CN111004770A - 功能性肝细胞诱导方法及其专用三维诱导培养基和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种功能性肝细胞诱导方法及其专用三维诱导培养基和应用，属于生物工程技术领域。本发明提供的功能性肝细胞三维诱导培养基包含多种小分子和细胞因子，能够有效用于由具有干/祖细胞特性的肝脏类器官诱导获得功能性肝细胞的方法中，诱导培养获得的功能性肝细胞可以用于人工肝脏的生产以及模拟体外肝功能，还可以作为建立肝病治疗药物筛选模型以及体外模拟肝病模型的种子细胞。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种功能性肝细胞诱导方法及其专用三维诱导培养基和应用，具体涉及一种利用具有干/祖细胞特性的肝脏类器官诱导获得功能性肝细胞的三维培养基及其诱导获得的功能性肝细胞在制备治疗肝病的药物中的应用。
背景技术
肝脏是人体最大的消化器官，调控着机体许多重要的生理功能，包括营养物质的代谢、尿素的合成、多种重要蛋白的合成、胆汁的分泌和异源性物质的解毒等。多种原因导致的肝脏损伤或疾病通常会造成严重的后果，如病毒性肝炎、肝纤维化、遗传代谢性肝病、肝硬化、胆道疾病等给人体带来巨大危害。据相关统计，全球每年新增终末期肝病(EndStage Liver Diseases,ESLD)病例数约为600万，其中死亡约100万。我国是受肝病危害程度最广泛同时也是最大的国家，各类肝病的发病率和死亡率均居世界前列，我国每年因ELSD死亡的人数接近40万，占据全球此类疾病死亡人数的51％(Wang FS,Fan JG,Zhang Z,等.The global burden of liver disease:the major impact of China[J].Hepatology,2014,60:2099-2108.)。肝移植是目前公认的终末期肝病唯一有效的治疗方式，但是供体肝脏的严重匮乏也是当今制约肝移植广泛开展的最主要因素。以美国为例，每年器官移植的供需比约为1:4；在中国，以2015年为例，全国肝移植数2581例(数据来源：中国肝移植注册系统)，而等待肝移植的患者有30余万例，绝大部分患者不能得到及时的肝移植治疗，而排在移植等待名单上的患者仍以每年11％的速度快速增加，每年有大量的患者(约17％)在等待肝移植的过程中不幸死亡。多年来，以人肝细胞为来源的细胞移植治疗及以生物人工肝为手段的内科辅助治疗，在临床前研究及小规模的临床应用中已经取得良好的治疗效果，然而，人肝细胞的获得和培养在技术上依然十分困难，难以规模化应用，人工肝也仅是内科保守性的辅助治疗方式，难以从根本上替代肝移植。近年来，干细胞技术的发展为功能性肝细胞的获取提供了全新的细胞来源，也为各种原因导致的终末期肝病的治疗开辟了新的路径。
在发育上，肝脏干细胞具有自我更新和双向分化潜能，是产生成熟肝细胞的种子细胞，是肝脏上皮系统形成的主要来源，因此在发育学上有重要意义(Miyajima A,TanakaM,Itoh T.Stem/Progenitor Cells in Liver Development,Homeostasis,Regeneration,and Reprogramming[J].Cell Stem Cell,2014,14:561-574)。正是因为肝脏干细胞的这种特性，多年来科学家们一直在通过不同的途径和技术手段在体外来获取肝脏的干细胞(Zhang RR,Zheng YW,Li B,等.Hepatic stem cells with self-renewal and liverrepopulation potential are harbored in CDCP1-positive subpopulations of humanfetal liver cells[J].Stem Cell Res Ther,2018,9:29.)，通过其大量的扩增继而分化来获取足量的功能性肝细胞。从胎儿肝脏和成体肝脏中通过细胞分离结合细胞表面特异性标记来获得肝干细胞，并在体外扩增是一种重要的方式，但是人的原代组织获取毕竟有限，这就限制了这种方式在广泛获得肝脏细胞的应用。随着人多能性干细胞(hPSCs)如胚胎干细胞(hESCs)和诱导多能性干细胞(hiPSCs)的建立，给功能性肝细胞的获得提供了全新的途径(Murry CE,Keller G.Differentiation of Embryonic Stem Cells ClinicallyRelevant Populations:Lessons from Embryonic Development[J].Cell,2008,132:661-680.)。多能性干细胞具有无限自我更新和向体内任意细胞类型分化的潜能，理论上可以提供大量的肝脏干细胞，进而可以提供足量的功能性肝细胞。
国内外不同的实验室已经使用不同的方式来获得由hPSCs通过诱导产生的肝脏干细胞。例如，2014年Hans.Clever团队从手术切除的原代肝组织中分离细胞并通过表面标记EPCAM筛选细胞，使用细胞外基质胶Matrigel或者BME，结合细胞因子和小分子化合物的三维类器官培养方法成功在体外大量扩增了具有双向分化潜能的肝脏干细胞(Huch M,Gehart H,van Boxtel R,等.Long-Term Culture of Genome-Stable Bipotent StemCells from Adult Human Liver[J].Cell,2015,160:299-312.)，这种肝脏类器官培养方式为体外大量扩增肝脏干细胞以及功能性肝细胞奠定了良好的基础，然而原代肝脏组织毕竟存在来源和数量的限制，想要大规模应用到临床或者药物研究还具有一定的局限性。发明人也已经以人胚胎干细胞(商业来源的hESCs)为来源，使用序贯的先二维培养，后三维培养的方式获得了具有向功能性肝细胞和胆管细胞双向分化潜能的肝脏类器官(王璇，构建人多能性干细胞来源具有双向分化潜能的肝脏类器官的研究，河北医科大学，硕士论文，2018年)，利用该肝脏类器官通过三维诱导培养可以获得足量的功能性肝细胞，但是该方法获得的肝细胞大量表达不成熟功能标志甲胎蛋白(AFP)，对其应用来说具有较多的局限性。
发明内容
针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明的一个方面提供一种功能性肝细胞三维诱导培养基，包括第一阶段三维培养基和第二阶段三维培养基；其中：
所述第一阶段三维培养基以HCM培养基(Lonza)/HM培养基(Sciencell)为基础培养基，还包含0.01％-1％BSA、0.2％-10％B-27，以及以下组分中的一种或多种：抗氧化剂、L-抗坏血酸盐、ROCK信号通路抑制剂、肝细胞生成因子、抑瘤素M、地塞米松、青霉素和链霉素；
所述第二阶段三维培养基以HCM培养基(Lonza)/HM培养基(Sciencell)为基础培养基，还包含0.01％-1％BSA、0.2％-10％B-27，以及以下组分中的一种或多种：抗氧化剂、L-抗坏血酸盐、ROCK信号通路抑制剂、地塞米松、胰岛素-转铁蛋白-硒钠、表皮细胞生长因子、腺苷酸环化酶激动剂、维生素K2、石胆酸、青霉素和链霉素。
上述第一阶段三维培养基中，所述抗氧化剂为N-乙酰基-L-半胱氨酸，浓度为0.1-10mM，优选为1.25mM；所述L-抗坏血酸盐浓度为0.05-2mM，优选为0.2mM；所述ROCK信号通路抑制剂为Y-27632(StemCell)，浓度为5-20μM，优选为10μM；所述肝细胞细胞生长因子为HGF，浓度为5-50ng/mL，优选为20ng/mL；所述抑瘤素M为OSM，浓度为5-50ng/mL，优选为20ng/mL；所述地塞米松为Dex，浓度为0.1-1mM，优选为0.5μM；所述青霉素的浓度为10-1000U/mL，优选为100U/mL；所述链霉素的浓度为0.01-1mg/mL，优选为0.1mg/mL。
上述第二阶段三维培养基中，所述抗氧化剂为N-乙酰基-L-半胱氨酸，浓度为0.1-10mM，优选为1.25mM；所述L-抗坏血酸盐浓度为0.05-2mM，优选为0.2mM；所述ROCK信号通路抑制剂为Y-27632(StemCell)，浓度为5-20μM，优选为10μM；所述胰岛素-转铁蛋白-硒钠为ITS，浓度为0.5％-10％，优选为1％；所述表皮细胞生长因子为EGF，浓度为5-50ng/mL，优选为10ng/mL；所述地塞米松为Dex，浓度为0.1-1mM，优选为0.5μM；所述腺苷酸环化酶激动剂为8-Br-cAMP(Selleck)，浓度为50-200μM，优选为100μM；所述维生素K2为vitamin K2(Sigma)，浓度为5-20μM，优选为10μM；所述石胆酸为Lithocholic acid(Sigma)，浓度为5-20μM，优选为10μM；所述地塞米松为Dex，浓度为0.1-1mM，优选为0.5μM；所述青霉素的浓度为10-1000U/mL，优选为100U/mL；所述链霉素的浓度为0.01-1mg/mL，优选为0.1mg/mL。
上述第一阶段三维培养基的配方选自以下配方中的任一种：
配方1：以HCM/HM培养基为基础培养基，还包含1％B-27、0.1％BSA、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、10μM Y-27632、20ng/mL HGF、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
配方2：以HCM/HM培养基为基础培养基，还包含1％B-27、0.1％BSA、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、10μM Y-27632、0.2mM L-抗坏血酸盐、20ng/mL HGF、20ng/mL OSM、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
配方3：以HCM/HM培养基为基础培养基，还包含1％B-27、0.1％BSA、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、0.2mM L-抗坏血酸盐、10μM Y-27632、20ng/mL HGF、20ng/mL OSM、0.5μMDex、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素。
上述第二阶段三维培养基的配方选自以下配方中的任一种：
配方1：以HCM/HM培养基为基础培养基，还包含1％B-27、0.1％BSA、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、10μM Y-27632、1％ITS、10ng/mL EGF、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
配方2：以HCM/HM培养基为基础培养基，还包含1％B-27、0.1％BSA、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、10μM Y-27632、1％ITS、10ng/mL EGF、0.2mM L-抗坏血酸盐、0.5μM Dex、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
配方3：以HCM/HM培养基为基础培养基，还包含1％B-27、0.1％BSA、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、10μM Y-27632、1％ITS、10ng/mL EGF、0.2mM L-抗坏血酸盐、0.5μM Dex、100μM 8-Br-cAMP、10μM vitamin K2、10μM Lithocholic acid、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素。
本发明的另一方面还提供一种功能性肝细胞诱导方法，包括以下步骤：
S1：将多能性干细胞定向诱导分化为肝干/祖阶段细胞；其中所述多能性干细胞不包括直接分解自人胚胎或胚泡的人多能干细胞或胚胎干细胞；
S2：将步骤S1获得的肝干/祖阶段细胞使用三维扩增培养基进行三维扩增培养，获得肝脏类器官；
S3：将S2获得的肝脏类器官消化成单个细胞后使用上述的功能性肝细胞三维诱导培养基向功能性肝细胞进行诱导分化。
上述功能性肝细胞诱导方法中，在步骤S2之后和步骤S3之前还包括：
S2-1：将步骤S2获得的肝脏类器官用预分化培养基进行预处理；
步骤S3为将步骤S2-1预处理之后的肝脏类器官消化成单个细胞后使用上述的功能性肝细胞三维诱导培养基向功能性肝细胞进行诱导分化。
上述功能性肝细胞诱导方法中，步骤S2-1中所述预处理条件为：37℃、5％CO2培养箱中培养，培养时间为4天，其中每2天更换所述预分化培养基一次；所述预分化培养基以Advanced DMEM/F-12培养基为基础培养基，还包含0.01％-1％BSA、0.2％-10％B-27、0.2％-10％N2添加剂、1-50mM HEPES、0.1％-10％谷氨酰胺添加剂，以及以下组分中的一种或多种：抗氧化剂、胃泌素、Sirt1蛋白抑制剂、肝细胞生成因子、骨形态发生蛋白、成纤维生长因子、青霉素和链霉素；
优选地，所述抗氧化剂为N-乙酰基-L-半胱氨酸，浓度为0.1-10mM，优选为1.25mM；所述胃泌素为Gastrin，浓度为1-100nM，优选为10nM；所述Sirt1蛋白抑制剂为尼克酰胺，浓度为1-100mM，优选为10mM；所述肝细胞细胞生长因子为HGF，浓度为5-100ng/mL，优选为50ng/mL；所述骨形态发生蛋白为BMP7或BMP4，浓度为5-100ng/mL，优选为25ng/mL，所述成纤维生长因子为FGF2或FGF4，浓度为5-100ng/mL，优选为25ng/mL；所述青霉素的浓度为10-1000U/mL，优选为100U/mL；所述链霉素的浓度为0.01-1mg/mL，优选为0.1mg/mL；
进一步优选地，所述预分化培养基的配方为：以Advanced DMEM/F12培养基为基础培养基，还包含0.1％BSA、1％N2添加剂、1％B-27、1％谷氨酰胺添加剂、10mM HEPES、1.25mMN-乙酰基-L-半胱氨酸、10mM尼克酰胺、10nM Gastrin、25ng/mL BMP7、25ng/mL FGF4、50ng/mL HGF、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素。
上述功能性肝细胞诱导方法中，步骤S1中，所述多能性干细胞为H9系干细胞。
上述功能性肝细胞诱导方法中，步骤S2中所述三维扩增培养的条件为：37℃、5％CO2培养箱中培养，培养时间为9-10天，其中每2天更换为所述三维扩增培养基一次；和/或
上述功能性肝细胞诱导方法中，步骤S2中所述三维扩增培养基以Advanced DMEM/F-12培养基或Advanced RPMI 1640培养基作为基础培养基，还包含0.01％-1％BSA、0.2％-10％B-27、0.2％-10％N2添加剂、1-50mM HEPES、0.1％-10％谷氨酰胺添加剂，以及以下组分中的一种或多种：抗氧化剂、Sirt1蛋白抑制剂、胃泌素、TGF-β信号通路抑制剂、Wnt信号通路激动剂、表皮细胞生长因子、腺苷酸环化酶激动剂、青霉素和链霉素；
优选地，所述抗氧化剂为N-乙酰基-L-半胱氨酸，浓度为0.1-10mM，优选为1.25mM；所述Sirt1蛋白抑制剂为尼克酰胺，浓度为1-100mM，优选为10mM；所述胃泌素为Gastrin，浓度为1-100nM，优选为10nM；所述Wnt信号通路激动剂为Wnt3a和R-spondin 1，Wnt3a浓度为10-1000ng/mL，优选为100ng/mL，R-spondin 1浓度为10-1000ng/mL，优选为250ng/mL；所述TGFβ信号通路抑制剂为A83-01，浓度为0.1-10μM，优选为5μM；所述腺苷酸环化酶激动剂为佛司可林FSK，浓度为1-100μM，优选为10μM；所述表皮细胞生长因子为EGF，浓度为5-200ng/mL，优选为50ng/mL；所述青霉素的浓度为10-1000U/mL，优选为100U/mL；所述链霉素的浓度为0.01-1mg/mL，优选为0.1mg/mL；
进一步优选地，所述三维扩增培养基的配方选自以下配方中的任一种：
配方1：以Advanced DMEM/F-12培养基为基础培养基，还包含0.1％BSA、1％B-27、1％N2添加剂、10mM HEPES、1％谷氨酰胺添加剂、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、50ng/mLEGF、250ng/mL R-Spondin 1、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
配方2：以Advanced DMEM/F-12培养基为基础培养基，还包含0.1％BSA、1％B-27、1％N2添加剂、10mM HEPES、1％谷氨酰胺添加剂、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、10mM尼克酰胺、5μM A83-01、50ng/mL EGF、250ng/mL R-Spondin 1、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
配方3：以Advanced DMEM/F-12培养基为基础培养基，还包含0.1％BSA、1％B-27、1％N2添加剂、10mM HEPES、1％谷氨酰胺添加剂、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、10mM尼克酰胺、10nM Gastrin、5μM A83-01、10μM Forskin、50ng/mL EGF、100ng/mL Wnt3a、250ng/mLR-Spondin 1、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素。
上述功能性肝细胞诱导方法中，步骤S1中将多能性干细胞定向诱导分化为肝干/祖阶段细胞的具体方法为：
1)用Dispase把所述多功能肝细胞消化成单个细胞后进行接种，培养基为TeSR-E8培养基加10μM Y-27632(Stem Cell)促进细胞贴附；
2)待24h细胞贴附后，将细胞培养基更换为RPMI1640培养基(Gibco)，添加1％B-27(Gibco)，100ng/mL Activin A(R&D)，50ng/mL Wnt3a(R&D)，向定性内胚层阶段进行诱导分化；
3)隔日弃去废液，将细胞培养基更换为RPMI 1640培养基，添加1％B-27，100ng/mLActivin A作用一天；
4)重复步骤3)一次，定性内胚层阶段诱导结束；
5)隔日弃去废液，将细胞培养基更换为HCM培养基(Lonza)，添加10ng/mL FGF-2(R&D)，20ng/mL BMP-4(R&D)，共作用5天，每隔2天换一次培养基，诱导获得肝干/祖阶段细胞。
由上述的功能性肝细胞诱导方法诱导获得的功能性肝细胞也属于本发明的内容。
上述的功能性肝细胞作为制造人工肝脏、建立肝病治疗药物筛选模型、体外模拟肝功能模型以及体外模拟肝病模型的种子细胞的应用也属于本发明的内容。
基于以上技术方案提供的肝细胞三维诱导培养基，能够有效用于从使用序贯的先二维培养、后三维培养的方式获得的具有向功能性肝细胞和胆管细胞双向分化潜能的肝脏类器官。诱导获得功能性肝细胞的方法中，该三维诱导培养基无血清、无滋养层细胞，其诱导获得的功能性肝细胞功能更加成熟，大量表达肝细胞成熟的标志如ALB、CK18、AAT、TF、CYP3A4、CYP2C9、CPS1、ASS1等，而不成熟功能标志甲胎蛋白(AFP)的表达量大大降低，另外，诱导产生的肝细胞的白蛋白分泌、尿素合成、药物代谢、糖原合成、靛青绿摄取等功能均大大增强，可以更好地用于制造人工肝脏，以及作为建立肝病治疗药物筛选模型、体外模拟肝功能模型以及体外模拟肝病模型的理想的种子细胞。并且本发明提供的肝细胞的诱导方法中，使用到的多能性干细胞可商业获得，获取相对容易，可以稳定建系，也具有向肝干细胞进行分化的潜能，因此可以简单高效获得肝脏类器官，进而获得大量的功能性肝细胞。
附图说明
图1是本发明的技术路线图；
图2是多能性干细胞不同诱导阶段的相差图像(A)；hEHOs连续生长的相差图像(B)；hEHOs在第1代、第20代以及复苏冻存后的相差图像(C)；
图3是hEHOs在第1代-第3代以及第13代-第15代的生长曲线(A)；hEHOs在第1代以及第15代的核型分析结果，染色体数目＝46(B)；
图4是对于PHH、hAHOs、FSCs、HS、HB、hEHOs的第1代及第3代的全基因组RNA-Seq，主成分分析(A)；聚类分析(B)；热敏图(C)；
图5是hEHOs特异性肝干/祖细胞相关蛋白的免疫荧光图像；
图6是hEHOs诱导分化产生成熟肝细胞在第1天以及第15天的相差图像；
图7是hEHOs诱导分化产生成熟肝细胞与起始细胞hEHOs和原代肝细胞的基因水平表达柱状图；
图8是hEHOs诱导分化产生成熟肝细胞在肝脏相关蛋白的免疫荧光染色图像；
图9是hEHOs诱导分化产生的肝细胞的AFP/ALB免疫荧光染色图像及其定量；
图10是hEHOs诱导分化产生成熟肝细胞流式分析测试图；
图11是hEHOs诱导分化产生成熟肝细胞的功能鉴定，靛青绿的摄取与排泌相差图像(A-B)；糖原颗粒染色图(C)；CDFDA染色图(D)；
图12是hEHOs诱导分化产生成熟肝细胞功能定量检测柱状图；
图13是hEHOs诱导分化产生成熟肝细胞透射电镜图。
具体实施方式
本发明根据多能性干细胞向肝细胞进行分化的阶段规律，以肝谱系特化的早期阶段(Hepatic specification，HS)为肝脏类器官建立的起始，这一阶段被认为是肝脏干细胞存在的阶段。然后参照其他类器官的培养方法(Sato T,Vries RG,Snippert HJ等.SingleLgr5 stem cells build crypt–villus structures in vitro without a mesenchymalniche.Nature 2009；459:262.Eiraku M,Takata N,Ishibashi H等.Self-organizingoptic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.Nature 2011；472:51.Lancaster MA,Renner M,Martin C-A等.Cerebral organoids model human braindevelopment and microcephaly.Nature 2013；501:373.Takasato M,Er PX,Chiu HS等.Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and modelhuman nephrogenesis.Nature 2016；536:238.Huch M,Bonfanti P,Boj SF等.Unlimitedin vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.The EMBO Journal 2013；32:2708-2721.Yamamoto Y,Gotoh S,Korogi Y等.Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells inorganoids.Nature Methods 2017；14:1097)，由HS阶段大量高效的培养出肝脏类器官。其次根据现有技术中肝细胞诱导分化的方案(Rashidi H,Luu N-T,Alwahsh SM等.3D humanliver tissue from pluripotent stem cells displays stable phenotype in vitroand supports compromised liver function in vivo.Archives of toxicology 2018；92:3117-3129.Ogawa S,Surapisitchat J,Virtanen C等.Three-dimensional cultureand cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes.Development 2013；140:3285-3296.Gieseck RL,3rd,Hannan NRF,Bort R等.Maturation of induced pluripotent stem cell derived hepatocytes by3D-culture.PloS one 2014；9:e86372-e86372.Avior Y,Levy G,Zimerman M等.Microbial-derived lithocholic acid and vitamin K2 drive the metabolicmaturation of pluripotent stem cells–derived and fetal hepatocytes.Hepatology2015；62:265-278.)，本发明人在此基础上进行了适应性修改，建立了适合hEHOs向肝细胞分化的特殊三维诱导分化方法和三维诱导培养基。经过相应的诱导之后，对由hEHOs获得的肝细胞的形态学、基因表达、蛋白表达和重要的体外功能包括肝细胞的白蛋白分泌功能、药物代谢功能、尿素合成功能、糖原合成功能等各个层次进行了相应的检测。
以下将通过具体实施方式详细说明本发明。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。
所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。培养基中“％”的含义为相对于培养基总量的百分比浓度，单位为mL/100mL。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但不应作为对本发明内容的限制。
实施例1、肝细胞诱导培养
在该实施例中，以多能性干细胞(细胞系H9，人胚胎干细胞(human EmbryonicStem Cells)，购自美国Wicell研究中心)为起始细胞，如图1所示，依次经过定性内胚层阶段、肝干/祖细胞阶段和肝脏类器官阶段，进而诱导获得肝细胞。具体包括以下步骤：
1.1、细胞系H9细胞的培养
1)提前一天把Matrigel(Corning)从-80℃冰箱取出，置于4℃冰箱融化，待其融化后，用预冷的DMEM/F12培养基(Gibco)按1:100比例稀释Matrigel。
2)将稀释好的Matrigel均匀铺于六孔板，每孔1mL，置于37℃培养箱孵育1小时备用。
3)从37℃培养箱中取出待传代的H9细胞，吸去废液，用DMEM/F12培养基洗一遍。
4)每孔加入1mL 0.1mg/mL Dispase(Sigma)消化细胞，置于37℃培养箱8-10min。
5)弃去Dispase，用DMEM/F12培养基轻轻地洗两遍，每孔再加入1mL DMEM/F12培养基，用枪头轻刮贴附于孔底的细胞克隆，将刮下来的细胞转移至15mL离心管，再用DMEM/F-12培养基洗一遍原孔，一起放入15mL离心管。
6)室温1000rpm，3min离心。
7)弃去上清，用TeSR-E8培养基(StemCell)轻轻地重悬细胞。
8)接种于含有提前包被Matrigel的六孔板中，每天给细胞换液。
1.2、H9细胞系向肝干/祖细胞诱导分化
该步骤中继续对步骤1.1中培养的H9细胞进行诱导分化，具体包括以下步骤：
1)待步骤1.1中培养的H9细胞在孔内融合度达到70-80％左右，细胞可开始进行诱导。
2)提前3小时将Matrigel，Laminin(Gibco)，Collagen IV(Gibco)按3:1:1比例均匀涂抹于24孔板，室温超净台(北京东联哈尔技术有限公司)内晾干。
3)按上述步骤1.1中H9细胞系传代的操作步骤，用Dispase把H9细胞消化成单个细胞，按1×105密度接种于步骤2)的24孔板中，培养基为TeSR-E8培养基加10μM Y-27632(Stem Cell)促进细胞贴附。
4)待24h细胞贴附后，将细胞培养基更换为RPMI1640培养基(Gibco)，添加1％B-27(Gibco)，100ng/mL Activin A(R&D)，50ng/mL Wnt3a(R&D)，向定性内胚层阶段进行诱导分化。
5)隔日弃去废液，将细胞培养基更换为RPMI 1640培养基，添加1％B-27，100ng/mLActivin A作用一天。
6)隔日弃去废液，将细胞培养基更换为RPMI 1640培养基，添加1％B-27，100ng/mLActivin A再作用一天。定性内胚层阶段诱导结束，向肝干/祖细胞阶段进行诱导。
7)隔日弃去废液，将细胞培养基更换为HCM培养基(Lonza)，添加10ng/mL FGF-2(R&D)，20ng/mL BMP-4(R&D)，共作用5天，每隔2天换一次液体，肝干/祖阶段细胞诱导结束。
对以上步骤中不同诱导阶段的细胞形态进行观察，结果如图2A所示，可见：在不同的诱导阶段细胞(多能性干细胞-定性内胚层阶段细胞-肝干/祖细胞)呈现出不同的细胞形态。
1.3、肝干/祖阶段细胞的三维扩增培养
该步骤中继续对上述步骤1.2获得的肝干/祖阶段细胞进行三维扩增培养，具体包括以下步骤：
1)上述步骤1.2中肝干/祖阶段作用结束后，用1×PBS(无Ca2+、Mg2+PBS的配制：将8g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH2PO4，1.44g Na2HPO4溶于1L去离子水中，待充分溶解后使用0.22μm滤膜过滤并放入高压锅高压蒸汽灭菌后使用，下同)洗两遍，然后用0.25％Trypsin-EDTA(Gibco)消化成单个细胞，用胎牛血清(Gibco)终止消化。
2)室温1000rpm，离心5min。
3)提前把BME-2(R&D)和/或Matrigel置于冰上备用。
4)将离心好的细胞用BME-2或Matrigel进行重悬，以每孔30-50μL的液滴(3,000-10,000个细胞密度)接种于低吸附24孔板中，置于37℃培养箱孵育7-8min。
5)待胶凝固后，往孔内添加三维扩增培养基(配方为：Advanced DMEM/F12培养基+0.1％BSA(Gibco)+1％N2添加剂+1％B-27+1％谷氨酰胺添加剂(Glutamax，Gibco)+N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine，1.25mM，Sigma)+Gastrin(10nM，Sigma)+尼克酰胺(Nicotinamide，10mM，Sigma)+HEPES(10mM，Gibco)+A83-01(5μM，Selleck)+Forskolin(10μM，Selleck)+R-spondin1(250ng/mL，R&D)+EGF(50ng/mL，R&D)+Wnt3a(100ng/mL，R&D)+100U/mL青霉素+0.1mg/mL链霉素)。
6)每隔两天更换一次三维扩增培养基。三维扩增培养肝干/祖细胞后获得肝脏类器官(hEHOs)。
该肝脏类器官(hEHOs)是具有自我更新能力的干细胞群，可双向分化为功能性肝细胞和胆管细胞，在向成熟肝细胞进行三维诱导分化后与肝脏器官拥有类似的空间组织并能够重现肝脏器官的部分功能，从而能够复制和模拟体内肝组织的三维环境。
其中步骤5)中的三维扩增培养基的配方还可以为以下配方中的任一种：
配方1：以Advanced DMEM/F-12培养基为基础培养基，还包含0.1％BSA、1％B-27、1％N2添加剂、10mM HEPES、1％谷氨酰胺添加剂、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、50ng/mLEGF、250ng/mL R-Spondin 1、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
配方2：以Advanced DMEM/F-12培养基为基础培养基，还包含0.1％BSA、1％B-27、1％N2添加剂、10mM HEPES、1％谷氨酰胺添加剂、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、10mM尼克酰胺、5μM A83-01、10μM Forskolin、50ng/mL EGF、250ng/mL R-Spondin 1、100ng/mLWnt3a、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素。
对上述步骤1.3获得的肝脏类器官进行以下处理和功能验证。
1.3.1、肝脏类器官的传代
1)待上述步骤1.3中的细胞扩增培养7-9天左右后进行连续传代培养，按1:6-8比例进行传代，先在原孔内以机械法把细胞吹散，然后把细胞转移至15mL离心管，冰上预冷30min。
2)室温800rpm，离心3min。
3)弃去上清，再添加Accutase(Sigma)把细胞消化成小块。
4)室温1000rpm，离心5min。
5)用上述步骤1.3中的三维扩增培养基进行重悬细胞，三维扩增培养基也为传代培养基，接种方法如上所述。
6)每隔两天换一次培养基。
1.3.2、肝脏类器官的冻存
1)待上述步骤1.3.1中细胞传代培养7-10天左右后，按前述步骤1.3.1中方法进行消化，离心。
2)离心后弃去废液，采用无血清快速细胞冻存液(StemCell)进行冻存细胞，放置于液氮中可长期保存。
1.3.3、肝脏类器官的复苏
1)提前把水浴锅(北京长风仪器仪表公司)预热至42℃。
2)从液氮中取出上述步骤1.5冻存的细胞，在42℃水浴锅内进行快速解冻。
3)待细胞解冻后，转移至15mL离心管。
4)室温1000rpm，离心5min。
5)弃去上清，复苏培养基和上述步骤1.3中的扩增培养基相同，但在前两天的培养中加入10μM Y-27632(Stem Cell)促进细胞聚合。
6)两天后弃去废液，更换为无Y-27632的三维扩增培养基。
7)待细胞培养7-10天左右，按上述方法进行传代培养。
对肝脏类器官连续生长的形态进行观察，结果如图2B所示，示出了其从第0天至第10天的形态图，可见肝脏类器官生长状态良好；对肝脏类器官的传代和复苏冻存后的形态进行观察，结果如图2C所示，示出了肝脏类器官第1代以及第20代，和复苏冻存后的形态图，可见肝脏类器官传代至第20代仍然保持活力和较高的存活力，复苏冻存后细胞形态清晰。
1.3.4、倍增曲线
1)将上述经传代后的细胞按照每孔1×104细胞密度接种在上述三维扩增培养基中培养8-10天；
2)将获得的肝脏类器官用Accutase酶消化成单个细胞，每个时间点用血球计数板进行台盼蓝计数；
3)增殖曲线按照y(t)＝y0×e(生长率×t)(y＝最终时间点的细胞数；y0＝每个时间点的细胞数；t＝时间)进行定量计算；
4)倍增时间按照ln(2)/生长率计算每个时间点。
结果如图3A所示，示出了肝脏类器官的倍增曲线，可见肝脏类器官从第1代到第3代的细胞倍增时间为62.24±1.09小时，第13代到第15代的细胞倍增时间为68.69±1.84小时，可见在长期传代培养过程中，肝脏类器官仍维持着细胞倍增时间的稳定增长。
1.3.5、核型分析
1)在上述1.3.4中培养的第1代和第15代的肝脏类器官培养基中添加40ng/mL秋水仙碱，37℃培养箱内孵育4小时。
2)4小时后，1×PBS洗两遍。
3)用Accutase酶消化成单个细胞，按照标准核型分析操作步骤进行操作。
肝脏类器官的核型分析结果如图3B所示，可见肝脏类器官第1代和第15代的细胞核型均正常，染色体数n＝46。
1.3.6、确定hEHOs的发育阶段
1.3.6.1、前肠干细胞(FSCs)、成人肝来源的肝脏类器官(hAHOs)、肝祖细胞(HB)、原代人肝细胞(PHH)的获得
(1)前肠干细胞(FSCs)的获得
1)人多能性干细胞(可商购获得的多能性干细胞系ESC或iPSC，例如H1、H7、H9、H13和H14等)来源的定性内胚层细胞在RPMI 1640培养基基础上添加2％B27和50ng/mLActivin A中培养3-4天；
2)把上述获得的定性内胚层细胞用0.25％胰酶进行消化并重新接种于Matrigel包被的孔板内；
3)前肠干细胞培养基以RPMI 1640培养基为基础，添加1％B27、1％NEAA(Gibco)、10ng/mL Activin A、20ng/mL bFGF、10ng/mL BMP4、20ng/mL HGF、50ng/mL EGF，作用3天，即为获得的前肠干细胞。
(2)肝祖细胞(HB)
人多能性干细胞(可商购获得的多能性干细胞系ESC或iPSC，例如H1、H7、H9、H13和H14等)来源的肝谱系特化早期阶段(HS)在HM培养基基础上，添加1％B27、0.2mM L-抗坏血酸盐、4.5×10-4MTG(Sigma)、20ng/mL HGF、0.5μM Dex、20ng/mL OSM，作用9天，即为获得的肝祖细胞。
(3)原代人肝细胞(PHH)的获得
1)原代人肝细胞的分离方法参照已发表文献(Lecluyse EL,AlexandreE.Isolation and culture of primary hepatocytes from resected human livertissue.Methods Mol Biol 2010；640:57-82.)中改进的两步胶原酶灌注法，其中使用到的原代人肝组织是从肝移植手术中的供体获得，征得北京友谊医院患者的知情同意。该方法经北京友谊医院和军事医学研究院卫生勤务与血液研究所医学伦理委员会批准；
2)原代人肝组织用含0.5mM EGTA(Sigma)和0.5％BSA的HBSS溶液冲洗15-30分钟，用已预热的1mg/mL IV型胶原酶(Sigma)灌注20-40分钟；
3)消化得到的肝细胞悬液过100μm滤网，75g离心3分钟；
4)细胞沉淀重悬于Percoll(GE healthcare，密度1.130g/mL)溶液，100-150g室温离心10分钟；
5)细胞沉淀用DMEM/F12(Gibco)洗三遍；
6)原代人肝细胞接种培养基为Williams’E培养基(Gibco)添加1％谷氨酰胺、5％胎牛血清(Gibco)，接种细胞于I型胶原(Corning)包被的孔板；
7)待细胞贴附4-10小时后，培养基更换为HM培养基。
(4)成人肝来源的肝脏类器官(hAHOs)的获得
1)成人肝来源的肝脏类器官(hAHOs)参照已发表文献(Huch M,Gehart H,vanBoxtel R等.Long-Term Culture of Genome-Stable Bipotent Stem Cells from AdultHuman Liver.Cell 2015；160:299-312.Broutier L,Andersson-Rolf A,Hindley CJ等.Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver andpancreas 3D organoids and their genetic manipulation.Nature Protocols 2016；11:1724.)方法进行分离培养，其中使用到的原代人肝组织是从肝移植手术中的供体获得，征得北京友谊医院患者的知情同意。该方法经北京友谊医院和军事医学研究院卫生勤务与血液研究所医学伦理委员会批准；
2)流式分选EpCAM+(BD biosciences,PE-CD326)细胞重悬于Matrigel或BME2，按照3000-10000细胞接种于低吸附24孔板；
3)hAHOs培养基以Advanced DMEM/F12为基础，添加1％N2、1％B27、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、10nM gastrin、10mM尼克酰胺、1％谷氨酰胺、5μM A83-01、10μMForskolin、50ng/mL EGF、250ng/mL R-Spondin 1、50ng/mL EGF、100ng/mL FGF10、25ng/mLHGF、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素，作用10-14天；
4)hAHOs传代、冻存复苏如1.3.1-1.3.3所述
1.3.6.2、Trizol法提取hEHOs第1代及第3代细胞的RNA样品；作为参照，同法提取前肠干细胞(FSCs)、成人肝来源的肝脏类器官(hAHOs)、肝祖细胞(HB)、HS细胞(根据上述步骤1.2中多能性干细胞诱导分化过程获得)、原代人肝细胞(PHH)的RNA样品：
1)按10cm2/mL的比例分别向上述细胞培养液中加入Trizol细胞裂解液(Gibco)，室温放置5min使细胞充分裂解，RNA充分溶出；
2)12000rpm，5min，4℃条件下离心，弃沉淀；
3)按200μL氯仿/ml Trizol加入氯仿溶液，刷推15s，振荡混匀后，室温放置10min；
4)12000rpm，5min，4℃离心；
5)溶液分层，共分为三层，RNA位于上层水相，DNA和蛋白位于中间层面和下层酚，只吸取上层水相至另一个1.5ml EP管；
6)按500μL异丙醇/ml Trizol加入预冷的异丙醇溶液，上下颠倒混匀，室温放置10min；
7)12000rpm，10min，4℃离心，弃上清液，RNA沉于1.5ml EP管底；
8)按1ml 75％乙醇/ml Trizol加75％乙醇溶液，温和振荡1.5ml EP管；
9)12000rpm，5min，4℃离心，弃上清液；
10)超净台干燥5-10min；
11)加入15-20μL无RNA酶的水溶液RNA，室温放置3-5min并充分混匀；
12)Nanodrop 2000(Thermo)测定RNA浓度。
1.3.6.3、基因测序处理及分析(北京安诺优达公司协作完成)
根据步骤1.3.6.1中提取的FSCs、hAHOs、HB、hEHOs第1代及第3代、HS、PHH的RNA样品，使用Illumina 
UltraTM RNA Library Prep试剂盒(E7530L,NEB,USA)用于产生RNA测序文库。测序由安诺优达公司(中国)进行，使用Noves6000进行RNA测序。通过DESeq2分析差异表达的基因(DEG)，其中q≤0.05和|log2_ratio|≥1的基因被鉴定为DEG。使用R包进行热图生成和主成分分析。上述6种细胞的原始RNA数据已上传至GeneExpression Omnibus database(accession number GSE128717)。
为了确定hEHOs的发育阶段，转录组由包括第1代和第3代细胞的hEHOs，hESC(人多能性干细胞，例如H9细胞系)衍生的FSC细胞，HS细胞，HB细胞，hAHOs细胞和PHH细胞建立。如图4中A幅所示，主成分分析显示每个分析组的清晰聚类，并且hEHO(第1代和第3代)稳定地显示出与HS和HB更多的相似性，但与它们保持不同。如图4中B幅所示，层级分层聚类分析显示，hEHOs介于FSC和两组未成熟肝系(HS和HB)之间，与HS和HB密切相关，远离PHH。如图4中C幅所示，成熟肝细胞标志物(包括CYP3A4，CYP1A2，CYP2E1，CYP2A6，CYP2C8，CYP2C9和CYP2D6)的显著表达在PHH中，而前肠特异性转录因子包括SOX17，SOX2和CER1在FSC中表达。hEHOs显示了早期肝脏发育的几种转录因子(PROX1，ONECUT2、SOX9、FGFR4,FOXA1，FOXA3和ONECUT1)基因的激活，而Wnt信号传导的上调成分(LGR5,ZNRF3,RNF43,AXIN2,CD44,DKK1,WNT7A和WNT10A)在hAHOs中表达，表明hEHOs在全基因组基因表达谱上显示与HS和HB相似。
1.3.7、细胞免疫荧光
1)将HS细胞及肝脏类器官用4％多聚甲醛(配方：将3.56g NaOH，42.7g PFA，13.6gKH2PO4溶于1L PBS中，磁力搅拌器65℃加热搅拌至澄清透亮后分装使用)室温固定15-20min，PBS洗两遍。
2)0.25％Triton X-100(Sigma)破膜10-15min，PBS洗两遍。
3)用和二抗(如下表2中所示)种属来源相同的血清室温封闭1小时。
4)用和二抗种属来源相同的血清稀释一抗(如下表1中所示)，一抗的浓度按说明书进行稀释，一抗4℃冰箱孵育过夜，PBS洗三遍。
5)用和二抗种属来源相同的血清稀释二抗，二抗室温避光孵育1小时，PBS洗三遍。
6)用DAPI(Sigma)衬染细胞核，室温避光孵育10分钟，PBS洗三遍。
7)水溶性封片剂封片。
8)激光共聚焦显微镜下观察并照相(Nikon TiE-A1)。
免疫荧光结果如图5所示，可见肝脏类器官表达肝干/祖细胞的特异性蛋白SOX9、EPCAM、CK19、HNF4A、TBX3，表达不成熟肝细胞的蛋白AFP，不表达肝细胞成熟的蛋白ALB，不表达干性标志OCT4、SOX2，细胞保持增殖特性，Ki67蛋白呈阳性表达。
表1：用于肝脏类器官(hEHOs)免疫荧光检测的第一抗体
| 一抗 | 公司来源 | 货号 | 一抗种属 | 稀释比 |
| AFP(甲胎蛋白) | Abcam | Ab169552 | 兔 | 200 |
| AFP(甲胎蛋白) | Sigma | A8452 | 小鼠免疫球蛋白2a | 200 |
| EPCAM(上皮细胞粘附分子) | Neomarker | MS-181 | 小鼠免疫球蛋白1 | 200 |
| EPCAM(上皮细胞粘附分子) | CST | 2929 | 小鼠免疫球蛋白1 | 800 |
| ALB(Albumin) | Bethyl | AF2400 | 山羊免疫球蛋白 | 200 |
| ALB(Albumin) | R&D | MAB1455 | 小鼠免疫球蛋白2a | 200 |
| SOX9(性别决定区域Y基因9) | Abcam | Ab185966 | 兔 | 100 |
| CK19(细胞角蛋白19) | Abcam | ab7754 | 小鼠免疫球蛋白2a | 200 |
| CK19(细胞角蛋白19) | Abcam | Ab52625 | 兔 | 100 |
| TBX3(T-框蛋白3) | Abcam | Ab99302 | 兔 | 100 |
| OCT4(八聚体结合转录因子4) | Abcam | Ab19857 | 兔 | 100 |
| SOX2(性别决定区Y框蛋白2) | R&D | 245610 | 小鼠免疫球蛋白2a | 100 |
| HNF4A(肝细胞核因子4) | Santa Cruz | sc-6556 | 山羊免疫球蛋白 | 100 |
| Ki67 | Thermo | 14-5698-80 | 大鼠免疫球蛋白2a | 200 |
表2：用于肝脏类器官(hEHOs)免疫荧光检测的第二抗体
1.4、hEHOs向肝细胞诱导分化
在该实施例中，发明人针对hEHOs的表型特点，建立了适合hEHOs向肝细胞分化的三维悬浮诱导方案和三维诱导培养基，具体包括以下步骤：
1)将hEHOs在BME或Matrigel提前预处理4天，其中预处理培养基为AdvancedDMEM/F12、0.1％BSA、1％N2添加剂、1％B-27、1％谷氨酰胺添加剂、10mM HEPES、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、10mM尼克酰胺(Nicotinamide)、10nM Gastrin(Sigma)、25ng/mL BMP7(骨形态发生蛋白7，其还可以为骨形态发生蛋白4)、25ng/mL FGF4(成纤维生长因子4，其还可以为成纤维生长因子2)、50ng/mL HGF、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素。
2)将hEHOs细胞加入0.25％Trypsin-EDTA，把细胞消化成单个细胞。
2)室温1000rpm，离心5min。
3)弃去上清，加入第一阶段肝细胞三维诱导培养基重悬细胞，按照1～1.5×105密度接种于低吸附24孔板每孔中，第一阶段三维诱导培养基为HM(ScienCell)/HCM(Lonza)+0.1％BSA+1％B-27+0.2mM L-抗坏血酸盐+1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸+20ng/mL HGF+20ng/mL OSM(R&D)+10μM Y-27632+0.5μM Dex+100U/mL青霉素+0.1mg/mL链霉素。
4)每隔三天更换一次培养基，诱导3天。
5)3天后，更换为第二阶段肝细胞三维诱导培养基，第二阶段三维诱导培养基为HM/HCM+0.1％BSA+1％B-27+0.2mM L-抗坏血酸盐+1％胰岛素-转铁蛋白-硒钠(ITS)+10μMY-27632+0.5μM Dex+10ng/mL EGF+100μM 8-Br-cAMP(Selleck)+10μM VK2(vitamin K2，Sigma)+10μM LCA(Lithocholic acid，Sigma)+100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素。
6)每隔两天换一次培养基，第一阶段诱导和第二阶段诱导总共诱导周期为15天。
如图6所示，第1天将hEHOs消化成单个细胞接种，并添加诱导培养进行诱导培养后，大约在15天左右可以长成直径为100-150μm的边缘光滑的三维细胞球，即诱导获得的肝细胞。
其中上述第一阶段三维诱导培养基的配方还可以为：
配方1：以HCM/HM培养基为基础培养基，还包含1％B-27、0.1％BSA、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、10μM Y-27-632、20ng/mL HGF、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
配方2：以HCM/HM培养基为基础培养基，还包含1％B-27、0.1％BSA、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、10μM Y27-632、0.2mM L-抗坏血酸盐、20ng/mL HGF、20ng/mL OSM、0.5μMDex、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素。
上述第二阶段三维诱导培养基的配方还可以为：
配方1：以HCM/HM培养基为基础培养基，还包含1％B-27、0.1％BSA、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、10μM Y-27632、1％ITS、10ng/mL EGF、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
配方2：以HCM/HM培养基为基础培养基，还包含1％B-27、0.1％BSA、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、10μM Y27-632、1％ITS、10ng/mL EGF、0.2mM L-抗坏血酸盐、0.5μM Dex、100μM 8-Br-cAMP、10μM VK2、10μM LCA、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素。
实施例2：肝细胞形态及功能验证
2.1、RNA提取、反转录及实时定量PCR
该步骤中使用RNA提取试剂盒(Qiagen)进行RNA提取，使用反转录试剂盒(TOYOBO)进行反转录，使用实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad)进行实时定量PCR。
1)收集上述实施例1诱导后的肝细胞(三维细胞球)，在收集的细胞中加入适量的裂解液Buffer RLT(Qiagen)充分裂解细胞。
2)加入等体积的70％乙醇到上述裂解液中，用移液枪混匀，并转移至spincolume，室温12000rpm，离心30s。
3)弃废液，加入700μL的Buffer RW1至spin colume，室温12000rpm，离心30s。
4)弃废液，加入500μL的Buffer RPE至spin colume，室温12000rpm，离心30s。
5)弃废液，加入500μL的Buffer RPE至spin colume，室温12000rpm，离心2min。
6)弃废液，室温12000rpm空离1min。
7)把spin colume转移至新的1.5mL的收集管内，加入30μL RNeasy-free water，室温12000rpm，离心1min。收集管内的液体即为RNA提取液。
8)使用NanoDrop 2000检测提取液中RNA浓度。
9)按1μg的RNA总量反转，RNA和RNeasy-free water的总体积为16μL，65℃加热5min变性，然后快速转移至冰上预冷2min。
10)加入4μL反转录试剂中的5×RT.MM，达到总体积为20μL的量，设置普通PCR仪的反转录程序为37℃15min，50℃5min，98℃5min，4℃终止。
11)准备三蒸水，将反转录得到的cDNA，及SYBR GREEN(TOYOBO)一起配制Q-PCR的混合物，提前于96孔板中加入引物(下表3所示的引物，每对引物的用量是2OD，每孔中加入表3所示引物的混合物)，每孔总体系为20μL(体系包括：引物、SYBR GREEN、cDNA、Mix)，封闭膜封闭96孔板(Bio-Rad)，放入实时定量PCR仪中，检测程序为：95℃3min，95℃10s，60℃35s，65℃5s，95℃5s，总共循环40次。实时定量PCR扩增结果如图7所示。
表3：PCR引物序列
如图7所示，示出了由hEHOs诱导分化的肝细胞的实时定量PCR结果，可见无论是由第1代hEHOs诱导获得的hEHOs(第1代)诱导肝细胞，还是由第15代hEHOs诱导获得的hEHOs(第15代)诱导肝细胞，与诱导前的hEHOs相比，诱导获得的肝细胞在肝脏成熟相关的基因(HNF4A，AAT，CK18，TAT，TF，G6PC，ALB)，尿素代谢相关的基因(OTC，CPS1，ASS1，ASL，ARG1)，药物代谢相关基因(CYP3A4，CYP2C9，CYP2E1)，核受体基因(CAR，PXR，FXR)的表达上均明显上调，其中某些基因和原代肝细胞的基因表达水平很接近，例如TF、ALB基因等，显示了hEHOs向肝细胞的成熟分化。
2.2、hEHOs来源的肝细胞的免疫荧光分析
1)将实施例1诱导获得的肝细胞(三维细胞球)用4％多聚甲醛(同实施例1)室温固定15-20min，PBS洗两遍。
2)0.25％Triton X-100(Sigma)破膜10-15min，PBS洗两遍。
3)用和二抗(如上表2所示)种属来源相同的血清室温封闭1小时。
4)用和二抗种属来源相同的血清稀释一抗(如下表4中所示)，一抗的浓度按说明书进行稀释，一抗4℃冰箱孵育过夜，PBS洗三遍。
5)用和二抗种属来源相同的血清稀释二抗，二抗室温避光孵育1小时，PBS洗三遍。
6)用DAPI(Sigma)衬染细胞核，室温避光孵育10分钟，PBS洗三遍。
7)水溶性封片剂封片。
8)激光共聚焦显微镜下观察并照相(Nikon TiE-A1)。
9)Image J软件计算免疫荧光定量结果。
10)按照上述步骤1)-9)的方法对实施例1诱导获得的肝细胞(本发明组)和本发明人之前(王璇，构建人多能性干细胞来源具有双向分化潜能的肝脏类器官的研究，河北医科大学，硕士论文，2018年)由肝脏类器官诱导获得的肝细胞(对照组)中的AFP/ALB进行免疫荧光定量染色。
实施例1诱导获得的肝细胞免疫荧光结果如图8所示，可见肝脏成熟相关的蛋白(ALB，AAT，TF，HNF4A，CK18，CYP3A4，CPS1)均有显著表达，且不成熟相关蛋白AFP的表达较弱，可见由hEHOs诱导分化获得的肝细胞更接近于成熟肝细胞。
本发明组和对照组的肝细胞中的AFP/ALB的免疫荧光染色结果如图9所示，其中图9中A幅表示对照组的染色结果，图9中B幅表示本发明组的染色结果，可见本发明组诱导获得的肝细胞相对于对照组诱导获得的肝细胞中肝脏成熟相关的蛋白ALB的表达量显著提高，不成熟相关蛋白AFP的表达量显著降低，可见实施例1中由hEHOs诱导分化获得的肝细胞相对于本发明人之前诱导获得的肝细胞更接近于成熟肝细胞。
表4：用于肝细胞免疫荧光检测的第一抗体
| 一抗 | 公司来源 | 货号 | 一抗种属 | 稀释比 |
| AAT(天门冬氨酸氨基转移酶) | Abcam | ab166610 | 兔 | 100 |
| AFP(甲胎蛋白) | Abcam | ab169552 | 兔 | 200 |
| ALB(Albumin) | Bethyl | AF2400 | 山羊免疫球蛋白 | 200 |
| ALB(Albumin) | R&D | MAB1455 | 小鼠免疫球蛋白2a | 200 |
| TF(转铁蛋白) | Abcam | ab82411 | 兔 | 200 |
| CPS1(氨甲酰磷酸合成酶) | Santa cruz | sc-30060 | 兔 | 200 |
| CK18(细胞角蛋白18) | Abcam | ab181597 | 兔 | 200 |
| CYP3A4(细胞色素P4503A4酶) | Santa Cruz | sc-53850 | 小鼠免疫球蛋白1 | 100 |
| MRP2(多药耐药相关蛋白-2) | Abcam | ab172630 | 兔 | 200 |
| HNF4A | Santa Cruz | sc-6556 | 兔 | 100 |
2.3、hEHOs来源的肝细胞的流式细胞分析
1)用Accutase酶把hEHOs诱导分化的肝细胞消化成单个细胞；
2)细胞在4％多聚甲醛(同步骤2.2)室温固定15分钟，用1×PBS洗两遍；
3)用和二抗种属来源相同的血清室温封闭30分钟；
4)一抗(上表4所示)室温孵育1小时，用1×PBS洗三遍；
5)二抗(上表2所示)室温避光孵育40分钟，用1×PBS洗三遍；
6)细胞重悬于1×PBS，上机前用70μm滤网过滤，用流式细胞分析仪进行分析。
肝细胞流式结果如图10所示，可见ALB阳性的肝细胞大约93％，ALB和AAT双阳性的细胞比例为92.7％，表明肝细胞诱导分化的效率较高；还有20％的肝细胞为ALB阳性和AFP双阳性，这群细胞接近于不成熟的胎肝细胞，占比较少。可见根据本发明的方法诱导获得的肝细胞更加成熟。
2.4、肝功能检测
2.4.1、糖原颗粒染色(PAS)
1)将hEHOs诱导的肝细胞用4％PFA(Sigma)在1.5mLEP管内室温固定15-20min，固定结束后，用PBS洗两遍。
2)加入高碘酸溶液(Periodic Acid Solution)，室温孵育5min。
3)室温1000rpm，离心4min，弃去废液，加入PBS洗两遍。
4)加入希夫试剂(Schiff’s Reagent，Sigma)，室温孵育15min。
5)离心收集细胞，加入PBS洗三遍，每次洗5min。
6)加入苏木素(Vector laboratories)溶液衬核90s。
7)用PBS洗三遍，每次洗5min，倒置相差显微镜(Leica)下观察并摄取图像。
2.4.2、靛青绿(Indocyanine Green,ICG，Sigma)摄取与排泌
1)收集hEHOs诱导的肝细胞，用PBS洗一遍。
2)加入1mg/mL的ICG(Sigma)试剂，37℃培养箱孵育30min。
3)结束后，用PBS洗三遍，加入PBS。
4)倒置相差显微镜(Leica)下观察细胞摄取ICG的图像，并拍照。
5)摄像结束后，去除PBS，加入新鲜的第二阶段肝细胞诱导培养基(同上)，放于37℃培养箱继续培养观察。
6)每隔1h镜下观察细胞排泌ICG的现象，直到细胞完全排出ICG并照相。
7)更换为新鲜的第二阶段的肝细胞诱导培养基放入37℃培养箱继续培养。
2.4.3、CDFDA(Sigma)染色
1)收集hEHOs诱导的肝细胞用PBS洗一遍。
2)加入2μM CDFDA试剂在37℃培养箱内孵育30min。
3)离心弃去废液，加入预冷的PBS洗三遍。
4)激光共聚焦显微镜(ZEISS)下观察细胞内微胆管的染色并摄取图像。
上述2.4.1-2.4.3的结果如图10所示，其中图11中A-D幅分别表示：靛青绿摄取、靛青绿排泌、糖原颗粒染色以及CDFDA染色结果，显示了由hEHOs诱导的肝细胞具备肝细胞的特异性功能：如靛氰绿(ICG)的摄取和排泌、糖原颗粒的储存(PAS)、微胆管的排泌功能(CDFDA)。
2.4.4、Albumin的ELISA检测
该步骤中采用人BSA检测试剂盒(Bethyl Laboratories)对Albumin进行ELISA检测，具体包括以下步骤：
1)提前24h把hEHOs的第二阶段肝细胞三维诱导培养基更换为以无酚红的HM培养基，同时做两个空白对照孔，放入37℃培养箱培养24h。
2)24h后离心收集细胞上清。
3)提前配制工作液，按照试剂盒的说明书把20×Buffer C稀释成1×Buffer C，20×Wash Buffer稀释成1×Wash Buffer。
4)在已经包被ALB抗体的96孔板内分别加入100μL的标准品、待测样品和空白对照，每个样品设置三个重复孔。
5)室温孵育1h。
6)倒尽孔中液体，每孔加入200μL的1×Wash Buffer洗四遍。
7)每孔加入100μL的Anti-albumin Detection Antibody。
8)室温孵育1h。
9)倒尽孔中液体，每孔加入200μL的1×Wash Buffer洗四遍。
10)每孔加入100μL的HRP Solution A。
11)倒尽孔中液体，每孔加入200μL的1×Wash Buffer洗四遍。
12)每孔加入100μL的TMB Substrate。
13)室温避光孵育30min。
14)每孔加入100μL的终止液
15)30min以内用酶标仪检测波长为450nm的吸光度值。
16)绘制标准曲线并根据曲线计算结果。
2.4.5、尿素检测
该步骤采用尿素检测试剂盒(BioAssay Systems)进行检测尿素，具体包括以下步骤：
1)提前24h把hEHOs的第二阶段肝细胞三维诱导培养基更换为含10mM氯化铵的无酚红HM培养基，37℃培养箱孵育24h。
2)24h后离心收集细胞上清。
3)提前配制尿素检测的工作液，即等体积的A液加上等体积的B液。
4)每孔加入50μL的标准品、待测样品和超纯水。
5)每孔加入200μL的尿素检测工作液，轻拍板子混匀。
6)室温孵育20min，若待测样品尿素含量较低，室温孵育50min。
7)20min以内用酶标仪检测波长为520nm的吸光度值。
8)根据公式计算结果。
2.4.6、CYP3A4酶活检测
该步骤采用CYP3A4检测试剂盒(Promega)进行CYP3A4酶活检测，具体包括以下步骤：
1)收集hEHOs诱导的肝细胞，加入含有3μM Luciferin-IPA的无酚红的HM培养基制备待测样品，并设置3μM Luciferin-IPA空白对照孔。
2)37℃培养箱孵育1h。
3)室温1000rpm，离心5min收集上清，细胞用PBS洗三遍，更换为新鲜的第二阶段肝细胞三维诱导培养基放入37℃培养箱培养。
4)在不透明的96孔板中每孔加入50μL的待测样品和空白对照，每个样品设置三个重复孔。
5)加入50μL的Luciferin Dectecion Reagent，轻拍板子混匀。
6)室温孵育20min。
7)20min以内用酶标仪检测各孔的荧光值。
8)计算结果。
上述2.4.4-2.4.6的结果如图12所示，可见由hEHOs诱导的肝细胞具备典型的肝脏功能，如白蛋白分泌、尿素合成以及CYP3A4肝药酶代谢功能。
2.5、透射电镜的样品制备与观察
将待检测的hEHO诱导获得的肝细胞提前一天用2.5％戊二醛在4℃冰箱固定过夜，固定好的细胞送至北京大学医学部电镜中心制样、切片、染色与照相，结果如图13所示。
根据图13，可见诱导的肝细胞具有成熟肝细胞相关的超微结构，如大量线粒体、粗面内质网、脂滴、糖原颗粒、以及细胞与细胞的连接面处由紧密连接所构成的毛细胆管。
根据以上实施例2的结果，可知根据本发明的方法诱导获得的功能性肝细胞更加成熟，其大量表达肝细胞成熟的标志如ALB、CK18、AAT、TF、CYP3A4、CYP2C9、CPS1、ASS1等，而不成熟功能标志甲胎蛋白(AFP)的表达量大大降低，另外，诱导产生的肝细胞的白蛋白分泌、尿素合成、药物代谢、糖原合成、靛青绿摄取等功能均大大增强，可以更好地用于生产以及模拟体外肝功能，在肝病治疗、药物研发以及疾病模型的建立方面可以提供理想的种子细胞。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京达博威迎医药技术有限公司
中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 功能性肝细胞诱导方法及其专用三维诱导培养基和应用
<160> 44
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gagtcaacgg atttggtcgt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccagtccgtc aacatcaaaa ct 22
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cttcaaccgc agaccctttc 20
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taatgtcaca ggtcactgca tgg 23
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ccagctttct acactacttg cc 22
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tcagggaaag ataaagccga cc 22
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cctcctacct tgattgcatc ag 22
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ttttgaccca tagaactctg cc 22
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tctctcgata ctctgtggca c 21
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Claims (10)
1.一种功能性肝细胞三维诱导培养基，其特征在于，包括第一阶段三维培养基和第二阶段三维培养基；其中：
所述第一阶段三维培养基以HCM培养基(Lonza)/HM培养基(Sciencell)为基础培养基，还包含0.01％-1％BSA、0.2％-10％B-27，以及以下组分中的一种或多种：抗氧化剂、L-抗坏血酸盐、ROCK信号通路抑制剂、肝细胞生成因子、抑瘤素M、地塞米松、青霉素和链霉素；
所述第二阶段三维培养基以HCM培养基(Lonza)/HM培养基(Sciencell)为基础培养基，还包含0.01％-1％BSA、0.2％-10％B-27，以及以下组分中的一种或多种：抗氧化剂、L-抗坏血酸盐、ROCK信号通路抑制剂、地塞米松、胰岛素-转铁蛋白-硒钠、表皮细胞生长因子、腺苷酸环化酶激动剂、维生素K2、石胆酸、青霉素和链霉素。
2.根据权利要求1所述的功能性肝细胞三维诱导培养基，其特征在于，所述第一阶段三维培养基中，所述抗氧化剂为N-乙酰基-L-半胱氨酸，浓度为0.1-10mM，优选为1.25mM；所述L-抗坏血酸盐浓度为0.05-2mM，优选为0.2mM；所述ROCK信号通路抑制剂为Y-27632(StemCell)，浓度为5-20μM，优选为10μM；所述肝细胞细胞生长因子为HGF，浓度为5-50ng/mL，优选为20ng/mL；所述抑瘤素M为OSM，浓度为5-50ng/mL，优选为20ng/mL；所述地塞米松为Dex，浓度为0.1-1mM，优选为0.5μM；所述青霉素的浓度为10-1000U/mL，优选为100U/mL；所述链霉素的浓度为0.01-1mg/mL，优选为0.1mg/mL；
所述第二阶段三维培养基中，所述抗氧化剂为N-乙酰基-L-半胱氨酸，浓度为0.1-10mM，优选为1.25mM；所述L-抗坏血酸盐浓度为0.05-2mM，优选为0.2mM；所述ROCK信号通路抑制剂为Y-27632(StemCell)，浓度为5-20μM，优选为10μM；所述胰岛素-转铁蛋白-硒钠为ITS，浓度为0.5％-10％，优选为1％；所述表皮细胞生长因子为EGF，浓度为5-50ng/mL，优选为10ng/mL；所述地塞米松为Dex，浓度为0.1-1mM，优选为0.5μM；所述腺苷酸环化酶激动剂为8-Br-cAMP(Selleck)，浓度为50-200μM，优选为100μM；所述维生素K2为vitamin K2(Sigma)，浓度为5-20μM，优选为10μM；所述石胆酸为Lithocholic acid(Sigma)，浓度为5-20μM，优选为10μM；所述地塞米松为Dex，浓度为0.1-1mM，优选为0.5μM；所述青霉素的浓度为10-1000U/mL，优选为100U/mL；所述链霉素的浓度为0.01-1mg/mL，优选为0.1mg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的功能性肝细胞诱导三维培养基，其特征在于，所述第一阶段三维培养基的配方选自以下配方中的任一种：
配方1：以HCM/HM培养基为基础培养基，还包含1％B-27、0.1％BSA、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、10μM Y-27632、20ng/mL HGF、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
配方2：以HCM/HM培养基为基础培养基，还包含1％B-27、0.1％BSA、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、10μM Y-27632、0.2mM L-抗坏血酸盐、20ng/mL HGF、20ng/mL OSM、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
配方3：以HCM/HM培养基为基础培养基，还包含1％B-27、0.1％BSA、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、0.2mM L-抗坏血酸盐、10μM Y-27632、20ng/mL HGF、20ng/mL OSM、0.5μM Dex、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的功能性肝细胞三维诱导培养基，其特征在于，所述第二阶段三维培养基的配方选自以下配方中的任一种：
配方1：以HCM/HM培养基为基础培养基，还包含1％B-27、0.1％BSA、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、10μM Y-27632、1％ITS、10ng/mL EGF、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
配方2：以HCM/HM培养基为基础培养基，还包含1％B-27、0.1％BSA、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、10μM Y-27632、1％ITS、10ng/mL EGF、0.2mM L-抗坏血酸盐、0.5μM Dex、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
配方3：以HCM/HM培养基为基础培养基，还包含1％B-27、0.1％BSA、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、10μM Y-27632、1％ITS、10ng/mL EGF、0.2mM L-抗坏血酸盐、0.5μM Dex、100μM8-Br-cAMP、10μM vitamin K2、10μM Lithocholic acid、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素。
5.一种功能性肝细胞诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将多能性干细胞定向诱导分化为肝干/祖阶段细胞；其中所述多能性干细胞不包括直接分解自人胚胎或胚泡的人多能干细胞或胚胎干细胞；
S2：将步骤S1获得的肝干/祖阶段细胞使用三维扩增培养基进行三维扩增培养，获得肝脏类器官；
S3：将S2获得的肝脏类器官消化成单个细胞后使用权利要求1-4中任一项所述的功能性肝细胞三维诱导培养基向功能性肝细胞进行诱导分化。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤S2之后和步骤S3之前还包括：
S2-1：将步骤S2获得的肝脏类器官用预分化培养基进行预处理；
步骤S3为将步骤S2-1预处理之后的肝脏类器官消化成单个细胞后使用权利要求1-4中任一项所述的功能性肝细胞三维诱导培养基向功能性肝细胞进行诱导分化。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S2-1中所述预处理条件为：37℃、5％CO2培养箱中培养，培养时间为4天，其中每2天更换所述预分化培养基一次；所述预分化培养基以Advanced DMEM/F-12培养基为基础培养基，还包含0.01％-1％BSA、0.2％-10％B-27、0.2％-10％N2添加剂、1-50mM HEPES、0.1％-10％谷氨酰胺添加剂，以及以下组分中的一种或多种：抗氧化剂、胃泌素、Sirt1蛋白抑制剂、肝细胞生成因子、骨形态发生蛋白、成纤维生长因子、青霉素和链霉素；
优选地，所述抗氧化剂为N-乙酰基-L-半胱氨酸，浓度为0.1-10mM，优选为1.25mM；所述胃泌素为Gastrin，浓度为1-100nM，优选为10nM；所述Sirt1蛋白抑制剂为尼克酰胺，浓度为1-100mM，优选为10mM；所述肝细胞细胞生长因子为HGF，浓度为5-100ng/mL，优选为50ng/mL；所述骨形态发生蛋白为BMP7或BMP4，浓度为5-100ng/mL，优选为25ng/mL，所述成纤维生长因子为FGF2或FGF4，浓度为5-100ng/mL，优选为25ng/mL；所述青霉素的浓度为10-1000U/mL，优选为100U/mL；所述链霉素的浓度为0.01-1mg/mL，优选为0.1mg/mL；
进一步优选地，所述预分化培养基的配方为：以Advanced DMEM/F12培养基为基础培养基，还包含0.1％BSA、1％N2添加剂、1％B-27、1％谷氨酰胺添加剂、10mM HEPES、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、10mM尼克酰胺、10nM Gastrin、25ng/mL BMP7、25ng/mL FGF4、50ng/mLHGF、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述多能性干细胞为H9系干细胞。
9.一种功能性肝细胞，其特征在于，由权利要求5-8中任一项所述的方法诱导获得。
10.权利要求9所述的功能性肝细胞作为制造人工肝脏、建立肝病治疗药物筛选模型、体外模拟肝功能模型以及体外模拟肝病模型的种子细胞的应用。
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