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CN115074361A - 真菌来源的强启动子及其应用 - Google Patents

真菌来源的强启动子及其应用 Download PDF

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CN115074361A
CN115074361A CN202110268572.8A CN202110268572A CN115074361A CN 115074361 A CN115074361 A CN 115074361A CN 202110268572 A CN202110268572 A CN 202110268572A CN 115074361 A CN115074361 A CN 115074361A
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aspergillus
polynucleotide
aspergillus niger
dna
acid
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CN202110268572.8A
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郑平
郑小梅
孙际宾
卢玉丹
周文娟
张立辉
马延和
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Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Original Assignee
Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
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Abstract

本发明涉及真菌中具有启动子活性的多核苷酸及其在生产有机酸、酶制剂中的用途、含有多核苷酸的转录表达盒、重组载体、重组宿主细胞，以及利用启动子活性的多核苷酸在增强目标基因表达中的应用，进而例如可以提高菌株的有机酸、酶制剂的产量。

Description

真菌来源的强启动子及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程和基因工程技术领域，涉及具有启动子活性的多核苷酸，以及利用启动子活性的多核苷酸增强目标基因表达的方法、提高菌株有机酸或酶制剂产量的方法。
背景技术
真菌是生物产业领域极为重要的工业菌株，广泛用于有机酸、酶制剂等工业生产。以黑曲霉为例，黑曲霉是有机酸与酶制剂产业极为重要的工业菌株，黑曲霉生产的柠檬酸全球年产量达200万吨，产值超过20亿美元，并以每年5％的速度递增。2015年全球真菌酶制剂的产值约35亿欧元。
众所周知，目标基因的高效表达是实现真菌高产有机酸和酶制剂的关键，而影响基因高效表达的因素主要有启动子活性、翻译效率、基因拷贝数等，基因拷贝数的增加会降低菌种基因组的稳定性，因此，启动子转录水平的高低是影响基因高效表达的关键因素。
目前，已有文献报道了真菌中的强启动子，如构巢曲霉三磷酸甘油醛脱氢酶gpdA启动子，泡盛曲霉谷氨酸脱氢酶gdhA启动子等(雷达，许杨等，曲霉属蛋白表达中高效启动子的应用研究[J]，食品工业科技，2013，34(13)：342－345)，其中，来源于构巢曲霉的gpdA启动子是目前已报道的商业化较好且普遍认为是真菌中的强启动子。Xu等(Xu Y，Zhou Y，Cao W，Liu H.Improved Production of Malic Acid in Aspergillus niger byAbolishing Citric Acid Accumulation and Enhancing Glycolytic Flux.ACS SynthBiol.2020.9(6):1418-1425)利用该启动子来强化糖酵解途径后，使苹果酸/葡萄糖的转化率从1.27mol/mol提高至1.64mol/mol，从而提高了苹果酸的产量。
然而，目前还需要丰富适用于各种不同用途的启动子活性的核酸分子。比如，开发活性更高的启动子或比较适用于相关用途的启动子，将有利于增强有机酸合成相关基因的表达，增强酶制剂的表达，从而更具工业应用潜力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种来源于真菌的具有强启动子活性的多核苷酸序列，该具有强启动子活性的多核苷酸能够提高有机酸相关基因、酶制剂编码基因的表达强度，从而提高有机酸、酶制剂的产量，更具有工业应用潜能。在此基础上，完成了本发明。
一方面，本发明提供了一种具有强启动子活性的多核苷酸，其中，所述多核苷酸选自如下(a)-(e)中组成的组中的任一项：
(a)包括如SEQ ID NO：1-5任一序列所示的核苷酸序列；
(b)包括如SEQ ID NO：54-60任一序列所示的核苷酸序列；
(c)包含如SEQ ID NO：1-5、SEQ ID NO：54-60任一序列所示的核苷酸序列的反向互补序列；
(d)在高严格性杂交条件下，能够与(a)或(b)或(c)所示的核苷酸序列杂交的序列，并仍具有启动子活性；
(e)与(a)或(b)或(c)所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性，且仍具有启动子活性的序列。
优选地，具有启动子活性的多核苷酸是核苷酸序列如SEQ ID NO：1-5、SEQ ID NO：54-60任一序列所示的多核苷酸。
第二方面，本发明提供了一种转录表达盒，其中，所述转录表达盒包括第一方面的启动子，可选地，所述转录表达盒还含有蛋白编码基因，所述蛋白编码基因与所述具有启动子活性的多核苷酸可操作地连接。
第三方面，本发明提供了一种重组表达载体，其中，所述重组表达载体包括第一方面所述的核苷酸序列或第二方面所述的转录表达盒。
第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，其中，所述宿主细胞中含有第二方面的转录表达盒，或第三方面的重组表达载体；其中，所述宿主细胞是真菌，可选地，所述宿主细胞为黑曲霉(Aspergillus niger)，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)，米曲霉(Aspergillusoryzae)，产黄青霉(Penicillium chrysogenum)，里氏木霉(Trichoderma reesei)，玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)，嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)，最优选黑曲霉(Aspergillus niger)，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)。
第五方面，本发明提供了第一方面所述的多核苷酸，第二方面的转录表达盒，第三方面的重组表达载体，第四方面的宿主细胞在如下至少一种中的用途：
(a)用于增强基因的转录水平，或制备用于增强基因的转录水平的试剂或试剂盒；
(b)用于制备蛋白，或制备用于制备蛋白的试剂或试剂盒；
(c)生产有机酸，或制备用于生产有机酸的试剂或试剂盒。
可选地，所述有机酸包括柠檬酸、琥珀酸、苹果酸中的任一种。所述蛋白为酶制剂，所述酶制剂包括葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶与植酸酶中的任一种。
第六方面，本发明提供了一种调控目标基因转录的方法，其中，所述方法包括将第一方面的具有启动子活性的多核苷酸与目标基因可操作地连接，例如通过将所述启动子活性的多核苷酸与目标基因可操作地连接的载体导入重组宿主细胞，增强所述重组宿主细胞中的目标基因的转录。
第七方面，本发明提供了一种制备蛋白的方法，其中，所述方法包括利用含有目标基因的第二方面的表达盒，或含有目标基因的第三方面的重组表达载体，导入重组宿主细胞以表达目标基因，或培养第四方面的宿主细胞以表达蛋白。
第八发明，本发明提供了一种有机酸或酶制剂的生产方法，其中，所述方法包括利用第二方面的表达盒，或第三方面的重组表达载体，导入宿主细胞，培养所述宿主细胞，收集产生的有机酸或酶，其中所述表达盒或重组表达载体中含有与第一方面所述的核苷酸可操作连接的编码与有机酸或酶制剂合成相关蛋白的基因；进一步地，还包括将有机酸或酶制剂从发酵液中分离出来的步骤；
在一个具体实施方式中，所述宿主细胞是真菌，可选地，所述宿主细胞为黑曲霉(Aspergillus niger)，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)，米曲霉(Aspergillusoryzae)，产黄青霉(Penicillium chrysogenum)，里氏木霉(Trichoderma reesei)，玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)，嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)，最优选黑曲霉(Aspergillus niger)，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)。
在另一个具体实施方式中，所述有机酸包括柠檬酸、琥珀酸、苹果酸中的任一种。所述酶制剂包括葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶与植酸酶中的任一种。
本发明通过研究从黑曲霉中分离得到一系列具有强启动子活性的多核苷酸序列，利用这些具有强启动子活性的多核苷酸可高效强化酶制剂与有机酸的生产，为真菌生产菌株的构建提供了新的调控元件，具有较大的应用潜力。
附图说明
图1显示不同启动子介导下荧光蛋白表达情况的检测
图2显示不同启动子介导下柠檬酸转运蛋白的表达强化提高柠檬酸发酵情况。
具体实施方式
当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”联用时，词语“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
本发明的术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
本发明所用的术语“启动子”是指一种核酸分子，通常位于目标基因编码序列的上游，为RNA聚合酶提供识别位点，并位于mRNA转录起始位点的5’方向的上游。它是不被翻译的核酸序列，RNA聚合酶与这一核酸序列结合后启动目标基因的转录。在核糖核酸(RNA)的合成中，启动子可以和调控基因转录的转录因子产生相互作用，控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度，包含核心启动子区域和调控区域，就像“开关”，决定基因的活动，继而控制细胞开始生产哪一种蛋白质。本发明的启动子的多核苷酸序列如SEQ ID：1-5、SEQID：54-60所示，本发明还包括上述核酸分子的一些具有相同功能的变异体，与SEQ ID NO：1-5、SEQ ID NO：54-60任一项所示的多核苷酸序列有至少90％以上，优选至少95％以上，优选至少96％以上，优选至少97％以上，优选至少98％以上，或优选至少99％以上的同一性，且具有启动子活性的多核苷酸。
优选的是，所述变异体的突变发生在启动子的调控区域，例如可通过插入或删除调控区域，或对调控区域进行随机或定点突变等来获得。换言之，本发明也包括在SEQ IDNO：1-5、SEQ ID NO：54-60所示的多核苷酸序列的基础上进行一个、数个或数十个(例如100个以内，或者80个以内，或60个以内，或50个以内，或40个以内，或30个以内，或20个以内，或15个以内，或10个以内，或5个以内)的碱基删除或突变而获得的保留了启动子指导目的基因表达的功能的SEQ ID NO：1-5、SEQ ID NO：54-60的变异体。本发明也包括在SEQ ID NO：1-5所示多核苷酸的两端添加例如15～50个碱基的片段，更优选长15～30个碱基且具有启动子活性的多核苷酸。也包括在SEQ ID NO：54-60所示多核苷酸的两端添加例如15～50个碱基的片段，更优选长15～30个碱基的片段，且具有启动子活性的多核苷酸。
本发明的术语“多核苷酸”指由核苷酸组成的聚合物。多核苷酸可以是单独片段的形式，也可以是更大的核苷酸序列结构的一个组成部分，其是从至少在数量或浓度上分离一次的核苷酸序列衍生而来的，能够通过标准分子生物学方法(例如，使用克隆载体)识别、操纵以及恢复序列及其组分核苷酸序列。当一个核苷酸序列通过一个DNA序列(即A、T、G、C)表示时，这也包括一个RNA序列(即A、U、G、C)，其中“U”取代“T”。换句话说，“多核苷酸”指从其他核苷酸(单独的片段或整个片段)中去除的核苷酸聚合物，或者可以是一个较大核苷酸结构的组成部分或成分，如表达载体或多顺反子序列。多核苷酸包括DNA、RNA和cDNA序列。
本发明的术语“表达”包括涉及RNA产生及蛋白产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
本发明的术语“转录表达盒”指的包含转录调控元件与目标基因，利用转录调控元件对目标基因的表达进行调控的一类表达元件。在本公开中，转录调控元件包含启动子，在此基础上，还可以包含增强子、沉默子、绝缘子等元件。在本公开中，目标基因具体为蛋白编码基因。目标基因与多核苷酸“可操作地连接”，是指将具有启动子活性的多核苷酸与目标基因功能性连接，以启动和介导目标基因的转录，所述可操作地连接的方式可以采用本领域技术人员所述的任何方式。
本发明的术语“目标基因”涉及与本发明中具有启动子活性的多核苷酸连接，以对其转录水平进行调控的任一种的基因。在一些实施方案中，目标基因是指编码微生物中目标蛋白质的基因。示例性的，目标基因是编码与目标化合物的生物合成相关的酶的基因、编码与还原力相关的酶的基因，编码与糖酵解或TCA循环相关的酶的基因，或编码与目标化合物的释放相关的酶的基因等等。
本发明的术语“目标化合物”可以选自有机酸、酶制剂，也可以选自本领域中可能通过生物合成得到的其他种类的化合物。在一些实施方式中，目标化合物为有机酸。有机酸可以是具有酸性的有机化合物，例如，其中包括羧基和磺酸基的那些化合物。示例性的，有机酸包括乳酸、醋酸、琥珀酸、丁酸、棕榈酸、草酸、酒石酸、柠檬酸、丙酸、己烯酸、癸酸、辛酸、戊酸、苹果酸中的一种或两种以上的组合，或者是本领域中其他种类的有机酸。在一些实施方式中，目标化合物为酶制剂，示例性的，酶制剂包括葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶与植酸酶中的一种或两种以上的组合。
本发明的术语“表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、病毒或其他载体。质粒可以是线性或闭合的环形质粒。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。载体的选择一般取决于载体与其中被导入该载体的宿主细胞的相容性。
表达载体一般包括(从5’到3’方向)：引导目的基因转录的启动子和目的基因。如果需要，所述的重组载体还可以包括：在所述启动子的下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点，翻译起始用的核糖体结合位点，3’转录终止子，3’多聚核苷酸化信号，其它非翻译核酸序列，转运和靶向核酸序列，抗性选择标记，增强子或操作子。目的基因连接入所述适合的多克隆位点或酶切位点内，从而将目的基因与启动子可操作地连接。
本领域常用的各种翻译起始用的核糖体结合位点、3’多聚核苷酸化信号，其它非翻译核酸序列，转运和靶向核酸序列，抗性选择标记，增强子或操作子都可用于本发明。
载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在，其复制不依赖于染色体复制的载体，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可包含用于保证自我复制的任何方式。备选地，载体可以是当被导入宿主细胞时，整合到基因组中并且与其已经被整合进入的染色体一起复制的载体。此外，可使用一起包含将被导入宿主细胞基因组的总DNA的单个载体或质粒或两个或多个载体或质粒，或转座子。
本发明的载体优选包含一个或多个容许容易选择转化、转染、转导等细胞的可选择标记。可选择的标记是基因，其产物提供对抗生素或病毒的抗性、对重金属的抗性、原养型至营养缺陷型等。
本发明的载体优选包含容许该载体整合进入宿主细胞基因组或该载体在细胞中独立于基因组自主个复制的元件。表达载体可含有一个以上拷贝的感兴趣的目的基因，以增加该基因产物的产量。目的基因拷贝数的增加可通过将至少一个附加拷贝的序列整合进入宿主细胞基因组或通过包括可扩增的选择标记基因和该目的基因来获得，其中包含扩增拷贝的选择标记基因并且由此包含附加拷贝目的基因的细胞可通过在存在适当的选择剂时培养该细胞来筛选。
用于制备重组表达载体的方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。
本发明所用的术语“外源性”是指某体系中包含了原来不存在的物质。例如，通过转化等方式在某菌株中引入该菌株中原本不存在的编码基因，则该基因对于该菌株是“外源性”的。
本发明所用的术语“野生型/内源性/天然存在”指的是在微生物中多肽处于未修饰状态的活性，即自然状态下的活性。
本发明所述“修饰”是指任何对野生型菌株或亲本菌株进行的遗传操作，包括但不限于各种分子生物学手段。
本发明的术语“序列同一性”和“同一性百分比”指两个或更多个多核苷酸或多肽之间相同(即同一)的核苷酸或氨基酸的百分比。两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列同一性可通过以下方法测定：将多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列对准且对经对准的多核苷酸或多肽中含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行评分，且将其与经对准的多核苷酸或多肽中含有不同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行比较。多核苷酸可例如通过含有不同核苷酸(即取代或突变)或缺失核苷酸(即一个或两个多核苷酸中的核苷酸插入或核苷酸缺失)而在一个位置处不同。多肽可例如通过含有不同氨基酸(即取代或突变)或缺失氨基酸(即一个或两个多肽中的氨基酸插入或氨基酸缺失)而在一个位置处不同。序列同一性可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中氨基酸残基的总数来计算。举例而言，可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中核苷酸或氨基酸残基的总数且乘以100来计算同一性百分比。
本发明的术语“互补的”是指在核苷酸或核苷酸之间的杂交或碱基配对，例如双链DNA分子的两条链之间或者寡核苷酸引物与被测序或扩增的单链核苷酸上的引物结合位点之间等。
本发明的术语“高严格条件”是指，对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃处在5X SSPE(saline sodium phosphate EDTA)、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃处使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
本发明所述“宿主细胞”具有本领域普通技术人员通常理解的含义，即，能够导入本发明启动子介导的表达盒的细胞，导入之后称为重组宿主细胞。换言之，本发明可以利用任何宿主细胞，只要其细胞中含有本发明的启动子序列。本发明的宿主细胞可以是真核细胞，包括但不限于黑曲霉(Aspergillus niger)，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)，米曲霉(Aspergillus oryzae)，产黄青霉(Penicillium chrysogenum)，里氏木霉(Trichodermareesei)，玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)，嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)等菌株中的任一种，优选黑曲霉、构巢曲霉、米曲霉、里氏木霉，最优选黑曲霉，以及由上述菌株制备的产生酶制剂与有机酸的突变体或菌株。
重组宿主细胞具体例如通过转化来实现。此处“转化”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即将外源性的DNA导入宿主的过程。所述转化的方法包括任何将核酸导入细胞的方法，这些方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙沉淀法、氯化钙(CaCl2)沉淀法、微注射法、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法以及乙酸锂-DMSO法。
在本发明中，所述宿主细胞的培养可以根据本领域的常规方法进行，包括但不限于孔板培养、摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等，并可以根据实际情况适当地调整各种培养条件如温度、时间和培养基的pH值等。
实施例
本发明的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本发明的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本发明的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法，例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。
实施例1具有启动子活性的DNA片段的鉴定
1.具有启动子活性的DNA片段介导的表达载体的构建
对黑曲霉菌株M202(购买于上海工微所科技有限公司菌种资源库，公开保藏号M202)进行转录组测序，通过对转录组数据的解析发现其中5个基因具有较高的表达水平，因此细致分析了这5个高表达基因的基因结构，假设基因上游的部分DNA片段为其各自启动子区。为鉴定各DNA片段的功能，本发明设计了各自DNA片段的上下游引物(表1)，以构建各DNA片段介导下的表达载体。采用各DNA片段的上下游引物，以黑曲霉M202菌株的基因组为模板，进行PCR扩增获得了SEQ ID NO：1-5的DNA片段，同时设计引物PCR扩增获得了三磷酸甘油醛脱氢酶的启动子(PgpdA)序列作为对照，该启动子是目前商业上普遍应用并认可的真菌的强启动子。具体引物序列如表1所示。
表1不同启动子介导表达载体构建的引物
Figure BDA0002973111990000081
Figure BDA0002973111990000091
PCR反应体系为5×FastPfu缓冲液10μL，10mM dNTPs 1μL，上游/下游引物各2.5μL，DNA模板0.5μL，FastPfu(TransGene)1.5μL，超纯水32μL。
PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸2min，35个循环；最后72℃延伸10min。
PCR产物进行纯化后，与由限制性内切酶SpeI与XholI酶切处理的质粒pSilent-1(GenBank:LT827033.1)，采用诺唯赞非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒(货号：C112-01)进行重组反应，然后转化至大肠杆菌Trans-T1。提取相应的重组质粒后，采用酶切与测序验证，获得SEQ ID NO：1-5的表达载体pP16、pP51、pP52、pP60与pP67。另外，以相同方式构建以三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(PgpdA)介导的表达载体pPgpdA作为对照。
2.上述DNA片段的启动子活性的检测
为鉴定上述选择的DNA片段是否具有启动子的功能，本发明首先以绿色荧光蛋白GFP为报告蛋白来进行测试。首先，采用gfp基因的上下游引物，以含有gfp基因的质粒pMF272(GenBank:AY598428.1)为模板，进行PCR扩增绿色荧光蛋白基因片段。具体引物序列如表2所示。
表2绿色荧光蛋白报告载体构建的引物
Figure BDA0002973111990000092
Figure BDA0002973111990000101
PCR反应体系和PCR反应条件同上。
PCR产物进行纯化后，与由限制性内切酶SnaBI与BglII酶切处理的质粒pP16，pP60，pP67与pPgpdA，或由限制性内切酶SphI与KpnI酶切处理的质粒pP51与pP52，采用诺唯赞非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒(货号：C112-01)进行重组反应，然后转化至大肠杆菌Trans-T1。提取相应的重组质粒后，采用酶切与测序验证，获得各不同NDA片段介导下的绿色荧光蛋白报告载体pP16-GFP、pP51-GFP、pP52-GFP、pP60-GFP、pP67-GFP与pPgpdA-GFP，其中pPgpdA-GFP作为对照。
取黑曲霉M202菌株的新鲜孢子悬浮于100mL CMA液体培养基(葡萄糖20g/L，麦芽提取物20g/L，蛋白胨1g/L)中，孢子悬液的终浓度为1×105/mL，在30℃、200r/min的条件培养12-16h。在无菌条件下用无菌的Micro-cloth滤布收集菌体，并用溶液A(K2HPO4 5mM，KH2PO4 5mM，MgSO4 96.31g/L，pH 5.8，过滤除菌)冲洗一次，用无菌棉签将其转移到20mL的裂解液(0.4g裂解酶于20mL溶液A)中，在37℃、75r/min条件下裂解约两个小时左右。用无菌的Micro-cloth滤布过滤上述裂解液，并用两个50mL无菌离心管收集原生质体，用溶液B(Tris-HCl 10mM，CaCl2 5.54g/L，D-山梨醇218.64g/L，pH 7.5，过滤除菌)冲洗定容使每管大约25mL。在2000r/min条件下离心5min弃去上清，用20mL溶液B对沉淀再重悬沉淀两次。将沉淀重悬浮于10mL溶液B中，将用血球计数板对原生质体计数。离心并根据计数结果加入适量溶液B重悬一次。在冰上向预先冷却的15mL离心管中加入100μL原生质体悬液，然后分别加入5μg各DNA片段介导的绿色荧光蛋白报告载体pP16-GFP，pP51-GFP，pP52-GFP，pP60-GFP，pP67-GFP与pPgpdA-GFP，向其加入1mL溶液C(Tris-HCl 10mM，CaCl2 5.54g/L，PEG600050％(w/v)，pH 7.5，过滤除菌)冰浴10min，2mL溶液B并混匀。与预热的含有潮霉素的上层培养基MMSH混匀后，再平铺至下层培养基MMSH平板上。将平板在30℃培养箱中培养3-5天，获得各DNA片段介导的荧光蛋白报告菌株，分别命名为AnP16-GFP、AnP51-GFP、AnP52-GFP、AnP60-GFP、AnP67-GFP与AnPgpdA-GFP。将获得的上述菌株与出发菌株M202的新鲜孢子悬浮于在50ml CMA液体培养基中，在30℃、200r/min的条件培养24h。在480nm下利用荧光共聚焦显微镜来各菌株培养物的荧光蛋白表达情况。结果发现，与M202出发菌株相比，各菌株均检测到荧光蛋白的表达，表明本发明所获得的SEQ ID NO：1-5的DNA片段均可启始下游基因的转录，具有启动子活性，各菌株的荧光蛋白表达情况如图1所示。
实施例2不同启动子在葡萄糖氧化酶表达中的应用效果
1.不同启动子介导下的葡萄糖氧化酶表达载体的构建
采用葡萄糖氧化酶编码基因goxC的上游引物与下游引物，以黑曲霉M202菌株的基因组为模板，进行PCR扩增葡萄糖氧化酶基因片段。具体引物序列如表3所示。
表3黑曲霉葡萄糖氧化酶表达载体构建的引物
引物名称 引物序列 序列编号
P16-GoxC-F tttcgttcatcacagccgtctcgagATGCAGACTCTCCTTGTGAGCT SEQ ID NO：25
P51-GoxC-F ccaattctccaaacgtcaaactcgagATGCAGACTCTCCTTGTGAGCT SEQ ID NO：26
P52-GoxC-F cataactcatccccctccagctcgagATGCAGACTCTCCTTGTGAGCT SEQ ID NO：27
P60-GoxC-F cctactagccgccctcatcctcgagATGCAGACTCTCCTTGTGAGCT SEQ ID NO：28
P67-GoxC-F tcagaaccaccacaaaccactcgagATGCAGACTCTCCTTGTGAGCT SEQ ID NO：29
P<sub>gpdA</sub>-GoxC-F ttaccccgccacatagacactcgagATGCAGACTCTCCTTGTGAGCT SEQ ID NO：30
GoxC-R cacaggccttagcatgcgaagatctTCACTGCATAGAAGCGTAGTCC SEQ ID NO：31
PCR反应体系和反应条件同实施例1。
PCR产物进行纯化后，与由限制性内切酶SnaBI与BglII酶切处理的质粒pP16、pP60、pP67与pPgpdA，或由限制性内切酶SphI与KpnI酶切处理的质粒pP51与pP52，采用诺唯赞非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒(货号：C112-01)进行重组反应，然后转化至大肠杆菌Trans-T1。提取相应的重组质粒后，采用酶切与测序验证，获得各不同启动子介导下的葡萄糖氧化酶表达载体pP16-GoxC、pP51-GoxC、pP52-GoxC、pP60-GoxC、pP67-GoxC与pPgpdA-GoxC，其中pPgpdA-GoxC作为对照。
2.葡萄糖氧化酶表达强化的黑曲霉重组菌株的构建
按照实施例1的方法将葡萄糖氧化酶表达载体pP16-GoxC、pP51-GoxC、pP52-GoxC、pP60-GoxC、pP67-GoxC与pPgpdA-GoxC转化至黑曲霉M202菌株，获得各启动子介导的葡萄糖氧化酶表达强化的黑曲霉菌株，分别命名为AnP16-GoxC、AnP51-GoxC、AnP52-GoxC、AnP60-GoxC、AnP67-GoxC与AnPgpdA-GoxC。
3.不同启动子介导下的黑曲霉葡萄糖氧化酶表达强化菌株的酶活检测
将黑曲霉葡萄糖氧化酶表达强化菌株AnP16-GoxC、AnP51-GoxC、AnP52-GoxC、AnP60-GoxC、AnP67-GoxC与AnPgpdA-GoxC分别接种于PDA培养基上30℃培养5天，然后用0.9％生理盐水收集孢子，并采用血球计数板进行孢子计数。以106/mL的接种量接种于黑曲霉蛋白发酵培养基(2％葡萄糖，2％麦芽糖，1.5％硫酸铵，4％胰蛋白酶消化的大豆培养液，0.1％磷酸二氢钠，0.1％硫酸镁)，34℃，250r/min培养96h，然后采用抽滤方式分离获得发酵上清，即为粗酶液。
葡萄糖氧化酶酶活测定将粗酶液直接用缓冲液稀释至合适浓度。取4支试管，加入2mL缓冲液、0.3mL葡萄糖、0.4mL苯酚、0.1mL 4-氨基安替吡啉、0.1mL辣根过氧化物酶，30℃预热5min。向其中一管加入0.1mL蒸馏水，作为空白调零。向样品管中加入0.1mL样品溶液，此时开始计时，涡旋混匀后立即在500nm波长处用1cm比色杯比色。读取0.5min时吸光度值为A0，再反应1min后，读取吸光度值A1，得出ΔA500＝A1-A0。酶活计算公式为ΔA500×酶液稀释倍数×反应液体积×1000/(887×反应时间×样品体积×比色皿的厚度)＝33.82×ΔA500×酶液稀释倍数。其中，反应体积为3mL，1000为消光系数单位转换系数；887为消光系数(L·mol-1·cm-1)；反应时间为1min；样品体积为0.1mL；比色皿的厚度为1cm。酶活单位定义在pH6.0，30℃条件下，每分钟能把1μmol的β-D-葡萄糖氧化为D-葡萄糖酸和过氧化氢所需要的酶量，定义为1个酶活力单位(U)。最终获得的所有菌株的葡萄糖氧化酶相对粗酶活如表4所示。结果显示，实施例1中获得的SEQ ID NO：1-5的DNA片段不仅具有启动子活性，同时，与目前商业应用中普遍认为的强启动子PgpdA相比，5个启动子介导下的葡萄糖氧化酶的酶活力显著提升，尤其是P51启动子介导下的葡萄糖氧化酶酶活是PgpdA启动子介导下的葡萄糖氧化酶酶活的1.3倍，效果十分显著，说明本发明的5个启动子具有强启动活性，是黑曲霉的强启动子。
表4不同启动子介导下葡萄糖氧化酶相对粗酶活
Figure BDA0002973111990000121
Figure BDA0002973111990000131
实施例3不同启动子在过氧化氢酶表达中的应用效果
1.不同启动子介导下的过氧化氢酶表达载体的构建
采用过氧化氢酶编码基因catR的上游引物与下游引物，以黑曲霉M202菌株的基因组为模板，进行PCR扩增过氧化氢酶的基因片段。具体引物序列如表5所示。
表5过氧化氢酶表达载体构建的引物
引物名称 引物序列 序列编号
P16-CatR-F tttcgttcatcacagccgtctcgagATGCGTCATTTCTGGCTTTTG SEQ ID NO：32
P51-CatR-F ccaattctccaaacgtcaaactcgagATGCGTCATTTCTGGCTTTTG SEQ ID NO：33
P52-CatR-F cataactcatccccctccagctcgagATGCGTCATTTCTGGCTTTTG SEQ ID NO：34
P60-CatR-F cctactagccgccctcatcctcgagATGCGTCATTTCTGGCTTTTG SEQ ID NO：35
P67-CatR-F tcagaaccaccacaaaccactcgagATGCGTCATTTCTGGCTTTTG SEQ ID NO：36
P<sub>gpdA</sub>-CatR-F ttaccccgccacatagacactcgagATGCGTCATTTCTGGCTTTTG SEQ ID NO：37
CatR-R cacaggccttagcatgcgaagatctCTACTCATCCAGCGCAAACCGGTC SEQ ID NO：38
PCR反应体系和反应条件同实施例1。
PCR产物进行纯化后，与由限制性内切酶SnaBI与BglII酶切处理的质粒pP16、pP60、pP67与pPgpdA，或由限制性内切酶SphI与KpnI酶切处理的质粒pP51与pP52，采用诺唯赞非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒(货号：C112-01)进行重组反应，然后转化至大肠杆菌Trans-T1。提取相应的重组质粒后，采用酶切与测序验证，获得各不同启动子介导下的过氧化氢酶表达载体pP16-CatR、pP51-CatR、pP52-CatR、pP60-CatR、pP67-CatR与pPgpdA-CatR，其中pPgpdA-CatR作为对照。
2.过氧化氢酶表达强化的黑曲霉重组菌株的构建
按照实施例1的方法将过氧化氢酶表达载体pP16-CatR、pP51-CatR、pP52-CatR、pP60-CatR、pP67-CatR与pPgpdA-CatR转化至黑曲霉M202菌株，获得各启动子介导的过氧化氢酶表达强化的黑曲霉菌株，分别命名为AnP16-CatR、AnP51-CatR、AnP52-CatR、AnP60-CatR、AnP67-CatR与AnPgpdA-CatR。
3.不同启动子介导下的黑曲霉过氧化氢酶表达强化菌株的酶活检测
采用实施例2的方法培养黑曲霉过氧化氢酶表达强化菌株AnP16-CatR、AnP51-CatR、AnP52-CatR、AnP60-CatR、AnP67-CatR与AnPgpdA-CatR，同时采用实施例2的方法制备粗酶液。
过氧化氢酶酶活测定将粗酶液直接用缓冲液稀释至合适浓度。50mM磷酸缓冲液(0.27％磷酸二氢钾，0.53％磷酸氢二钾，pH7.0)，过氧化氢底物取0.1mL 30％过氧化氢溶液加入到50ml 50mM磷酸缓冲液中，使其在240nm的吸收值在0.53-0.55之间。取1支试管加入2.9mL磷酸缓冲液与0.1mL酶液，作为空白调零。取3支试管，将0.1mL酶液与2.9mL过氧化氢底物缓冲液混合，然后测定反应体系在240nm的吸收值从0.45下降到0.40所用的时间T，所用时间须在0.27-0.40min之间。酶活计算方法：240nm的吸光值从0.45下降到0.40所用的时间对应于3mL溶液中3.45μmol过氧化氢被降解。过氧化氢酶的计算公式为3.45×D/(T×0.1mL酶液体积)＝34.5×D/T。其中，D为酶液稀释倍数，T为240nm的吸收值从0.45下降到0.40所用的时间。酶活单位定义在pH7.0，30℃条件下，每分钟降解1μmol的过氧化氢的酶量定义为1个酶活力单位(U)。结果显示，与强启动子PgpdA相比，本发明提供的5个启动子介导下的过氧化氢酶酶活力显著提升。
实施例4不同启动子在柠檬酸菌株改造中的应用效果
1.不同启动子介导下的柠檬酸外排蛋白黑曲霉表达载体的构建
采用柠檬酸外排蛋白编码基因cexA的上游引物与下游引物，以黑曲霉M202菌株的基因组为模板，进行PCR扩增柠檬酸外排蛋白的基因片段。具体引物序列如表6所示。
表6柠檬酸外排蛋白黑曲霉表达载体构建的引物
Figure BDA0002973111990000141
Figure BDA0002973111990000151
PCR反应体系和PCR反应条件同实施例1。PCR产物进行纯化后，与由限制性内切酶SnaBI与BglII酶切处理的质粒pP16、pP60、pP67与pPgpdA，或由限制性内切酶SphI与KpnI酶切处理的质粒pP51与pP52，采用诺唯赞非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒(货号：C112-01)进行重组反应，然后转化至大肠杆菌Trans-T1。提取相应的重组质粒后，采用酶切与测序验证，获得各不同启动子介导下的柠檬酸外排蛋白表达载体pP16-CexA、pP51-CexA、pP52-CexA、pP60-CexA、pP67-CexA与pPgpdA-CexA，其中pPgpdA-CexA作为对照。
2.柠檬酸外排蛋白表达强化的黑曲霉重组菌株的构建
按照实施例1的方法将柠檬酸外排蛋白表达载体pP16-CexA、pP51-CexA、pP52-CexA、pP60-CexA、pP67-CexA以及pPgpdA-CexA转化至黑曲霉M202菌株，获得各启动子介导的柠檬酸外排蛋白表达强化的黑曲霉菌株，分别命名为AnP16-CexA、AnP51-CexA、AnP52-CexA、AnP60-CexA、AnP67-CexA与对照菌株AnPgpdA-CexA。
3.不同启动子介导下的黑曲霉柠檬酸外排蛋白表达强化菌株的柠檬酸发酵
将黑曲霉柠檬酸外排蛋白表达强化菌株AnP16-CexA、AnP51-CexA、AnP52-CexA、AnP60-CexA、AnP67-CexA与对照菌株AnPgpdA-CexA分别接种于PDA培养基上30℃培养5天，然后用0.9％生理盐水收集孢子，并采用血球计数板进行孢子计数。以106/mL的接种量接种于柠檬酸发酵培养基(玉米淀粉培养基，总糖含量12％)，34℃，250r/min培养96h。
通过快速抽滤收集发酵上清，稀释10倍后，加热煮沸10min，用滤膜过滤后用HPLC检测柠檬酸含量。具体检测条件为采用色谱柱Aminex HPX-87H(300mm X 7.8mm X 9μm，BioRad)，岛津UFLC高效液相色谱仪(配有岛津LC-20AD输液泵、SPD-20A UV检测器、CTO-20A/AC柱温箱、SIL-20ACHT UFLC规格自动进样器，岛津LCsution工作站)，流动相A为超纯水，流动相B为2.75mM H2SO4，流速为0.6mL/min，进样量为10uL，柱温50℃，紫外检测波长为210nm。与强启动子PgpdA介导的对照菌株相比，本发明提供的5个启动子介导下的菌株的柠檬酸发酵水平显著提升，其中，P16、P52、P60的介导下的菌株的柠檬酸产量较对照菌株提升了15.25％、25.42％、42.37％，效果十分显著，尤其P51与P67介导下的菌株的柠檬酸发酵水平分别提升62.71％、86.44％，效果极其显著(图2)。
实施例5启动子截短后在柠檬酸菌株改造中的应用效果
1.不同长度的启动子介导下的柠檬酸外排蛋白黑曲霉表达载体的构建
为了验证不同长度的核酸序列是否仍然具有启动子活性，分别以pP16-CexA、pP51-CexA、pP52-CexA、pP60-CexA、pP67-CexA为模板，以截短不同长度的启动子片段的上游引物与载体的下游引物进行反向扩增，来构建不同长度的启动子介导下的柠檬酸外排蛋白表达载体。具体引物序列如表7所示。
表7柠檬酸外排蛋白黑曲霉表达载体构建的引物
引物名称 引物序列 序列编号
P16-m1-F cacacaggaaacagctatgacGTTGCCTGGGCCAGCATTAG SEQ ID NO：46
P51-m1-F cacacaggaaacagctatgacTTCGTCCGCGCTACTAGGAA SEQ ID NO：47
P51-m2-F cacacaggaaacagctatgacAAGGAATTGCGCTCCAACC SEQ ID NO：48
P51-m3-F cacacaggaaacagctatgacTGCATCCCCGGTTTTAGTCG SEQ ID NO：49
P52-m1-F cacacaggaaacagctatgacAAGAAGTAGCCTGTAGCAAG SEQ ID NO：50
P60-m1-F cacacaggaaacagctatgacTTCACTACCGATGCAGTACC SEQ ID NO：51
P67-m1-F cacacaggaaacagctatgacACTAGGGATAACGGATGATAC SEQ ID NO：52
Rev-R GTCATAGCTGTTTCCTGTGTG SEQ ID NO：53
PCR反应体系和PCR反应条件同实施例1。PCR产物进行纯化后，采用诺唯赞非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒(货号：C112-01)利用引物上的同源臂进行重组反应，然后转化至大肠杆菌Trans-T1。提取相应的重组质粒后，采用测序验证，获得各不同长度的启动子介导下的柠檬酸外排蛋白表达载体pP16-m1-CexA、pP51-m1-CexA、pP51-m2-CexA、pP51-m3-CexA、pP52-m1-CexA、pP60-m1-CexA与pP67-m1-CexA。启动子不同长度截短后的表达载体中的启动子信息如SEQ ID NO:54-60表8所示。
表8各启动子截短后的启动子片段的信息
Figure BDA0002973111990000161
Figure BDA0002973111990000171
2.启动子截短后的黑曲霉重组菌株的构建
按照实施例1的方法将柠檬酸外排蛋白表达载体pP16-m1-CexA、pP51-m1-CexA、pP51-m2-CexA、pP51-m3-CexA、pP52-m1-CexA、pP60-m1-CexA、pP67-m1-CexA转化至黑曲霉M202菌株，获得各启动子介导的柠檬酸外排蛋白表达强化的黑曲霉菌株，分别命名为AnP16-m1-CexA、AnP51-m1-CexA、AnP51-m2-CexA、AnP51-m3-CexA、AnP52-m1-CexA、AnP60-m1-CexA、AnP67-m1-CexA。
3.启动子截短后的黑曲霉重组菌株的柠檬酸发酵
黑曲霉柠檬酸外排蛋白表达强化菌株AnP16-m1-CexA、AnP51-m1-CexA、AnP51-m2-CexA、AnP51-m3-CexA、AnP52-m1-CexA、AnP60-m1-CexA、AnP67-m1-CexA的培养方法和柠檬酸的检测方法同实施例4。结果显示，与各自的全长启动子相比，本实施例中截短后的启动子仍可起始柠檬酸外排蛋白的表达，柠檬酸产量与全长启动子介导下的表达菌株的发酵水平相当，说明截短后的核酸序列仍然具有强启动子的活性，也就是说只要含有截短后的核酸序列就可以完全具备强启动子的功能。
序列表
<110>中国科学院天津工业生物技术研究所
<120>真菌来源的强启动子及其应用
<160>58
<170> PatentIn Version 3.1
<210>1
<211> 805
<212>DNA
<213> Aspergillus niger
<400> 1
agcgcgaagg tgtggactcc aagaaaacgc tttggttcgg tcaagacggg gaaatgggag 60
aggaatggat atcttacgaa gccgaattac ggagaaaggg cccaaacatg taaattatgg 120
cctgtaggtc aatcagcaaa gggccgagcg gtgattgcga gtacaccgat cggtagacta 180
cggaagggat gaaaaagaca ggaaaatagc gagagctaca tgccgtttca gaggctatcg 240
aaatgatatt ccaaagtatc accagtagcc ataaccacta taataaagga cgaagatgag 300
agtgccttcg ttctctttga ccagaaattc actcatagta tcaaagggta tttcccaata 360
atgtcagcgg tcggagttgg ttactggcgc gatcgggaga tatcggctct tcgttgcctg 420
ggccagcatt agcgccgggt ccaggttttt tttttgcaaa tttttttttc ttttcctggc 480
tatgtttttt ttcgttcccc ctaacaatgg gaaggacctc cctactccgt accgggccaa 540
ccaatccggc caatggaaac tgggccggga cgcccatcgc cgccgctgcc actgcaaatt 600
caggccagcg aaaaacccaa gagcgtccta gcgtctccgc tcgcttcttc ccgcttacaa 660
gagcccttcg ctcgctattt tttcttccct cccttccctt ctctcttctt ttctttccat 720
cccctttgaa gtgtcctgtt tgactggcac tatcatccat ctcctctctt tctttcctta 780
gttttcgttc atcacagccg tcaaa 805
<210>2
<211> 1171
<212>DNA
<213> Aspergillus niger
<400>2
atctagtata gtactacgga gtactaacct tgtactatac tctttccatc ccaacctgcg 60
cccctcccct aattgcttat cattcgccca caaggcttgg acgaagcttg ttgtgcctgc 120
gccggtgccg cttccctccc ctcctcccct gccttttcgg gcgacgccat ccgcgcacta 180
accctccacg tattccaata taccaaatct gcccaaagcg ccagccagct tcctcaagcc 240
ttgcggtcag ataaggccct gtacctagct agttgccgct gctcccggcg ctgggccaag 300
ccgtcggacg tccgtccccc ctctttcccc ctcctctccc ctctccactg gtggaacgat 360
gtctggctgt tgccatcgtt ctcagaagca acgccccctg gatcgggtgg ctgtcgtact 420
attgcatgtt cgtccgcgct actaggaaag tttttttccc acccggagta tccgtgttta 480
gtccgcgggc tggctgaccg gctagctggc cgtgccagtt gggtaaggtt ccaagggagg 540
accttactag gtagaaacgg gatccaacaa tgaggggaaa agggcggata tggcttgccg 600
ggggttcatt gcggcctgga cgaagaaagg gagatgatca ctaatgcaac acaatcttgg 660
cttgcaagga attgcgctcc aaccagaatg tctctgcgta gggatgccaa ttcgtgcggg 720
ccatgctgga tggatagtac gctgctccac tctcgctcga ccttttgcag tccacaatcg 780
tttccccgta tcgttgggcg ggggcgtttt tctgcagcta tggttgctgc tgccccgacg 840
gtgaaccttt ctgcatcccc ggttttagtc gattttagtt ggcgggcctg gagattaaac 900
tccgtcggac gaagaggagc agtggtgtca tcgtcggcgg attgcatgct atcggaagag 960
catggaagag ggaaaacatc aacttcattt gcaaaacgct cgagcataaa tagaggcctg 1020
gattccgccg ttctggtgtc ttttcttctt catccagcat cgcaagtctc tcaagcatcg 1080
cctggttcgt tcttctcact cttccaccac cagccttgtc aataagttag ctcttcatct 1140
tttcgaagaa accaattctc caaacgtcaa a 1171
<210>3
<211> 1056
<212>DNA
<213> Aspergillus niger
<400> 3
gtgcggattg agttgtgtgg aaaggagggg ttaactgcgc ctacttacag gtggcaggat 60
gcatctgcga tctgtatcag aagcatcatt actgtcatac cagctttagc cgtggcccag 120
gccgggaaga agacatggaa agaggagcca tggagcatcg tcaaccccgt cctgagtagc 180
aacacccgcc ttaccccgag ggaatgcgga agatctcgct ggggagggta gcagtcgaag 240
cagcttcagc cagcgagagc agcgacagat gctggctgcc ccaccattcc cttggaaaga 300
ttcggaggac gagaccgtga gctttcccgg ggcacgcctt tgggggagtt tttggctcga 360
gcttacaaga agtagcctgt agcaagtctg tggtcgtgtt tattatttat ctactacttc 420
cccctcctcc ctcctcctct tgtgttaaga gtactctcaa aaaaagcctt tcttagatag 480
tacaaccacc atcttcaagg tcctgtaagt atgacttgtc ccatatactc attttatcac 540
ccctcccatc tttctctgtc catttcatcc tcctcttctt cctcttagct gctagtcatg 600
accccgccat catcccacca tgttgtgctt gacccctcca tctatccatc catccatcct 660
cctgtctata tgccatcact ccatcctgtc tgtctatcaa tgatctggca tctccggatt 720
tagcaccaag tcccattgat tagttgatca tttgggaaac ttggctgtgc cgagcctggt 780
ctatttgatg gatcggacct ctccacctct aattcccccc ccgtccttcc cttctccgtc 840
actcatccgc catccgctca ttctttttgg gtcctcggtg aacactcacc accttccccc 900
ccgctgctgc tagtgcacac cgaaacagca agtccggagc gcttacattt ttgcctcctc 960
cgttttttcc tatatctggg ccatgttctc cctttgccat ctttgttttc tcccagtttc 1020
actgatccat aactcatccc cctccagtcc atcaac 1056
<210>4
<211> 1215
<212>DNA
<213> Aspergillus niger
<400> 4
gtgtgtgaca ggtccgagat gagaattggc agagcgacct ccgaagaggc atatatggtc 60
ggggaacagc cattgttgga gtaaattgag ttggctgatc tgccaaagat caggtggtgc 120
caggtattgc gcctgtcgag aatcaaccgg tccttgttcc ctccgagctc cacctatggt 180
ctagagccag tagtgggtag ggatttggta atggaggaat cgttcagatc atcggctccg 240
aggcacagta tgggaccacc tgcggcctca atattccgga atgtcgtgag gatatgaacc 300
tgtttgcacg gtttgctatg attgttgagt ttgtctgggt ttgggacccg gcccggctga 360
gataagcatt ttgcatggtt tgctgggcta ccacccctgg gtccgaacat ccccaggcag 420
cagcacaaca tcaagcgggg ttgctccagg agtgaagaaa tgtgtcagtt actagcggag 480
tagattcaac tacgttactt ggcagatatt gaacgatctg agtcactcaa gaccagtcac 540
tagattggta gagtgtagaa ggtgtgggtg ctgcaccgag cggtagacag taatcattct 600
agcatgggaa accccataat ctaggcgctg atcctaagtg gaggctggag gcaacgcccg 660
ccgagctacc acttcactac cgatgcagta ccgcgaaggc ggcccagctc gatgataacc 720
agacggtatc atccgcattg gtcatttgga tgagtgcacg acatccacgt gccagaatga 780
cgacaggaac tgccctgacg gactggcttt cgatatccgg aagatgatcg aatgtgcttc 840
gaatcgagcc agcacatgac ccggcctgac tcacgtgtgg ggccgctcac cgcctccacc 900
ccgtgatcca cgcttgcctg gcggccttat cagccgtgga agccgttccc tcaccaaatg 960
acgcggggct gtcgccttca actctctcta caactgccat cctgctcacc ttttgtcatc 1020
atccatctat ctctctatct ctccatccat ccatcctcca tccatcgtcc atctcaacct 1080
tttgtctgtt atctcttagc ttccatctag tctctgttac cctttttact cctcttcgtc 1140
tatttcgtca cttatctccc cccttaaggg acccgtcgga ccagacctac tagccgccct 1200
catctactta tcaaa 1215
<210>5
<211>869
<212>DNA
<213> Aspergillus niger
<400> 5
agggagaagg ggacaattta tatgtaagga aagaatgaag ggagggaccc gtagagacaa 60
gacaagaatg tttttttctc tcctttttgt gacgacacga gggaaaaaag gaattgaacg 120
gaagggatcg gttcatacaa gtgtaaaata cacacacgac tacggaataa tcccatcaga 180
tgcagcaatg ggttatctga agggggagga gatgtgtgag tgaatgagag agtaagccaa 240
tgctccatcg cggaccagca cggtcaggtg aagaccctga aaccattggc tgtaccagta 300
gtaactcccc tggttacccc catcccgaat gatcccgaag ggtgtgtatg tgtgtatgtg 360
tacacagtat gtgtaaggaa gtgtggtaag tgtgtatgtg cggtggaatg cccactgctt 420
tcccggggga aggaaaaagg atgatgagcc aaaaacgagg cgccaaacac ggtgtaaggg 480
aaaaagaagg gaaaggataa actagggata acggatgata ccaaagacag acacaaacag 540
gaaaaacagg aacaatacaa tacaaacaaa cggtgccaaa acaccaaaca aaaaagtagg 600
tagggctttt ttttctggtc ccaacaaagc gcactaacac ccgacggggg ggctgggtgg 660
gaaaagggca aaaaaccgcg aaaatttagc gggagagtat ttatgtcccg gggggccttc 720
tgttgtcact tttcctccag ctttttcctc cagaaaagtt ctccttcctt ctttcccttc 780
ccaatcccat cattttctag agaaactcct ctctcagaac caccacaaac cactcgaggt 840
acgtacaagc ttatggtgag caagggcga 869
<210>6
<211> 45
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 6
gggttgcggc cgctctagaa ctagtgttgc ctgggccagc attag 45
<210>7
<211> 44
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 7
ccagcaagct tgtacgtacc tcgagacggc tgtgatgaac gaaa 44
<210>8
<211> 44
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 8
gggttgcggc cgctctagaa ctagtcggag tactaacctt gtac 44
<210>9
<211> 45
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 9
ccagcaagct tgtacgtacc tcgagtttga cgtttggaga attgg 45
<210>10
<211> 45
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
gggttgcggc cgctctagaa ctagtcggat tgagttgtgt ggaaa 45
<210>11
<211> 45
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
ccagcaagct tgtacgtacc tcgagctgga gggggatgag ttatg 45
<210>12
<211> 45
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 12
gggttgcggc cgctctagaa ctagttgtga caggtccgag atgag 45
<210>13
<211> 45
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 13
ccagcaagct tgtacgtacc tcgaggatga gggcggctag taggt 45
<210>14
<211> 45
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 14
gggttgcggc cgctctagaa ctagtaggga gaaggggaca attta 45
<210>15
<211> 45
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
ccagcaagct tgtacgtacc tcgagtggtt tgtggtggtt ctgag 45
<210>16
<211> 45
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 16
gggttgcggc cgctctagaa ctagtctcag gaggcgaata gataa 45
<210>17
<211> 45
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 17
ccagcaagct tgtacgtacc tcgagtgtct atgtggcggg gtaat 45
<210>18
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 18
tttcgttcat cacagccgtc tcgagatgca gactctcctt gtgagct 47
<210>19
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 19
ccaattctcc aaacgtcaaa ctcgagatgg tgagcaaggg cgaggag 47
<210>20
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 20
cataactcat ccccctccag ctcgagatgg tgagcaaggg cgaggag 47
<210>21
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 21
cctactagcc gccctcatcc tcgagatggt gagcaagggc gaggag 46
<210>22
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 22
tcagaaccac cacaaaccac tcgagatggt gagcaagggc gaggag 46
<210>23
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 23
ttaccccgcc acatagacac tcgagatggt gagcaagggc gaggag 46
<210>24
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 24
cacaggcctt agcatgcgaa gatctttact tgtacagctc gtcca 45
<210>25
<211> 47
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 25
tttcgttcat cacagccgtc tcgagatgca gactctcctt gtgagct 47
<210>26
<211> 48
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 26
ccaattctcc aaacgtcaaa ctcgagatgc agactctcct tgtgagct 48
<210>27
<211> 48
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 27
cataactcat ccccctccag ctcgagatgc agactctcct tgtgagct 48
<210>28
<211> 47
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 28
cctactagcc gccctcatcc tcgagatgca gactctcctt gtgagct 47
<210>29
<211> 47
<212>DNA
<213>人工序列
<400>29
tcagaaccac cacaaaccac tcgagatgca gactctcctt gtgagct 47
<210>30
<211> 47
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 30
ttaccccgcc acatagacac tcgagatgca gactctcctt gtgagct 47
<210>31
<211> 47
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 31
cacaggcctt agcatgcgaa gatcttcact gcatagaagc gtagtcc 47
<210>32
<211> 46
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 32
tttcgttcat cacagccgtc tcgagatgcg tcatttctgg cttttg 46
<210>33
<211> 47
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 33
ccaattctcc aaacgtcaaa ctcgagatgc gtcatttctg gcttttg 47
<210>34
<211> 47
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 34
cataactcat ccccctccag ctcgagatgc gtcatttctg gcttttg 47
<210>35
<211> 46
<212>DNA
<213>人工序列
<400>35
cctactagcc gccctcatcc tcgagatgcg tcatttctgg cttttg 46
<210>36
<211> 46
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 36
tcagaaccac cacaaaccac tcgagatgcg tcatttctgg cttttg 46
<210>37
<211> 46
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 37
ttaccccgcc acatagacac tcgagatgcg tcatttctgg cttttg 46
<210>38
<211> 49
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 38
cacaggcctt agcatgcgaa gatctctact catccagcgc aaaccggtc 49
<210>39
<211> 46
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 39
tttcgttcat cacagccgtc tcgagatgtc ttcaaccacg tcttca 46
<210>40
<211> 47
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 40
ccaattctcc aaacgtcaaa ctcgagatgt cttcaaccac gtcttca 47
<210>41
<211> 47
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 41
cataactcat ccccctccag ctcgagatgt cttcaaccac gtcttca 47
<210>42
<211> 46
<212>DNA
<213>人工序列
<400>42
cctactagcc gccctcatcc tcgagatgtc ttcaaccacg tcttca 46
<210>43
<211> 46
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 43
tcagaaccac cacaaaccac tcgagatgtc ttcaaccacg tcttca 46
<210>44
<211> 46
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 44
ttaccccgcc acatagacac tcgagatgtc ttcaaccacg tcttca 46
<210>45
<211> 44
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 45
cacaggcctt agcatgcgaa gatctctagt tgccgttggc tttg 44
<210>46
<211> 41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>46
cacacaggaa acagctatga cgttgcctgg gccagcatta g 41
<210>47
<211> 41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>47
cacacaggaa acagctatga cttcgtccgc gctactagga a 41
<210>48
<211> 40
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 48
cacacaggaa acagctatga caaggaattg cgctccaacc 40
<210>49
<211> 41
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 49
cacacaggaa acagctatga ctgcatcccc ggttttagtc g 41
<210>50
<211> 41
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 50
cacacaggaa acagctatga caagaagtag cctgtagcaa g 41
<210>51
<211> 41
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 51
cacacaggaa acagctatga cttcactacc gatgcagtac c 41
<210>52
<211> 42
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 52
cacacaggaa acagctatga cactagggat aacggatgat ac 42
<210>53
<211> 21
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 53
gtcatagctg tttcctgtgt g 21
<210>54
<211>393
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 54
gttgcctggg ccagcattag cgccgggtcc aggttttttt tttgcaaatt tttttttctt 60
ttcctggcta tgtttttttt cgttccccct aacaatggga aggacctccc tactccgtac 120
cgggccaacc aatccggcca atggaaactg ggccgggacg cccatcgccg ccgctgccac 180
tgcaaattca ggccagcgaa aaacccaaga gcgtcctagc gtctccgctc gcttcttccc 240
gcttacaaga gcccttcgct cgctattttt tcttccctcc cttcccttct ctcttctttt 300
ctttccatcc cctttgaagt gtcctgtttg actggcacta tcatccatct cctctctttc 360
tttccttagt tttcgttcat cacagccgtc aaa 393
<210>55
<211>743
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 55
ttcgtccgcg ctactaggaa agtttttttc ccacccggag tatccgtgtt tagtccgcgg 60
gctggctgac cggctagctg gccgtgccag ttgggtaagg ttccaaggga ggaccttact 120
aggtagaaac gggatccaac aatgagggga aaagggcgga tatggcttgc cgggggttca 180
ttgcggcctg gacgaagaaa gggagatgat cactaatgca acacaatctt ggcttgcaag 240
gaattgcgct ccaaccagaa tgtctctgcg tagggatgcc aattcgtgcg ggccatgctg 300
gatggatagt acgctgctcc actctcgctc gaccttttgc agtccacaat cgtttccccg 360
tatcgttggg cgggggcgtt tttctgcagc tatggttgct gctgccccga cggtgaacct 420
ttctgcatcc ccggttttag tcgattttag ttggcgggcc tggagattaa actccgtcgg 480
acgaagagga gcagtggtgt catcgtcggc ggattgcatg ctatcggaag agcatggaag 540
agggaaaaca tcaacttcat ttgcaaaacg ctcgagcata aatagaggcc tggattccgc 600
cgttctggtg tcttttcttc ttcatccagc atcgcaagtc tctcaagcat cgcctggttc 660
gttcttctca ctcttccacc accagccttg tcaataagtt agctcttcat cttttcgaag 720
aaaccaattc tccaaacgtc aaa 743
<210>56
<211>506
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 56
aaggaattgc gctccaacca gaatgtctct gcgtagggat gccaattcgt gcgggccatg 60
ctggatggat agtacgctgc tccactctcg ctcgaccttt tgcagtccac aatcgtttcc 120
ccgtatcgtt gggcgggggc gtttttctgc agctatggtt gctgctgccc cgacggtgaa 180
cctttctgca tccccggttt tagtcgattt tagttggcgg gcctggagat taaactccgt 240
cggacgaaga ggagcagtgg tgtcatcgtc ggcggattgc atgctatcgg aagagcatgg 300
aagagggaaa acatcaactt catttgcaaa acgctcgagc ataaatagag gcctggattc 360
cgccgttctg gtgtcttttc ttcttcatcc agcatcgcaa gtctctcaag catcgcctgg 420
ttcgttcttc tcactcttcc accaccagcc ttgtcaataa gttagctctt catcttttcg 480
aagaaaccaa ttctccaaac gtcaaa 506
<210>57
<211>320
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 57
tgcatccccg gttttagtcg attttagttg gcgggcctgg agattaaact ccgtcggacg 60
aagaggagca gtggtgtcat cgtcggcgga ttgcatgcta tcggaagagc atggaagagg 120
gaaaacatca acttcatttg caaaacgctc gagcataaat agaggcctgg attccgccgt 180
tctggtgtct tttcttcttc atccagcatc gcaagtctct caagcatcgc ctggttcgtt 240
cttctcactc ttccaccacc agccttgtca ataagttagc tcttcatctt ttcgaagaaa 300
ccaattctcc aaacgtcaaa 320
<210>58
<211>690
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 58
aagaagtagc ctgtagcaag tctgtggtcg tgtttattat ttatctacta cttccccctc 60
ctccctcctc ctcttgtgtt aagagtactc tcaaaaaaag cctttcttag atagtacaac 120
caccatcttc aaggtcctgt aagtatgact tgtcccatat actcatttta tcacccctcc 180
catctttctc tgtccatttc atcctcctct tcttcctctt agctgctagt catgaccccg 240
ccatcatccc accatgttgt gcttgacccc tccatctatc catccatcca tcctcctgtc 300
tatatgccat cactccatcc tgtctgtcta tcaatgatct ggcatctccg gatttagcac 360
caagtcccat tgattagttg atcatttggg aaacttggct gtgccgagcc tggtctattt 420
gatggatcgg acctctccac ctctaattcc ccccccgtcc ttcccttctc cgtcactcat 480
ccgccatccg ctcattcttt ttgggtcctc ggtgaacact caccaccttc ccccccgctg 540
ctgctagtgc acaccgaaac agcaagtccg gagcgcttac atttttgcct cctccgtttt 600
ttcctatatc tgggccatgt tctccctttg ccatctttgt tttctcccag tttcactgat 660
ccataactca tccccctcca gtccatcaac 690
<210>59
<211>543
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 59
ttcactaccg atgcagtacc gcgaaggcgg cccagctcga tgataaccag acggtatcat 60
ccgcattggt catttggatg agtgcacgac atccacgtgc cagaatgacg acaggaactg 120
ccctgacgga ctggctttcg atatccggaa gatgatcgaa tgtgcttcga atcgagccag 180
cacatgaccc ggcctgactc acgtgtgggg ccgctcaccg cctccacccc gtgatccacg 240
cttgcctggc ggccttatca gccgtggaag ccgttccctc accaaatgac gcggggctgt 300
cgccttcaac tctctctaca actgccatcc tgctcacctt ttgtcatcat ccatctatct 360
ctctatctct ccatccatcc atcctccatc catcgtccat ctcaaccttt tgtctgttat 420
ctcttagctt ccatctagtc tctgttaccc tttttactcc tcttcgtcta tttcgtcact 480
tatctccccc cttaagggac ccgtcggacc agacctacta gccgccctca tctacttatc 540
aaa 543
<210>60
<211>369
<212>DNA
<213> Aspergillus niger
<400> 60
actagggata acggatgata ccaaagacag acacaaacag gaaaaacagg aacaatacaa 60
tacaaacaaa cggtgccaaa acaccaaaca aaaaagtagg tagggctttt ttttctggtc 120
ccaacaaagc gcactaacac ccgacggggg ggctgggtgg gaaaagggca aaaaaccgcg 180
aaaatttagc gggagagtat ttatgtcccg gggggccttc tgttgtcact tttcctccag 240
ctttttcctc cagaaaagtt ctccttcctt ctttcccttc ccaatcccat cattttctag 300
agaaactcct ctctcagaac caccacaaac cactcgaggt acgtacaagc ttatggtgag 360
caagggcga 369

Claims (10)

1.具有强启动子活性的多核苷酸，其中，所述多核苷酸选自如下(a)-(e)中组成的组中的任一项：
(a)包括如SEQ ID NO：1-5任一序列所示的核苷酸序列；
(b)包括如SEQ ID NO：54-60任一序列所示的核苷酸序列；
(c)包含如SEQ ID NO：1-5、54-60任一序列所示的核苷酸序列的反向互补序列；
(d)在高严格性杂交条件下，能够与(a)或(b)或(c)所示的核苷酸序列杂交的序列，并仍具有启动子活性；
(e)与(a)或(b)或(c)所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性，且仍具有启动子活性的序列。
2.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ IDNO：1-5、SEQ ID NO：54-60任一序列所示。
3.一种转录表达盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的多核苷酸，可选地，所述转录表达盒还包括所述具有启动子活性的多核苷酸可操作地连接的蛋白编码基因。
4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括权利要求1或2所述的多核苷酸，或权利要求3所述的转录表达盒。
5.一种重组宿主细胞，其特征在于，含有权利要求3所述的转录表达盒，或权利要求4的重组表达载体；优选地，所述宿主细胞是真菌，更优选地，所述宿主细胞为黑曲霉(Aspergillus niger)，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)，米曲霉(Aspergillusoryzae)，产黄青霉(Penicillium chrysogenum)，里氏木霉(Trichoderma reesei)，玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)，嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)，最优选黑曲霉(Aspergillus niger)，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)。
6.权利要求1或2所述的多核苷酸，权利要求3所述的转录表达盒，权利要求4所述的重组表达载体，或权利要求5所述的宿主细胞在如下至少一种中的用途：
(a)用于增强基因的转录水平，或制备用于增强基因的转录水平的试剂或试剂盒；
(b)用于蛋白，或制备用于制备蛋白的试剂或试剂盒；
(c)生产有机酸，或制备用于生产有机酸的试剂或试剂盒；优选地，所述有机酸选自柠檬酸、琥珀酸、苹果酸中的至少一种。
7.一种增强目标基因转录的方法，其特征在于，包括将权利要求1或2所述的多核苷酸与目标基因可操作地连接。
8.一种制备蛋白的方法，其特征在于，包括利用权利要求3所述的表达盒，或权利要求4所述的重组表达载体，或权利要求5所述的宿主细胞表达蛋白的步骤。
9.一种有机酸或酶制剂的生产方法，其特征在于，培养权利要求5所述的宿主细胞使之生产有机酸或酶制剂，收集产生的有机酸或酶制剂；进一步地，还包括将有机酸或酶制剂从发酵液中分离出来的步骤。
10.如权利要求9所述的生产方法，其特征在于，所述宿主细胞是真菌，更优选地，所述宿主细胞为黑曲霉(Aspergillus niger)，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)，米曲霉(Aspergillus oryzae)，产黄青霉(Penicillium chrysogenum)，里氏木霉(Trichodermareesei)，玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)，嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)，最优选黑曲霉(Aspergillus niger)，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)；所述有机酸是柠檬酸、琥珀酸、苹果酸中的任一种；所述酶制剂是葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶与植酸酶中的任一种。
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