CN106479957A

CN106479957A - 肝细胞培养液及培养方法

Info

Publication number: CN106479957A
Application number: CN201610890462.4A
Authority: CN
Inventors: 高歌; 陈瑛
Original assignee: Ixcell Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Ixcell Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2016-08-10
Filing date: 2016-10-12
Publication date: 2017-03-08
Anticipated expiration: 2036-10-12
Also published as: CN106479957B

Abstract

本发明公开了一种基于外周血单核细胞的肝细胞培养液，所述培养液包括：体积比为1:0.9～1.3的DMEM/F12培养基和肝细胞培养基Hepato ZYME‑SFM，以及肝细胞生长因子、L‑抗坏血酸、L‑谷氨酰胺、Wnt激活剂、GSK‑3β抑制剂和TGF‑β抑制剂。本发明还公开了一种由外周血单核细胞培养肝细胞的培养方法，使用所述培养液，可由外周血单核细胞为原料定向培养得到肝细胞，取材方便，培养时间短，可避免伦理道德争议。

Description

肝细胞培养液及培养方法

技术领域

本发明属于肝细胞培养技术领域，具体涉及一种肝细胞培养液及培养方法。

背景技术

肝脏是人体重要的器官，对于肝脏疾病的研究目前主要使用动物模型的研究手段，但由于动物的基因背景与人类有所差异，因此动物模型的研究成果并不能完全符合人类自身。现阶段已有一些方法可以体外获得肝细胞，目前这些肝细胞可以用来作为疾病研究模型、药物筛选，未来还可注射到人体内修复由于疾病而造成的肝脏损伤等。

现阶段肝细胞的体外获得方法主要包括以下两种：

一、由胚胎干细胞诱导分化。胚胎干细胞是取自人体胚胎，具有分化成各组织器官细胞能力的一类细胞。胚胎干细胞经诱导分化可得到肝细胞，这些肝细胞具有和人体肝细胞相似的功能，可用于药物筛选，疾病机制研究。但是由于受到伦理道德的限制，目前可应用的胚胎干细胞系有限，无法获得各种疾病表型的肝细胞，限制了其在药物筛选和疾病机制研究方面的应用，而且由于这类肝细胞来源于异体，具有免疫排斥反应，更无法应用于未来的临床细胞治疗中。

二、由诱导多功能干细胞诱导分化。诱导多功能干细胞技术是干细胞应用领域的一项新技术，于2007年诞生，该技术通过向体细胞中导入转录因子，将体细胞诱导成具有胚胎干细胞类似功能的诱导多功能干细胞，诱导多功能干细胞具有无限增殖能力，能够分化为各组织器官细胞。由于它来源于人体自身的体细胞，避免了伦理道德的限制和免疫排斥反应，而且具有无限增殖能力，在药物筛选、疾病机制研究和未来临床细胞治疗领域有较大的应用前景。但是诱导多功能干细胞制备周期长，一般需要4～8个月，而且得到诱导多功能干细胞后还需要1～2个月的时间进行分化才能得到肝细胞，这使得肝细胞的获得周期至少需要半年，周期过长必然使得制备成本较高。

综上，由胚胎干细胞诱导分化受到伦理道德约束、获得的肝细胞数量有限且具有免疫排斥反应，而由诱导多功能干细胞诱导分化的制备周期长成本较高，这些使得体外获得的肝细胞在疾病机制研究、药物筛选及临床细胞治疗中的应用受到较大限制。

发明内容

因此，本发明针对现有技术中由诱导多功能干细胞诱导分化获得肝细胞的方法的制备周期长、成本较高的技术问题，目的在于提供一种由外周血单核细胞(PBMC)培养肝细胞的可大大缩短肝细胞制备周期的培养液。

本发明的培养液包括：体积比为1:0.9～1.3的DMEM/F12培养基和肝细胞培养基HepatoZYME-SFM，以及肝细胞生长因子、L-抗坏血酸、L-谷氨酰胺、Wnt激活剂、GSK-3β抑制剂和TGF-β抑制剂。

所述培养液中的各组分可协同诱导外周血单核细胞定向分化为肝细胞。其中，DMEM/F12和肝细胞培养基HepatoZYME-SFM混合作为无血清的基础培养基，DMEM/F12含有体积比为1:1的DMEM培养基和F12培养基，营养成分丰富；肝细胞培养基HepatoZYME-SFM可长期维持肝细胞表型基因如活性形式和可诱导形式的细胞色素P450和活化的II相酶(phaseII enzyme)的表达。所述肝细胞生长因子为人肝细胞生长因子(即Hepatocyte GrowthFactor human，购自Sigma公司，货号H5791，具体氨基酸序列参见NCBI蛋白质库数据，NCBI/Protein/hepatocyte growth factor[Homo sapiens]，数据库编号BAA14348.1)，用于辅助维持肝细胞的生长和代谢。L-抗坏血酸作为培养基中的辅助因子。L-谷氨酰胺作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。所述Wnt激活剂选用SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮，CAS号为280744-09-4)。所述TGF-β抑制剂选用LY364947(4-(3-吡啶-2-基-1H-吡唑-4-基)喹啉，CAS号为396129-53-6)和/或SB431542(4-[4-(3,4-亚甲二氧基苯基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]-苯甲酰胺，CAS号为301836-41-9)。所述GSK-3β抑制剂选用Kenpaullone(9-溴-7,12-二氢吲哚并[3,2-D][1]苯并氮杂卓-6(5H)-酮，CAS号为142273-20-9)和/或Indirubin-3’-monoxime(靛玉红-3’-单肟，CAS号为160807-49-8)。

其中，肝细胞生长因子浓度为2～10mmol/L，L-抗坏血酸浓度为0.10～0.16mmol/L，L-谷氨酰胺浓度为4～16mmol/L，所述Wnt激活剂浓度为15～40μmol/L，所述GSK-3β抑制剂浓度为0.02～0.10μmol/L，所述TGF-β抑制剂浓度为3～15μmol/L。

进一步的，DMEM/F12培养基和肝细胞培养基HepatoZYME-SFM的体积比优选1:1，肝细胞生长因子浓度优选3～8mmol/L，更优选6mmol/L；L-抗坏血酸浓度优选0.12～0.15mmol/L，更优选0.13mmol/L；L-谷氨酰胺浓度优选6～12mmol/L，更优选10mmol/L；所述Wnt激活剂剂浓度优选25～38μmol/L，更优选30μmol/L；所述GSK-3β抑制剂浓度优选0.04～0.09μmol/L，更优选0.06μmol/L；所述TGF-β抑制剂浓度优选5～10μmol/L，更优选8μmol/L。

本发明的一较佳实施例中，所述培养液还包括地塞米松，地塞米松的浓度为0.02～0.16μmol/L，优选为0.04～0.12μmol/L更优选0.10μmol/L。

本发明的另一目的还在于提供一种由外周血单核细胞培养肝细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

1)用本发明所述的肝细胞培养液对外周血单核细胞进行定向分化培养得到初始培养物；

2)初始培养物用本发明所述培养液继续培养3～5天得到肝细胞。

本发明的一较佳实施例的所述方法中，步骤1)具体为，于35～39℃优选37℃、3～7％优选5％CO₂条件下，用本发明所述的肝细胞培养液对外周血单核细胞进行定向分化培养15～21天，移除未贴壁的细胞，定向分化培养期间每1～3天优选2天更换一次培养液；

步骤2)具体为，将步骤1)得到的初始培养物于35～39℃优选37℃、3～7％优选5％CO₂条件下用所述培养液继续培养，培养5～8天得到肝细胞，继续培养期间每1～2天优选1天更换一次培养液。

所述外周血单核细胞用Ficoll-Paque密度梯度离心法分离患者血样得到。

对培养得到的肝细胞经过进行细胞类型鉴定后，包括肝细胞特征性蛋白表达(免疫荧光)、存储脂肪和糖原鉴定，即可低温贮藏或者用于医学研究。

本发明的积极进步效果在于：本发明所述培养液采用DMEM/F12培养基和HepatoZYME-SFM组成的基础培养基，并添加有一些关键因子如肝细胞生长因子、Wnt激活剂、GSK-3β抑制剂、TGF-β抑制剂等，各组分协同作用可以有效的诱使细胞朝肝细胞方向分化。经所述方法，可在较短时间内将外周血单核细胞定向分化培养得到肝细胞。所述方法一方面取材方便，所述外周血单核细胞可取自患者血液，且无数量限制，可避免道德争议，而且相比于由胚胎干细胞诱导分化得到的来源于异体肝细胞，大大降低了甚至避免了免疫排斥反应；另一方面，培养肝细胞的周期为20～30天，与现有的诱导多功能干细胞技术相比，大大提高了肝细胞的制备速度，降低了制备成本。

附图说明

图1为外周血单核细胞的显微镜照片；

图2为本发明培养得到的肝细胞的显微镜照片；

图3为本发明培养得到的肝细胞的特征性蛋白表达的鉴定显微镜照片；

图4为本发明培养得到的肝细胞的糖原存储功能的鉴定显微镜照片；

图5为本发明培养得到的肝细胞的脂肪存储功能的鉴定显微镜照片。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1～4利用外周血单核细胞培养肝细胞

一、培养液

实施例1～4的培养液包括由DMEM/F12培养基和肝细胞培养基HepatoZYME-SFM混合而成的基础培养基，以及添加在基础培养基中的添加组分。各实施例的DMEM/F12培养基和肝细胞培养基HepatoZYME-SFM的混合的体积比例、添加组分及其含量如表1所示。

表1培养液的组分及含量

备注：表1所述各物质均为市场上购得

二、培养过程

实施例1～4分别使用表1所示的对应的培养液按照以下步骤培养肝细胞。

1、外周血单核细胞的分离(Ficoll-Paque密度梯度离心法)

通过SepMate^TM管中间小孔向管内加入3.5mL Ficoll-Paque(相对密度1.077)，液面超过管子内置管，保持SepMate^TM管直立放置于离心管架子上。

取5mL DPBS+2％FBS至于15mL离心管中，然后加入5mL外周血血样，盖好后轻轻地来回颠倒4次混匀，混匀后用移液管取10mL沿着SepMate^TM管侧壁缓慢地加在Ficoll-Paque上，1200×g离心10分钟。

外周血单核细胞位于SepMate^TM管最上层，将最上层细胞悬液缓慢倒入新的15mL离心管，向离心管中加入5mL DPBS+2％FBS，300×g离心8分钟。弃去上清，轻弹离心管底部，再加入5mL DPBS+2％FBS，300×g离心5分钟。弃去上清液，轻弹离心管底部用剩余未吸走的DPBS+2％FBS重悬细胞得到外周血单核细胞，外周血单核细胞的显微镜照片如图1所示。

2、肝细胞的定向分化培养

将得到的外周血单核细胞平均分到一块12孔板中，并加入培养液(1mL/孔)(若培养液存放于4℃冰箱中，需提前取出室温预热20分钟)，于37℃，5％CO₂的孵箱里培养n₁天，培养液每2天更换一次。

将12孔板置于无菌操作台中，轻轻晃动12孔板，使用吸引泵吸去培养液，用2mL移液管将死细胞以及未贴壁的细胞移除。

用5mL移液管沿着孔壁缓慢加入新鲜的培养液(1mL/孔)，继续放入孵箱中培养n₂天，培养液每天更换一次。

其中实施例1～4的培养过程中的时间参数n₁和n₂如表2所示。

表2各实施例的时间参数

效果实施例1实施例1～4所得肝细胞特征性蛋白表达的鉴定(免疫荧光法)

1)固定细胞

取培养完成的12孔板，吸去培养液后，沿12孔板板壁缓缓加入1×PBS(pH7.4，下同，1mL/孔)，洗2次；然后沿板壁缓慢加入4％的PFA(多聚甲醛)(1mL/孔)，室温放置18分钟固定细胞，轻柔地吸去PFA，加入1×PBS洗3次(1mL/孔/次)。

2)一抗孵育

加入0.3％Triton×100(0.5mL/孔)，于37℃孵育30分钟；然后加入5％的BSA(0.5mL/孔)封闭，于37℃孵育30分钟；然后直接向封闭液中加入一抗(甲胎蛋白AFP抗体，老鼠来源，购自Sigma)，一抗加入量为20μL/孔，于37℃孵育1小时，加入1×PBS洗3次(1mL/孔/次)。

3)二抗孵育

加入用1％BSA稀释(稀释比例1:200)后的二抗(驴抗老鼠二抗，购自lifetechnologies)，二抗加入量为0.5mL/孔，37℃避光孵育30分钟后吸去二抗，加入1×PBS洗3次(1mL/孔/次)，每次5分钟；然后加入用1×PBS配好的终浓度为1μg/mL的DAPI(0.5mL/孔)，染色1分钟，吸去DAPI，加入1×PBS洗2次(1mL/孔/次)；最后加入1×PBS(0.5mL/孔)，显微镜下观察并拍照处理。

图3中A～D分别对应实施例1～4培养得到的细胞的免疫荧光鉴定结果，由图3可知实施例1-4中培养得到的细胞均具有肝细胞特征因子AFP的表达。

效果实施例2实施例1～4所得肝细胞存储糖原功能的鉴定(PAS染色法)

取培养完成的12孔板，吸去培养液后，加入无Ca²⁺和Mg²⁺的DPBS洗2次(1mL/孔/次)；然后沿板壁缓慢加入4％的PFA(1mL/孔)，室温放置8分钟固定细胞，吸去PFA溶液，用1×PBS洗3次(1mL/孔/次)；然后加入过碘酸酒精清液，室温处理5分钟，吸去过碘酸酒精清液，用蒸馏水洗2次；然后加入Schiff氏液，室温处理15分钟，吸去Schiff氏液，细胞用自来水冲洗5遍；然后加入苏木精溶液染色90秒，用自来水冲洗至孔无色；最后加入1×PBS(1mL/孔)，显微镜下拍照观察。

上述过碘酸酒精清液由0.4g过碘酸、35mL 95％的酒精、5mL 5mol/L的醋酸钠和10mL蒸馏水配制而成；使用的Schiff氏液由0.5克碱性品红、100毫升蒸馏水中、10毫升1mol/L盐酸、1克偏重硫酸钠和230mL酒精配制而成，配好后置于4℃冰箱中。

图4中A～D分别对应实施例1～4得到的细胞的鉴定结果，图中紫红色部分为细胞存储的糖原，深紫色部分为细胞核，由此可知实施例1～4得到的细胞都具有肝细胞存储糖原的功能。

效果实施例3实施例1～4所得肝细胞存储脂肪功能的鉴定(油红染色法)

取培养完成的12孔板，吸去培养液后，加入无Ca²⁺和Mg²⁺的DPBS洗2次(1mL/孔)；然后沿板壁缓慢加入4％的PFA(1mL/孔)，室温放置8分钟固定细胞，吸去PFA溶液，用1×PBS洗3次(1mL/孔/次)；然后加入油红工作液，室温染色20min，吸去油红工作液；然后加入苏木精室温染色90s，用自来水冲洗至孔无色；最后加入1×PBS(1mL/孔)，显微镜下拍照观察。

上述油红工作液为现配现用，由油红储备液：蒸馏水＝3:2配制而成，而油红储备液由1g油红粉末溶解到200mL异丙醇中配制而成，油红储备液可长期存放于4℃冰箱。

图5中A～D分别对应实施例1～4得到的细胞的鉴定结果，图中红色部分为细胞存储的脂肪，蓝色部分为细胞核，由此可知实施例1～4得到的细胞都具有肝细胞存储脂肪的功能。

效果实施例1～3的鉴定结果显示，使用本发明的培养液，通过本发明的培养方法，由外周血单核细胞培养得到的细胞不仅含有肝细胞特征性蛋白AFP，还具有存储糖原和脂肪的功能，从而可知为肝细胞。

本发明可由取自肝病患者血液中的外周血单核细胞进行定向分化培养得到肝细胞。相比于由来源于异体的胚胎干细胞诱导分化得到的肝细胞，本发明培养得到的肝细胞具有很小的甚至没有免疫排斥反应，可用于疾病机制研究、药物筛选及临床细胞治疗，而且原料限制大大减小，不会引起道德争议，培养周期也只需要20～30天，与现有的诱导多功能干细胞技术相比，大大提高了肝细胞的制备速度，降低了制备成本。

Claims

1.一种基于外周血单核细胞的肝细胞培养液，其特征在于，所述培养液包括：体积比为1:0.9～1.3的DMEM/F12培养基和肝细胞培养基HepatoZYME-SFM，以及肝细胞生长因子、L-抗坏血酸、L-谷氨酰胺、Wnt激活剂、GSK-3β抑制剂和TGF-β抑制剂。

2.如权利要求1所述的肝细胞培养液，其特征在于，所述肝细胞生长因子为人肝细胞生长因子，所述Wnt激活剂为SB216763；所述GSK-3β抑制剂为Kenpaullone和/或Indirubin-3’-monoxime；所述TGF-β抑制剂为LY364947和/或SB431542。

3.如权利要求1或2所述的肝细胞培养液，其特征在于，肝细胞生长因子物浓度为2～10mmol/L，L-抗坏血酸浓度为0.10～0.16mmol/L，L-谷氨酰胺浓度为4～16mmol/L，所述Wnt激活剂浓度为15～40μmol/L，所述GSK-3β抑制剂浓度为0.02～0.10μmol/L，所述TGF-β抑制剂浓度为3～15μmol/L。

4.如权利要求3所述的肝细胞培养液，其特征在于，DMEM/F12培养基和肝细胞培养基HepatoZYME-SFM的体积比为1:1，肝细胞生长因子浓度为3～8mmol/L，优选6mmol/L；L-抗坏血酸浓度为0.12～0.15mmol/L，优选0.13mmol/L；L-谷氨酰胺浓度为6～12mmol/L，优选10mmol/L；所述Wnt激活剂剂浓度为25～38μmol/L，优选30μmol/L；所述GSK-3β抑制剂浓度为0.04～0.09μmol/L，优选0.06μmol/L；所述TGF-β抑制剂浓度为5～10μmol/L，优选8μmol/L。

5.如权利要求3所述的肝细胞培养液，其特征在于，还包括地塞米松，地塞米松的浓度为0.02～0.16μmol/L，优选为0.04～0.12μmol/L更优选0.10μmol/L。

6.一种由外周血单核细胞培养肝细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求1～5任一项所述的肝细胞培养液对外周血单核细胞进行定向分化培养得到初始培养物；

2)初始培养物用权利要求1～5任一项所述肝细胞培养液继续培养3～5天得到肝细胞。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：

步骤1)具体为，于35～39℃优选37℃、3～7％优选5％CO₂条件下，用权利要求1～5任一项所述肝细胞培养液对外周血单核细胞进行定向分化培养15～21天，移除未贴壁的细胞，定向分化培养期间每1～3天优选2天更换一次培养液；

步骤2)具体为，将步骤1)得到的初始培养物于35～39℃优选37℃、3～7％优选5％CO₂条件下用权利要求1～5任一项所述肝细胞培养液继续培养，培养5～8天得到肝细胞，继续培养期间每1～2天优选1天更换一次培养液。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述外周血单核细胞用Ficoll-Paque密度梯度离心法分离患者血样得到。