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CN110129255B - 细胞培养基、试剂盒及细胞培养方法 - Google Patents

细胞培养基、试剂盒及细胞培养方法 Download PDF

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CN110129255B CN201910437121.5A CN201910437121A CN110129255B CN 110129255 B CN110129255 B CN 110129255B CN 201910437121 A CN201910437121 A CN 201910437121A CN 110129255 B CN110129255 B CN 110129255B
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Abstract

本发明提供了一种细胞培养基，所述细胞培养基由基础培养基、营养源、通路抑制成分、抗氧化成分、糖皮质激素、激活成分和促分化成分组成。所述基础培养基为DMEM/12，所述通路抑制成分中的转化生长因子‑β信号抑制剂和γ‑分泌酶抑制剂用于促进肝向分化，再配合所述糖皮质激素、由腺苷酸环化酶激活剂组成的所述激活成分以及由FH1(BRD‑K4477)、FPH1(BRD‑6125)或FPH2(BRD‑9424)组成的促分化成分，共同取代现有技术中的二甲基亚砜来进一步促进肝前体细胞的成熟分化，避免了由于二甲基亚砜的毒性容易引起细胞凋亡的问题，且有利于缩短细胞成熟的时间。本发明还提供了包括所述细胞培养基的试剂盒，以及应用所述试剂盒进行的细胞培养方法。

Description

细胞培养基、试剂盒及细胞培养方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及细胞培养基、试剂盒及细胞培养方法。
背景技术
传统临床上治疗肝癌或肝硬化等恶性肝脏病变的主要手段是肝移植，但是由于肝供体缺乏、手术风险大、费用高以及容易发生免疫排斥等负面因素制约了肝移植手术技术的发展。近年来，以肝细胞移植以及生物人工肝为代表的肝细胞替代治疗，成为终末期肝病治疗研究的热点。
肝前体细胞(Hepatic Progenitor Cells，HPCs)是一类具有自我更新且增殖能力较强，并具有多向分化潜能的干细胞群，其表型特征接近肝细胞，能够直接参与肝脏的生长和发育，是肝细胞移植、细胞再生、研究病毒性肝炎发病机理以及抗病毒药物筛选研究方面的理想细胞来源。其中的人肝癌细胞系(HepaRG)是高度增殖的祖细胞系，具有同时分化成胆管细胞样细胞和肝细胞样细胞的潜力。而原代肝细胞来源的肝前体样细胞(Hepatocyte-derived liver progenitor-like cells，HepLPCs)在体外极易实现肝向分化，转变回功能性肝细胞。
现有技术中，例如2002年发表在Proceedings of the National Academy ofSciences ofthe United States ofAmerica(美国科学院院报)第99卷的“Infection of ahuman hepatoma cell line by hepatitis B virus”，采用含有较高浓度二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)的培养基来诱导HepaRG的分化。然而，DMSO具有一定的毒性，容易引起细胞的凋亡，且分化时间至少长达28天，限制了肝前体细胞分化成熟技术的应用推广。
因此，有必要开发一种新型的细胞培养基以避免现有技术中存在的上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种细胞培养基，具有所述细胞培养基的试剂盒以及利用所述试剂盒进行的细胞培养方法，以促进不同类型肝前体细胞的分化和成熟，避免现有技术中由于使用DMSO诱导细胞分化而容易产生细胞凋亡的问题，同时缩短细胞分化成熟的时间，以利于肝前体细胞分化成熟技术的应用推广。
为实现上述目的，本发明的所述细胞培养基，由基础培养基、营养源、通路抑制成分、抗氧化成分、糖皮质激素、激活成分和促分化成分组成；所述基础培养基为DMEM/12培养基，所述营养源包括无血清细胞培养添加剂，所述通路抑制成分由转化生长因子-β信号抑制剂和γ-分泌酶抑制剂组成，所述激活成分为腺苷酸环化酶激活剂，以用于激活蛋白激酶A，所述抗氧化成分包括氮乙酰半胱氨酸，所述促分化成分为FH1(BRD-K4477)、FPH1(BRD-6125)或FPH2(BRD-9424)；所述营养源的体积占所述基础培养基体积的1％-2％；每1000克所述基础组合培养基中，所述通路抑制成分的质量为7×10-4克-3×10-2克，所述抗氧化成分的质量为3.5×10-4克-1.1克，所述糖皮质激素的质量为2.3×10-3克-5.8×10-2克，所述激活成分的质量为8.2×10-4克-2.1×10-2克，所述促分化成分的质量为1.1×10-3克-0.15克。
本发明所述细胞培养基的有益效果在于：所述细胞培养基中的所述无血清细胞培养添加剂提高了所述细胞培养基对不同类型的肝前体细胞的普适性；由所述转化生长因子-β信号抑制剂和所述γ-分泌酶抑制剂来阻断缺刻(Notch)信号的传递通路以及转化生长因子-β(TGF-β)信号的传递通路，以促进肝向分化，再配合所述糖皮质激素、所述腺苷酸环化酶激活剂以及由FH1(BRD-K4477)、FPH1(BRD-6125)或FPH2(BRD-9424)组成的所述促分化成分，共同取代现有技术中的二甲基亚砜来进一步促进肝前体细胞的成熟分化，避免了由于二甲基亚砜的毒性容易引起细胞凋亡的问题，且通过调节所述细胞培养基中各成分的配比，有利于在后续的细胞培养过程中，缩短细胞成熟的时间。
优选的，所述无血清细胞培养添加剂为N2添加剂或胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂。其有益效果在于：有利于神经元细胞的体外培养。
进一步优选的，所述胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂占所述无血清细胞培养添加剂的体积百分比为25％-50％。
进一步优选的，所述N2添加剂占所述无血清细胞培养添加剂的体积百分比为25％-50％。
优选的，所述营养源还具有B27添加剂，所述B27添加剂占所述无血清细胞培养添加剂的体积百分比不大于100％。
进一步优选的，所述B27添加剂占所述无血清细胞培养添加剂的体积百分比为50％-75％。
优选的，所述转化生长因子-β信号抑制剂与所述γ-分泌酶抑制剂的质量比为3:1-5:1。其有益效果在于：有利于进一步促进肝向分化，提高得到的肝细胞样细胞的功能。
进一步优选的，所述转化生长因子-β信号抑制剂为SB431542或A83-01，所述γ-分泌酶抑制剂为DATP、YO-01027、Compound E或LY-411575。
优选的，所述腺苷酸环化酶激活剂为佛司可林或环磷酸腺苷，所述糖皮质激素为地塞米松或氢化可的松，所述抗氧化成分还具有L-抗坏血酸、维生素E、类胡萝卜素或抗氧化酶。
本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括增殖培养基以及所述细胞培养基，所述增殖培养基为William's E培养基或TEM培养基。
本发明的所述试剂盒的有益效果在于：所述试剂盒中具有的所述细胞培养基，由于所述细胞培养基不具有DMSO，所述无血清细胞培养添加剂提高了所述细胞培养基对不同类型的肝前体细胞的普适性；由所述转化生长因子-β信号抑制剂和所述γ-分泌酶抑制剂来阻断缺刻(Notch)信号的传递通路以及转化生长因子-β(TGF-β)信号的传递通路以促进肝向分化，配合所述糖皮质激素、所述腺苷酸环化酶激活剂以及由FH1(BRD-K4477)、FPH1(BRD-6125)或FPH2(BRD-9424)组成的所述促分化成分，共同取代现有技术中的二甲基亚砜来进一步促进肝前体细胞的成熟分化，一方面避免了由于二甲基亚砜的毒性容易引起细胞凋亡的问题，另一方面通过调节所述细胞培养基中各成分的配比，有利于所述试剂盒应用于细胞过程中，缩短细胞成熟的时间。
优选的，所述试剂盒还具有包被液，所述包被液由DMEM/12培养基和细胞外基质组成。其有益效果在于：有利于后续细胞培养过程中促进细胞的贴壁效果。
本发明还提供了利用所述试剂盒进行的细胞培养方法，包括：
S1：将所述增殖培养基以及待培养细胞悬液以2:1-4:1的体积比混合，在150倍–200倍的重力加速度下离心5-10分钟，去除上清液以得到待培养细胞沉淀液，用所述增值培养基对所述待培养细胞沉淀液进行重悬处理后得到待培养细胞重悬液；
S2：将所述待培养细胞重悬液加入到所述培养位中，以使所述培养位的每平方厘米的培养面积上具有1×105-2×106个待培养细胞，对所述待培养细胞进行扩增处理，以得到扩增细胞；
S3：向所述扩增细胞中加入所述细胞培养基以启动分化培养，每24小时-72小时用新的所述细胞培养基进行置换处理以促进分化过程，所述分化培养的时间为6-14天。
本发明所述细胞培养方法的有益效果在于：由于所述试剂盒中具有不含DMSO的所述细胞培养基，所述无血清细胞培养添加剂提高了所述细胞培养基对不同类型的肝前体细胞的普适性；由所述转化生长因子-β信号抑制剂和所述γ-分泌酶抑制剂来阻断缺刻(Notch)信号的传递通路以及转化生长因子-β(TGF-β)信号的传递通路以促进肝向分化，配合所述糖皮质激素、所述腺苷酸环化酶激活剂以及由FH1(BRD-K4477)、FPH1(BRD-6125)或FPH2(BRD-9424)组成的所述促分化成分，共同取代现有技术中的二甲基亚砜来进一步促进肝前体细胞的成熟分化，一方面避免了由于二甲基亚砜的毒性容易引起细胞凋亡的问题，另一方面通过调节所述细胞培养基中各成分的配比，有利于所述试剂盒应用于细胞过程中，缩短细胞成熟的时间。
优选的，还包括步骤S0，所述步骤S0中，将所述包被液加入到培养位中，在37℃下静置30-120分钟后，执行所述步骤S1。其有益效果在于：有利于后续细胞培养过程中促进细胞的贴壁效果。
进一步优选的，所述培养位为多孔细胞培养板的每个培养孔，当所述多孔细胞培养板的孔数分别为6、12、24、48和96，对应的每个所述培养孔中的所述包被液的体积分别为500微升-700微升，150微升-200微升，80微升-120微升，40微升-80微升以及20微升-40微升。其有益效果在于：有利于使肝前体细胞获得良好的贴壁性能，以利于快速分化成熟。
进一步优选的，所述培养位为细胞培养皿，当所述细胞培养皿的直径分别为3.5厘米、6厘米、10厘米和15厘米，对应的所述细胞培养皿中的所述包被液的体积分别为250微升-350微升，500微升-700微升，1000微升-1500微升以及2000微升-3000微升。其有益效果在于：有利于使肝前体细胞获得良好的贴壁性能，以利于快速分化成熟。
进一步优选的，所述培养位为T25细胞培养瓶，所述包被液的体积为500微升-700微升。其有益效果在于：有利于使肝前体细胞获得良好的贴壁性能，以利于快速分化成熟。
优选的，所述步骤S2中，所述培养位的每平方厘米的培养面积上具有1×105-5×105个所述待培养细胞，将所述待培养细胞静置至少6小时，使所述扩增细胞的汇合率大于98％，以完成所述扩增处理。其有益效果在于：有利于后续对所述肝前体细胞进行的二维细胞培养。
进一步优选的，所述步骤S3中，用缓冲液润洗所述培养位后，向所述培养位中加入所述细胞培养基以启动分化培养，每24小时-48小时用所述细胞培养基置换所述培养位中的液体以促进分化过程，所述分化培养的时间为6-12天。
优选的，所述步骤S2中，所述培养位的每平方厘米的培养面积上具有1×105-2×105个所述待培养细胞，将所述培养位置于振荡设备中，并在37摄氏度的处理温度以及20转/分钟-30转/分钟的振荡速率下处理48小时-72小时，使所述扩增细胞成球，以完成扩增处理。其有益效果在于：有利于后续对所述肝前体细胞进行的三维细胞培养。
进一步优选的，所述步骤S3中，将所述培养位中的物质在50倍–100倍的重力加速度下离心5-10分钟后，去除上清液以得到扩增细胞沉淀液，向所述扩增细胞沉淀液中加入所述细胞培养基以启动分化培养，每48小时-72小时用所述细胞培养基置换所述培养位中的液体以促进分化过程，所述分化培养的时间为7-14天。
附图说明
图1a为本发明实施例1的第一肝细胞样细胞的微观结构示意图；
图1b为本发明实施例1的扩增HepaRG的微观结构示意图；
图1c为本发明实施例1的第一肝细胞样细胞的荧光图；
图2为本发明实施例1的第二肝细胞样细胞的免疫组化图；
图3a为本发明实施例2的扩增HepLPCs的微观结构示意图；
图3b为本发明实施例2的第一功能肝细胞的微观结构示意图；
图3c为本发明实施例2的第一功能肝细胞的荧光图；
图4为本发明实施例2的第二功能肝细胞的免疫荧光图；
图5a为本发明实施例3的第二肝细胞样细胞的微观结构示意图；
图5b为本发明实施例3的扩增iHepLPCs的微观结构示意图；
图6为本发明实施例4的第三肝细胞样细胞的免疫荧光图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另外定义，此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。具体实施方式中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
具体实施方式中的试剂来源如下：
DMEM/12培养基、William's E培养基、磷酸盐缓冲液、胰酶溶液、N2添加剂、B27添加剂、地塞米松均购自上海源培生物科技股份有限公司。
DMEM/12培养基的产品编号为L310KJ；William's E培养基的产品编号为L660KJ；磷酸盐缓冲液的产品编号为B310KJ；N2添加剂的产品编号为S430J4；B27添加剂的产品编号为S442J7；地塞米松的产品编号为R631R4；胰酶溶液的产品编号为S310KJ。
L-抗坏血酸购自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司，产品编号为A1300000。
SB431542、DATP、Compound E、佛司可林购自上海陶素生化科技有限公司。
SB431542的产品编号为T1726；DATP的产品编号为T6202；Compound E的产品编号为T1734；佛司可林的产品编号为T2939。
FH1(BRD-K4477)的CAS编号为2719-05-3；FPH1(BRD-6125)的CAS编号为708219-39-0；FPH2(BRD-9424)的CAS编号为957485-64-2。
FH1(BRD-K4477)、FPH1(BRD-6125)和FPH2(BRD-9424)均购自美国APExBIO公司。
人肝癌细胞系(HepaRG)购自BioProduct公司。
人原代肝细胞来源的肝前体样细胞(Hepatocyte-derived liver progenitor-like cells，HepLPCs)的来源记载在2019年发表在Cell Research(细胞研究)第29卷第1期的“Expansion and differentiation of human hepatocyte-derived liverprogenitor-like cells and their use for the study of hepatotropic pathogens.”中。
永生化的人原代肝细胞来源的肝前体样细胞(Immortalized hepatocyte-derived liver progenitor-like cells，iHepLPCs)购自上海赛立维生物科技有限公司。
具体实施方式中的仪器来源如下：
康宁低粘附六孔板购自美国康宁(Corning)公司，产品编号为3471；
细胞孵箱购自新加坡艺思高科技有限公司(ESCO)，产品型号为CCL-170B-8；
荧光倒置显微镜购自株式会社尼康(Nikon)，产品型号为Ta2-FL。
针对现有技术存在的问题，本发明的实施例提供了一种细胞培养基，用于促进肝前体细胞的分化和成熟。所述细胞培养基由基础培养基、营养源、通路抑制成分、抗氧化成分、糖皮质激素、激活成分和促分化成分组成。
本发明实施例的每1000克所述基础培养基中，所述通路抑制成分的质量为7×10-4克-3×10-2克，所述抗氧化成分的质量为3.5×10-4克-1.1克，所述糖皮质激素的质量为2.3×10-3克-5.8×10-2克，所述激活成分的质量为8.2×10-4克-2.1×10-2克，所述促分化成分的质量为1.1×10-3克-0.15克。
本发明实施例中，所述基础培养基为DMEM/12培养基。所述营养源包括无血清添加剂，所述营养源的体积占所述基础组合培养基体积的1％-2％。
本发明一些实施例中，所述无血清细胞培养添加剂为N2添加剂或胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂。
本发明一些实施例中，所述胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂占所述无血清细胞培养添加剂的体积百分比为25％-50％。
本发明一些实施例中，所述N2添加剂占所述无血清细胞培养添加剂的体积百分比为25％-50％。
本发明一些实施例中，所述营养源为所述无血清添加剂和B27添加剂，所述B27添加剂占所述无血清细胞培养添加剂的体积百分比不大于100％。本发明另一些实施例中，所述B27添加剂占所述无血清细胞培养添加剂的体积百分比为50％-75％。
本发明一些实施例中，所述转化生长因子-β信号抑制剂与所述γ-分泌酶抑制剂的质量比为3:1-5:1。所述转化生长因子-β信号抑制剂为SB431542或A83-01。所述γ-分泌酶抑制剂为DATP、YO-01027、Compound E或LY-411575。
本发明实施例中，所述激活成分为腺苷酸环化酶激活剂，以用于激活蛋白激酶A。
本发明一些实施例中，所述腺苷酸环化酶激活剂为佛司可林或环磷酸腺苷。
本发明实施例中，所述抗氧化成分包括氮乙酰半胱氨酸。
本发明一些实施例中，所述抗氧化成分还具有L-抗坏血酸、维生素E、类胡萝卜素或抗氧化酶。
本发明实施例中，所述促分化成分为FH1(BRD-K4477)、FPH1(BRD-6125)或FPH2(BRD-9424)。
本发明实施例提供了试剂盒，所述试剂盒包括增殖培养基以及所述细胞培养基。所述增殖培养基为William's E培养基或TEM培养基。
本发明一些实施例中，所述试剂盒还具有包被液，所述包被液由DMEM/12培养基和细胞外基质组成。所述细胞外基质为基质胶(Matrigel)。
本发明实施例还提供了利用所述试剂盒进行的细胞培养方法，所述细胞培养方法包括：
S1：将所述增殖培养基以及待培养细胞悬液以2:1-4:1的体积比混合，在150倍–200倍的重力加速度下离心5-10分钟，去除上清液以得到待培养细胞沉淀液，用所述增值培养基对所述待培养细胞沉淀液进行重悬处理后得到待培养细胞重悬液；
S2：将所述待培养细胞重悬液加入到所述培养位中，以使所述培养位的每平方厘米的培养面积上具有1×105-2×106个待培养细胞，对所述待培养细胞进行扩增处理，以得到扩增细胞；
S3：向所述扩增细胞中加入所述细胞培养基以启动分化培养，每24小时-72小时用新的所述细胞培养基进行置换处理以促进分化过程，所述分化培养的时间为6-14天。
本发明一些实施例中，所述细胞培养方法还包括步骤S0，所述步骤S0中，将所述包被液加入到培养位中，在37℃下静置30-120分钟后，执行所述步骤S1。所述培养位为多孔细胞培养板的每个培养孔。
当所述多孔细胞培养板为6孔细胞培养板，向所述6孔细胞培养板的每个培养孔中加入500-700微升所述包被液。
当所述多孔细胞培养板为12孔细胞培养板，向所述12孔细胞培养板的每个培养孔中加入150-200微升所述包被液。
当所述多孔细胞培养板为24孔细胞培养板，向所述24孔细胞培养板的每个培养孔中加入80-120微升所述包被液。
当所述多孔细胞培养板为48孔细胞培养板，向所述48孔细胞培养板的每个培养孔中加入40-80微升所述包被液。
当所述多孔细胞培养板为96孔细胞培养板，向所述96孔细胞培养板的每个培养孔中加入20-40微升所述包被液。
本发明一些实施例中，所述培养位为细胞培养皿。
当所述细胞培养皿的直径为3.5厘米，向所述细胞培养皿中加入250-350微升所述包被液。
当所述细胞培养皿的直径为6厘米，向所述细胞培养皿中加入500-700微升所述包被液。
当所述细胞培养皿的直径为10厘米，向所述细胞培养皿中加入1000-1500微升所述包被液。
当所述细胞培养皿的直径为15厘米，向所述细胞培养皿中加入2000-3000微升所述包被液。
本发明一些实施例中，所述培养位为T25细胞培养瓶，向所述T25细胞培养瓶中加入500-700微升所述包被液。
本发明一些实施例中，所述步骤S2中，所述培养位的每平方厘米的培养面积上具有1×105-5×105个待培养细胞，将所述待培养细胞静置至少6小时，使所述扩增细胞的汇合率大于98％，以完成所述扩增处理。所述步骤S3中，用缓冲液润洗所述培养位后，向所述培养位中加入所述细胞培养基以启动分化培养，每24小时-48小时用所述细胞培养基置换所述培养位中的液体以促进分化过程，所述分化培养的时间为6-12天。
本发明一些实施例中，所述步骤S2中，所述培养位的每平方厘米的培养面积上具有1×105-2×105个待培养细胞，将所述培养位放置在振荡设备中，在37摄氏度的处理温度和20转/分钟-30转/分钟的振荡速率下处理48小时-72小时，使所述扩增细胞成球，以完成扩增处理。所述步骤S3中，对所述培养位中的物质在50倍–100倍的重力加速度下离心5-10分钟，去除上清液以得到扩增细胞沉淀液，向所述扩增细胞沉淀液中加入所述细胞培养基以启动分化培养，每48小时-72小时用所述细胞培养基置换所述培养位中的液体以促进分化过程，所述分化培养的时间为7-14天。
本发明一些实施例中，所述振荡设备为细胞孵箱内的水平摇床。
以下通过实施例1-4对所述细胞培养基、所述试剂盒以及应用所述试剂盒进行的细胞培养方法进行详细叙述。
实施例1
本实施例提供了第一细胞培养基、第一试剂盒以及应用所述第一试剂盒对人肝癌细胞系(HepaRG)进行的细胞培养方法。所述细胞培养方法分别是二维细胞培养方法和三维细胞培养方法。
所述第一细胞培养基具有DMEM/12培养基、N2添加剂、B27添加剂、SB431542、DAPT、Compound E、地塞米松、氮乙酰半胱氨酸、L-抗坏血酸、佛司可林、FH1(BRD-K4477)、FPH1(BRD-6125)以及FPH2(BRD-9424)。
所述第一细胞培养基中，N2添加剂的体积为B27体积的50％。N2添加剂与B27添加剂的总体积占DMEM/12培养基体积的1.5％。
每1000g的DMEM/12培养基中，SB431542为3.84×10-3克，DAPT为8.65×10-4克，Compound E为4.09×10-5克，L-抗坏血酸为1.76×10-3克，氮乙酰半胱氨酸为2.02×10-4克，地塞米松为1.18×10-2克，佛司可林为4.10×10-3克，FH1(BRD-K4477)为5.65×10-3克，FPH1(BRD-6125)为7.78×10-3克，FPH2(BRD-9424)为1.54×10-2克。
所述第一试剂盒具有所述第一细胞培养基、第一包被液以及第一增殖培养基。所述第一包被液具有DMEM/12培养基和基质胶(Matrigel)，所述DMEM/12培养基与所述基质胶的体积比为1:80，所述第一增殖培养基为William's E培养基。
利用所述第一试剂盒对HepaRG进行的细胞培养方法为二维细胞培养方法，具体为：
所述步骤S0中，取12孔细胞培养板，向每个所述培养孔中加入150微升所述第一包被液，在37℃下静置120分钟。
所述步骤S1中，所述待培养细胞悬液中的待培养细胞为HepaRG，所述增殖培养基为William's E培养基，将待培养HepaRG悬液在37摄氏度下解冻，将解冻后的所述待培养HepaRG悬液加入至占所述待培养HepaRG悬液3倍体积的所述William's E培养基中稀释，然后在150倍的重力加速度下离心10分钟，去除上清液以得到待培养HepaRG沉淀液，用所述William's E培养基对所述待培养HepaRG沉淀液进行重悬处理后得到待培养HepaRG重悬液。
所述步骤S2中，将所述待培养HepaRG重悬液加入到所述12孔细胞培养板的每个培养孔中，以使所述12孔细胞培养板的每个培养孔中，每平方厘米的培养面积上具有4×105个待培养HepaRG，然后在37摄氏度下静置24小时，使所述待培养HepaRG贴壁并扩增，以完成扩增处理，获得扩增HepaRG。所述12孔细胞培养板的每个培养孔中，所述扩增HepaRG的汇合率为100％。
所述步骤S3中，用磷酸盐缓冲液润洗所述12孔细胞培养板的每个培养孔后，向所述12孔细胞培养板的每个培养孔加入1毫升的所述第一细胞培养基以启动分化培养，每24小时-48小时用1毫升的所述第一细胞培养基置换所述12孔细胞培养板的每个培养孔中的液体以促进分化过程，所述分化培养的时间为6天，以获得第一肝细胞样细胞。
取少量所述第一肝细胞样细胞以及所述扩增HepaRG，通过荧光倒置显微镜进行微观分析，得到图1a所示的所述第一肝细胞样细胞的微观结构示意图和图1b所示的扩增HepaRG的微观结构示意图。
取少量所述第一肝细胞样细胞进行免疫组织化学染色后，通过荧光倒置显微镜进行微观分析，以获取如图1c所示的所述第一肝细胞样细胞的荧光图。
从图1b中可以看到，所述扩增HepaRG由于没有分化，没有显示出规则的组织结构。分化培养6天后，所述扩增HepaRG完全分化成为图1a中白色箭头所示的形状规则，颗粒明显且质核较大的所述第一肝细胞样细胞。参照图1c，白色箭头所指的绿色荧光部分表示所述第一肝细胞样细胞具有明显极性结构，证明所述第一肝细胞样细胞具有了肝细胞的功能。
本实施例提供了利用所述第一试剂盒对HepaRG进行的另外一种细胞培养方法，即三维细胞培养方法，所述三维细胞培养方法与利用所述第一试剂盒对HepaRG进行的二维细胞培养方法的区别在于：
所述步骤S2中，向所述康宁低粘附六孔板的每个培养孔中加入的所述待培养HepaRG重悬液为2.5mL，以使所述康宁低粘附六孔板的每个培养孔中具有2×106个待培养HepaRG，然后在37度下将所述康宁低粘附六孔板置于细胞孵箱内的水平摇床上，设定振荡速率为20转/分钟，所述振荡处理的时间为72小时。然后将所述康宁低粘附六孔板的每个培养孔中的物质都转移至离心管中，在50倍的重力加速度下离心10分钟，去除上清液以得到扩增HepaRG沉淀，所述扩增HepaRG沉淀中，扩增HepaRG为球状结构。
所述步骤S3中，将所述扩增HepaRG沉淀加入到所述康宁低粘附六孔板的每个培养孔，然后分别加入2毫升所述第一细胞培养基以启动分化培养，每48小时用所述第一细胞培养基置换所述康宁低粘附六孔板的每个培养孔的液体以促进分化过程，所述分化培养的时间为9天，以得到第二肝细胞样细胞。
当所述分化培养结束后，取少量所述第二肝细胞样细胞，进行免疫组织化学染色后，通过荧光倒置显微镜进行微观分析，以获取如图2所示的所述第二肝细胞样细胞的免疫组化图。
分化培养9天后，图2中黑色箭头所示的蓝色部分为所述第二肝细胞样细胞的细胞核结构，而白色箭头所示的棕色部分表明所述第二肝细胞样细胞表达了多药耐药相关蛋白2(Muti-drug Resistance-assoiated Protein 2，MRP2)，具有了肝细胞的功能。
实施例2
本实施例提供了利用所述第一试剂盒对人原代肝细胞来源的肝前体样细胞(Hepatocyte-derived liverprogenitor-like cells，HepLPCs)进行的细胞培养方法。所述细胞培养方法分别是二维细胞培养方法和三维细胞培养方法。
利用所述第一试剂盒对HepLPCs进行的二维细胞培养方法与实施例1的利用所述第一试剂盒对HepaRG进行的二维细胞培养方法的区别在于：
所述步骤S1中，所述待培养细胞悬液中的待培养细胞为HepLPCs。
所述步骤S3中，所述分化培养的时间为9天，以得到分化成熟的第一功能肝细胞。
图3a为扩增HepLPCs的微观结构示意图。图3b为所述第一功能肝细胞的微观结构示意图。图3c为所述第一功能肝细胞的免疫荧光图。
从图3a和图3b中可以看到，分化培养9天后，所述扩增HepLPCs从图3a所示的没有显示出规则的组织结构完全分化成为图3b中白色箭头所示的颗粒状的所述第一功能肝细胞。参照图3c，白色箭头所指的绿色荧光部分表示所述第一功能肝细胞的明显极性结构，证明所述第一功能肝细胞具有了肝细胞的功能。
实施例2的应用所述第一试剂盒对HepLPCs进行的三维细胞培养方法与实施例1的应用所述第一试剂盒对HepaRG进行的三维细胞培养方法的区别在于：
所述步骤S1中，所述待培养细胞悬液中的待培养细胞为HepLPCs。
所述步骤S2中，向所述康宁低粘附六孔板的每个培养孔中加入的待培养HepLPCs重悬液为2.5mL，以使所述康宁低粘附六孔板的每个培养孔中具有1×106个待培养HepLPCs，所述康宁低粘附六孔板中每孔的培养面积为9.6平方厘米，然后在37度下将所述康宁低粘附六孔板置于细胞孵箱内的水平摇床上，设定振荡速率为20转/分钟，所述振荡处理的时间为48小时。
所述步骤S3中，所述分化培养的时间为14天，以得到分化成熟的第二功能肝细胞。
图4为所述第二功能肝细胞的免疫荧光图。参照图4，分化培养14天后，所述扩增HepLPCs表达了乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)受体，即图4中白色箭头所示的红色区域表示的钠离子牛磺胆酸共转运多肽(sodium-taurocholate co-transportingpolypeptide，NTCP)，证明具有了肝细胞的功能。
实施例3
本实施例提供了第二细胞培养基、第二试剂盒以及应用所述第二试剂盒对永生化的人原代肝细胞来源的肝前体样细胞(Immortalized hepatocyte-derived liverprogenitor-like cells，iHepLPCs)进行的细胞培养方法。所述细胞培养方法是二维细胞培养方法。
所述第二细胞培养基具有DMEM/12培养基、N2添加剂、B27添加剂、SB431542、DAPT、Compound E、地塞米松、氮乙酰半胱氨酸、L-抗坏血酸、佛司可林和FH1(BRD-K4477)。
所述第二细胞培养基中，N2添加剂的体积与B27体积相等。N2添加剂与B27添加剂的总体积占DMEM/12培养基的总体积的2％。
所述第二细胞培养基的每1000g的DMEM/12培养基中，SB431542为1.9×10-2克，DAPT为4.3×10-3克，Compound E为2.5×10-4克，L-抗坏血酸为8.8×10-3克，氮乙酰半胱氨酸为1×10-3克，地塞米松为5.9×10-2克，佛司可林为2.10×10-2克，FH1(BRD-K4477)为2.8×10-2克。
所述第二试剂盒具有所述第二细胞培养基、所述第一包被液以及第二增殖培养基。所述第二增殖培养基为TEM培养基，所述TEM培养基的具体配方记载在2019年的Cellresearch(细胞研究)第29卷第1期的“Expansion and differentiation of humanhepatocyte-derived liver progenitor-like cells and their use forthe studyofhepatotropic pathogens.”中。
应用所述第二试剂盒对iHepLPCs进行的二维细胞培养的方法与实施例1中的应用所述第一试剂盒对HepaRG进行的二维细胞培养方法的区别在于：
所述步骤S1中，所述待培养细胞悬液中的待培养细胞为iHepLPCs，所述增殖培养基为TEM培养基，得到待培养iHepLPCs重悬液。
所述步骤S2中，装有所述待培养iHepLPCs重悬液的所述12孔细胞培养板在37摄氏度下静置6小时，以完成贴壁和扩增处理，获得贴壁iHepLPCs。所述12孔细胞培养板的每个培养孔中，所述扩增iHepLPCs的汇合率为98％。
所述步骤S3中，加入所述第二细胞培养基以启动分化培养，每24小时-48小时用1毫升的所述第二细胞培养基置换所述12孔细胞培养板的每个培养孔中的液体以促进分化过程，所述分化培养的时间为9天，以获得第二肝细胞样细胞。
当所述分化培养结束后，取少量所述第二肝细胞样细胞，通过倒置荧光显微镜进行微观分析，以获取如图5a所示的所述第二肝细胞样细胞的微观结构示意图。
取少量所述扩增iHepLPCs，通过倒置荧光显微镜进行微观分析，以获取如图5b所示的扩增iHepLPCs的微观结构示意图。
参照图5a，所述扩增iHepLPCs没有显示出规则的组织结构，参照图5b，经过所述分化培养后，所述扩增iHepLPCs完全分化成为图5b中白色箭头所示的颗粒状的所述第二肝细胞样细胞。
实施例4
本实施例提供了第三细胞培养基、第三试剂盒以及应用所述第三试剂盒对iHepLPCs进行的细胞培养方法。所述细胞培养方法是三维细胞培养方法。
所述第三细胞培养基具有DMEM/12培养基、N2添加剂、B27添加剂、SB431542、DAPT、Compound E、地塞米松、氮乙酰半胱氨酸、L-抗坏血酸、佛司可林和FH1(BRD-K4477)。
所述第三细胞培养基中，N2添加剂的体积占所述B27体积的50％。N2添加剂与B27添加剂的总体积占DMEM/12培养基的总体积的1.5％。
所述第三细胞培养基的每1000g的DMEM/12培养基中，SB431542为7.7×10-4克，DAPT为1.7×10-5克，Compound E为9.8×10-6克，L-抗坏血酸为3.5×10-5克，氮乙酰半胱氨酸为4.1×10-5克，地塞米松为2.4×10-4克，佛司可林为8.2×10-4克，FH1(BRD-K4477)为1.1×10-4克。
所述第三试剂盒具有所述第三细胞培养基、所述第一包被液以及所述第二增殖培养基。
应用所述第三试剂盒对iHepLPCs进行的三维细胞培养的方法与实施例1的应用所述第一试剂盒对HepaRG进行的二维细胞培养方法的区别在于：
所述步骤S1中，采用所述康宁低粘附六孔板，所述康宁低粘附六孔板中每孔的培养面积为9.6平方厘米，所述待培养细胞悬液中的待培养细胞为iHepLPCs，所述增殖培养基为TEM培养基，得到的是待培养iHepLPCs重悬液。
所述步骤S3中，向所述康宁低粘附六孔板的每个培养孔中加入的所述待培养iHepLPCs重悬液为2.5mL，以使所述康宁低粘附六孔板的每个培养孔中具有1×106个待培养iHepLPCs，然后在37℃下，将所述康宁低粘附六孔板置于细胞孵箱内的水平摇床上，设定振荡速率为20转/分钟，所述振荡处理的时间为24小时。然后将所述康宁低粘附六孔板的每个培养孔中的物质都转移至离心管中，在50倍的重力加速度下离心5分钟，去除上清液以得到3D成球的iHepLPCs沉淀。
所述步骤S4中，用磷酸盐缓冲液润洗所述康宁低粘附六孔板的每个培养孔后，向所述康宁低粘附六孔板的每个培养孔加入1毫升的所述第三细胞培养基以启动分化培养，每24小时-48小时用1毫升的所述第三细胞培养基置换所述康宁低粘附六孔板的每个培养孔中的液体以促进分化过程，所述分化培养的时间为14天，以获得第三肝细胞样细胞。
图6为所述第三肝细胞样细胞的免疫荧光图。参照图6，所述第三肝细胞样细胞表达了如图6中白色箭头所示的HBV受体NTCP，证明所述第三肝细胞样细胞具有了肝细胞的功能。
虽然在上文中详细说明了本发明的实施方式，但是对于本领域的技术人员来说显而易见的是，能够对这些实施方式进行各种修改和变化。但是，应理解，这种修改和变化都属于权利要求书中所述的本发明的范围和精神之内。而且，在此说明的本发明可有其它的实施方式，并且可通过多种方式实施或实现。

Claims (15)

1.一种细胞培养基，用于促进肝前体细胞的分化和成熟，其特征在于，所述细胞培养基由DMEM/12培养基、N2添加剂、B27添加剂、SB431542、DATP、Compound E、氮乙酰半胱氨酸、L-抗坏血酸、地塞米松、佛司可林和促分化成分组成；
所述促分化成分为FH1、FPH1或FPH2；
所述N2添加剂和所述B27添加剂的体积占所述基础培养基体积的1％-2％；
每1000克所述DMEM/12培养基中，所述SB431542、所述DATP和所述Compound E的总质量为7×10-4克-3×10-2克，所述氮乙酰半胱氨酸和所述L-抗坏血酸的总质量为3.5×10-4克-1.1克，所述地塞米松的质量为2.3×10-3克-5.8×10-2克，所述佛司可林的质量为8.2×10-4克-2.1×10-2克，所述促分化成分的质量为1.1×10-3克-0.15克。
2.根据权利要求1所述的细胞培养基，其特征在于，所述B27添加剂占所述N2添加剂的体积百分比不大于100％。
3.根据权利要求2所述的细胞培养基，其特征在于，所述B27添加剂占所述N2添加剂的体积百分比为50％-75％。
4.根据权利要求1所述的细胞培养基，其特征在于，所述SB431542与所述DATP和所述Compound E的质量和之比为3:1-5:1。
5.一种试剂盒，其特征在于，包括增殖培养基以及如权利要求1-4中任意一项所述的细胞培养基，所述增殖培养基为William's E培养基或TEM培养基。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还具有包被液，所述包被液由DMEM/12培养基和细胞外基质组成。
7.一种细胞培养方法，其特征在于，包括：
S1：提供如权利要求5所述的试剂盒，所述试剂盒包括增殖培养基和细胞培养基，将所述增殖培养基和待培养细胞悬液以2:1-4:1的体积比混合，在150倍–200倍的重力加速度下离心5-10分钟，去除上清液以得到待培养细胞沉淀液，用所述增殖培养基对所述待培养细胞沉淀液进行重悬处理后得到待培养细胞重悬液；
S2：将所述待培养细胞重悬液加入到培养位中，以使所述培养位的每平方厘米的培养面积上具有1×105-2×106个待培养细胞，对所述待培养细胞进行扩增处理，以得到扩增细胞；
S3：向所述扩增细胞中加入所述细胞培养基以启动分化培养，每24小时-72小时用新的所述细胞培养基进行置换处理以促进分化过程，所述分化培养的时间为6-14天。
8.根据权利要求7所述的细胞培养方法，其特征在于，还包括步骤S0，所述步骤S0中，将所述包被液加入到培养位中，在37℃下静置30-120分钟后，执行所述步骤S1。
9.根据权利要求8所述的细胞培养方法，其特征在于，所述培养位为多孔细胞培养板的每个培养孔，当所述多孔细胞培养板的孔数分别为6、12、24、48和96，对应的每个所述培养孔中的所述包被液的体积分别为500微升-700微升，150微升-200微升，80微升-120微升，40微升-80微升以及20微升-40微升。
10.根据权利要求8所述的细胞培养方法，其特征在于，所述培养位为细胞培养皿，当所述细胞培养皿的直径分别为3.5厘米、6厘米、10厘米和15厘米，对应的所述细胞培养皿中的所述包被液的体积分别为250微升-350微升，500微升-700微升，1000微升-1500微升以及2000微升-3000微升。
11.根据权利要求8所述的细胞培养方法，其特征在于，所述培养位为T25细胞培养瓶，所述包被液的体积为500微升-700微升。
12.根据权利要求8所述的细胞培养方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述培养位的每平方厘米的培养面积上具有1×105-5×105个待培养细胞，将所述待培养细胞静置至少6小时，使所述扩增细胞的汇合率大于98％，以完成所述扩增处理。
13.根据权利要求12所述的细胞培养方法，其特征在于，所述步骤S3中，用缓冲液润洗所述培养位后，向所述培养位中加入所述细胞培养基以启动所述分化培养，每24小时-48小时用所述细胞培养基置换所述培养位中的液体以促进所述分化过程，所述分化培养的时间为6-12天。
14.根据权利要求7所述的细胞培养方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述培养位的每平方厘米的培养面积上具有1×105-2×105个待培养细胞，将所述培养位置于振荡设备中，并在37摄氏度的处理温度以及20转/分钟-30转/分钟的振荡速率下处理48小时-72小时，使所述扩增细胞成球，以完成所述扩增处理。
15.根据权利要求14所述的细胞培养方法，其特征在于，所述步骤S3中，将经过所述扩增处理后所述培养位中得到的物质在50倍–100倍的重力加速度下离心5-10分钟后，去除上清液以得到扩增细胞沉淀液，向所述扩增细胞沉淀液中加入所述细胞培养基以启动所述分化培养，每48小时-72小时用所述细胞培养基置换所述培养位中的液体以促进所述分化过程，所述分化培养的时间为7-14天。
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