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CN110050000B - 含有TGF-β受体的融合蛋白及其医药用途 - Google Patents

含有TGF-β受体的融合蛋白及其医药用途 Download PDF

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CN110050000B CN201880004344.6A CN201880004344A CN110050000B CN 110050000 B CN110050000 B CN 110050000B CN 201880004344 A CN201880004344 A CN 201880004344A CN 110050000 B CN110050000 B CN 110050000B
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Abstract

提供了含有TGF‑β受体的融合蛋白及其医药用途。进一步提供了包含所述PD‑L1抗体靶向部分和TGF‑βRII胞外区的双功能融合蛋白，以及包含所述含有TGF‑β受体融合蛋白的药物组合物，以及其制备抗癌药物的用途。

Description

含有TGF-β受体的融合蛋白及其医药用途
技术领域
本发明涉及肿瘤免疫治疗药物领域。具体地说，本发明涉及用于癌症治疗的融合蛋白，包括包含靶向分子和免疫调节因子如TGF-βRII的融合蛋白。更具体地涉及靶向分子PD-L1抗体和免疫调节因子如TGF-βRII的融合蛋白，包含其的药物组合物，以及其作为抗癌药物的应用。
背景技术
在肿瘤治疗中，人们早已认识到化疗所带来的高毒性及可导致耐药性癌细胞产生的负面影响。即使是靶向性针对与肿瘤生存生长相关的过度表达或激活的蛋白的治疗手段，仍会有癌细胞通过变异来减少或逃脱对靶向性治疗所针对通路的依赖，并利用其它的通路继续生存。肿瘤免疫治疗近年来备受关注，是肿瘤治疗领域的焦点，较难产生耐药性是该疗法的突出优势。肿瘤免疫治疗主要通过免疫学原理和方法，提高肿瘤细胞的免疫原性和对效应细胞杀伤的敏感性，激发和增强机体抗肿瘤免疫应答，并应用免疫细胞和效应分子输注宿主体内，协同机体免疫系统杀伤肿瘤、抑制肿瘤生长。
程序性死亡受体1(programmed death 1，PD-1)为CD28超家族成员。PD-1表达于活化的T细胞，B细胞及髓系细胞，其有两个配体，即程序性死亡配体-1(programmed deathligand 1，PD-L1)和PD-L2。PD-L1与T细胞上的受体PD-1相互作用，在免疫应答的负调控方面发挥着重要作用。在许多人类肿瘤组织中均可检测到PD-L1蛋白的表达，肿瘤部位的微环境可诱导肿瘤细胞上的PD-L1的表达，表达的PD-L1有利于肿瘤的发生和生长，诱导抗肿瘤T细胞的凋亡。PD-1/PD-L1通路抑制剂可以阻断PD-1与PD-L1的结合，阻断负向调控信号，使T细胞恢复活性，从而增强免疫应答，因此，以PD-1/PD-L1为靶点的免疫调节对肿瘤抑制有重要的意义。
转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)属于调节细胞生长和分化的TGF-β超家族。TGF-β通过异源四聚体受体复合物传递信号，这个受体复合物是由两个I型和两个II型的跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体组成。
TGF-β是一种多功能的细胞因子，以细胞或背景依赖的方式发挥肿瘤抑制或肿瘤促进的作用。TGF-β信号的肿瘤抑制作用源于其诱导多个基因表达的能力。当肿瘤发展过程中引入突变或表观遗传修饰时，癌细胞逐渐耐受TGF-β信号的抑制作用，最终导致肿瘤的发展。
研究发现阻断TGF-β信号传导通路能够减少肿瘤的转移。运用截短的Smad2/3显负性突变体抑制乳腺肿瘤细胞系的TGF-β信号通路，结果发现肿瘤细胞的转移能力被抑制。结肠癌的微卫星不稳定性研究发现，TGF-βRII无活性的突变，使转移减少，增加了患者术后的存活率。但总体而言，抑制TGF-β信号通路的抑制剂单用在临床治疗中效果微弱，可能跟TGF-β主要在肿瘤细胞内异常性高表达及信号通路抑制剂的生物利用度有关。
因此，在靶向中和肿瘤微环境的TGF-β基础上抑制PD-1/PD-L1通路，可以使T细胞恢复活性，增强免疫应答，更有效地提高抑治肿瘤发生和发展的效果。本申请人在先的PCT申请PCT/CN2016/104320提供了一种PD-L1抗体。
目前已有抗体/TGF-β受体融合蛋白公开，如WO2006074451A2、WO2009152610A1、WO2011109789A2、WO2013164694A1、WO2014164427A1、WO2015077540A2、WO9309228A1、WO9409815A1、WO2015077540A2、WO2015118175A2。但一些融合蛋白仍存在不稳定或表达量不高的问题。在实际生产和临床应用上仍需进一步开发具有更优性能的产品。本发明提供一种更利于生产，性能更稳定的技术方案。
发明内容
本发明提供一种含有TGF-β受体的融合蛋白，包含靶向部分和TGF-β受体部分，其中，所述的TGF-β受体部分为TGF-βRII胞外区的N端截短形式。
在本发明一个优选的实施方案中，TGF-βRII胞外区的N端截短形式选自在TGF-βRII胞外区的N端上有26个以下连续氨基酸的缺失，优选14-26个连续氨基酸的缺失，更优选14-21个连续氨基酸的缺失；最优选包含14-21个连续氨基酸的缺失，非限制性实施例包括SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15所示的序列。
在本发明一个优选的实施方案中，TGF-βRII胞外区的序列如SEQ ID NO：13所示。
在本发明一个优选的实施方案中，所述的靶向部分为细胞特异性靶向部分；优选的，所述的靶向部分为癌细胞特异性靶向部分。
在本发明一个优选的实施方案中，所述的癌细胞特异性靶向部分选自抗体或其抗原结合片段、生长因子、激素、肽、受体或细胞因子。
在本发明一个优选的实施方案中，所述的抗体或其抗原结合片段选自全长抗体、嵌合抗体、Fab’、Fab、F(ab’)2、单结构域抗体(DAB)、Fv、scFv、小抗体、双特异性抗体、三特异性抗体或其混合物。
在本发明一个优选的实施方案中，所述的抗体或其抗原结合片段结合选自以下一种或多种多肽或蛋白：HER2、HER3、免疫检验点分子、CD33、VEGF、VEGFR、VEGFR-2、CD152、TNF、IL-1、IL-5、IL-17、IL-6R、IL-1、IL-2R、BLYS、PCSK9、EGFR、c-Met、CD2、CD3、CD11a、CD19、CD30、CD38、CD20、CD52、CD60、CD80、CD86、TNF-α、IL-12、IL-17、IL-23、IL-6、IL-1β、RSVF、IgE、RANK、BLyS、α4β7、PD-1、CCR4、SLAMF7、GD2、CD21、CD79b、IL20Rα、CD22、CD79a、CD72、IGF-1R和RANKL；优选所述的抗体或其抗原结合片段结合免疫检验点分子。
在本发明一个优选的实施方案中，所述的抗体为PD-L1抗体；优选的，所述的PD-L1抗体选自：MSB0010718C、MEDI4736、BMS-936559、MPDL3280A的PD-L1抗体，或包含1个或多个选自以下的CDR区序列或CDR区序列的突变序列的抗体：
Figure GPA0000266365870000051
其中X1选自H或G，优选为G；X2选自G或F，优选为F。
在本发明一个优选的实施方案中，所述的抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体或其功能片段、人源化抗体或其功能片段、或人抗体或其或其功能片段。
在本发明一个优选的实施方案中，所述人源化抗体的重链可变区具有如SEQ IDNO：7所示的序列，优选具有如SEQ ID NO：9所示的序列。
在本发明一个优选的实施方案中，所述的人源化抗体进一步包括序列SEQ ID NO：11所示的重链。
在本发明一个优选的实施方案中，所述的人源化抗体包含SEQ ID NO：8或10所示的抗体轻链可变区序列或轻链可变区的突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，所述的人源化抗体包含序列SEQ ID NO：12所示的轻链。
在本发明一个优选的实施方案中，所述的含有TGF-β受体的融合蛋白如通式(I)所示：
Ab-L-TGF-βRII ECD (I)
其中TGF-βRII ECD为TGF-βRII胞外区的截短形式；
Ab为抗体；
L为连接序列。
在本发明一个优选的实施方案中，所述的连接序列L为(G4S)xG，其中x为3-6，优选为4-5。
本发明进一步提供一种药物组合物，其含有治疗有效量的如上所述的含有TGF-β受体的融合蛋白，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明进一步提供一种编码如上所述的含有TGF-β受体的融合蛋白的DNA分子。
本发明进一步提供一种含有如上所述的DNA分子的表达载体。
本发明进一步提供一种用如上所述的表达载体转化的宿主细胞，所述宿主细胞选自细菌、酵母菌和哺乳动物细胞；优选哺乳动物细胞。
本发明进一步提供一种所述的含有TGF-β受体的融合蛋白或包含其的药物组合物，在制备用于肿瘤治疗的药物中的用途；优选在制备用于治疗PD-L1介导的肿瘤的药物中的用途；更优选为表达PD-L1的癌症。
本发明进一步提供一种治疗和预防肿瘤的方法，包括给予所需患者治疗有效量的本发明所述的含有TGF-β受体的融合蛋白或包含其的药物组合物。
本发明进一步提供一种截短的TGF-βRII胞外区，其中所述的TGF-βRII胞外区的截短选自在SEQ ID NO：13的N端上有26个以下连续氨基酸的缺失，优选N端14-26个连续氨基酸的缺失，更优选N端14-21个连续氨基酸的缺失；最优选包含14-21个连续氨基酸的缺失，非限制性实施例包括SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15所示的序列。
本发明进一步提供一种药物组合物，其含有治疗有效量的本发明所述的截短的TGF-βRII胞外区，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明进一步提供一种本发明所述的截短的TGF-βRII胞外区或包含其的药物组合物，在制备用于治疗、抑制癌细胞增殖或转移的疾病或病症的药物中的用途。
本发明进一步提供一种治疗和预防肿瘤的方法，包括给予所需患者治疗有效量的本发明所述的截短的TGF-βRII胞外区或包含其的药物组合物。
本公开中所述肿瘤或癌症选自以下部位的肿瘤或癌症：结直肠、乳腺、卵巢、胰腺、胃、前列腺、肾、宫颈、骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、甲状腺、子宫内膜、子宫、膀胱、神经内分泌、头部颈部、肝、鼻咽、睾丸、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、基底细胞皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、隆突性皮肤纤维肉瘤、梅克尔细胞癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、肉瘤、间皮瘤，和骨髓增生异常综合征。
附图说明
图1：融合蛋白结构示意图。
图2：融合蛋白体外结合人源TGF-β1的结果。
图3：融合蛋白体外结合人源TGF-β1的结果。
图4：融合蛋白体外结合人源PD-L1的结果。
图5：融合蛋白体外检测PD-1/PD-L1通路阻断实验结果。
图6：融合蛋白以剂量依赖性形式抑制TGFβ诱导的pSMAD3报告物活性。
图7：融合蛋白样品均能够增强激活的T淋巴细胞分泌细胞因子IFN-γ。
图8：融合蛋白对荷瘤小鼠瘤重的影响。
具体实施方式
一、术语
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。
本发明所述的“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。
在本发明中，本发明所述的抗体轻链可进一步包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源或鼠源的κ、λ链或其变体。
在本发明中，本发明所述的抗体重链可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体。
抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(Fv区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本发明所述的抗体或抗原结合片段的LCVR区和HCVR区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat编号规则(LCDR1-3，HCDE2-3)，或者符合kabat和chothia的编号规则(HCDR1)。
本发明的抗体包括选自鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体的全长抗体，优选人源化抗体。
术语“鼠源抗体”在本发明中为根据本领域知识和技能制备的对人PD-L1的单克隆抗体。制备时用PD-L1抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。在本发明一个优选的实施方案中，所述的鼠源PD-L1抗体或其抗原结合片段，可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，或进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其变体的重链恒定区。
术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要先建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从小鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将小鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入人载体中，最后在真核工业系统或原核工业系统中表达嵌合抗体分子。在本发明一个优选的实施方案中，所述的PD-L1嵌合抗体的抗体轻链进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。所述的PD-L1嵌合抗体的抗体重链进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区。人抗体的恒定区可选自人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG2或IgG4重链恒定区，或者使用氨基酸突变后无ADCC(antibody-dependentcell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用)毒性的IgG4。
术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-graftedantibody)，是指将小鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体构架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量小鼠蛋白成分，从而诱导的强烈的抗体可变抗体反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(在因特网www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可获得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活性。本发明的人源化抗体也包括进一步由噬菌体展示对CDR进行亲和力成熟后的人源化抗体。
术语“人抗体”与“人源抗体”可以互换使用，是指有一或多个可变区和恒定区来源于人免疫球蛋白序列。其中一个优选的方式是所有的可变区和恒定区均来自于人免疫球蛋白序列，即“完全人源抗体”或“全人抗体”。这些抗体可以通过多种方式制备获得，包括通过噬菌体展示技术，从人PBMC、脾脏、淋巴结组织分离B细胞，构建天然单链噬菌体人抗体库，或者通过免疫可表达人抗体轻重链的转基因小鼠，筛选获得的抗体。
本发明中所述的“抗体或其抗原结合”或“功能片段”，指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab‘片段，F(ab’)2片段，以及与抗体结合的Fv片段ScFv片段。Fv片段含有抗体重链可变区和轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般地，Fv抗体还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。也可以用不同的连接物将两个抗体可变区连接成一条多肽链，称为单链抗体(single chainantibody)或单链Fv(sFv)。本发明的术语“与PD-L1结合”，指能与人PD-L1相互作用。本发明的术语“抗原结合位点”指抗原上不连续的，由本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。
本发明中所述的“ADCC”，即antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用，是指表达Fc受体的细胞通过识别抗体的Fc段直接杀伤被抗体包被的靶细胞。可通过对IgG上Fc段的修饰，降低或消除抗体的ADCC效应功能。所述的修饰指在抗体的重链恒定区进行突变，如选自IgG1的N297A、L234A、L235A；IgG2/4嵌合体，IgG4的F234A/L235A突变。
本发明所述的“突变序列”中的“突变”包括但不限于“回复突变”、“保守修饰”或“保守置换或取代”。本公开中所述的“保守修饰”或“保守置换或取代”是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得可频繁进行改变而不改变蛋白的生物学活性。本领域技术人员知晓，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224页，(第4版))。另外，结构或功能类似的氨基酸的置换不大可能破环生物学活性。
本发明所述的“突变序列”是指对本发明的核苷酸序列和氨基酸序列进行适当的替换、插入或缺失等突变修饰情况下，得到的与本发明的核苷酸序列和氨基酸序列具有不同百分比序列同一性程度的核苷酸序列和氨基酸序列。
本发明中所述“同一性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。本发明中的序列同一性可以至少为85％、90％或95％，优选至少为95％。非限制性实施例包括85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，100％。两个序列之间的序列比较和同一性百分比测定可以通过National CenterFor Biotechnology Institute网站上可得的BLASTN/BLASTP算法的默认设置来进行。
本发明所述的“PD-L1抗体或其抗原结合蛋白”可包括本领域中所述的任何抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。抗PD-L1抗体可以是市售可得的或已通过文献公开的PD-L1抗体。包括但不限于，如PD-L1抗体BMS-936559，MPDL3280A，MEDI4736，MSB0010718C(参见US2014341917、US20130034559、US8779108)等。抗体可以是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体，或人抗体。抗体片段包括具有抗原结合活性的Fab片段，Fab‘片段，F(ab’)2片段，以及与抗体结合的Fv片段和ScFv片段。
本发明示例性的PD-L1抗体制备过程参见(PCT/CN2016/104320)包括如下所述的重链可变区的CDR序列：
HCDR1： SYWMH SEQ ID NO：1
HCDR2： RI X1PNSG X2TSYNEKFKN SEQ ID NO：2
HCDR3： GGSSYDYFDY SEQ ID NO：3
在可选的实施方式中，X1选自H或G，X2选自G或F。
在另一个实施方式中，本发明示例性的PD-L1抗体进一步包括如下所述的轻链可变区的CDR序列：
LCDR1选自： RASESVSIHGTHLMH SEQ ID NO：4
LCDR2选自： AASNLES SEQ ID NO：5
LCDR3选自： QQSFEDPLT SEQ ID NO：6；
在另一个实施方式中，本发明对上述的CDR区采用CDR移植策略进行抗体人源化，人源化构架的人源化轻链模板为IGKV7-3*01和hjk2.1，人源化重链模板为IGHV1-46*01和hjh6.1，人源化可变区序列如下：
人源化重链可变区
Figure GPA0000266365870000101
人源化轻链可变区
Figure GPA0000266365870000102
注：顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜体为FR序列，下划线为CDR序列。
在另一个实施方式中，对本发明人源化抗体的回复突变设计，见下表1：
表1
Figure GPA0000266365870000103
注：如Y91F表示依照Kabat编号系统，将91位Y突变回F。
“植入”代表鼠抗体CDR植入人种系FR区序列。
表中各种轻重链的突变组合可得到新的人源化抗体。
本发明的另一方面，提供一种人源化克隆构建的实施例，如下：
设计引物PCR搭建各人源化抗体VH/VK基因片段，再与表达载体pHr(带信号肽及恒定区基因(CH1-FC/CL)片段)进行同源重组，构建抗体全长表达载体VH-CH1-FC-pHr/VK-CL-pHr。
1、引物设计：利用在线软件DNAWorks(v3.2.2)(http：//helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计多条引物合成VH/VK含重组所需基因片段：5’-30bp信号肽+VH/VK+30bpCH1/CL-3’。
2、片段拼接：按照TaKaRa公司Primer STAR GXL DNA聚合酶操作说明书，用上面设计的多条引物，分两步PCR扩增得到VH/VK含重组所需基因片段。
3、表达载体pHr(带信号肽及恒定区基因(CH1-FC/CL)片段)构建及酶切
利用一些特殊的限制性内切酶，如BsmBI，识别序列与酶切位点不同的特性设计构建表达载体pHr(带信号肽及恒定区基因(CH1-FC/CL)片段)。BsmBI酶切载体，切胶回收备用。
4、重组构建表达载体VH-CH1-FC-pHr/VK-CL-pHr
VH/VK含重组所需基因片段与BsmBI酶切回收表达载体pHr(带信号肽及恒定区基因(CH1-FC/CL)片段)按3∶1比例分别加入DH5H感受态细胞中，0℃冰浴30min，42℃热击90s，加入5倍体积LB介质，37℃孵育45min，涂布LB-Amp平板，37℃培养过夜，挑取单克隆送测序得到各目的克隆。
5、根据本实施例的设计方案构建质粒，然后表达纯化蛋白，用检测例SPR测定所得蛋白亲和力。
6、最终用BIACORE测试人源化回复突变体与人源PD-L1-his或杂交瘤抗体的亲和力，筛选得到的人源化回复突变位点的选择及序列组合如下：
重链可变区：
Figure GPA0000266365870000111
其中，CDR2为SEQ ID NO：7的X1为G，X2为F。
轻链可变区：
Figure GPA0000266365870000112
注：顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜体为FR序列；下划线为CDR序列。
本发明的另一方面，提供一种构建和表达抗PD-L1人源IgG4类型的实施例，并进一步用于融合蛋白构建的PD-L1抗体。该PD-L1抗体也可用作本发明中的测试例对照分子。
由于PD-L1在活化T细胞中也有表达，如果采用野生型IgG1恒定区会引起Fc介导的效应作用，比如ADCC和CDC，从而导致活化T细胞的消减。本发明选择突变IgG4以得到无ADCC和CDC的抗体。将亲合力成熟得到的克隆转换成IgG4类型，IgG4的核心铰链区包含S228P突变。并进一步引入F234A和L235A突变(mAbs 4：3，310-318；May/June 2012)。同时，为防止抗体重链C末端在引入连接肽连接TGF-βRII胞外区时发生断裂，又将PD-L1抗体重链的最后一位K突变成A，以增加融合蛋白的稳定性。本发明用于融合蛋白构建的的PD-L1抗体序列如下：
PD-L1抗体重链序列：IgG4(AA)(S228P)
Figure GPA0000266365870000121
PD-L1抗体轻链序列
Figure GPA0000266365870000122
注：划线部分为抗体重链或轻链的可变区序列，或编码其的核苷酸序列；未划线部分为抗体恒定区序列及其相应的编码核苷酸序列。
本发明中所述的融合蛋白是一种通过DNA重组得到的两个基因共表达的蛋白产物。现有技术中熟知生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法，如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章。例如，小鼠可以用人PD-L1或其片段免疫，所得到的抗体能被复性、纯化，并且可以用常规的方法进行氨基酸测序。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。发明所述的抗体或抗原结合片段用基因工程方法在非人源的CDR区加上一个或多个人源FR区。人FR种系序列可以通过比对IMGT人类抗体可变区种系基因数据库和MOE软件，从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站http：//imgt.cines.fr得到，或者从免疫球蛋白杂志，2001ISBN012441351上获得。
本发明工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如，编码重链和轻链的cDNA序列，可以克隆并重组至GS表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化，特别是在Fc区的高度保守N端位点。通过表达与人PD-L1特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化。比如，用含调整过的缓冲液的A或G Sepharose FF柱进行纯化。洗去非特异性结合的组分。再用PH梯度法洗脱结合的抗体，用SDS-PAGE检测抗体片段，收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。得到的产物需立即冷冻，如-70℃，或者冻干。
本发明所述的“免疫调节分子”可用于削弱癌细胞的免疫耐受性。本发明采用TGF-βRII胞外结构域的截短形式作为融合蛋白中免疫调节分子部分。“TGF-β受体II(TGF-βRII)”以高亲和力结合配体TGF-β1和3。TGF-β RII/TGF-β复合物招募TGF-β RI以形成信号转导复合物(Won等，Cancer Res.1999；59：1273-7)。TGF-βRII的胞外结构域是TGF-βRII细胞外自N端开始的一段长136个氨基酸残基的肽段，其中一个示例性的例子如SEQ ID NO：13所示。其他长度约为136个氨基酸，并且来源于人的具有TGF-βRII的胞外区的能够与TGF-β1和3相结合的变体同样同样属于本发明TGF-βRII的胞外结构域的范围。本发明研究发现，TGF-βRII胞外结构域N端连续截短形式的结构和功能较未截短分子稳定。含TGF-βRII胞外结构域N端未截短(SEQ ID NO：13所示的1-136多肽)形式的融合蛋白容易断裂。尤其是在其N端作26个以下氨基酸的截短后更为稳定，优选14-26个氨基酸的截短，更优选N端14-21个氨基酸截短形式，具有更高的表达量，最优选截短N端19或21个连续氨基酸。
“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。
“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，例如包含本发明的任一种结合化合物的组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，以诱导这类症状退化或抑制这类症状发展到任何临床右测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽管本发明的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解每个目标疾病症状方面可能无效，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如Student t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定，其在统计学显著数目的患者中应当减轻目标疾病症状。
“保守修饰”或“保守置换或取代”是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得可频繁进行改变而不改变蛋白的生物学活性。本领域技术人员知晓，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等(1987)Molecular Biologyofthe Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224页，(第4版))。另外，结构或功能类似的氨基酸的置换不大可能破环生物学活性。
“有效量”包含足以改善或预防医学疾病的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：例如，待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。
“外源性”指根据情况在生物、细胞或人体外产生的物质。“内源性”指根据情况在细胞、生物或人体内产生的物质。
“同源性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60％同源。一般而言，当比对两个序列而得到最大的同源性百分率时进行比较。
“免疫检验点(immune checkpoint)分子”包括刺激性免疫检验点分子和抑制性免疫检验点分子，示例性分子包括CD27、CD28、CD40、CD40L、CD122、OX40、OX40L、GITR、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR(Killer-cell Immunoglobulin-likeReceptor)、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、VISTA等。
本文使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这类名称都包括后代。因此，单词“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物，而不考虑转移数目。还应当理解的是，由于故意或非有意的突变，所有后代在DNA含量方面不可能精确相同。包括具有与最初转化细胞中筛选的相同的功能或生物学活性的突变后代。在意指不同名称的情况下，其由上下文清楚可见。
本文使用的“聚合酶链式反应”或“PCR”是指其中微量的特定部分的核酸、RNA和/或DNA如在例如美国专利号4,683,195中所述扩增的程序或技术。一般来说，需要获得来自目标区域末端或之外的序列信息，使得可以设计寡核苷酸引物；这些引物在序列方面与待扩增模板的对应链相同或相似。2个引物的5’末端核苷酸可以与待扩增材料的末端一致。PCR可用于扩增特定的RNA序列、来自总基因组DNA的特定DNA序列和由总细胞RNA转录的cDNA、噬菌体或质粒序列等。一般参见Mullis等(1987)Cold Spring HarborSymp.Ouant.Biol.51：263；Erlich编辑，(1989)PCR TECHNOLOGY(Stockton Press，N.Y.)。本文使用的PCR被视为用于扩增核酸测试样品的核酸聚合酶反应法的一个实例，但不是唯一的实例，所述方法包括使用作为引物的已知核酸和核酸聚合酶，以扩增或产生核酸的特定部分。
“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生的场合。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”意味着特定序列的抗体重链可变区可以但不必须存在。
“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，所述其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
二、实施例与测试例
以下结合实施例进一步描述本发明，但这些实施例并非限制着本发明的范围。
本发明实施例或测试例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。参见Sambrook等，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室；当代分子生物学方法，Ausubel等著，Greene出版协会，Wiley Interscience，NY。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例
实施例1：融合蛋白PD-L1/TGF-β trap克隆和表达
采用TGF-βRII胞外结构域(SEQ ID NO：13的全长或截短形式)作为融合蛋白中免疫调节分子部分，将PD-L1抗体作为融合蛋白的靶向部分，形成PD-L1抗体/TGF-βRII胞外区融合蛋白(PD-L1/TGF-β trap)。研究发现，TGF-βRII胞外结构域截短形式的结构和功能较为稳定，尤其是在其N端作26个以下氨基酸的截短后更为稳定，优选14-26个氨基酸的截短，更优选N端截短14-21个连续氨基酸的形式，具有更高的表达量和稳定的结构，更优选N端截短14、19或21个连续氨基酸的形式。本发明TGF-βRII胞外结构域及其截短形式的非限制性实施例序列如下：
TGF-βRII胞外结构域序列：ECD(1-136)
Figure GPA0000266365870000151
TGF-βRII胞外结构域序列在N端有19个氨基酸的截短或缺失：ECD(20-136)
Figure GPA0000266365870000152
TGF-βRII胞外结构域序列在N端有21个氨基酸的截短或缺失：ECD(22-136)
Figure GPA0000266365870000161
TGF-βRII胞外结构域序列在N端有14个氨基酸的截短或缺失：ECD(15-136)
Figure GPA0000266365870000162
利用同源重组技术将本发明PD-L1抗体的重链C末端氨基酸通过(G4S)xG连接不同长度TGF-βRII胞外区，与轻链一起，通过293表达系统进行常规表达，得到如表2所示的融合蛋白：
表2：PD-L1抗体/TGF-βRII胞外区融合蛋白
融合蛋白例 序列描述 N端连续氨基酸缺失数
融合蛋白1 Ab-(G<sub>4</sub>S)<sub>4</sub>G-ECD(1-136) 未缺失
融合蛋白2 Ab-(G<sub>4</sub>S)<sub>3</sub>G-ECD(15-136) 14
融合蛋白3 Ab-(G<sub>4</sub>S)<sub>3</sub>G-ECD(15-136，N19A) 14
融合蛋白4 Ab-(G<sub>4</sub>S)<sub>3</sub>G-ECD(20-136) 19
融合蛋白5 Ab-(G<sub>4</sub>S)<sub>3</sub>G-ECD(22-136) 21
融合蛋白6 Ab-(G<sub>4</sub>S)<sub>3</sub>G-ECD(27-136) 26
融合蛋白7 Ab-(G4S)<sub>4</sub>G-ECD(15-136) 14
融合蛋白8 Ab-(G4S)<sub>4</sub>G-ECD(15-136，N19A) 14
融合蛋白9 Ab-(G4S)<sub>4</sub>G-ECD(20-136) 19
融合蛋白10 Ab-(G4S)<sub>4</sub>G-ECD(22-136) 21
融合蛋白11 Ab-(G4S)<sub>4</sub>G-ECD(27-136) 26
融合蛋白12 Ab-(G<sub>4</sub>S)<sub>5</sub>G-ECD(15-136) 14
融合蛋白13 Ab-(G<sub>4</sub>S)<sub>5</sub>G-ECD(15-136，N19A) 14
融合蛋白14 Ab-(G<sub>4</sub>S)<sub>5</sub>G-ECD(20-136) 19
融合蛋白15 Ab-(G<sub>4</sub>S)<sub>5</sub>G-ECD(22-136) 21
融合蛋白16 Ab-(G<sub>4</sub>S)<sub>5</sub>G-ECD(27-136) 26
融合蛋白17 Ab-(G<sub>4</sub>S)<sub>6</sub>G-ECD(27-136) 26
注：Ab为本发明所述PD-L1抗体，序列描述中ECD(n-136)为TGF-βRII胞外区的全长或截短形式，n为TGF-βRII胞外区截短后的氨基酸起始位数。本发明融合蛋白结构如图1所示；N19A表示表示TGF-βRII胞外区的第19位氨基酸突变为A。
编码PD-L1抗体的核苷酸序列、编码TGF-βRII胞外区的核苷酸序列、接头蛋白片段((G4S)xG)的核苷酸序列通过所属领域常规技术手段获得。利用同源重组技术将PD-L1抗体的C末端核苷酸通过接头蛋白连接不同长度TGF-βRII胞外区的N末端核苷酸，克隆到Phr-BsmbI载体上。重组的PD-L1/TGF-β trap在293细胞表达，通过实施例2进行纯化。纯化的蛋白可用于下述各实施例实验中。
实施例2：PD-L1/TGF-β trap融合蛋白纯化
细胞培养液高速离心后收集上清，利用亲合层析进行第一步纯化。层析介质为与Fc相互作用的Protein A或者衍生填料，如GE的Mabselect。平衡缓冲液为1×PBS(137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4，2mmol/L KH2PO4，pH7.4)，平衡5倍柱体积后，将细胞上清上样结合，流速控制为样品在柱上保留时间≥1min。上样结束后，用1×PBS(pH7.4)冲洗柱子，直至A280紫外吸收降至基线。然后用0.1M甘氨酸(pH3.0)的洗脱缓冲液冲洗层析柱，根据A280紫外吸收峰收集洗脱峰，收集的洗脱样品用1M Tris(pH8.5)中和。
将上述中和后的洗脱样品超滤浓缩后进行体积排阻层析，缓冲液为1×PBS，层析柱为XK26/60 Superdex200(GE)，流速控制在4ml/min，上样体积小于5ml，根据A280紫外吸收合并目的蛋白峰。收集的蛋白经SEC-HPLC鉴定纯度大于95％，经LC-MS鉴定为正确后分装备用。得到PD-L1/TGF-β trap。
以下用生化测试方法验证本发明性能及有益效果。
体外活性生物学评价
测试例1：ELISA检测PD-L1/TGF-β trap体外结合TGF-β1实验：
检测流程描述如下：
a.以1μg/ml浓度的人源TGF-β1(8915LC，CST)为抗原按100μl/孔包被96孔板，4℃过夜。
b.250μl 1×PBST洗涤3次，加入250μl 5％牛奶PBS，37℃封闭2小时。
c.250μl 1×PBST洗涤3次，加入梯度稀释的PD-L1/TGF-β trap，TGF-β trap和阳性对照，37℃孵育1小时。
d.250μl 1×PBST洗涤3次。
e.每孔加入100μl Anti-human FC antibody-HRP(1∶4000)，37℃孵育40分钟。
f.每孔加入100μl TMB，室温孵育10分钟后加入100μl 1M H2SO4终止反应。
g.酶标仪上检测450nm测吸收值，Graphpad Prism5分析数据。
融合蛋白体外结合人源TGF-β1的结果如图2、图3所示。ELISA显示表2中融合蛋白1未保留对人源TGF-β1的结合活性。质谱分析结果显示融合蛋白1(即TGF-βRII胞外区非截短形式(1-136))不稳定，容易在重链TGF-βRII部分断裂，阳性对照同样存在相同情况，而融合蛋白7、9、10、12-15等TGFβRII胞外区N端截短形式的融合蛋白对于结合至人源TGF-β1是具有特异性的。
测试例2：ELISA检测PD-L1/TGF-β trap体外结合PD-L1实验：
检测用抗原：PD-L1-His
Figure GPA0000266365870000181
检测流程描述如下：
a.以5μg/ml浓度的人源PD-L1-His(SEQ ID NO：17)为抗原按100μl/孔包被96孔板，4℃过夜。
b.250μl 1×PBST洗涤3次，加入250μl 5％牛奶PBS 37℃封闭2小时。
c.250μl 1×PBST洗涤3次，加入梯度稀释的PD-L1/TGF-β trap，PD-L1抗体为阳性对照，37℃孵育1小时。
d.250μl 1×PBST洗涤3次。
e.每孔加入100μl抗人FC抗体-HRP(1∶4000)，37℃孵育40分钟。
f.每孔加入100μl TMB，室温孵育10分钟后加入100μl 1M H2SO4终止反应。
g.酶标仪上检测450nm测吸收值，Graphpad Prism5分析数据。
本发明融合蛋白体外结合人源PD-L1的结果如图4所示。ELISA显示融合蛋白均保留了对人源PD-L1的结合活性。
测试例3：体外检测PD-1/PD-L1通路阻断实验
1、测试目的：
为了研究PD-L1/TGF-β trap对PD-1/PD-L1信号通路的阻断作用，采用来自Promaga公司构建的分别带有人源PD-1和PD-L1受体分子的细胞，进行基于细胞水平上的抗体阻断实验。
2、测试样品：
①PD-L1抗体：SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12；
②对照1(20T-Fc)：ECD(20-136)-Fc，TGF-βRII胞外区截短片段ECD(20-136)与Fc的融合蛋白
序列如下：
Figure GPA0000266365870000182
Figure GPA0000266365870000191
③对照2(22T-Fc)：ECD(22-136)-Fc，TGF-βRII胞外区截短片段ECD(22-136)与Fc的融合蛋白
序列如下：
Figure GPA0000266365870000192
④融合蛋白9，融合蛋白15；
⑤人IgG：空白对照，从混合的正常人血清中，利用传统的亲和层析方法如ProteinA纯化获得的人免疫球蛋白；
⑥阳性对照(M7824，参考专利WO2015118175制备)：PD-L1抗体/TGF-βRII胞外区融合蛋白
PD-L1抗体轻链的氨基酸序列
Figure GPA0000266365870000193
PD-L1抗体重链/TGF-βRII胞外区(1-136)的H链的氨基酸序列：
Figure GPA0000266365870000194
Figure GPA0000266365870000201
3、测试过程
取CHO/PD-L1细胞(CS187108，Promega)，消化并用F-12 Nutrient Mixture(Ham)完全培养基重悬细胞，根据细胞计数结果使用完全培养基调整细胞密度至4×105/mL，将细胞悬液转移至加样槽中，使用多道移液器以100μL/孔加入到96孔板中，放置于37℃，5％CO2培养箱培养20～24h；第二天制备Jurkat/PD-1(CS187102，Promega)细胞悬液，根据细胞计数结果使用分析培养基重悬细胞，并调整细胞密度至1.25×106/mL；将加入CHO/PD-L1细胞的细胞培养板从培养箱中取出，使用多道移液器每孔取出95μL培养液，按照40μL/孔加入梯度稀释的融合蛋白，以及PD-L1抗体及阳性对照(M7824)，然后将Jurkat/PD-1细胞悬液转移至加样槽中，以40μL/孔加入到细胞培养板中，置于37℃，5％CO2培养箱培养5～6h。在蛋白孵育期间，将Bio-GloTM Reagent取出使其温度恢复至室温。取出细胞培养板，置于室温放置5～10min，然后每孔加入40μL Bio-GloTM Reagent，置于安全柜中孵育5～10min，使用多功能酶标仪读取化学发光信号值。
4、结果
如图5所示，本发明融合蛋白9同阳性分子一样均能够有效地阻断表达有PD-1分子的Jurkat细胞同CHO/PD-L1细胞结合，并且有药物浓度剂量依赖效应。融合蛋白15与融合蛋白9有相同水平的阻断能力。
测试例4：Biacore检测体外结合亲和力和动力学实验
通过Biacore T200(GE)测定待测分子与人或鼠源TGF-β1或人源PD-L1蛋白的亲和力，实验过程描述如下：
用Protein A芯片亲和捕获一定量的PD-L1/TGF-β trap，然后于芯片表面流经人或鼠源TGF-β1(8915LC，CST)或人源PD-L1(Sino Biological)，利用Biacore实时检测反应信号，从而获得结合和解离曲线，然后用甘氨酸-盐酸(pH 1.5，GE)将生物芯片洗净再生。实验中用到的缓冲溶液为HBS-EP Buffer(GE)。实验得到的数据用BIAevaluation version4.1软件(GE)以(1∶1)Langmuir模型进行拟合，得出如表3所示的亲和力数值。
表3：本发明融合蛋白与TGF-β1或人源PD-L1的体外亲和力
Figure GPA0000266365870000202
Figure GPA0000266365870000211
*对应序号的融合蛋白形式见表2。
融合蛋白结合活性见表3，结果表明，本发明融合蛋白9和15均对人，小鼠TGF-β1以及人PD-L1具极高的亲和力。
测试例5：SMAD3报告基因抑制实验
1、测试目的
该实验通过HepG2细胞表达带荧光素酶报告基因的Smad3结合原件(SBE)来研究PD-L1/TGF-β trap对TGF-β1诱导Smad3活化的抑制作用，根据IC50大小评价PD-L1/TGF-βtrap的体外活性。
2、测试样品：融合蛋白9、阳性对照(M7824)
3、测试过程
HepG2细胞使用含有10％FBS的MEM完全培养基(GE，SH30243.01)培养，每3天传代一次。实验第一天以每孔25,000个细胞的密度接种于96孔板(Corning，3903)，在37℃、5％CO2条件下培养24小时。第二天，弃去细胞培养板中的培养基，每孔转染100ng 3TP-Lux质粒。细胞在37℃、5％CO2条件下继续培养24小时。加入待测样品前6小时，弃去96孔板中完全培养基，每孔加入80μL不完全培养基(MEM+0.5％FBS)。6小时后再加入10μL使用不完全培养基配制的人TGF-β1(R&D，240-B-010)溶液，终浓度为2ng/mL和10μL待测样品，终浓度为500、50、5、0.5、0.05、0.005、0.0005和0nM，以人TGF-β1溶剂为对照，细胞在37℃、5％CO2条件下继续培养18h。然后每孔加入100μL配制好的萤光素酶底物ONE-GloTM Luciferase Assaysystem(promega，E6110)，室温避光放置10分钟，然后使用Victor3多功能酶标仪(PerkinElmer)读取发光信号值。待测样品的IC50值使用数据处理软件Graphpad Prism5.0计算得到。
图6显示融合蛋白9以剂量依赖性形式抑制TGFβ诱导的pSMAD3报告物活性，且与阳性对照M7824具有相当的功效和IC50(抑制最大活性的50％所需的浓度)。PD-L1抗体的测试结果显示其不具有抑制作用(IC50＞500nM)。
测试例6：体外检测结核杆菌素(TB)刺激PBMC释放IFNγ实验
1、测试目的
为了研究PD-L1/TGF-β trap对T淋巴细胞的激活作用，收集和纯化人外周血单核细胞(PBMC)，采用结核杆菌素(TB)体外刺激5天，检测IFNγ细胞因子的分泌水平。
2、测试样品：①Human IgG；②PD-L1抗体；③融合蛋白9；④对照1(20T-Fc)：ECD(20-136)-Fc；⑤PD-L1抗体+对照1(20T-Fc)。
3、测试过程
新鲜分离纯化的PBMC，15mL约3×107个，加入20μL结核菌素，37℃、5％CO2培养箱培养5天。第6天，收集上述培养的细胞离心，用PBS洗一次，重悬至新鲜的培养基中，调整密度为1×106个每毫升，接种至96孔细胞培养板，每孔90μL。将不同浓度的抗体分别加入上述96孔细胞培养板的对应孔中，每孔10μL，对照组和空白组分别加入10μL PBS。细胞培养板置于37℃，5％CO2培养箱孵育3天。取出细胞培养板，离心(4000rpm，10min)每孔取上清，10倍稀释后，采用ELISA的方法(人IFN-γ检测试剂盒，欣博盛，EHC102g.96)检测IFN-γ的水平。具体操作参考试剂说明书。结果如图所示，PD-L1/TGF-β trap融合蛋白样品均能够增强激活的T淋巴细胞分泌细胞因子IFN-γ，并且有药物浓度剂量效应。
表4
Figure GPA0000266365870000221
4、结果
如图7、表4所示，融合蛋白9能够剂量依赖地增强激活的T淋巴细胞分泌细胞因子IFN-γ，并且具有比PD-L1抗体，20T-FC更强的激活作用。
药代动力学评价
测试例7：
实验用SD大鼠3只，雌性，12/12小时光/暗调节，温度24±3℃恒温，湿度50-60％，自由进食饮水。购自杰思捷实验动物有限公司。实验当天对SD大鼠分别尾静脉注射融合蛋白，给药剂量为6mg/kg，注射体积为5ml/kg。
取血时间点为：第1天给药后15min、7h、24h(第2天)，第3天，第4天，第6天，第8天，第10天，第15天，于大鼠眼底静脉取血，每次200μl(相当于取血清100μl)；收集的血样在室温下置放半小时至凝集，然后4℃下10000xg离心10分钟。收集上清，立即放置-80℃贮存。用ELISA检测血清中的融合蛋白浓度。
检测流程描述如下：
a.以2μg/ml浓度的人源PD-L1-His为抗原按100μl/孔包被96孔板，4℃过夜。
b.250μl 1×PBST洗涤4次，加入250μl 5％牛奶PBS，37℃封闭3小时。
c.250μl 1×PBST洗涤4次，加入100μl梯度稀释的待测血清，以融合蛋白9为阳性对照，37℃孵育1小时。
d.250μl 1×PBST洗涤5次。
e.每孔加入100μl生物素化的抗人源TGF-βRII的抗体(R&D)，37℃孵育1小时。
f.250μl 1×PBST洗涤5次。
g.每孔加入100μl TMB，室温孵育10分钟后加入100μl 1M H2SO4终止反应。
h.酶标仪上检测450nm测吸收值，Graphpad Prism5分析数据。
表5：融合蛋白在SD大鼠中的T1/2
Figure GPA0000266365870000231
参见表5，PK分析结果表明，本发明融合蛋白分子融合蛋白9在大鼠体内的半衰期约为236h(9.8天)。
体内活性生物学评价
测试例8：PD-L1/TGF-β trap对人乳腺癌MDA-MB-231小鼠皮下移植瘤的疗效
本实验应用的小鼠品系为NOD/SCID雌性小鼠(卡文斯)，实验使用的人外周血单个核细胞从新鲜采集的血液中提取获得，提取方法如下：将肝素抗凝处理的静脉血与同体积含2％FBS的PBS混合，混匀后将25ml稀释后的血液缓慢加入到含15ml淋巴细胞分离液的离心管中，室温下1200g离心10分钟，吸取淋巴细胞层转移到另一个离心管，加入PBS清洗细胞，室温下300g离心8分钟，重复一次后，用含10％FBS的RPMI-1640培养基重悬细胞，将细胞加入到事先包被好CD3抗体(OKT3，40ng/ml)的6孔板中，每孔2×106个细胞(2ml)，置于37℃培养箱中培养4天。
实验样品：
①空白对照：PBS；②融合蛋白9-4.8mpk；③融合蛋白9-24mpk；④PD-L1抗体-4mpk；⑤PD-L1抗体-20mpk；⑥PD-L1抗体-4mpk+对照1(20T-Fc)-2.14mpk；⑦对照1(20T-Fc)-2.14mpk。
将MDA-MB-231细胞重悬于无血清RPMI-1640培养基中，与等体积基质胶混合后100μl(2.3×106)接种于NOD/SCID小鼠右肋部皮下，11天后去除肿瘤体积过大过小动物后，将小鼠随机分组，每组9只。将5×105个刺激后的PBMC(60μl)注射到肿瘤组织中，剩余的PBMC停止刺激并继续培养，1周后将5×106个PBMC(100μl)腹腔注射到荷瘤小鼠体内，视为第1轮注射。整个实验周期，进行2轮半、共5次PBMC注射。首次瘤内注射当日开始腹腔给药，一周三次，共给药14次，给药方式见表6。每周2次测量瘤体积，称体重。实验结果见表7。实验结束后将荷瘤小鼠安乐死并剥瘤称重。
表6：试验分组及给药情况
组别 给药剂量
①空白对照：PBS 0
②融合蛋白9-4.8mpk 4.8mg/kg
③融合蛋白9-24mpk 24mg/kg
④PD-L1抗体-4mpk 4mg/kg
⑤PD-L1抗体-20mpk 20mg/kg
⑥PD-L1抗体-4mpk+对照1-2.14mpk 4mg/kg+2.14mg/kg
⑦对照1-2.14mpk 2.14mg/kg
表7：融合蛋白9对MDA-MB-231小鼠皮下移植瘤的疗效
Figure GPA0000266365870000241
第0天：第一次给药时间；*p＜0.05 **p＜0.01 ***p＜0.001通过student t检验与PBS对比。
实验结果如图8显示，抗体融合蛋白9(4.8、24mg/kg)能明显抑制人乳腺癌MDA-MB-231小鼠皮下移植瘤的生长，高低剂量间呈现剂量依赖关系，且优于各自等同摩尔剂量的参比药物PD-L1抗体(4、20mg/kg)、TGF-βRII对照分子20T-FC(2.14mg/kg)和联用组(PD-L1抗体-4mg/kg+20T-FC-2.14mg/kg)。各剂量的融合蛋白9从给药后14d开始，就一直保持理想的抑瘤效果，且其高剂量与PD-L1抗体-20mpk相比，优势非常明显(p＜0.05)；给药后25d，各抗体抑瘤效果最好，融合蛋白9和PDL-1抗体低、高剂量与联用组的抑瘤率分别为37.24％、52.38％、30.24％、28.01％、31.38％；给药后32天，融合蛋白9的抑瘤作用仍十分明显，低高剂量组％TGI分别为36.68％和50.76％，且瘤体积与对照组相比都存在统计学差异(p＜0.05)。
测试例9：PD-L1/TGF-β trap的物理稳定性
本测试例用于检测融合蛋白融合蛋白9和融合蛋白15的稳定性。
利用DSC(Differential scanning calorimetry，差示扫描量热法)检测不同抗体的热稳定性，比较了不同的缓冲体系下的稳定性情况，不同缓冲体系如10mM醋酸盐/135mMNaCl(pH 5.5)和10mM醋酸盐/9％海藻糖(pH 5.5)。
将样品置换到对应缓冲液中，控制样品浓度在50mg/ml左右，利用MicroCal*VP-Capillary DSC(Malvern)进行检测。检测前，将各个样品及空白缓冲液用真空脱气器脱气1～2min。样品板每个孔加入400μl样品或空白缓冲液(仪器上样量为300μl)。最后两对孔板分别加入14％Decon 90和ddH2O，以备清洗用，样品板加样完毕后，套上塑料软盖板。扫描温度从25℃开始到100℃结束，扫描速率60℃/h。具体结果如下表8所示，在两个测试体系中融合蛋白9、融合蛋白15均表现了良好的热稳定性。
表8
Figure GPA0000266365870000251
通过SEC-HPLC监测样品纯度考察一定浓度条件下周期性稳定性，示例性的条件比如将样品浓度控制在约50mg/ml，在10mM醋酸盐/135mM NaCl(pH 5.5)比较在比如-80℃反复冻融5次及40℃保存一个月的稳定性情况。利用Xbridge protein BEH SEC 200A(Waters)HPLC柱子检测。检测结果如下表9所示，两个融合蛋白均表现出良好的稳定性。
表9
融合蛋白9(Δ％) 融合蛋白15(Δ％)
40℃ 3.39％ 1.8％
-80℃冻融 1.44％ 1.39％
注：Δ％表示变化率。
测试例10：融合蛋白的化学稳定性
脱酰胺修饰是抗体中可能影响后期稳定性的一种常见的化学修饰，尤其是CDR区域的部分氨基酸高度脱酰胺修饰一般选择尽量避免或者突变降低。取1600μg待测抗体溶于200μl 10mM醋酸盐/135mM NaCl(pH 5.5)中，40℃恒温箱存放；分别于0、14、28天取样，用于酶解实验。将100μg不同时间点取样的样品溶于100μl 0.2M His-HCl，8M Gμa-HCl，pH 6.0溶液中，加3μl 0.1g/mL DTT，50℃水浴1小时，后用0.02M His-HCl，pH 6.0的溶液超滤两次，加入3μL 0.25mg/mL的胰蛋白酶，37℃水浴酶解过夜。Agilent 6530 Q-TOF进行LC-MS检测脱酰胺修饰情况，结果如下表10所示。
表10
Figure GPA0000266365870000261
备注：N代表检测到修饰的天冬酰胺，数字代表所处轻链或者重链N端开始计数所处的位置。百分含量代表LC-MS检测到的脱酰胺修饰占该位点所处全部肽段信号的比例。
质谱检测结果显示两个融合蛋白都没有明显的脱酰胺修饰位点，提示其后期化学稳定性良好。

Claims (16)

1.一种含有TGF-β受体的融合蛋白，包含靶向部分和TGF-β受体部分，其中所述的靶向部分为PD-L1抗体或其抗原结合片段，TGF-β受体部分为TGF-βRII胞外区的N端截短形式；其中所述的含有TGF-β受体的融合蛋白如通式(I)所示：
Ab-L-TGF-βRII ECD (I)
其中TGF-βRII ECD为TGF-βRII胞外区的N-端截短形式；Ab为抗PD-L1抗体或其抗原结合片段；L为连接序列；
所述的TGF-βRII胞外区的N端截短形式为在TGF-βRII胞外区的N端上有14-21个连续氨基酸的缺失；
所述的TGF-βRII胞外区的序列如SEQ ID NO：13所示；
所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：1所示的HCDR1，如SEQ ID NO：2所示的HCDR2；如SEQ ID NO：3所示的HCDR3；如SEQ ID NO：4所示的LCDR1；如SEQ ID NO：5所示的LCDR2；和如SEQ ID NO：6所示的LCDR3；其中，SEQ ID NO：2如RIX1PNSG X2TSYNEKFKN所示，且当X1是G时，X2是F；或当X1是H时，X2是G。
2.根据权利要求1所述的含有TGF-β受体的融合蛋白，其中所述的TGF-βRII胞外区的N端截短形式为在TGF-βRII胞外区的N端上有14、19或21个连续氨基酸的缺失。
3.根据权利要求1或2所述的含有TGF-β受体的融合蛋白，其中所述的TGF-βRII胞外区的N端截短形式包含SEQ ID NO：14、15或16所示的序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的含有TGF-β受体的融合蛋白，其中所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体或其功能片段、人源化抗体或其功能片段、或人抗体或其功能片段。
5.根据权利要求4所述的含有TGF-β受体的融合蛋白，其中所述抗PD-L1抗体为人源化抗体，其重链可变区具有如SEQ ID NO：7所示的序列。
6.根据权利要求5所述的含有TGF-β受体的融合蛋白，其中所述抗PD-L1抗体的重链可变区具有如SEQ ID NO：9所示的序列。
7.根据权利要求4所述的含有TGF-β受体的融合蛋白，其中所述的抗PD-L1人源化抗体进一步包括序列SEQ ID NO：11所示的重链。
8.根据权利要求4所述的含有TGF-β受体的融合蛋白，其中所述的抗PD-L1人源化抗体包含SEQ ID NO：8或10所示的轻链可变区序列。
9.根据权利要求4所述的含有TGF-β受体的融合蛋白，其中所述的抗PD-L1人源化抗体包含序列SEQ ID NO：12所示的轻链。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的含有TGF-β受体的融合蛋白，其中所述的连接序列为(G4S)xG，其中x为3-6。
11.根据权利要求10所述的含有TGF-β受体的融合蛋白，其中所述的连接序列为(G4S)xG，其中x为4-5。
12.一种药物组合物，其含有治疗有效量的根据权利要求1至11中任一项所述的含有TGF-β受体的融合蛋白，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
13.一种DNA分子，其编码根据权利要求1至12中任一项所述的含有TGF-β受体的融合蛋白。
14.一种表达载体，其含有根据权利要求13所述的DNA分子。
15.一种宿主细胞，其含有根据权利要求14所述的表达载体，所述宿主细胞选自细菌、酵母菌和哺乳动物细胞。
16.根据权利要求1至11中任一项所述的含有TGF-β受体的融合蛋白或根据权利要求12所述的药物组合物在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途，其中所述的肿瘤为表达PD-L1的癌症。
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