pcDNA-C/EBPα共转染3T3-L1细胞24h后相对荧光素酶活性检测结果，** P<0.01。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1分离克隆与鉴定ACOX1基因启动子片段

1、牛血液基因组DNA提取与检测

血液基因组DNA提取按照苯酚-氯仿抽提法进行，具体操作步骤如下：

(1)提前在10mL或15mL离心管中加500μL EDTA抗凝剂(占1/10血样体积)，采大别山黄牛血5mL左右，与抗凝剂充分混匀。

(2)4℃，5000r/min，离心10min，弃上层血浆

(3)加入2倍体积双蒸水，混匀沉淀10min，静置5min，破碎红细胞。

(4)4℃，5000r/min，离心10min，弃上层，留白细胞沉淀(视红细胞破碎程度，决定是否重复一次)。

(5)白细胞沉淀加入1×TES 1～2mL，蛋白酶K 30μL左右，10％SDS 150 μL至终浓度0.5％，55℃水浴消化过夜。

(6)将消化后的血液加入等体积的Tris饱和酚，缓慢颠倒离心管10min， 4℃，10000r/min，离心10min，，小心吸取上清液转移至另一10mL离心管中。

(7)重复步骤(6)

(8)加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，缓慢颠倒10-20min，4℃， 12000r/min，离心10min，转移上层水相至另一新的10mL离心管。

(9)加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)缓慢颠倒10min，4℃，12000r/min，离心10min，转移上层水相至另一新的10mL离心管。

(10)加入2.5倍体积的无水乙醇(-20℃预冷)，轻轻混匀后DNA呈白色絮状物析出，4℃，10000r/min，离心10min，弃上清留沉淀。

(11)再用预冷的无水乙醇漂洗一次，4℃，10000r/min，离心10min，弃上清，自然干燥DNA沉淀。

(12)加入20-100μL去离子水溶解DNA。

(13)取3μL DNA，加4μL上样缓冲液，混匀后点样于1％的琼脂糖凝胶 (EB染色液)，同时点5μL标准分子量DL 2000 DNA Marker作为参照。15V/cm 条件下电泳，然后在凝胶成像系统中观察结果并拍照保存。

(14)使用NanoDrop 2000型DNA/RNA浓度测定仪，测定DNA浓度和 OD值，按照所测浓度将管中的DNA做相应稀释，以50ng/μL分装，于-20℃保存备用。

2、ACOX1基因启动子缺失片段双荧光素酶载体构建

(1)ACOX1基因启动子生物信息学分析

根据NCBI数据库GenBank牛ACOX1基因的序列信息(登录号：NC_037346.1)，找到翻译起始位点ATG的位置，利用NCBI数据库检索工具往前延伸2000bp以此获得ACOX1 5’UTR序列。利用MatInspector、 gene-regulation等在线预测软件分析5’UTR序列上顺式作用元件的情况，依据预测信息综合考虑确定缺失片段引物设计的范围。

(2)启动子缺失片段引物设计

依据生物信息学预测的信息，综合考虑缺失片段引物设计的范围。利用 Primer5软件设计了5条上游引物(ACOX1-F1、ACOX1-F2、ACOX1-F3、 ACOX1-F4、ACOX1-F5)和一条共同的下游引物(ACOX1-R)。其中在上游引物的5′端添加限制性内切酶KpnI的酶切位点5′-GGGGTACC-3′，下游引物的 5′端添加限制性内切酶XhoI的酶切位点5′-CCGCTCGAG-3′，组成5对缺失片段的引物。引物序列如下所示：

表1

(3)PCR扩增启动子缺失片段

利用上述设计的5对引物，以牛基因组DNA为模板，采用Touch-down PCR 方法扩增ACOX1启动子的5个缺失片段(产物长度分别为1235bp、1012bp、 714bp、551bp、263bp)。

PCR反应体系(25μL)：

表2

反应程序：95℃预变性4min；95℃变性30sec，72℃每循环降1℃退火 30sec，72℃延伸1.5min，10个循环；95℃变性30sec，62℃退火30sec，72℃延伸1.5min，35个循环；72℃延伸10min；25℃保存2min。

取25μL PCR扩增产物，加2.5μL Loading Buffer，混匀后点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，以5μL DNA标准分子量DL 2000 Marker作为参照，15V/cm电泳，电泳结束后，在凝胶成像系统中观察结果并拍照保存。

将琼脂糖凝胶上呈现的目的条带采用Omega Bio-tek公司的凝胶回收试剂盒切胶回收，具体操作步骤按照该试剂盒说明书进行。

(4)双酶切

将回收纯化的PCR产物及pGL3-Basic质粒分别用限制性内切酶KpnI和 Xho I进行双酶切，所用的内切酶均购自NEB公司。

双酶切反应体系如下所示：

表3

反应体系于37℃消化2h，之后将消化后的反应体系全部经1.5％的琼脂糖凝胶电泳分离，将目的片段采用Omega Bio-tek公司的凝胶回收试剂盒切胶回收。

(5)连接

将酶切后纯化的载体pGL3-Basic和5个缺失片段，用T4连接酶(NEB) 于16℃连接12h。T4连接体系如下：

表4

(6)转化、测序及质粒提取

①无菌条件下取上述10μL连接产物加入到50μL DH5α感受态细胞(TransGen)中，混匀后静置冰浴5min，42℃热激45sec，立即置于冰上2-3min，然后均匀涂布于平板(含有100mg/L的Amp)上，平放于37℃恒温培养箱中约1h，之后倒置过夜培养。

②用小枪头挑取平板上形态正常的单菌落，置于含400μL LB液体培养基 (含100mg/L Amp)的1.5mL离心管中，于37℃恒温摇床培养4h。取lμL 菌液作为PCR扩增的模板，PCR扩增产物用浓度为1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，并在凝胶成像系统中拍照记录。

③经菌液PCR检测，结果为阳性的含重组质粒的菌液送北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序。

④将测序正确的菌液重新扩大培养，120μL菌液加入到含有30mL液体培养基(含100mg/L Amp)的50mL离心管中，于37℃恒温摇床培养14-16h。按照Endo-free PlasmidMini Kit II(Omega Bio-tek)说明书进行去内毒素质粒提取，提取的质粒于-20℃保存备用。

(7)细胞转染

将细胞接种至48孔板中，待细胞长至80％时进行转染。每孔加0.4μg启动子质粒和0.02μg pRL-TK(图2)质粒于25μL opti-MEM中稀释，1μL Lipofectamine 2000于25μLopti-MEM中稀释，5min后将两部分混合，室温静置10-15min后一滴一滴地加入到细胞培养板中。转染24h后利用1×PLB (Passive lysis buffer)裂解细胞并收集细胞裂解液，测定双荧光素酶活性。

(8)双荧光素酶活性测定

利用Dual-

Reporter Assay System在多功能酶标仪中检测荧光载体的相对荧光活性：吸取10μL细胞裂解液加入酶标板中，首先加入50μL 的LARII读取样品中荧火虫荧光素酶的活性值A，加入50μL的Stop&Glo Reagent读取样品中海肾荧光素酶的活性值B。A/B比值即代表该荧光载体的活性，采用spss软件对所得结果进行单因素方差分析，p<0.05时为差异显著， p<0.01时为差异极显著。

3、结果与分析

5个重组的双荧光素酶报告载体质粒经KpnI和XhoI双酶切进行鉴定，释放出与预期大小相符的条带(图3)，表明载体构建成功。

将5个缺失片段的质粒和对照组质粒pGL3-Basic分别转染至3T3-L1细胞， 24h后收集细胞裂解液，测定双荧光素酶活性。结果如图4所示，与对照组 pGL3-Basic相比，5个缺失片段的荧光活性均有极显著上升，并且随着片段长度的增加，荧光活性整体呈现上升的趋势，ACOX1-P1的活性最高。

实施例2转录因子C/EBPα对ACOX1的转录调控作用

1、ACOX1缺失片段载体与C/EBPα过表达载体共转染

将细胞接种至48孔板中，待细胞长至80％时进行转染。每孔加0.2μg重组载体质粒、0.2μg C/EBPα过表达载体质粒和0.02μg pRL-TK质粒于25μL opti-MEM中稀释，1μLLipofectamine 2000于25μL opti-MEM中稀释，5min 后将两部分混合，室温静置10-15min后一滴一滴地加入到细胞培养板中。转染24h后利用1×PLB(Passive lysis buffer)裂解细胞并收集细胞裂解液，测定双荧光素酶活性。

2、双荧光素酶活性测定

利用Dual-

Reporter Assay System在多功能酶标仪中检测荧光载体的相对荧光活性：吸取10μL细胞裂解液加入酶标板中，首先加入50μL 的LARII读取样品中荧火虫荧光素酶的活性值A，加入50μL的Stop&Glo Reagent读取样品中海肾荧光素酶的活性值B。A/B比值即代表该荧光载体的活性，采用spss软件对所得结果进行单因素方差分析，p<0.05时为差异显著， p<0.01时为差异极显著。

3、结果与分析

为了检测C/EBPα对ACOX1转录活性的影响，我们将实施例1得到的 ACOX1的5个缺失片段载体分别与过表达载体pcDNA-C/EBPα、空载体pcDNA-3.1(+)共转染于3T3-L1细胞中，24h后收集细胞裂解液，测定双荧光素酶活性。结果如图5所示，与对照组pcDNA-3.1(+)相比，过表达C/EBPα后5 个缺失片段载体的活性均有显著或极显著降低，表明转录因子C/EBPα抑制了ACOX1基因的转录，从而明确了转录因子C/EBPα对ACOX1的转录调控作用。

实施例3转录因子C/EBPα与ACOX1的结合位点的确定

1、C/EBPα转录结合位点定点突变载体构建

(1)生物信息学分析

利用MatInspector、gene-regulation等在线预测软件发现在ACOX1基因的启动子区-1142bp～-1129bp、-831bp～-826bp、-303bp～-298bp存在3个潜在的C/EBPα结合位点。因此，我们推测转录因子C/EBPα是否通过结合上述1 个或多个转录结合位点靶向ACOX1基因的启动子区。

(2)突变载体构建

以ACOX1-P1重组质粒为模板，根据重叠引物延伸PCR法(融合PCR)，将预测的3个C/EBPα结合位点分别进行突变，所用的引物序列如下所示：

表5

其中下划线为酶切位点，加粗部分为保护碱基，小写字母为突变碱基。

以mut1为例，具体步骤如下：以ACOX1-F1和mut1-R为引物常规PCR 扩增出mut1(上)片段，以mut1-F和ACOX1-R为引物常规PCR扩增出mut1 (下)片段，将片段mut1(上)和mut1(下)“搭桥”后再进行常规PCR扩增。“搭桥”体系为：mut1(上)，1μL；mut1(下)，1μL；Mix，12.5μL；灭菌 ddH₂O，10.5μL。“搭桥”条件为：95℃5min；95℃30s，40℃30s，45℃5s， 50℃5s，55℃5s，60℃5s，72℃30s，30个循环；72℃5min；25℃5min。之后以“搭桥”后的体系为模板，再分别以ACOX1-F1和ACOX1-R为上游和下游引物，再进行常规PCR扩增，之后一系列的分子克隆技术同实施例1中缺失片段双荧光素酶载体构建方法，经琼脂糖凝胶电泳回收目的片段、克隆、双酶切等最终连接至pGL3-Basic载体中，构建的载体我们称之为mut1。

mut2与mut3载体的构建方法同mut1。

常规PCR反应体系(25μL)如表6所示：

表6

反应程序：95℃预变性4min；95℃变性40sec，60℃退火45sec，72℃延伸1min，32个循环；72℃延伸10min；25℃保存2min。

2、双荧光素酶活性测定

利用Dual-

Reporter Assay System在多功能酶标仪中检测荧光载体的相对荧光活性：吸取10μL细胞裂解液加入酶标板中，首先加入50μL 的LARII读取样品中荧火虫荧光素酶的活性值A，加入50μL的Stop&Glo Reagent读取样品中海肾荧光素酶的活性值B。A/B比值即代表该荧光载体的活性，采用spss软件对所得结果进行单因素方差分析，p<0.05时为差异显著， p<0.01时为差异极显著。

3、结果与分析

将ACOX1-P1野生型质粒与3个突变型质粒分别转染3T3-L1细胞，24h 后收集细胞裂解液，测定双荧光素酶活性。结果如图6所示，与野生型(wt) 质粒相比，mut1的荧光活性极显著上升，而mut2和mut3的活性极显著降低。

此外，将野生型质粒与突变型质粒分别与C/EBPα过表达载体共转染 3T3-L1细胞，24h后收集细胞裂解液，测定双荧光素酶活性。结果同样显示 mut1的荧光活性极显著上升，而mut2和mut3的活性极显著降低(图7)。

以上结果初步表示，C/EBPα可通过第一个结合位点靶向ACOX1启动子区，进而抑制ACOX1的转录。所述结合位点位于ACOX1基因的启动子上游的-1142 bp～1129bp；且所述结合位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 转录因子C/EBPα作为ACOX1启动子区的转录因子的应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1235

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcagagacat cactttgtca acaaaggtcc gtctagtcaa ggctatggtt ttcccagtgg 60

tcatgtatgg atgtgagagt tggactataa agaaagctga gagcagaaga attgatgctt 120

ttgaactgtg gtgttgcaga agcctcttga gagtcccttg gactccaagg agatcaaacc 180

agtcaatcgt aaaggaaatc aactctgaat attcattgga aggactgatg ctgaagctga 240

agcttcaata ctctggccac ctgatgcgaa gagtcaactc attggaaagg accctgatgc 300

tgggaaagat tgaaggcggg agaaggggag ggtagagaat gagatggttg gatggaatca 360

ccgactgcat ggacatgagt ccgagcaagc tctgggagtt ggtgatggac agggaaggct 420

ggcgtgctgc agtccatggg gtcgcaagga gtcggacagg actgagcgac cgaactgaag 480

cccacaccca caacccataa taaatgcggg gtcgggggag cgctagctat ctcacgctct 540

gcttccccgc cgccttcgcc tctggcagca gagatgctat tatcttaaca agtgatggtt 600

ggagcctctc ctcagtgcga ccttttgtcc ccgtcctttt ggttccattc ttggagggtt 660

ttgggaaaaa ccctacgacc tccccgagcc atctcaagaa ggcccgggtc acccgctgca 720

gccctggaga ccccctcccc ctctcacgtc ccgggaggac acggcgcgcg gacccggaag 780

cggcggcgcg ggcgggtccc ggggcgcagg cgcagtcgtc ctcagacgcg tggtcccgcc 840

ccttcccaac cccccggcga agctgtgtgg gcgcgcgggc ggcctttttc cgccccgtgg 900

gaccgcctga cgagggaggg ccgggttgct gagagcgtct ccgttccccc cgcaccacca 960

ccaccacctg ggcaattcct tgaccttctt ccggggtccg cttgtcaagg ggctgctctg 1020

aggcgccact ggccgagaac aggggactcg cccgccccgg cggcgcccac agcggcacag 1080

ccgccgcctc acgccctgtc cgcggtcggt cacgcgcctt ggggccgcgg tgaaggagaa 1140

ggggcgggcc gaggcggccg gggggcgggg acccgccttg tactggggcg gctcttagcg 1200

tcggccccgc gcaggagctg cggattcctg ctgtc 1235

<210> 2

<211> 1012

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

actgatgctg aagctgaagc ttcaatactc tggccacctg atgcgaagag tcaactcatt 60

ggaaaggacc ctgatgctgg gaaagattga aggcgggaga aggggagggt agagaatgag 120

atggttggat ggaatcaccg actgcatgga catgagtccg agcaagctct gggagttggt 180

gatggacagg gaaggctggc gtgctgcagt ccatggggtc gcaaggagtc ggacaggact 240

gagcgaccga actgaagccc acacccacaa cccataataa atgcggggtc gggggagcgc 300

tagctatctc acgctctgct tccccgccgc cttcgcctct ggcagcagag atgctattat 360

cttaacaagt gatggttgga gcctctcctc agtgcgacct tttgtccccg tccttttggt 420

tccattcttg gagggttttg ggaaaaaccc tacgacctcc ccgagccatc tcaagaaggc 480

ccgggtcacc cgctgcagcc ctggagaccc cctccccctc tcacgtcccg ggaggacacg 540

gcgcgcggac ccggaagcgg cggcgcgggc gggtcccggg gcgcaggcgc agtcgtcctc 600

agacgcgtgg tcccgcccct tcccaacccc ccggcgaagc tgtgtgggcg cgcgggcggc 660

ctttttccgc cccgtgggac cgcctgacga gggagggccg ggttgctgag agcgtctccg 720

ttccccccgc accaccacca ccacctgggc aattccttga ccttcttccg gggtccgctt 780

gtcaaggggc tgctctgagg cgccactggc cgagaacagg ggactcgccc gccccggcgg 840

cgcccacagc ggcacagccg ccgcctcacg ccctgtccgc ggtcggtcac gcgccttggg 900

gccgcggtga aggagaaggg gcgggccgag gcggccgggg ggcggggacc cgccttgtac 960

tggggcggct cttagcgtcg gccccgcgca ggagctgcgg attcctgctg tc 1012

<210> 3

<211> 714

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctagctatc tcacgctctg cttccccgcc gccttcgcct ctggcagcag agatgctatt 60

atcttaacaa gtgatggttg gagcctctcc tcagtgcgac cttttgtccc cgtccttttg 120

gttccattct tggagggttt tgggaaaaac cctacgacct ccccgagcca tctcaagaag 180

gcccgggtca cccgctgcag ccctggagac cccctccccc tctcacgtcc cgggaggaca 240

cggcgcgcgg acccggaagc ggcggcgcgg gcgggtcccg gggcgcaggc gcagtcgtcc 300

tcagacgcgt ggtcccgccc cttcccaacc ccccggcgaa gctgtgtggg cgcgcgggcg 360

gcctttttcc gccccgtggg accgcctgac gagggagggc cgggttgctg agagcgtctc 420

cgttcccccc gcaccaccac caccacctgg gcaattcctt gaccttcttc cggggtccgc 480

ttgtcaaggg gctgctctga ggcgccactg gccgagaaca ggggactcgc ccgccccggc 540

ggcgcccaca gcggcacagc cgccgcctca cgccctgtcc gcggtcggtc acgcgccttg 600

gggccgcggt gaaggagaag gggcgggccg aggcggccgg ggggcgggga cccgccttgt 660

actggggcgg ctcttagcgt cggccccgcg caggagctgc ggattcctgc tgtc 714

<210> 4

<211> 551

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgagccatct caagaaggcc cgggtcaccc gctgcagccc tggagacccc ctccccctct 60

cacgtcccgg gaggacacgg cgcgcggacc cggaagcggc ggcgcgggcg ggtcccgggg 120

cgcaggcgca gtcgtcctca gacgcgtggt cccgcccctt cccaaccccc cggcgaagct 180

gtgtgggcgc gcgggcggcc tttttccgcc ccgtgggacc gcctgacgag ggagggccgg 240

gttgctgaga gcgtctccgt tccccccgca ccaccaccac cacctgggca attccttgac 300

cttcttccgg ggtccgcttg tcaaggggct gctctgaggc gccactggcc gagaacaggg 360

gactcgcccg ccccggcggc gcccacagcg gcacagccgc cgcctcacgc cctgtccgcg 420

gtcggtcacg cgccttgggg ccgcggtgaa ggagaagggg cgggccgagg cggccggggg 480

gcggggaccc gccttgtact ggggcggctc ttagcgtcgg ccccgcgcag gagctgcgga 540

ttcctgctgt c 551

<210> 5

<211> 263

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caattccttg accttcttcc ggggtccgct tgtcaagggg ctgctctgag gcgccactgg 60

ccgagaacag gggactcgcc cgccccggcg gcgcccacag cggcacagcc gccgcctcac 120

gccctgtccg cggtcggtca cgcgccttgg ggccgcggtg aaggagaagg ggcgggccga 180

ggcggccggg gggcggggac ccgccttgta ctggggcggc tcttagcgtc ggccccgcgc 240

aggagctgcg gattcctgct gtc 263

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggggtaccgc agagacatca ctttgtca 28

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggggtaccac tgatgctgaa gctgaagc 28

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggggtaccta tctcacgctc tgcttccc 28

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggggtacccg agccatctca agaaggcc 28

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggggtaccca attccttgac cttcttcc 28

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccgctcgagg acagcaggaa tccgcagct 29

<210> 12

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tttgaactgt ggtgggatag aagcctcttg ag 32

<210> 13

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ctcaagaggc ttctatccca ccacagttca aa 32

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gcagtccatg gggttatcag gagtcggaca gg 32

<210> 15

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cctgtccgac tcctgataac cccatggact gc 32

<210> 16

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

accaccacca cctgaatcat tccttgacct tc 32

<210> 17

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gaaggtcaag gaatgattca ggtggtggtg gt 32

<210> 18

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gtgttgcaga agcc 14

Claims (6)

1.转录因子C/EBPα在抑制ACOX1基因表达中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，转录因子C/EBPα是通过与靶基因牛ACOX1的启动子上游的-1142bp～1129bp的结合位点进行结合来发挥对ACOX1基因转录的抑制作用的。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述结合位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，转录因子C/EBPα对ACOX1的转录抑制作用的鉴定步骤包括：分别获取牛ACOX1启动子缺失片段载体和C/EBPα过表达载体后共转染细胞，培养后裂解细胞，对裂解液进行双荧光素酶活性测定，过表达C/EBPα后的牛ACOX1缺失片段载体的荧光素酶活性降低，即表明转录因子C/EBPα抑制了ACOX1基因的转录。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述启动子缺失片段的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5所示。

6.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述结合位点的确定步骤包括：

S21、牛ACOX1缺失片段的重组载体为模板，根据重叠引物进行融合PCR扩增，对预测的结合位点分别进行突变，构建突变载体；

S22、对突变载体、野生型载体分别与C/EBPα过表达载体共转染，进行双荧光素酶活性测定，荧光活性提升的突变载体对应的所述结合位点即为C/EBPα与ACOX1启动子区的结合位点。

Images