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CN110760511B - 一种用于治疗杜氏肌营养不良症的gRNA、表达载体、CRISPR-Cas9系统 - Google Patents

一种用于治疗杜氏肌营养不良症的gRNA、表达载体、CRISPR-Cas9系统 Download PDF

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CN110760511B
CN110760511B CN201810851087.1A CN201810851087A CN110760511B CN 110760511 B CN110760511 B CN 110760511B CN 201810851087 A CN201810851087 A CN 201810851087A CN 110760511 B CN110760511 B CN 110760511B
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Abstract

本发明提供了一种用于治疗杜氏肌营养不良症的gRNA，包括用于敲除Dys基因43号内含子的gRNA和用于敲除Dys基因54号内含子的gRNA。本发明还提供了一种用于治疗杜氏肌营养不良的gRNA、表达载体、CRISPR‑Cas9系统，以及它们的用途。与现有技术相比，本发明可以覆盖不少于60％的DMD患者；利用CRISPR‑SaCas9系统，有利于使用AAV病毒作为治疗载体，更具有针对性，安全性高更高；本发明筛选出来的gRNA，具有较高的打靶效率，从而对Dys基因读码框的纠正效率更高。

Description

一种用于治疗杜氏肌营养不良症的gRNA、表达载体、CRISPR- Cas9系统
技术领域
本发明涉及一种用于治疗杜氏肌营养不良症的gRNA、表达载体、CRISPR-Cas9系统及其用途。
背景技术
罕见病主要指发病率极低的慢性、退行性疾病。目前已知的罕见病超过7000种，其中80％是由于基因缺陷所致，具有遗传性。其实罕见病并不罕见，据统计，全球约有3.5亿罕见病患者，中国占2000多万，每年新出生的患者超过20万。我国主要依靠产前诊断和引产等手段控制罕见病群体扩大。但罕见病涉及基因复杂多样，发病机制不清晰，尚未列入婚检产检常规项目，国民和基层医疗卫生机构对该病的认知也有待加强，诊断技术尚未完善等，致使患儿出生率居高不下。罕见病患者一出生便面临“病无所医”、“医无所药”的窘境，因为目前可以治疗的罕见病仅占5％，另外95％无药可医。主要因为罕见病药物的研发难度高、成本大、受众少，极少医药企业愿意投入研发。面对全球7000多种罕见病，有特异性治疗作用的药物仅400-500种，而在我国上市的还不到20％，且绝大多数为进口药。
杜氏肌营养不良症，也称假肥大性肌营养不良(DMD)，是由抗肌萎缩蛋白基因(Dystrophin，Dys)突变所致，Dys基因全长约2220kb，含79个外显子，cDNA长14kb，是目前已知最大的人类基因。DMD为X染色体隐性遗传，主要为男孩发病，女性为致病基因的携带者，患病率约3.3/10万，占出生男婴的20-30/10万，其中约1/3为散发病例，没有家族病史。
长久以来，国内外均无针对DMD的有效临床干预措施或药物。2016年9月，美国FDA通过加快审批方式(仅进行了12例临床试验)批准了Sarepta Therapeutics公司的新药Exondys 51(Eteplirsen)注射液，该药是世界上第一款被批准用于治疗DMD的药物。Eteplirsen注射液只能针对Dys基因第51号外显子缺失的患者(约占DMD患者的13％)，且目前尚无足够的证据证明eteplirsen对DMD的治疗效果。Eteplirsen是一种靶向51号外显子的磷酰吗啉寡核苷酸，通过诱导Dys基因51号外显子跳读，使其mRNA阅读框不被破坏，从而促进抗肌萎缩蛋白的生成，使致死型DMD转变为临床表型较轻的贝克肌营养不良症(BMD)。除了Dys基因第51号外显子缺失，Dys基因的突变多集中在2-20号外显子区和45-53号外显子区。因此Sarepta Therapeutics公司还在开发另外7种外显子跳跃产品，它们通过跳过53、45、50、44、52、55和8号外显子治疗其他基因突变型的DMD患者。
Sarepta Therapeutics公司开发的外显子跳跃产品需要定期注射。随着科学的发展，通过基因编辑技术直接在基因组水平对遗传缺陷进行修正，被认为是治疗单基因遗传病的有效手段，且无需重复用药，一次治疗便终生有效。CRISPR-Cas9被誉为第三代基因编辑技术，其使用和设计更加简单，对目的基因的突变也更为高效，只要根据目的基因设计特异性的gRNA序列，即可引导Cas9在靶位点附近进行切割，产生双链断裂(double strandbreak,DSB)，断裂后的DNA双链可以通过非同源末端连接(NHEJ)的方式重新连接(如图1所示)。
现有技术采用Sp.CRISPR-Cas9基因编辑技术针对Dys基因内含子44和内含子55分别设计gRNA，诱导DNA双链切割并通过NHEJ连接，切除最容易产生突变的外显子45-55，纠正Dys基因的读码框，使其表达出有一定功能的抗肌萎缩蛋白。
然而针对Dys基因内含子44和内含子55设计的Sp.CRISPR-gRNA，其效率较低，直接导致DNA双链切割后NHEJ的效率也较低。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种用于治疗杜氏肌营养不良症的gRNA、表达载体、CRISPR-Cas9系统，本发明还提供了它们的用途。本发明所筛选的gRNA，其打靶效率更高，从而对Dys基因读码框的纠正效率更高。此外，本发明采用的Sa.Cas9核酸序列全长(含核定位信号)3258bp，可进行AAV(腺相关病毒)的有效包装，对治疗过程中采用肌肉局部注射更有优势。AAV是世界上最常用的基因治疗载体之一，具有宿主范围广、安全性高、免疫原性低、表达稳定和物理性质稳定等优点，已被广泛地应用于基础研究和临床试验中。AAV具有多种血清型分别针对不同的组织和细胞，可根据临床需求进行选择。AAV的基因组约4700bp，可装载外源核酸序列最大片段约4500bp。而Sp.Cas9核酸序列全长(含核定位信号)4200bp，加上启动子和polyA后全长超过4500bp，不能进行AAV的有效包装。
为实现上述目的，所采取的技术方案：一种用于治疗杜氏肌营养不良症的gRNA，包括用于敲除Dys基因43号内含子的gRNA和用于敲除Dys基因54号内含子的gRNA。
优选地，所述用于敲除Dys基因43号内含子的gRNA的靶序列如SEQ ID NO:1-SEQID NO:50中的至少一种所示；优选地，所述用于敲除Dys基因43号内含子的gRNA的靶序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:14、SEQID NO:16、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:50中的至少一种所示。
优选地，所述用于敲除Dys基因54号内含子的gRNA的靶序列如SEQ ID NO:51-SEQID NO:65中的至少一种所示；优选地，所述用于敲除Dys基因54号内含子的gRNA的靶序列如SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64中的至少一种所示。
优选地，所述gRNA由靶序列如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:39中的一种所示的gRNA和靶序列如SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:63中的一种所示的gRNA组成，或由靶序列如SEQ IDNO:55所示的gRNA和靶序列如SEQ ID NO:53所示的gRNA组成。
本发明提供了一种用于治疗杜氏肌营养不良症的表达载体，所述表达载体表达上述所述的gRNA；优选地，所述表达载体的基础载体为AAV载体。
本发明提供了一种用于治疗杜氏肌营养不良症的CRISPR-Cas9系统，包括上述所述的gRNA和Cas9蛋白；优选地，所述Cas9蛋白为SaCas9蛋白。
本发明提供了一种用于治疗杜氏肌营养不良症的表达载体，，所述表达载体表达Cas9蛋白和上述所述的gRNA。
优选地，所述cas9蛋白为SaCas9蛋白，所述表达载体的基础载体为AAV载体。
本发明提供了上述所述的gRNA或者上述所述的表达载体在制备用于预防或治疗杜氏肌营养不良症的药物中的用途。
本发明提供了上述所述的CRISPR-Cas9系统、或者上述所述的表达载体在制备用于预防或治疗杜氏肌营养不良症的药物中的用途。
本发明提供了一种治疗杜氏肌营养不良症的的方法，其特征在于，所述方法是将上述所述的表达载体施用给杜氏肌营养不良症患者。
本发明采用来源于金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的CRISPR-SaCas9基因编辑系统，设计一对gRNA以引导Sa.Cas9在Dys基因突变热点区域45-53号外显子区的上游和下游分别进行双链切割，使得45-53号外显子区的上下游之间产生大片段缺失，从而纠正Dys基因的读码框(见图2)，使DMD患者向症状较轻的BMD转变。本发明的治疗方法是一种广谱性、通用型的治疗技术，适用于45-53号外显子区的缺失、重复、插入等一切突变类型(约适用于60％的DMD患者)，将(3N+1)或(3N+2)的读码框错误纠正为(3N),使DMD转变为非致死性的BMD。
本发明的有益效果在于：与现有技术相比，本发明可以覆盖不少于60％的DMD患者；利用CRISPR-SaCas9系统，有利于使用AAV病毒作为治疗载体，更具有针对性，安全性高更高；本发明筛选出来的gRNA，具有较高的打靶效率，从而对Dys基因读码框的纠正效率更高。
附图说明
图1为CRISPR-Cas9介导的非同源末端连接修复原理图；
图2为CRISPR-Sa.Cas9介导的Dys基因45-53号外显子区上下游之间的大片段缺失；
图3为pX601质粒图；
图4为本发明实施例1中SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:5检测结果；
图5为本发明实施例1中SEQ ID NO:6-SEQ ID NO:15检测结果；
图6为本发明实施例1中SEQ ID NO:16检测结果；
图7为本发明实施例1中SEQ ID NO:17-SEQ ID NO:23检测结果；
图8为本发明实施例1中SEQ ID NO:24-SEQ ID NO:26检测结果；
图9为本发明实施例1中SEQ ID NO:27检测结果；
图10为本发明实施例1中SEQ ID NO:28-SEQ ID NO:31检测结果；
图11为本发明实施例1中SEQ ID NO:32-SEQ ID NO:37检测结果；
图12为本发明实施例1中SEQ ID NO:38-SEQ ID NO:41检测结果；
图13为本发明实施例1中SEQ ID NO:42-SEQ ID NO:50检测结果；
图14为本发明实施例2中SEQ ID NO:51-SEQ ID NO:53检测结果；
图15为本发明实施例2中SEQ ID NO:54检测结果；
图16为本发明实施例2中SEQ ID NO:55-SEQ ID NO:60检测结果；
图17为本发明实施例2中SEQ ID NO:61-SEQ ID NO:65检测结果；
图18为本发明实施例3中Group NO:3-Group NO:24 PCR检测结果；
图19为本发明实施例3中Group NO:1-Group NO:2 PCR检测结果，
图20为本发明实施例3中Group NO:25-Group NO:26 PCR检测结果。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1 Dys基因43号内含子Sa-gRNA筛选
1.1 gRNA准备
(1)根据Dys基因的序列设计21nt的gRNA序列，如表1所示，所述gRNA的靶序列如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:55中的一种所示；
(2)分别合成gRNA的DNA序列正义链和反义链(正义链的5’-端加cacc，若正义链5’-端第一个核苷酸不是鸟嘌呤G，则在正义链的5’-端加caccG；在反义链的5’-端加aaac，若正义链5’-端第一个核苷酸不是鸟嘌呤G，则在反义链的3’-端加C)；
(3)将上述gRNA正义链和反义链混合，90℃处理后自然冷却至室温进行退火处理，合成带粘性末端的双链gRNA。
表1针对Dys基因43号内含子所设计的Sa-gRNA的DNA序列正义链及其检测引物
Figure BDA0001745987570000061
Figure BDA0001745987570000071
Figure BDA0001745987570000081
1.2载体准备
(1)pX601质粒(图3)扩增和提取，并测定质粒浓度；
(2)采用限制性内切酶Bsa I对pX601进行酶切，37℃酶切1h后加loading buffer终止反应。
(3)琼脂糖凝胶电泳后切胶回收线性化质粒pX601，并测定回收产物浓度，-20℃保存备用。
1.3连接转化
(1)将切胶回收的线性化pX601载体与退火后的gRNA双链进行连接反应；
(2)连接产物热击法转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，转化后向每个离心管加入无菌的LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后置于恒温摇床37℃200rpm振荡培养45min使菌体复苏。
(3)将复苏后的TOP10细胞涂布LB固体平板(Amp+)，倒置于恒温培养箱37℃静置培养12-16h。
(4)从上述平板上分别挑取单菌落接种到LB液体培养基(Amp+)中扩大培养。
(5)使用引物601SaF-F(5’-TTCCTTgACCCTggAAggTg-3’)(SEQ ID NO:66)，对上述菌液分别测序；
(6)将测序正确的菌液提取质粒并测定质粒浓度后至-20℃保存备用。
1.4细胞转染
(1)HEK293T细胞铺板；
(2)采用Lipofectamine 3000试剂盒将1.3(6)中提取的质粒分别转染HEK293T细胞；
(3)转染后的细胞培养48小时，离心收集细胞。
1.5 T7E1酶切分析突变效率
(1)将上述1.4(3)收集的细胞提取细胞基因组，并检测基因组浓度；
(2)分别在gRNA结合位点上下游设计PCR引物，如表1所示；
(3)分别使用PCR法扩增带有靶位点的目的片段；
(4)纯化回收PCR产物，并测定产物浓度；
(5)将上述纯化的PCR产物退火处理，即先加热至95℃，保温10min，然后以每30s下降2～3℃的速度降温至室温；
(6)上述每管退火产物分别加入T7核酸内切酶1(T7E1)，设置mock组(未转化的细胞)和空白对照组(不加T7E1，用ddH2O代替)，37℃酶切1h。
(7)2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，以Takara公司的DL 2,000 DNAMarker作为参照(电泳条带从上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp(以下所有电泳图如无特别说明，均为使用TAKARA DL2000 Marker)。)。
结果如下图所示(图中泳道编号与SEQ ID NO编号对应)，图4为SEQ ID NO:1-SEQID NO:5检测结果，图5为SEQ ID NO:6-SEQ ID NO:15检测结果，图6为SEQ ID NO:16检测结果，图7为SEQ ID NO:17-SEQ ID NO:23检测结果，图8为SEQ ID NO:24-SEQ ID NO:26检测结果，图9为SEQ ID NO:27检测结果，图10为SEQ ID NO:28-SEQ ID NO:31检测结果，图11为SEQ ID NO:32-SEQ ID NO:37检测结果，图12为SEQ ID NO:38-SEQ ID NO:41检测结果，图13为SEQ ID NO:42-SEQ ID NO:50检测结果。
根据T7E1检测的原理，酶切条带越亮、酶切效率越高，表示该gRNA的突变效率越高。图中SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:50切割效率较高。
实施例2 Dys基因54号内含子Sa-gRNA筛选
2.1 gRNA准备
(1)根据Dys基因的序列设计21nt的gRNA序列，如表2所示，所述gRNA的靶序列如SEQ ID NO:56-SEQ ID NO:69中的一种所示；
(2)分别合成gRNA的DNA序列正义链和反义链(正义链的5’-端加cacc，若正义链5’-端第一个核苷酸不是鸟嘌呤G，则在正义链的5’-端加caccG；在反义链的5’-端加aaac，若正义链5’-端第一个核苷酸不是鸟嘌呤G，则在反义链的3’-端加C)；
(3)将上述gRNA正义链和反义链混合，90℃处理后自然冷却至室温进行退火处理，合成带粘性末端的双链gRNA。
表2针对Dys基因54号内含子所设计的Sa-gRNA的DNA序列正义链及其检测引物
Figure BDA0001745987570000101
Figure BDA0001745987570000111
2.2载体准备
(1)pX601质粒(图3)扩增和提取，并测定质粒浓度；
(2)采用限制性内切酶Bsa I对pX601进行酶切，37℃酶切1h后加loading buffer终止反应。
(3)琼脂糖凝胶电泳后切胶回收线性化质粒pX601，并测定回收产物浓度，-20℃保存备用。
2.3连接转化
(1)将切胶回收的线性化pX601载体与退火后的gRNA双链进行连接反应；
(2)连接产物热击法转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，转化后向每个离心管加入无菌的LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后置于恒温摇床37℃200rpm振荡培养45min使菌体复苏。
(3)将复苏后的TOP10细胞涂布LB固体平板(Amp+)，倒置于恒温培养箱37℃静置培养12-16h。
(4)从上述平板上分别挑取单菌落接种到LB液体培养基(Amp+)中扩大培养。
(5)使用引物601SaF-F(5’-TTCCTTgACCCTggAAggTg-3’)(SEQ ID NO:66)，对上述菌液分别测序；
(6)将测序正确的菌液提取质粒并测定质粒浓度后至-20℃保存备用。
2.4细胞转染
(1)HEK293T细胞铺板；
(2)采用Lipofectamine 3000试剂盒将2.3(6)中提取的质粒分别转染HEK293T细胞；
(3)转染后的细胞培养48小时，离心收集细胞。
2.5 T7E1酶切分析突变效率
(1)将上述2.4(3)收集的细胞提取细胞基因组，并检测基因组浓度；
(2)分别在gRNA结合位点上下游设计PCR引物，如表2所示；
(3)分别使用PCR法扩增带有靶位点的目的片段；
(4)纯化回收PCR产物，并测定产物浓度；
(5)将上述纯化的PCR产物退火处理，即先加热至95℃，保温10min，然后以每30s下降2～3℃的速度降温至室温；
(6)上述每管退火产物分别加入T7核酸内切酶1(T7E1)，设置mock组(未转化的细胞)和空白对照组(不加T7E1，用ddH2O代替)，37℃酶切1h。
(7)2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，以Takara公司的DL 2,000 DNA Marker作为参照。
结果如下图所示(图中泳道编号与SEQ ID NO编号对应)，图14为SEQ ID NO:51-SEQ ID NO:53检测结果，图15SEQ为ID NO:54检测结果，图16为SEQ ID NO:55-SEQ ID NO:60检测结果，图17为SEQ ID NO:61-SEQ ID NO:65检测结果。
根据T7E1检测的原理，酶切条带越亮、酶切效率越高表示该gRNA的突变效率越高。图中SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64切割效率较高。
实施例3 Dys基因外显子43-55上下游Sa-gRNA组合筛选
3.1 Sa-gRNA组合
将实施例1中的靶点与实施例2中的靶点进行组合，如表3所示；
表3 Dys基因外显子43-55上下游Sa-gRNA组合
Figure BDA0001745987570000131
Figure BDA0001745987570000141
3.2细胞转染
(1)HEK293T细胞铺板；
(2)采用Lipofectamine 3000试剂盒将1.3(6)和2.3(6)中提取的质粒按照3.1中的组合分别转染HEK293T细胞；
(3)转染后的细胞培养48小时，离心收集细胞。
3.3 PCR检测突变效果及测序分析
(1)将上述3.2(3)收集的细胞提取细胞基因组，并检测基因组浓度；
(2)分别在gRNA结合位点上下游设计PCR引物，如表4所示；
表4 PCR检测分析引物列表
Figure BDA0001745987570000142
Figure BDA0001745987570000151
(3)分别使用PCR法扩增带有靶位点的目的片段；
(4)1％琼脂糖凝胶电泳检测打靶敲除效果，以Takara公司的DL 2,000 DNAMarker作为参照。
结果如下图所示(图中泳道编号与Group NO编号对应)，图18为Group NO:3-GroupNO:24 PCR检测结果，图19为Group NO:1-Group NO:2 PCR检测结果，图20为Group NO:25-Group NO:26 PCR检测结果。
根据非同源末端连接修复原理，基因组断裂后，细胞会倾向于将两个DNA断端彼此连接在一起。按照表3在细胞中共转入1.3(6)和2.3(6)中的载体后，两个Sa-gRNA之间的DNA片段被切除，DNA断端彼此连接修复。通过在Dys基因43号内含子Sa-gRNA 5’端和Dys基因54号内含子Sa-gRNA 3’端设计引物进行PCR，根据PCR产物大小可以判断是否发生非同源末端连接。图18中，泳道下方数字表示两个Sa-gRNA之间发生非同源末端连接修复后所得PCR产物大小，箭头指示前述PCR产物的位置。
切胶回收PCR产物箭头所指条带，委外进行sanger一代测序，并与Dys基因组比对分析。所有PCR产物测序均使用PCR上游引物。结果如表5所示：所有Sa-gRNA组合两个靶点之间的序列被切除，上游靶点PAM序列5’端第3个碱基处与下游靶点PAM序列5’端第3个碱基处发生非同源末端连接，Dys基因44号外显子至54号外显子被切除，将(3N+1)或(3N+2)的读码框错误纠正为(3N)，使DMD转变为非致死性的BMD。Group NO:1(SEQ ID NO:105)392bp处为非同源末端连接位点；Group NO:3(SEQ ID NO:107)399bp处为非同源末端连接位点；GroupNO:4(SEQ ID NO:108)394bp处为非同源末端连接位点；Group NO:5(SEQ ID NO:109)401bp处为非同源末端连接位点；Group NO:6(SEQ ID NO:110)410bp处为非同源末端连接位点；Group NO:7(SEQ ID NO:11)417bp处为非同源末端连接位点；Group NO:8(SEQ ID NO:112)418bp处为非同源末端连接位点；Group NO:9(SEQ ID NO:113)421bp处为非同源末端连接位点；Group NO:10(SEQ ID NO:114)424bp处为非同源末端连接位点；Group NO:11(SEQ IDNO:115)290bp处为非同源末端连接位点；Group NO:12(SEQ ID NO:116)289bp处为非同源末端连接位点；GroupNO:13(SEQ ID NO:117)289bp处为非同源末端连接位点；Group NO:14(SEQ ID NO:118)292bp处为非同源末端连接位点；Group NO:15(SEQ ID NO:119)289bp处为非同源末端连接位点；Group NO:16(SEQ ID NO:120)486bp处为非同源末端连接位点；Group NO:17(SEQ ID NO:121)488bp处为非同源末端连接位点；处为非同源末端连接位点；Group NO:19(SEQ ID NO:123)487bp处为非同源末端连接位点；Group NO:20(SEQ ID NO:124)486bp处为非同源末端连接位点；Group NO:21(SEQ ID NO:125)286bp处为非同源末端连接位点；Group NO:22(SEQ ID NO:126)286bp处为非同源末端连接位点；Group NO:23(SEQ ID NO:127)289bp处为非同源末端连接位点；Group NO:24(SEQ ID NO:128)288bp处为非同源末端连接位点；Group NO:25(SEQ ID NO:129)298bp处为非同源末端连接位点；Group NO:26(SEQ ID NO:130)528bp处为非同源末端连接位点。
表5 Dys基因外显子43-55上下游Sa-gRNA组合Sanger一代测序结果
Figure BDA0001745987570000171
Figure BDA0001745987570000181
Figure BDA0001745987570000191
Figure BDA0001745987570000201
Figure BDA0001745987570000211
Figure BDA0001745987570000221
Figure BDA0001745987570000231
Dys基因NCBI Sequence ID:NG_012232.1，Dys基因43号内含子序列范围为1057082至1127546，和Dys基因54号内含子序列范围为1686618至1716744。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 广东赤萌医疗科技有限公司
<120> 一种用于治疗杜氏肌营养不良症的gRNA、表达载体、CRISPR-Cas9系统
<130> 2018
<160> 130
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
attggtacgg gtctgtggct c 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gaatcgggtc cctaacaggc a 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gaggtggagc tcaggcagaa a 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gcagctagat ggtcccatct g 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aaaggaagct caaggctccc a 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tttgggacat ggccagggca t 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cctggccatg tcccaaatca g 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aagaaggggg tggtgagaag t 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ccatgaccac gagagaccag a 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tagacagcag ggacggcagt g 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
aagctgccga aatcgcagtt g 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gtgggcggat cacctgaggt c 21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tgccttagcc tcctgagtag c 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tctcaccaca acctatgcct c 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cttcgctctt gttgccccag c 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
agtcctgagg ctagcagtgt g 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
actgtgggag cagggcagtt c 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
catacaggct agggagtggg t 21
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
ggctagggag tgggtaggag t 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
atatgccagg ggccccttat t 21
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
tggacccgtt ccctctgcct t 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
tgcacccata aggcagaggg a 21
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ccttatgggt gcaactcccg g 21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
cactttggga ggccgaggca g 21
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
cctttctccc gcctcagctt c 21
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
gtctcgctct gtcaaccagg c 21
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
ccaggaacag cgcttagtac c 21
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
acacctgctc tgccttccac c 21
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
gagagagagt tggtggtggg g 21
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
gtggggcctg gtgagaggtg a 21
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
ccaggcccca cctccaacat t 21
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
gacttcccag cctccagaac t 21
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
tcccagcctc cagaactgtg a 21
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
ttggtctggg tgatggtcac c 21
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
catggttggc catgcctatc c 21
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
cagggatagg catggccaac c 21
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
catgctagtg tctctctggt g 21
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
acacaaaggc agacagagtg g 21
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
taccttccca ctctgcccct t 21
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
gggcagagtg ggaaggtagt g 21
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
gctccattaa ttgggctgcc c 21
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
tccaggccca caagagggag g 21
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
ccagctctgt cttacagagc t 21
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
ctcagactgt ggtagcagga g 21
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
ctgtggtagc aggaggaggg t 21
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
actgatgtcc tgggcagaga a 21
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
tatggtgctg cctcagagta c 21
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
ttaccggcta tggtgctgcc t 21
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
agcaccatag ccggtaatct g 21
<210> 50
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
agttggtctg gaatggagcc c 21
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
ccctcccaag ctccagttta g 21
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
tccagctaaa ctggagcttg g 21
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
tgggtgtgtg gagtgagata c 21
<210> 54
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
gcttgggcca tcaaggagca t 21
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
gctgggaagg gtagggggtg a 21
<210> 56
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
tggtggttac ctgatgctgg g 21
<210> 57
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
tgtggagggt gggaggagcg a 21
<210> 58
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
tgctggggaa gtgagactgg a 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
gtggtgctgg ggaagtgaga c 21
<210> 60
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
agagagagag ggaggtggaa g 21
<210> 61
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 61
agcactttgg gaggccgagg t 21
<210> 62
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 62
gggaggccga ggtgggggtg g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 63
gtgggaggat cactagaggc c 21
<210> 64
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 64
gtctcactac gtcacccagg c 21
<210> 65
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 65
tacctcggcc tcccaaagtg c 21
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 66
ttccttgacc ctggaaggtg 20
<210> 67
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 67
ccaaaattgt aatgggtaga cttc 24
<210> 68
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 68
aatccagctt tcacttatcc ca 22
<210> 69
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 69
ccaactctac cttttacttc cca 23
<210> 70
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 70
accatgtttt ccattaaccc tac 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 71
cttctagctt ctcctatgct ctc 23
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 72
ctagttgggc aagatgtact ag 22
<210> 73
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 73
agtacatctt gcccaactag c 21
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 74
gcacgaggga aatgttcttg 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 75
caggtttaga catgtgcctt c 21
<210> 76
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 76
tgaaaccaat ctcaaaggtt gc 22
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 77
tgccaccatt gagcacttac 20
<210> 78
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 78
ccacactaaa tgctccctaa g 21
<210> 79
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 79
ttaggatggt gttgaacttg c 21
<210> 80
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 80
acctcacttc ctactttggt c 21
<210> 81
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 81
tctagcttgg aaatcattga ct 22
<210> 82
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 82
cttcaactaa catctacagc agg 23
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 83
tcagtcagct tgctctcttg 20
<210> 84
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 84
catctggcag tgttccacaa g 21
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 85
agcagcacaa ttcacagttg 20
<210> 86
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 86
ctcatggtcc aaactgtatg tg 22
<210> 87
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 87
gcacataaat gaagcagcag tg 22
<210> 88
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 88
tgctactgtc ttaggacttg tg 22
<210> 89
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 89
gtttagcagt tgcatgctgt 20
<210> 90
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 90
cattgttcca tactggtgag ac 22
<210> 91
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 91
acttggcctc tgttttctcc 20
<210> 92
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 92
gaaccagggc tgtatgttta c 21
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 93
acttggccct gaaacttctc 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 94
acaaggctta gtttgaggag a 21
<210> 95
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 95
ggcaaacttg aatatggagc tg 22
<210> 96
<211> 20
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<213> 人工序列
<400> 96
agcagcagga tctacatgtc 20
<210> 97
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 97
agatatgggt gagactcaag g 21
<210> 98
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 98
tgccatcctg tcatagttgt ag 22
<210> 99
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 99
acatactcaa gtctccctca tc 22
<210> 100
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 100
tcagatgcca gttacccctc 20
<210> 101
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 101
tcatcagatg ttgggcactg 20
<210> 102
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 102
cctgaagagc cgaaagacac 20
<210> 103
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 103
gaattgaatg accacagaga cg 22
<210> 104
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 104
gacaactact cccttgctgt c 21
<210> 105
<211> 526
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 105
attaaagatg acttatgtct ctgatctttt tttccttcta agtaataact accttgcaga 60
gttattactt gaattggcca taaggtaaag aggacaccaa atacagtaaa taataacata 120
ataataaaga aaccttatga attctattca gtgatatcca tattgaggta tttaaggtga 180
atgatactga tgtcagcagt ttacctggat atgcatcaaa aatatgattg attgatggat 240
ggatcggagg aaggaaaaga tatgtgatca aaacgagtat agtaaaatgt tcatggtgga 300
atctagatat atagatatca cttgtaattt ttaaaaatgt tattgcattt ttgaaatttg 360
ttatgttaaa atattgggtg aaaattctga tgtctcactc cacacaccca atgggaaaat 420
ttgtggaggg caatatgact cgtcacttca tttcccatta tatatgaatg gaaattaaca 480
gcgcttatag acagtatctc ctcaaactaa agccatatca aaagat 526
<210> 106
<211> 816
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 106
ccaactctac cttttacttc ccatgtgaac attaaaagat gacttaatgt ctctgaatct 60
ttttttcctt ctaagtaata actaccttgc agagttatta cttgaattgg ccataaggta 120
aagaggacac caaatacagt aaataataac ataataataa agaaacctta tgaattctat 180
tcagtgatat ccatattgag gtatttaagg tgaatgatac tgatgtcagc agtttacctg 240
gatatgcatc aaaaatatga ttgattgatg gatggatcgg aggaaggaaa agatatgtga 300
tcaaaacgag tatagtaaaa tgttcatggt ggaatctaga tatatagata tcacttgtaa 360
tttttaaaaa tgttattgca tttttgaaat ttgttatgtt aaaatattgg gtgaaaattc 420
tgatgctcct tgatggccca agccactctc tcagtttttt aaaaaattgt tttatcaagg 480
tctctggatt cttcatggga atgacttcca gtttatattt tttggcttgg ttccaaaaag 540
ctatcagcta aggaatgcat atacttactt cccctatggg taaagtaaat gagaatttta 600
gaagccaact cacattttta gcctgtacag aatctgcaat tcaccaagct acttctgact 660
catgtctata aagttcttcc ctgttctttt ctcacttcac atgtactctt tgcaagaatt 720
catccacttg tgtagtttca gtctgttgat gactacccat ctataattcc agctgagaat 780
gatcttttga gttttagaca tgtagatcct gctgct 816
<210> 107
<211> 989
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 107
gggaaattaa agatggactt aatgtctctg atcttttttt ccttctaagt aataactacc 60
ttgcagagtt attacttgaa ttggccataa ggtaaagagg acaccaaata cagtaaataa 120
taacataata ataaagaaac cttatgaatt ctattcagtg atatccatat tgaggtattt 180
aaggtgaatg atactgatgt cagcagttta cctggatatg catcaaaaat atgattgatt 240
gatggatgga tcggaggaag gaaaagatat gtgatcaaaa cgagtatagt aaaatgttca 300
tggtggaatc tagatatata gatatcactt gtaattttta aaaatgttat tgcatttttg 360
aaatttgtta tgttaaaata ttgggtgaaa attctgatga gtctcacttc cccagcacca 420
ccactttatg aaaacaagga cttactaaga tcatcagtga ctttgtaata gctaattagt 480
gtattttaat tcgtccatct tcttgactat attttaacat tgatcctgtt ggtcaactct 540
gctaatcaaa actttatcct ccttggttcc cagaacaata ttatcttgaa tatctcattt 600
ctctaatcat ataataattg tgaggtgctt ggcacaatgc ctagtgcgta gtaagaactc 660
agtaaaatat catctgccat cgacaccata aaaattaatt tacttactca acaaatactt 720
ttgtatgaag tttgtgctag gtaggcccag taattggtac ttggtataga gcaatgaaaa 780
gccctaaccc tcataaagct tatattcttg gaagcagaag ttggaagaca gacattgaca 840
aataaaaatt aaatacatga tgtgtcagat ggtcatacac acagtgtgga agaacaaaga 900
ggaaaacaag tggagagaga gagggaggtg ggaagaggag tgctgccatg aaaatgtggt 960
aattcaaaaa aggtctttac tgaaaaggt 989
<210> 108
<211> 1000
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 108
attaaaagga tgacttatgt ctctgatctt tttttccttc taagtaataa ctaccttgca 60
gagttattac ttgaattggc cataaggtaa agaggacacc aaatacagta aataataaca 120
taataataaa gaaaccttat gaattctatt cagtgatatc catattgagg tatttaaggt 180
gaatgatact gatgtcagca gtttacctgg atatgcatca aaaatatgat tgattgatgg 240
atggatcgga ggaaggaaaa gatatgtgat caaaacgagt atagtaaaat gttcatggtg 300
gaatctagat atatagatat cacttgtaat ttttaaaaat gttattgcat ttttgaaatt 360
tgttatgtta aaatattggg tgaaaattct gatgtcactt ccccagcacc accactttat 420
gaaaacaagg acttactaag atcatcagtg actttgtaat agctaattag tgtattttaa 480
ttcgtccatc ttcttgacta tattttaaca ttgatcctgt tggtcaactc tgctaatcaa 540
aactttatcc tccttggttc ccagaacaat attatcttga atatctcatt tctctaatca 600
tataataatt gtgaggtgct tggcacaatg cctagtgcgt agtaagaact cagtaaaata 660
tcatctgcca tcgacaccat aaaaattaat ttacttactc aacaaatact tttgtatgaa 720
gtttgtgcta ggtaggccca gtaattggta cttggtatag agcaatgaaa agccctaccc 780
tcataaagct tatattcttg gaagcagaag ttggaagaca gacattgaca aataaaaatt 840
aaatacatga tgtgtcagat ggtcatacac acagtgtgaa gacaagagga aaacaagtga 900
gagagagagg gagtggagag agtgctgcca tgaaattgtg taatcaaaaa gtcttactga 960
aagtggcatt aagcaattct aaagactgag atgtggcata 1000
<210> 109
<211> 562
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 109
aggggactta aagaatgact ttaatgtctc tgatcttttt ttccttctaa gtaataacta 60
ccttgcagag ttattacttg aattggccat aaggtaaaga ggacaccaaa tacagtaaat 120
aataacataa taataaagaa accttatgaa ttctattcag tgatatccat attgaggtat 180
ttaaggtgaa tgatactgat gtcagcagtt tacctggata tgcatcaaaa atatgattga 240
ttgatggatg gatcggagga aggaaaagat atgtgatcaa aacgagtata gtaaaatgtt 300
catggtggaa tctagatata tagatatcac ttgtaatttt taaaaatgtt attgcatttt 360
tgaaatttgt tatgttaaaa tattgggtga aaattctgat ggccaagagt ttgagaccag 420
cctgggcaac atagtgagat accatttcta caaaacataa aaaaaaaaaa aaaaaggcca 480
gttttttgtc cccccctctt tgggaagggg aggcaaagga tttttttgaa ccaaggattt 540
catttcaggg ggccgggggc ta 562
<210> 110
<211> 540
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 110
tttaagatga cttatgtctc tgatcttttt ttccttctaa gtaataacta ccttgcagag 60
ttattacttg aattggccat aaggtaaaga ggacaccaaa tacagtaaat aataacataa 120
taataaagaa accttatgaa ttctattcag tgatatccat attgaggtat ttaaggtgaa 180
tgatactgat gtcagcagtt tacctggata tgcatcaaaa atatgattga ttgatggatg 240
gatcggagga aggaaaagat atgtgatcaa aacgagtata gtaaaatgtt catggtggaa 300
tctagatata tagatatcac ttgtaatttt taaaaatgtt attgcatttt tgaaatttgt 360
tatgttaaaa tattgggtga aaattctgat gccctggcca tgtcccaaat tctcactcca 420
cacacccaat gggaaaattt gtggagggca atatgactcg tcacttcatt tcccattata 480
tatgaatgga aattaacagc gcttatagac agtatctcct caaactaagc cttgtgggag 540
<210> 111
<211> 813
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 111
aggaatttta agatgactta atgtctctga tctttttttc cttctaagta ataactacct 60
tgcagagtta ttacttgaat tggccataag gtaaagagga caccaaatac agtaaataat 120
aacataataa taaagaaacc ttatgaattc tattcagtga tatccatatt gaggtattta 180
aggtgaatga tactgatgtc agcagtttac ctggatatgc atcaaaaata tgattgattg 240
atggatggat cggaggaagg aaaagatatg tgatcaaaac gagtatagta aaatgttcat 300
ggtggaatct agatatatag atatcacttg taatttttaa aaatgttatt gcatttttga 360
aatttgttat gttaaaatat tgggtgaaaa ttctgatgcc ctggccatgt cccaaatctc 420
cttgatggcc caagccactc tctcagtttt ttaaaaaatt gttttatcaa ggtctctgga 480
ttcttcatgg gaatgacttc cagtttatat tttttggctt ggttccaaaa agctatcagc 540
taaggaatgc atatacttac ttcccctatg ggtaaagtaa atgagaattt tagaagccaa 600
ctcacatttt tagcctgtac agaatctgca attcaccaag ctacttctga ctcatgtcta 660
taaagttctt ccctgttctt ttctcacttc acatgtactc tttgcaagaa ttcatccact 720
tgtgtagttt cagtctgttg atgactaccc aatctataaa ttccagcaga gaatgatctt 780
ttgagtttta gacatgtaga tacactgctg ctc 813
<210> 112
<211> 939
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 112
ggggttaaat taagatgact tatgtctctg atcttttttt ccttctaagt aataactacc 60
ttgcagagtt attacttgaa ttggccataa ggtaaagagg acaccaaata cagtaaataa 120
taacataata ataaagaaac cttatgaatt ctattcagtg atatccatat tgaggtattt 180
aaggtgaatg atactgatgt cagcagttta cctggatatg catcaaaaat atgattgatt 240
gatggatgga tcggaggaag gaaaagatat gtgatcaaaa cgagtatagt aaaatgttca 300
tggtggaatc tagatatata gatatcactt gtaattttta aaaatgttat tgcatttttg 360
aaatttgtta tgttaaaata ttgggtgaaa attctgatgc cctggccatg tcccaaatag 420
tctcacttcc ccagcaccac cactttatga aaacaaggac ttactaagat catcagtgac 480
tttgtaatag ctaattagtg tattttaatt cgtccatctt cttgactata ttttaacatt 540
gatcctgttg gtcaactctg ctaatcaaaa ctttatcctc cttggttccc agaacaatat 600
tatcttgaat atctcatttc tctaatcata taataattgt gaggtgcttg gcacaatgcc 660
tagtgcgtag taagaactca gtaaaatatc atctgccatc gacaccataa aaattaattt 720
acttactcaa caaatacttt tgtatgaagt ttgtgctagg taggcccagt aattggtact 780
tggtatagag caatgaaaag ccctaccctc ataaagctta tattcttgga agcagaagtt 840
ggaagacaga cattgacaaa taaaaattaa atacatgatg tgtcagatgg tcatacacac 900
agtgtgggaa gacaaagagg aaaacaagtg gagagagag 939
<210> 113
<211> 928
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 113
tggggttcta taaaagaaga cttaatgtct ctgatctttt tttccttcta agtaataact 60
accttgcaga gttattactt gaattggcca taaggtaaag aggacaccaa atacagtaaa 120
taataacata ataataaaga aaccttatga attctattca gtgatatcca tattgaggta 180
tttaaggtga atgatactga tgtcagcagt ttacctggat atgcatcaaa aatatgattg 240
attgatggat ggatcggagg aaggaaaaga tatgtgatca aaacgagtat agtaaaatgt 300
tcatggtgga atctagatat atagatatca cttgtaattt ttaaaaatgt tattgcattt 360
ttgaaatttg ttatgttaaa atattgggtg aaaattctga tgccctggcc atgtcccaaa 420
ttcacttccc cagcaccacc actttatgaa aacaaggact tactaagatc atcagtgact 480
ttgtaatagc taattagtgt attttaattc gtccatcttc ttgactatat tttaacattg 540
atcctgttgg tcaactctgc taatcaaaac tttatcctcc ttggttccca gaacaatatt 600
atcttgaata tctcatttct ctaatcatat aataattgtg aggtgcttgg cacaatgcct 660
agtgcgtagt aagaactcag taaaatatca tctgccatcg acaccataaa aattaattta 720
cttactcaac aaatactttt gtatgaagtt tgtgctaggt aggcccagta attggtactt 780
ggtatagagc aatgaaaagc cctaccctca taaagcttat attcttggaa gcagaagttg 840
gaagacagac attgacaaat aaaaattaaa tacatgatgt gtcagatggt catacacaca 900
gtgtgggaag aacaaaggag gaaaacaa 928
<210> 114
<211> 522
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 114
aggggttcca ttaggatgac tttaattgtc tctgaatctt tttttccttc taagtaaata 60
actaccttgc agagttatta cttgaattgg ccataaggta aagaggacac caaatacagt 120
aaataataac ataataataa agaaacctta tgaattctat tcagtgatat ccatattgag 180
gtatttaagg tgaatgatac tgatgtcagc agtttacctg gatatgcatc aaaaatatga 240
ttgattgatg gatggatcgg aggaaggaaa agatatgtga tcaaaacgag tatagtaaaa 300
tgttcatggt ggaatctaga tatatagata tcacttgtaa tttttaaaaa tgttattgca 360
tttttgaaat ttgttatgtt aaaatattgg gtgaaaattc tgatgccctg gccatgtccc 420
aaatgccaag agtttgagac cagcctgggc aacatagtga gataccattt ctacaaaaca 480
taaaaaaaaa aaaaaaaagc caattttttt gtccccggct ac 522
<210> 115
<211> 422
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 115
gcggtgactc gttcatgcac tggttgaaat atgctcccca ccccagtaac atcagcatca 60
gacctctgca accagaaaga ttccataggt aatgaaatcc aaatgctggc atttggaagt 120
caaaccagtg tattttgaaa tggaaaggca aggggaagtg catggagcaa gtacagcatg 180
tgctacaact tcagttcata ccctccttaa aatactgtgc aactaaactg tcaattgccc 240
attgatagag atagtatctt tttcagcttt acaccttccg aattcaacac tctcactcca 300
cacacccaat gggaaaattt gtggagggca atatgactcg tcacttcatt tcccattata 360
tatgaatgga aattaacagc gcttatagac agtatctcct caaactaaga cttgagaaaa 420
aa 422
<210> 116
<211> 690
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 116
ccgtgaatcg tcatgcactg gttgaaaata tgctccccac cccagtaaca tcagcatcag 60
acctctgcaa ccagaaagat tccataggta atgaaatcca aatgctggca tttggaagtc 120
aaaccagtgt attttgaaat ggaaaggcaa ggggaagtgc atggagcaag tacagcatgt 180
gctacaactt cagttcatac cctccttaaa atactgtgca actaaactgt caattgccca 240
ttgatagaga tagtatcttt ttcagcttta caccttccga attcaacacc tccttgatgg 300
cccaagccac tctctcagtt ttttaaaaaa ttgttttatc aaggtctctg gattcttcat 360
gggaatgact tccagtttat attttttggc ttggttccaa aaagctatca gctaaggaat 420
gcatatactt acttccccta tgggtaaagt aaatgagaat tttagaagcc aactcacatt 480
tttagcctgt acagaatctg caattcacca agctacttct gactcatgtc tataaagttc 540
ttccctgttc ttttctcact tcacatgtac tctttgcaag aattcatcca cttgtgtagt 600
ttcagtctgt tgatgactac ccatctataa ttccagcaga gaatgatctt ttgagtttta 660
gacatgtaga tcacagcaga gctgaaatgg 690
<210> 117
<211> 994
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 117
gcgttacttc atcatgcact ggttgaaata tgctccccac cccagtaaca tcagcatcag 60
acctctgcaa ccagaaagat tccataggta atgaaatcca aatgctggca tttggaagtc 120
aaaccagtgt attttgaaat ggaaaggcaa ggggaagtgc atggagcaag tacagcatgt 180
gctacaactt cagttcatac cctccttaaa atactgtgca actaaactgt caattgccca 240
ttgatagaga tagtatcttt ttcagcttta caccttccga attcaacaca gtctcacttc 300
cccagcacca ccactttatg aaaacaagga cttactaaga tcatcagtga ctttgtaata 360
gctaattagt gtattttaat tcgtccatct tcttgactat attttaacat tgatcctgtt 420
ggtcaactct gctaatcaaa actttatcct ccttggttcc cagaacaata ttatcttgaa 480
tatctcattt ctctaatcat ataataattg tgaggtgctt ggcacaatgc ctagtgcgta 540
gtaagaactc agtaaaatat catctgccat cgacaccata aaaattaatt tacttactca 600
acaaatactt ttgtatgaag tttgtgctag gtaggcccag taattggtac ttggtataga 660
gcaatgaaaa gccctaccct cataaagctt atattcttgg aagcagaagt tggaagacag 720
acattgacaa ataaaaatta aatacatgat gtgtcagatg gtcatacaca cagtgtggaa 780
gaacaaagag gaaaacaagt ggagagagag agggaggtgg aagaggagtg ctgccatgaa 840
aatgtggtaa tcaaaaaagg tcttactgaa aaaggtggca tttaagcaaa ttctaaaaga 900
cctgaggatg tgggcctatg tatattgggg ggggaaaagt aatccaggag agtcctaaat 960
aattaaaatg cccaagcagg aattttcttg gcat 994
<210> 118
<211> 889
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 118
cgggtgaaat tcttcatgca ctggttgaaa atatgctccc caccccagta acatcagcat 60
cagacctctg caaccagaaa gattccatag gtaatgaaat ccaaatgctg gcatttggaa 120
gtcaaaccag tgtattttga aatggaaagg caaggggaag tgcatggagc aagtacagca 180
tgtgctacaa cttcagttca taccctcctt aaaatactgt gcaactaaac tgtcaattgc 240
ccattgatag agatagtatc tttttcagct ttacaccttc cgaattcaac actcacttcc 300
ccagcaccac cactttatga aaacaaggac ttactaagat catcagtgac tttgtaatag 360
ctaattagtg tattttaatt cgtccatctt cttgactata ttttaacatt gatcctgttg 420
gtcaactctg ctaatcaaaa ctttatcctc cttggttccc agaacaatat tatcttgaat 480
atctcatttc tctaatcata taataattgt gaggtgcttg gcacaatgcc tagtgcgtag 540
taagaactca gtaaaatatc atctgccatc gacaccataa aaattaattt acttactcaa 600
caaatacttt tgtatgaagt ttgtgctagg taggcccagt aattggtact tggtatagag 660
caatgaaaag ccctaccctc ataaagctta tattcttgga agcagaagtt ggaagacaga 720
cattgacaaa taaaaattaa atacatgatg tgtcagatgg tcatacacac agtgtggaag 780
aacaaagagg aaaacaagtg gagagagaga gggaggtgga aagaggagtg ctgccatgaa 840
aatgttggta atcaaaaaag gtcttactga agaggtggct atttaagca 889
<210> 119
<211> 730
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 119
gcgtggatct tcatgcactg gttgaaaata tgctccccac cccagtaaca tcagcatcag 60
acctctgcaa ccagaaagat tccataggta atgaaatcca aatgctggca tttggaagtc 120
aaaccagtgt attttgaaat ggaaaggcaa ggggaagtgc atggagcaag tacagcatgt 180
gctacaactt cagttcatac cctccttaaa atactgtgca actaaactgt caattgccca 240
ttgatagaga tagtatcttt ttcagcttta caccttccga attcaacacg ccaagagttt 300
gagaccagcc tgggcaacat agtgagatac catttctaca aaacataaaa aaaaaaaaaa 360
aaaagccaat tttttttccc cccctcttgg gaaacttggg gaaaaagatt tttttgaccc 420
agggatttct tttcaggggg ggggggggct taaaaaagcc cagggtcccc cccccggggg 480
gacgtaggga aaccccctcc ttaaaattta attaaatttt aagggtaaaa gggcccccaa 540
accccccgtt cacccccccc attttttaaa accccatttt aaatcctcct taggaaaatt 600
acccttgttg ctctttttag ggggggaagg gtttgggtat gtttaaaaat taatccgttt 660
aacaactctt tttggacctt aggaattaaa aaatgttcct tttggctctt ggggaaaaaa 720
aaaaataaat 730
<210> 120
<211> 622
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 120
gcggggcaag tttatgaatg tagtagtttt atgccaagaa catttccctc gtgcacctgt 60
gttttaataa gatagaatat aaaatagcaa aaggggcccg acttttgtga tgatatttac 120
tcataaggta gtaagtcaga tgtgatgaca ttttctttga cttagagctg ctatacttgg 180
gtcagatttc agttcagtaa atttgcagtg aagttgtctt tctaacatgg tgtcatcctg 240
gaactgccct gctcccacag ttacatacag gctagggagt gggtaggagt gggggtgaaa 300
tcctcttaat gtttatggtg tcagtagatt caaactaaaa ttagccttac agccatactc 360
ctaataaggg gcccctggca tatttaattg atttaacaaa tttatcaaaa atagataaac 420
tgaaatctgc cttgaaatta attactgtat ctctattttt ataagaaaat attttggacc 480
cgttcctctc actccacaca cccaatggga aaatttgtgg agggcaatat gactcgtcac 540
ttcatttccc attatatatg aatggaaatt aacagcgctt atagacagta tctcctcaaa 600
ctaagccctt tggtgggggt gg 622
<210> 121
<211> 893
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 121
ggcgggggga aaaattatga tgtagtagtt ttatgccaag aacatttccc tcgtgcacct 60
gtgttttaat aagatagaat ataaaatagc aaaaggggcc cgacttttgt gatgatattt 120
actcataagg tagtaagtca gatgtgatga cattttcttt gacttagagc tgctatactt 180
gggtcagatt tcagttcagt aaatttgcag tgaagttgtc tttctaacat ggtgtcatcc 240
tggaactgcc ctgctcccac agttacatac aggctaggga gtgggtagga gtgggggtga 300
aatcctctta atgtttatgg tgtcagtaga ttcaaactaa aattagcctt acagccatac 360
tcctaataag gggcccctgg catatttaat tgatttaaca aatttatcaa aaatagataa 420
actgaaatct gccttgaaat taattactgt atctctattt ttataagaaa atattttgga 480
cccgttccct ccttgatggc ccaagccact ctctcagttt tttaaaaaat tgttttatca 540
aggtctctgg attcttcatg ggaatgactt ccagtttata ttttttggct tggttccaaa 600
aagctatcag ctaaggaatg catatactta cttcccctat gggtaaagta aatgagaatt 660
ttagaagcca actcacattt ttagcctgta cagaatctgc aattcaccaa gctacttctg 720
actcatgtct ataaagttct tccctgttct tttctcactt cacatgtact ctttgcaaga 780
attcatccac ttgtgtagtt tcagtctgtt gatgactacc catctataat tccagcagag 840
aatgatcttt tgagttttag acatgtagac cctgccagtg aaagaaaaaa agg 893
<210> 122
<211> 1323
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 122
caggtttaga catgtgcctt ccggtgtggg aaagaaaaaa tttaatgaat gtagtagttt 60
tatgccaaga acatttccct cgtgcacctg tgttttaata agatagaata taaaatagca 120
aaaggggccc gacttttgtg atgatattta ctcataaggt agtaagtcag atgtgatgac 180
attttctttg acttagagct gctatacttg ggtcagattt cagttcagta aatttgcagt 240
gaagttgtct ttctaacatg gtgtcatcct ggaactgccc tgctcccaca gttacataca 300
ggctagggag tgggtaggag tgggggtgaa atcctcttaa tgtttatggt gtcagtagat 360
tcaaactaaa attagcctta cagccatact cctaataagg ggcccctggc atatttaatt 420
gatttaacaa atttatcaaa aatagataaa ctgaaatctg ccttgaaatt aattactgta 480
tctctatttt tataagaaaa tattttggac ccgttccagt ctcacttccc cagcaccacc 540
actttatgaa aacaaggact tactaagatc atcagtgact ttgtaatagc taattagtgt 600
attttaattc gtccatcttc ttgactatat tttaacattg atcctgttgg tcaactctgc 660
taatcaaaac tttatcctcc ttggttccca gaacaatatt atcttgaata tctcatttct 720
ctaatcatat aataattgtg aggtgcttgg cacaatgcct agtgcgtagt aagaactcag 780
taaaatatca tctgccatcg acaccataaa aattaattta cttactcaac aaatactttt 840
gtatgaagtt tgtgctaggt aggcccagta attggtactt ggtatagagc aatgaaaagc 900
cctaccctca taaagcttat attcttggaa gcagaagttg gaagacagac attgacaaat 960
aaaaattaaa tacatgatgt gtcagatggt catacacaca gtgtggaaga acaaagagga 1020
aaacaagtgg agagagagag ggaggtggaa gaggagtgct gccatgaaaa tgtggtaatc 1080
aaaaaaggtc ttactgaaaa ggtggcattt aagcaaattc taaaagacct gaggatgtgg 1140
gccatatgta taattggggg ggaaaaagta gtccaggaga gtcctaataa gttaaaatgc 1200
cccaaagcag gaatattctt ggcatgttga aggaacctta aaagggagat cagttaggca 1260
gaaaaggatc aagcgagcag gaaggtagtt gacaataaat ttagaggggt aactggcatc 1320
tga 1323
<210> 123
<211> 964
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 123
cgcgggtgga aatttatgat gtagtagttt tatgccaaga acatttccct cgtgcacctg 60
tgttttaata agatagaata taaaatagca aaaggggccc gacttttgtg atgatattta 120
ctcataaggt agtaagtcag atgtgatgac attttctttg acttagagct gctatacttg 180
ggtcagattt cagttcagta aatttgcagt gaagttgtct ttctaacatg gtgtcatcct 240
ggaactgccc tgctcccaca gttacataca ggctagggag tgggtaggag tgggggtgaa 300
atcctcttaa tgtttatggt gtcagtagat tcaaactaaa attagcctta cagccatact 360
cctaataagg ggcccctggc atatttaatt gatttaacaa atttatcaaa aatagataaa 420
ctgaaatctg ccttgaaatt aattactgta tctctatttt tataagaaaa tattttggac 480
ccgttcctca cttccccagc accaccactt tatgaaaaca aggacttact aagatcatca 540
gtgactttgt aatagctaat tagtgtattt taattcgtcc atcttcttga ctatatttta 600
acattgatcc tgttggtcaa ctctgctaat caaaacttta tcctccttgg ttcccagaac 660
aatattatct tgaatatctc atttctctaa tcatataata attgtgaggt gcttggcaca 720
atgcctagtg cgtagtaaga actcagtaaa atatcatctg ccatcgacac cataaaaatt 780
aatttactta ctcaacaaat acttttgtat gaagtttgtg ctaggtaggc ccagtaattg 840
gtacttggta tagagcaatg aaaagcccta ccctcataaa gcttatattc ttggaagcag 900
aagttggaag acagacattg acaaataaaa atttaaatac atgatgtgtc agatggtcat 960
acac 964
<210> 124
<211> 900
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 124
cgcgggtgga aattatgatg tagtagtttt atgccaagaa catttccctc gtgcacctgt 60
gttttaataa gatagaatat aaaatagcaa aaggggcccg acttttgtga tgatatttac 120
tcataaggta gtaagtcaga tgtgatgaca ttttctttga cttagagctg ctatacttgg 180
gtcagatttc agttcagtaa atttgcagtg aagttgtctt tctaacatgg tgtcatcctg 240
gaactgccct gctcccacag ttacatacag gctagggagt gggtaggagt gggggtgaaa 300
tcctcttaat gtttatggtg tcagtagatt caaactaaaa ttagccttac agccatactc 360
ctaataaggg gcccctggca tatttaattg atttaacaaa tttatcaaaa atagataaac 420
tgaaatctgc cttgaaatta attactgtat ctctattttt ataagaaaat attttggacc 480
cgttccgcca agagtttgag accagcctgg gcaacatagt gagataccat ttctacaaaa 540
cataaaaaaa aaaaaaaaaa acccagtttg tgactccccc ccatttggaa attggaggaa 600
aaagattttt ttgaaccaag aatttctttt aagggggggg ggggcctata atatggccgg 660
gtaatcccgc cggggggaaa ggagggaaac ccccccctta aaattaaatt aaatttaaaa 720
gctaaaaata acccaaaacc cccgttaccc cccccaattt ttaaaaccca ttttaaattt 780
ccccttgtcg aaagggcctt gtatcccttt ttaggaataa aagattgggt ggttaaaaaa 840
taatccatta ccaatccctt gggacctagc aaattaaaat ggctcttcgc cccctcagaa 900
<210> 125
<211> 417
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 125
agcattctgc tgtgagaaca gcaggaggcc ctcaccagac accaaatgcc agagccttta 60
tcttggactt cccagcctcc agaactgtga gtgaatacat tggtattatt tgtaaattac 120
ccagtctcag gcattttgtt ataacagcac aaacagacta agacaatcat acagtgagaa 180
attaatcaac aactaataag caaagaggta gattaatctt gaaactatga tatagagtgt 240
tccatttggc tgctggaagt tttatttctt ggtctgggtg atggtctctc actccacaca 300
cccaatggga aaatttgtgg agggcaatat gactcgtcac ttcatttccc attatatatg 360
aatggaaatt aacagcgctt atagacagta tctcctcaaa ctaaagccat gagaaaa 417
<210> 126
<211> 685
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 126
ccatctgcat gtgagaacag caggaaggcc ctcaccagac accaaatgcc agagccttta 60
tcttggactt cccagcctcc agaactgtga gtgaatacat tggtattatt tgtaaattac 120
ccagtctcag gcattttgtt ataacagcac aaacagacta agacaatcat acagtgagaa 180
attaatcaac aactaataag caaagaggta gattaatctt gaaactatga tatagagtgt 240
tccatttggc tgctggaagt tttatttctt ggtctgggtg atggtcctcc ttgatggccc 300
aagccactct ctcagttttt taaaaaattg ttttatcaag gtctctggat tcttcatggg 360
aatgacttcc agtttatatt ttttggcttg gttccaaaaa gctatcagct aaggaatgca 420
tatacttact tcccctatgg gtaaagtaaa tgagaatttt agaagccaac tcacattttt 480
agcctgtaca gaatctgcaa ttcaccaagc tacttctgac tcatgtctat aaagttcttc 540
cctgttcttt tctcacttca catgtactct ttgcaagaat tcatccactt gtgtagtttc 600
agtctgttga tgactaccca tctataattc cagcagagaa tgatcttttg agttttagac 660
atgtagaaca agctgcctga aaaaa 685
<210> 127
<211> 979
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 127
cacatttctg cctgtgagat acagcaggag gccctcacca gacaccaaat gccagagcct 60
ttatcttgga cttcccagcc tccagaactg tgagtgaata cattggtatt atttgtaaat 120
tacccagtct caggcatttt gttataacag cacaaacaga ctaagacaat catacagtga 180
gaaattaatc aacaactaat aagcaaagag gtagattaat cttgaaacta tgatatagag 240
tgttccattt ggctgctgga agttttattt cttggtctgg gtgatggtca gtctcacttc 300
cccagcacca ccactttatg aaaacaagga cttactaaga tcatcagtga ctttgtaata 360
gctaattagt gtattttaat tcgtccatct tcttgactat attttaacat tgatcctgtt 420
ggtcaactct gctaatcaaa actttatcct ccttggttcc cagaacaata ttatcttgaa 480
tatctcattt ctctaatcat ataataattg tgaggtgctt ggcacaatgc ctagtgcgta 540
gtaagaactc agtaaaatat catctgccat cgacaccata aaaattaatt tacttactca 600
acaaatactt ttgtatgaag tttgtgctag gtaggcccag taattggtac ttggtataga 660
gcaatgaaaa gccctaccct cataaagctt atattcttgg aagcagaagt tggaagacag 720
acattgacaa ataaaaatta aatacatgat gtgtcagatg gtcatacaca cagtgtggaa 780
gaacaaagag gaaaacaagt ggagagagag agggaggtgg aagaggagtg ctgccatgaa 840
aatgtggtaa tcaaaaaagg tcttactgaa aaggtggcat ttaagcaatt ctaaagacct 900
gaggatgtgg gccatatgta taattggggg ggaaaagtag tccaggagag tcctaataag 960
ttaaaatgcc ccaaagcag 979
<210> 128
<211> 989
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 128
accttctgcg tgtgagatac agcaggaagg ccctcaccag acaccaaatg ccagagcctt 60
tatcttggac ttcccagcct ccagaactgt gagtgaatac attggtatta tttgtaaatt 120
acccagtctc aggcattttg ttataacagc acaaacagac taagacaatc atacagtgag 180
aaattaatca acaactaata agcaaagagg tagattaatc ttgaaactat gatatagagt 240
gttccatttg gctgctggaa gttttatttc ttggtctggg tgatggtctc acttccccag 300
caccaccact ttatgaaaac aaggacttac taagatcatc agtgactttg taatagctaa 360
ttagtgtatt ttaattcgtc catcttcttg actatatttt aacattgatc ctgttggtca 420
actctgctaa tcaaaacttt atcctccttg gttcccagaa caatattatc ttgaatatct 480
catttctcta atcatataat aattgtgagg tgcttggcac aatgcctagt gcgtagtaag 540
aactcagtaa aatatcatct gccatcgaca ccataaaaat taatttactt actcaacaaa 600
tacttttgta tgaagtttgt gctaggtagg cccagtaatt ggtacttggt atagagcaat 660
gaaaagccct accctcataa agcttatatt cttggaagca gaagttggaa gacagacatt 720
gacaaataaa aattaaatac atgatgtgtc agatggtcat acacacagtg tggaagaaca 780
aagaggaaaa caagtggaga gagagaggga ggtggaagag gagtgctgcc atgaaaatgt 840
ggtaatcaaa aaaggtctta ctgaaaaggt ggcatttaag caaattctaa agacctgagg 900
atgtgggcca tatgtataat tgggggggaa aagtagtcca ggagagtcct aataagttaa 960
aatgccccaa agcaggaata ttcttggca 989
<210> 129
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 129
gccgtttgcc gggtgagata cagcaggatg gccctcacca gacaccgaat gccagagcct 60
ttatcttgga cttcccagcc tccagaactg tgagtgaata cattggtatt atttgtaaat 120
tacccagtct caggcatttt gttataacag cacaaacaga ctaagacaat catacagtga 180
gaaattaatc aacaactaat aagcaaagag gtagattaat cttgaaacta tgatatagag 240
tgttccattt ggctgctgga agttttattt cttggtctgg gtgatggtcg ccaagagttt 300
gagaccagcc tgggcaacat aatgagatac catttctaca aaacataaaa aaaaaaaaaa 360
aaacgccgtt tttttttccc ccccttttgg gaaaccttga ggaaagattt ttttggaccc 420
aaaaagttct gttacgggtc cgggggattt ttttaatttc ccttttcctc ccagtggggg 480
gagaatggga aaacccctct cataaaaaaa aataaattta aaaccaaaaa aggcccccca 540
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gttgtggggg ggccctattt agggagggaa gatatttgga agttaaaaaa tcccttccct 660
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<210> 130
<211> 661
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 130
gggagttaat attgttatgc tgcagggtta ttgtaggtgt caatgaaatg atgtgtctgg 60
cactataaaa gcacagagcc cggtgcctgg ctattagtaa ctgtttaata aatgttaatt 120
cctttctctg cccaggacat cagtaggcag atgtagcaat ttaaaacttc tagtgttact 180
ttaaattcct gaatgaaggt agaggactga aaagatatca tggtattcaa aagtatgatc 240
cattgcttct taagaataga gttcagaaaa gcttgacaga ttcctgtact ctgaggcagc 300
accatagccg gtaatctgta ggatggctat tggttttgtg ctcacaaatg cttgcttggg 360
caggccccag gaaatctggt agactgtaag cccagtaaga tttcaaatct tactttacgg 420
cagtgttttt caccttgact gtacattgaa atcacctgga tgctttgaaa aataacagcg 480
tcagtgtcca acctccagaa atactgatta agttggtctg gaatggagtc tcactccaca 540
cacccaatgg gaaaatttgt ggagggcaat atgactcgtc acttcatttc ccattatata 600
tgaatggaaa ttaacagcgc ttatagacag tatctcctca aactaagcct ttgtgaaaga 660
a 661

Claims (9)

1.一种用于治疗杜氏肌营养不良症的gRNA，其特征在于，所述gRNA由靶序列如SEQ IDNO:22所示的gRNA和靶序列如SEQ ID NO:59所示的gRNA组成。
2.一种用于治疗杜氏肌营养不良症的表达载体，其特征在于，所述表达载体表达如权利要求1所述的gRNA。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其中，所述表达载体的基础载体为AAV载体。
4.一种用于治疗杜氏肌营养不良症的CRISPR-Cas9系统，其特征在于，所述系统包括如权利要求1所述的gRNA和Cas9蛋白。
5.根据权利要求4所述的CRISPR-Cas9系统，其特征在于，所述Cas9蛋白为SaCas9蛋白。
6.一种用于治疗杜氏肌营养不良症的表达载体，其特征在于，所述表达载体表达Cas9蛋白和如权利要求1所述的gRNA。
7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述C as9蛋白为SaCas9蛋白，所述表达载体的基础载体为AAV载体。
8.如权利要求1所述的gRNA或者如权利要求2或3所述的表达载体在制备用于预防或治疗杜氏肌营养不良症的药物中的用途。
9.如权利要求4或5所述的CRISPR-Cas9系统、或者如权利要求6或7所述的表达载体在制备用于预防或治疗杜氏肌营养不良症的药物中的用途。
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