CN105121474A - 融合免疫调节蛋白及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明大体涉及生产用于癌症治疗的重组嵌合融合蛋白的领域，更具体地涉及抗-EGFRl-TGFβRII、抗-EGFR1-PD1和抗-CTLA4-PD1的融合分子及其生产方法，其中所述方法削减了生产成本并增加了重组嵌合融合蛋白的同源性。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求在2013年3月12日提交的美国临时专利申请61/777016的优先权，出于所有目的将所述申请的内容在此通过引用并入本文中。
发明背景
技术领域
本发明大体涉及生产用于癌症治疗的重组嵌合融合蛋白的领域，更具体地涉及抗-EGFRl-TGFβRII、抗-EGFR1-PD1和抗-CTLA4-PD1的融合分子其生产方法，其中所述方法削减了生产成本并增加了重组嵌合融合蛋白的同源性。
背景技术
尽管医药研究有许多进展，但是癌症仍是美国死亡的第二主要原因。临床护理的传统模式如手术切除、放射疗法和化学疗法具有显著的失效率，尤其对于实体肿瘤。因为原发肿瘤不响应或因为在起始部位处的再生或转移导致的复发而发生失效。癌症仍是医药研究和开发的中心焦点。
对癌症的免疫疗法已经探索了一个世纪，但是仅仅是在过去十年才将各种抗体基产品引入患有不同形式癌症的患者的管理中。目前，这是临床研究的最活跃领域之一，有许多抗体治疗产品已经被批准用于肿瘤学。
使用特定抗体作为治疗剂提供了相对于非靶向疗法的优点，所述非靶向疗法例如为通过药物的口服或静脉内施用的全身化学疗法或放射疗法。存在两种类型的抗体基疗法。更常用的类型是识别肿瘤抗原(即在肿瘤和癌细胞上表达且不在正常组织中表达的蛋白)和开发抗体，优选针对肿瘤抗原的单克隆抗体。人们便可以将任何治疗剂如化疗剂、放射性核素、改性毒素等结合至该抗体以实现治疗剂对肿瘤的靶向治疗。另一种抗体基疗法是通过提供本身对于其靶向的肿瘤/癌细胞具有治疗性能的抗体。该第二种形式的抗体基疗法的附加优点是人们可以将另一种治疗剂结合至该治疗抗体以实现更有效的治疗。任何抗体引导的疗法和特别是使用单克隆抗体(mAb)的疗法的主要优点是能够将增加剂量的治疗剂输送至肿瘤，并且更多地使正常组织免受治疗剂的副作用。
尽管识别了用于癌症疗法的几种抗体，但仍需要识别新的和更有效的疗法来克服免疫耐受性和激活T细胞应答。另外，即使分子工程已经改善了这种抗体基疗法的前景，但是仍存在关于生成的重组产品的连续性的问题。
发明内容
本发明提供了用于生成如下的新型和一致的合成方法：同源重组融合免疫调节分子，更具体地，包括连接至免疫调节蛋白的靶向抗体的重组嵌合多肽。
为了介导对癌症的免疫应答，T细胞活化和共刺激都是重要的。T细胞的共刺激主要通过CD28与其在抗原呈细胞(APC)上的B7家族的配体结合来介导。然而，在活化之后，T细胞表达被称作细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)的分子，其以比CD28高的多的亲和力结合至B7配体，并且这种结合下调了T细胞活性。因此，包括结合至CTLA-4受体的抗体将阻断与B7家族的配体的相互作用并增强抗肿瘤应答。
上面讨论的B7配体之一程序性死亡配体-1(PDL1)通过如下阻断了抗肿瘤免疫：(1)通过结合至其在T细胞上的受体PD1(CD279)而使肿瘤反应性T细胞耐受；(ii)通过经肿瘤细胞表达的PDL1的PD-1信号传导使得肿瘤细胞对于CD8+T细胞和FasL介导的裂解是抗性的；和(iii)促进诱导的T调节细胞的生长和维持。因此，PDL1是自然抗肿瘤免疫和需要活化宿主T细胞介导的抗肿瘤免疫的癌症免疫疗法的主要障碍。这一理念得到了如下研究的支持，所述研究证明了PDL1-PD1相互作用的抗体阻断改进了T细胞活化并减小了肿瘤进展。尽管PDL1或PD1的抗体已经在癌症患者的小团体中显示了疗效，但是大多数患者没有受益于抗体治疗。因此，需要用于调节PD-L1功能的机制，其将产生新的普遍适用的用于将癌症患者中的PD-L1介导的免疫抑制最小化的治疗且比当前可获得的PD-1或PD-L1的mAb更有效。
许多上皮癌如结肠、头颈部、乳房、卵巢、非小细胞肺(NSCL)和胰腺癌症的特征是癌细胞表面上的表皮生长因子受体(EGFR)的水平不正常得高。表皮生长因子受体家族(EGFR；HER1，HER2/neu，HER3和HER4)包括具有内在酪氨酸激酶活性的细胞膜受体，所述细胞膜受体响应不同配体的结合而诱发生物生理信号反应的级联。这些受体在恶性肿瘤细胞在种种人肿瘤中的行为方面发挥关键作用，从而诱导增加的增殖、降低凋亡、并增强肿瘤细胞能动性和血管形成。因此，本发明包括靶向EGFR家族成员的抗体。
本发明还提供通过削弱癌细胞的免疫耐受性而降低癌细胞生长的方法，其中T细胞仍是有活性的并抑制T调节的招募，所述T调节的招募被认为是抑制免疫系统的肿瘤应答。因此，由本发明的多核苷酸序列产生的嵌合多肽因为表达的融合或嵌合多肽而有用于治疗癌症。
在一个方面，本发明提供如下的嵌合多肽，其包含至少一个靶向癌细胞的靶向部分和至少一个削弱癌细胞的免疫耐受性的免疫调节部分，其中所述靶向部分和所述免疫调节部分通过足够长度氨基酸残基的氨基酸间隔子连接，使得两个部分能够成功地结合至它们各自的靶点。在可选方案中，靶向部分和削弱癌细胞的免疫耐受性的免疫调节部分可以直接相互结合。本发明的嵌合/融合多肽有用于结合至癌细胞受体并降低癌细胞避免免疫应答的能力。
优选靶向部分是对CTLA-4或EGFR1具有结合亲和力的抗体，其中所述抗体是从如下多核苷酸序列转录的，所述多核苷酸序列缺失用于表达所表达的抗体的重链的C末端赖氨酸的核苷酸。已经发现，通过在转录期间去除抗体重链的C末端赖氨酸，终产品显示提高的同源性，由此降低了进一步纯化的需要和成本。
已知在IgG分子在CHO细胞中转录和翻译的过程期间，将表达在重链C末端的赖氨酸(K)。在商业产品中，必须去除这种表达的赖氨酸以增加纯度。如在图1中所示，在制造的产品存在很多异源性。这是因为CHO细胞具有内源酶羧肽酶B(CPB)而发生，只要表达的抗体仍可细胞内获得，则所述羧肽酶B将会剪切C末端赖氨酸。然而，一旦抗体被分泌到介质中，该酶将不会剪切赖氨酸。因此，该内源CPB的剪切效率是基于细胞内的可获得性。这样，抗体中的一些将会分泌有赖氨酸而一些将不会，并且这种组合将在分泌的产品中造成显著的异源性，即一些抗体有C末端赖氨酸而一些没有。当将重组产品用于治疗用途时，人们需要纯化至同源性。因此，现有技术的重组产品需要另外的纯化步骤，其中重组产品需要首先用酶CPB处理并使用另外的步骤再次纯化以从终产品去除任何赖氨酸和酶CPB。这些另外的步骤向制造工艺添加了大量成本。
通过从缺失用于表达所表达的抗体的重链的C末端赖氨酸的核苷酸的多核苷酸序列转录表达的蛋白，本发明避免了以前的合成重组抗-CTLA-4和抗-EGFRl抗体的方法的缺点。
本发明是基于通过表达编码削弱或逆转癌细胞的免疫耐受性的融合蛋白的多核苷酸而制备嵌合/融合蛋白。癌细胞能够通过在肿瘤微环境中的特定免疫抑制机制逃脱化疗剂或肿瘤靶向抗体的消除并且癌细胞的这种能力被视作免疫耐受性。这种免疫抑制机制包括免疫抑制细胞因子(例如转变生长因子β(TGF-β))和调节性T细胞和/或免疫抑制髓样树突状细胞(DC)。通过削弱肿瘤诱导的免疫耐受性，本发明提供用于癌症治疗的有效组合物和方法，其任选地与另一种现有的癌症治疗相结合。通过活化和利用对于抗性和弥散性癌细胞的T细胞介导的适应性抗肿瘤，本发明提供削弱肿瘤诱导的免疫耐受性和增强化疗的抗肿瘤疗效的策略。
在另一个方面，本发明提供包含与至少一个免疫调节部分融合的至少一个靶向部分的分子。所述靶向部分特异地结合靶分子，所述免疫调节部分特异地结合以下分子中的一种：(i)转化生长因子β(TGF-β)和/或(ii)程序性死亡配体1(PD-L1)。
在另一个方面，靶向部分包括含有重链和轻链两者的抗体，其中抗体特异地结合肿瘤细胞、肿瘤抗原、肿瘤血管、肿瘤微环境或肿瘤浸润免疫细胞的组分。值得注意的是，重链和/或轻链可能单独地连接至相同类型的免疫调节部分或分开的和不同的免疫调节部分。另外，抗体靶向部分的重或轻链可以连接至免疫调节部分，免疫调节部分转而可以进一步连接至第二免疫调节部分，其中在两个免疫调节部分之间有连接子。
在又一个方面，提供了包含肿瘤靶向部分和免疫调节部分的嵌合多肽，所述免疫调节部分包含结合转化生长因子β(TGF-β)的分子，其中肿瘤靶向部分是结合EGFR1的抗体，其中抗体可以是完整的抗体、重链或轻链。
肿瘤靶向部分可包括靶向癌细胞的单克隆抗体，包括但不限于西妥昔单抗，曲妥单抗，利妥昔单抗，易普利姆玛，tremelimumab，莫罗单抗-CD3，阿昔单抗，达利珠单抗，巴利昔单抗，帕利珠单抗，英夫利昔，吉妥珠单抗奥唑米星，阿仑单抗，替伊莫单抗，阿达木单抗，奥马珠单抗、托西莫单抗，I-131托西莫单抗，依法利珠单抗，贝伐单抗，帕尼单抗，帕妥珠单抗，那他珠单抗，依那西普，IGN101(Aphton)，volociximab(BiogenIdec和PDLBioPharm)，抗-CD80单抗(BiogenIdec)，抗-CD23单抗(BiogenIdel)，CAT-3888(CambridgeAntibodyTechnology)，CDP-791(Imclone)，eraptuzumab(Immunomedics)，MDX-010(MedarexandBMS)，MDX-060(Medarex)，MDX-070(Medarex)，matuzumab(默克)，CP-675,206(Pfizer)，CAL(Roche)，SGN-30(SeattleGenetics)，zanolimumab(Serono和Genmab)，adecatumumab(Sereno)，奥戈伏单抗(UnitedTherapeitics)，尼妥珠单抗(YMBioscience)，ABT-874(AbbottLaboratories)，地诺单抗(Amgen)，AM108(Amgen)，AMG714(Amgen)，fontolizumab(BiogenIdec和PDLBioPharm)，达克珠单抗(BiogentIdec和PDLBioPharm)，戈利木单抗(Centocor和Schering-Plough)，CNTO1275(Centocor)，ocrelizumab(Genetech和Roche)，HuMax-CD20(Genmab)，贝利木单抗(HGS和GSK)，依帕珠单抗(Immunomedics)，MLN1202(MillenniumPharmaceuticals)，visilizumab(PDLBioPharm)，塔西单抗(Roche)，ocrerlizumab(Roche)，聚乙二醇化赛妥珠单抗(UCB，前Celltech)，依库丽单抗(AlexionPharmaceuticals)，培克珠单抗(AlexionPharmaceuticals和Procter&Gamble)，阿昔单抗(Centocor)，ranibizimumab(Genetech)，美泊利单抗(GSK)，TNX-355(Tanox)，或MYO-029(Wyeth)。
在优选实施方式中，肿瘤靶向部分是通过本发明的方法生产的结合至CTLA-4或EGFR1的单克隆抗体，其中所述方法包含以下步骤：
a.制备编码融合蛋白的密码子优化的核酸序列，其中抗体的密码子优化的核酸序列缺失用于表达在抗体重链C末端的赖氨酸的核苷酸；
b.在能够瞬时或连续表达的宿主细胞中克隆所述融合蛋白的优化序列；
c.在生长的合适条件下在介质中生长宿主细胞并允许宿主细胞表达融合蛋白；以及
d.收集分泌的融合蛋白。
在又一个方面，免疫调节部分包括结合TGF-β并抑制其功能的分子。具体地，免疫调节部分包括转化生长因子-β受体TGF-βRII、TGF-βRIIb或TGF-βRIII的细胞外配体-结合区域。在另一个方面，免疫调节部分包括TGF-βRII的细胞外配体-结合区域(ECD)。
在又一个方面，靶向部分包括特异地结合至HER2/neu、EGFR1、CD20或细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)的抗体，其中免疫调节部分包括TGF-βRII的细胞外配体-结合区域。
在又一个方面，免疫调节部分包括特异地结合程序性死亡-1配体1(PD-L1)并抑制程序性死亡-1配体1的活性的分子。
在另一个方面，靶向部分包括特异地结合至HER2/neu、EGFR1、CD20、细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、CD25(lL-2a受体；IL-2aR)或CD4的抗体、抗体片段或多肽，其中免疫调节部分包括程序性死亡-1(PD-1)的细胞外配体-结合区域或胞外域。
在又一个方面，靶向部分包括特异地结合至EGFR1和CTLA-4的抗体，免疫调节部分包括来自与转化生长因子-β(TGF-β)相互作用的序列。
在一个方面，本发明提供用于编码融合多肽的优化基因，所述融合多肽包含至少一个靶向部分和至少一个免疫调节部分，用于治疗人类受试者中的癌症，其中已经对所述基因进行了优化以增加在人类受试者和/或细胞中的表达。
在另一个方面，本发明提供包含用于治疗人类受试者中的癌症的优化基因的载体，其中所述优化基因已经被修饰为增加了CG序列。优选地，载体包括用于编码至少一个靶向部分、至少一个免疫调节部分和连接部分的核苷酸序列，其中如在表2中所列出的，优化的核苷酸序列选自SEQIDNO：1-7。
在又一个方面，本发明提供治疗受试者中癌症的方法，所述方法包含：
提供至少一种包含如下核苷酸序列的重组载体，所述核苷酸序列编码至少一个靶向部分、至少一个免疫调节部分和位于靶向部分和免疫调节部分之间的连接部分，其中所述核苷酸序列选自SEQIDNO：1-7；和
在使得所述核苷酸序列以在受试者中生产治疗有效量的编码的融合蛋白的水平表达的条件下将所述重组载体施用至受试者。
在又一个方面，本发明提供用本发明的编码融合蛋白肽的多核苷酸序列转染的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸序列选自SEQIDNO：1-7。
在又一个方面，本发明构想了制备本发明的嵌合融合蛋白的方法，其包含：
用编码嵌合融合蛋白的多核苷酸序列转染宿主细胞以制造转化的宿主细胞，其中所述多核苷酸序列编码至少一个靶向部分和至少一个免疫调节部分，其中所述多核苷酸序列包含选自SEQIDNO：1-7的序列的组合；和
将所述转化的宿主细胞保持在足以表达所述嵌合融合蛋白的生物条件下。
在另一个方面，本发明涉及嵌合融合蛋白的用途，其中在用于治疗癌症的药物中时，如分别在图3、4和5中所示的，所述嵌合融合蛋白包含抗-EGFRl连接子PD1(SEQIDNO：8、9、10和11)；抗-EGFRl-连接子-TGFβRII(SEQIDNO：8、9、10和12)；抗-CTLA-4-连接子-PD1(SEQIDNO：13、14、10和11)。优选地，融合蛋白在宿主细胞中表达，并且以治疗量施用这种表达的蛋白以在需要其的受试者中减小癌症的影响。
在又一个方面，本发明提供治疗肿瘤病的方法。在各个方面，该方法包括将本发明的一种或多种融合蛋白施用至需要其的受试者，将本发明的一种或多种融合蛋白连同另一种抗癌疗法施用至受试者。在一个方面，所述抗癌疗法包括化疗分子、抗体、小分子激酶抑制剂、激素制剂或细胞毒素剂。所述抗癌疗法可还包括电离放射、紫外线放射、冷冻消融、热消融或射频消融。
在优选的实施方式中，治疗活性抗体-肽融合蛋白是融合至一个或多个削弱癌细胞的免疫耐受性的免疫调节部分的靶向抗体。在一个方面，免疫调节部分可通过长度足以允许分子的双特异结合的氨基酸间隔子连接。免疫调节部分可结合至抗体的重链的N末端或C末端或轻链的N末端或C末端。
本发明的方法提供编码治疗活性抗体-肽融合蛋白的核酸序列，这种表达可以在瞬时细胞系或稳定细胞系中进行。通过利用载有编码的融合蛋白的载体将宿主细胞转染或转化到哺乳动物宿主细胞中完成了瞬时表达。
一旦表达了融合肽，就优选对它们进行纯化和体外试验以检查其双特异性，即具有结合至靶点部分和免疫调节部分两者的能力。这种试验可包括验证双功能靶点结合或免疫细胞刺激的体外试验如ELISA或NK/T细胞结合试验。
值得注意的是，一旦特异融合肽证明了期望的双特异性，就对编码这种融合肽的多核苷酸序列进行选择以亚克隆到稳定细胞系中进行更大规模的表达和纯化。这种稳定细胞系在以前被公开，例如哺乳动物细胞系，包括但不限于HEK293、CHO或NSO。
在另一方面，本发明提供抑制和/或降低PDL1结合至PD1从而增加对肿瘤细胞的免疫应答的方法，所述方法包含：
a.提供嵌合多肽，其包含PD1和抗-EGFRl或抗-CTLA-4抗体；和
b.用所述嵌合多肽接触肿瘤细胞，其中所述嵌合多肽至少与肿瘤细胞的PDL1结合。
在又一个方面，本发明提供制备治疗活性抗体-肽融合蛋白的方法，所述方法包含：
a.制备所述融合蛋白的密码自由化的序列，其中抗-EGFRl和抗-CTLA-4抗体的密码子优化的序列缺失用于表达在抗体重链C末端的赖氨酸的核苷酸；
b.在能够瞬时或连续表达的宿主细胞中克隆所述融合蛋白的优化序列；
c.在适合生长的条件下在介质中生长宿主细胞，并允许宿主细胞表达融合蛋白；和
d.收集分泌的融合蛋白。
在又一个方面，本发明提供编码嵌合融合蛋白的核酸序列，其中所述嵌合融合蛋白包含至少一个对癌细胞具有亲和力的靶向部分和至少一个削弱癌细胞的免疫耐受性的免疫调节部分，其中靶向部分是抗体并且靶向部分的核酸序列缺失用于表达在抗体重链C末端的赖氨酸的核苷酸。编码抗体重链的核酸序列优选包括SEQIDNO：1或SEQIDNO：5。编码嵌合融合蛋白的核酸序列优选包含选自SEQIDNO：1、2、4和7；SEQIDNO：1、2、3和4；和SEQIDNO：5、6、3和4的序列。
在又一个方面，本发明提供治疗受试者中的癌症的方法，所述方法包含：
a)制备治疗活性融合蛋白，其中所述融合蛋白包含肿瘤靶向部分和至少一个免疫调节分子，其中肿瘤靶向部分是结合至CTLA-4或EGFR1的抗体，且其中融合蛋白通过以下步骤制备：
制备编码融合蛋白的密码子优化的核酸序列，其中抗体的密码子优化的核酸序列缺失用于表达在抗体重链C末端的赖氨酸的核苷酸；
a)ii)在能够瞬时或持续表达的宿主细胞中克隆所述融合蛋白的优化序列；
b)iii)在适合生长的条件下在介质中生长宿主细胞并允许宿主细胞表达融合蛋白；和
c)iv)收集分泌的融合蛋白；
b.b)将治疗活性量的分泌的融合蛋白施用至受试者。
融合蛋白选自由如下构成的氨基酸序列：SEQIDNO：15和9；SEQIDNO：8和16；SEQIDNO：17和9；SEQIDNO：8和18；SEQIDNO：27和9；SEQIDNO：8和28；SEQIDNO：29和9；SEQIDNO：8和30；SEQIDNO：31和28；SEQIDNO：31和30；SEQIDNO：29和28；SEQIDNO：29和30；SEQIDNO：32和14；SEQIDNO：13和33；SEQIDNO：34和14；SEQIDNO：13和35；SEQIDNO：32和33；SEQIDNO：32和35；SEQIDNO：34和33和SEQIDNO：34和35。
在另一个方面，本发明提供治疗肿瘤病的方法，所述方法包含将一种或多种由至少一种多核苷酸序列编码的融合蛋白施用至需要其的受试者，所述至少一种多核苷酸序列选自SEQIDNO：1、2、4和7；SEQIDNO：1、2、3和4；和SEQIDNO：5、6、3和4。
值得注意的是，通过使用上面限定的多核苷酸序列，可以表达融合蛋白的以下组合，包括抗-EGFRl连接子PD1(SEQIDNO：8、9、10和11)；抗-EGFRl-连接子-TGFβRII(SEQIDNO：8、9、10和12)；和抗-CTLA-4-连接子-PDl(SEQIDNO：13、14、10和11)。
本发明的其它特征和优点将从具体实施方式、附图以及权利要求书显而易见。
附图说明
图1显示重链上赖氨酸位置的不同可能性和这种异源性造成需要提供纯化。
图2显示用于表达本发明的抗体-肽融合蛋白的密码子优化的核苷酸序列，包括抗-EGFRl重链(SEQIDNO：1)；抗-EGFRl轻链(SEQIDNO：2)；PD1(SEQIDNO：3)；连接子(SEQIDNO：4)；抗-CTLA-4重链(SEQIDNO：5)；抗-CTLA-4轻链(SEQIDNO：6)和TGFβRII(SEQIDNO：7)。
图3显示抗-EGFRl连接子PD1构建物的氨基酸残基(SEQIDNO：8、9、10和11)。
图4显示抗-EGFRl-连接子-TGFβRII构建物的氨基酸残基(SEQIDNO：8、9、10和12)。
图5显示抗-CTLA-4-连接子-PDl的氨基酸残基(SEQIDNO：13、14、10和11)。
图6显示抗-EGFRl抗体上PD1分子位置的不同可能性：FMab5，FMab6，FMab7和FMab8。
图7显示包括SEQIDNO：15和9的抗-EGFRlHC-PD1+抗-EGFRlLC的氨基酸序列，其中PD1分子连接至由连接子隔开的重链C末端。
图8显示包括SEQIDNO：8和16的抗-EGFRlHC+抗-EGFRlLC-PD1的氨基酸序列，其中PD1分子连接至由连接子隔开的轻链C末端。
图9显示包括SEQIDNO：17和9的抗-EGFRlHC+抗-EGFRlLC-PD1的氨基酸序列，其中PD1分子连接至由连接子隔开的重链N末端。
图10显示包括SEQIDNO：8和18的抗-EGFRlHC+PD1-抗-EGFRlLC的氨基酸序列，其中PD1分子连接至由连接子隔开的轻链N末端。
图11显示使用如在SEQIDNO：1、2和3中列出的cDNA生成的表达构建物。
图12显示抗-EGFRl抗体上TGFβRII分子位置的不同可能性：FMabl，FMab2，FMab3，FMab4，FMab9，FMab10，FMab11和FMabl2。
图13显示包括SEQIDNO：27和9的抗-EGFRlHC-TGFβRII+抗-EGFRlLC的氨基酸序列，其中TGFβRII分子连接至由连接子隔开的重链C末端。
图14显示包括SEQIDNO：8和28的抗-EGFRlHC+抗-EGFRlLC-TGFβRII的氨基酸序列，其中TGFβRII分子连接至由连接子隔开的轻链C末端。
图15显示包括SEQIDNO：29和9的TGFβRII-抗-EGFRlHC+抗-EGFRlLC的氨基酸序列，其中TGFβRII分子连接至由连接子隔开的重链N末端。
图16显示包括SEQIDNO：8和30的抗-EGFRlHC+TGFβRII-抗-EGFRlLC的氨基酸序列，其中TGFβRII分子连接至由连接子隔开的轻链N末端。
图17显示包括SEQIDNO：31和28的抗-EGFRlHC-TGFβRII+抗-EGFRlLC-TGFβRII的氨基酸序列，其中TGFβRII分子连接至由连接子隔开的重和轻链C末端。
图18显示包括SEQIDNO：31和30的抗-EGFRlHC-TGFβRII+TGFβRII-抗-EGFRlLC的氨基酸序列，其中TGFβRII分子连接至由连接子隔开的重链C末端和轻链N末端。
图19显示包括SEQIDNO：29和28的TGFβRII-抗-EGFRlHC+抗-EGFRlLC-TGFβRII的氨基酸序列，其中TGFβRII分子连接至由连接子隔开的重链N末端和轻链C末端。
图20显示包括SEQIDNO：29和30的TGFβRII-抗-EGFRlHC+TGFβRII-抗-EGFRlLC的氨基酸序列，其中TGFβRII分子连接至由连接子隔开的重链N末端和轻链N末端。
图21显示了使用如在SEQIDNO：1、2和7中列出的cDNA生成的表达构建物。
图22显示在12％还原性SDS-PAGE上分析的蛋白A纯化的试样。
图23显示在6％非还原性SDS-PAGE上分析的蛋白A纯化的试样。
图24显示抗-CTLA4抗体上PD1分子位置的不同可能性。
图25显示包括SEQIDNO：32和14的抗-CTLA4HC-PD1+抗-CTLA4LC的氨基酸序列，其中PD1分子连接至由连接子隔开的重链C末端。
图26显示包括SEQIDNO：13和33的抗-CTLA4HC+抗-CTLA4LC-PD1的氨基酸序列，其中PD1分子连接至由连接子隔开的轻链C末端。
图27显示包括SEQIDNO：34和14的PD1-抗-CTLA4HC+抗-CTLA4LC的氨基酸序列，其中PD1分子连接至由连接子隔开的重链N末端。
图28显示包括SEQIDNO：13和35的抗-CTLA4HC+PDl-抗-CTLA4LC的氨基酸序列，其中PD1分子连接至由连接子隔开的轻链N末端。
图29显示包括SEQIDNO：32和33的抗-CTLA4HC-PD1+抗-CTLA4LC-PD1的氨基酸序列，其中PD1分子连接至由连接子隔开的重链和轻链C末端。
图30显示包括SEQIDNO：32和35的抗-CTLA4HC-PD1+PDl-抗-CTLA4LC的氨基酸序列，其中PD1分子连接至由连接子隔开的重链C末端和轻链N末端。
图31显示包括SEQIDNO：34和33的PD1-抗-CTLA4HC+抗-CTLA4LC-PD1的氨基酸序列，其中PD1分子连接至由连接子隔开的重链N末端和轻链C末端。
图32显示包括SEQIDNO：34和35的PD1-抗-CTLA4HC+PDl-抗-CTLA4LC的氨基酸序列，其中PD1分子连接至由连接子隔开的重链N末端和轻链N末端。
图33显示用如在SEQIDNO：3、5和6中列出的cDNA生成的表达构建物。
图34显示EGFR1靶点结合ELISA。抗-EGFRlHC-TGFβRII+抗-EGFRlLC融合单抗结合至其固定化靶EGFR1。
图35显示TGFβ靶点结合ELISA。抗-EGFRlHC-TGFβRII+抗-EGFRlLC融合单抗结合至其靶TGFβ。
图36显示双功能ELISA。抗-EGFRlHC-TGFβRII+抗-EGFRlLC融合单抗同时结合至其靶EGFR1和TGFβ两者。
图37显示抗-EGFRlHC-TGFβRII+抗-EGFRlLC融合单抗结合至表达EGFR1的A431细胞的流式细胞分析。
图38显示针对表达EGFR1的A431细胞的ADCC。抗-EGFRlHC-TGFβRII+抗-EGFRlLC融合单抗介导针对表达EGFR1的A431细胞的ADCC且效果是剂量依赖性的。
图39显示增殖试验的抑制。抗-EGFRlHC-TGFβRII+抗-EGFRlLC融合单抗抑制表达EGFR1的A431细胞的增殖。
图40显示EGFR1靶点结合ELISA。抗-EGFRlHC+抗-EGFRlLC-TGFβRII融合单抗结合至其固定化靶EGFR1。
图41显示TGFβ靶点结合ELISA。抗-EGFRlHC+抗-EGFRlLC–TGFβRII融合单抗结合至其靶TGFβ。
图42显示双功能ELISA。抗-EGFRlHC+抗-EGFRlLC–TGFβRII融合单抗同时结合至其靶EGFR1和TGFβ两者。
图43显示增殖试验的抑制。抗-EGFRlHC+抗-EGFRlLC–TGFβRII融合单抗抑制表达EGFR1的A431细胞的增殖。
图44显示EGFR1靶点结合ELISA。TGFβRII-抗-EGFRlHC+抗-EGFRlLC融合单抗结合至其固定化靶EGFR1。
图45显示TGFβ靶点结合ELISA。TGFβRII-抗-EGFRlHC+抗-EGFRlLC融合单抗结合至其靶TGFβ。
图46显示双功能ELISA。TGFβRII-抗-EGFRlHC+抗-EGFRlLC融合单抗同时结合至其靶EGFR1和TGFβ两者。
图47显示增殖试验的抑制。TGFβRII-抗-EGFRlHC+抗-EGFRlLC融合单抗抑制表达EGFR1的A431细胞的增殖。
图48显示EGFR1靶点结合ELISA。抗-EGFRlHC+TGFβRII-抗-EGFRlLC融合单抗结合至其固定化靶EGFR1。
图49显示TGFβ靶点结合ELISA。抗-EGFRlHC+TGFβRII-抗-EGFRlLC融合单抗结合至其靶TGFβ。
图50显示双功能ELISA。抗-EGFRlHC+TGFβRII-抗-EGFRlLC融合单抗同时结合至其靶EGFR1和TGFβ两者。
图51显示抗-EGFRlHC+TGFβRII-抗-EGFRlLC融合单抗结合至表达EGFR1的A431细胞的流式细胞分析。
图52显示EGFR1靶点结合ELISA。抗-EGFRlHC-TGFβRII+TGFβRII-抗-EGFRlLC融合单抗结合至其固定化靶EGFR1。
图53显示TGFβ靶点结合ELISA。抗-EGFRlHC-TGFβRII+TGFβRII-抗-EGFRlLC融合单抗结合至其靶TGFβ。
图54显示双功能ELISA。抗-EGFRlHC-TGFβRII+TGFβRII-抗-EGFRlLC融合单抗同时结合至其靶EGFR1和TGFβ两者。
图55显示EGFR1靶点结合ELISA。TGFβRII-抗-EGFRlHC+TGFβRII-抗-EGFRlLC融合单抗结合至其固定化靶EGFR1。
图56显示TGFβ靶点结合ELISA。TGFβRII-抗-EGFRlHC+TGFβRII-抗-EGFRlLC融合单抗结合至其靶TGFβ。
图57显示双功能ELISA。TGFβRII-抗-EGFRlHC+TGFβRII-抗-EGFRlLC融合单抗同时结合至其靶EGFR1和TGFβ两者。
图58显示双功能ELISA。抗-CTLA4HC-PD1+抗-CTLA4LC融合单抗同时结合至其靶CTLA4和PDL1两者。
图59显示双功能ELISA。抗-CTLA4HC+抗-CTLA4LC-PD1融合单抗同时结合至其靶CTLA4和PDL1两者。
图60显示双功能ELISA。PD1-抗-CTLA4HC+抗-CTLA4LC融合单抗同时结合至其靶CTLA4和PDL1两者。
图61显示双功能ELISA。抗-CTLA4HC-PD1+PD1-抗-CTLA4LC-PD1、抗-CTLA4HC-PD1+抗-CTLA4LC-PD1和抗-CTLA4HC-PD1+PD1-抗-CTLA4LC融合单抗同时结合至其靶CTLA4和PDL1两者。
图62显示双功能ELISA。PD1-抗-CTLA4HC+抗-CTLA4LC-PD1和PD1-抗-CTLA4HC+PD1-抗-CTLA4LC融合单抗同时结合至其靶CTLA4和PDL1两者。
图63显示双功能ELISA。抗-EGFRlHC-PD1+抗-EGFRlLC融合单抗同时结合至其靶EGFR和PDL1两者。
图64显示双功能ELISA。抗-EGFRlHC+抗-EGFRlLC-PD1融合单抗同时结合至其靶EGFR和PDL1两者。
具体实施方式
为了有助于评述本发明的各种实施方式和提供对于用于做出和使用本发明的各种要素和组成的理解，在发明说明书中使用的以下术语具有以下含义。
如在本文中使用的，术语“多肽”、“蛋白”和“肽”用于可互换地表示由酰胺键共价连接的至少两个氨基酸的序列聚合物，与长度或翻译后修饰(例如，糖苷化、磷酸化、脂化、myristilation、泛素化等)无关。也包括了D-和L-氨基酸，以及D-和L-氨基酸的混合物。
嵌合多肽指具有通常在自然氨基酸序列中不会一起发现的两个以上部分的氨基酸序列。
如在本文中使用的术语“间隔子/连接子”指的是如下分子，其连接两个单体蛋白单元以形成嵌合分子并且仍供于将所述部分结合至期望的受体。间隔子/连接子的特别实例可包括氨基酸间隔子，其中所述氨基酸序列可以基本上是任何长度，例如小至5或多至200以上优选从约5至30的氨基酸残基。
如在本文中使用的，术语“治疗”是指向表现出病理学迹象的受试者施用的用于减小或消除这些迹象的处理。
如在本文中使用的术语“治疗有效量”是指足以向施用了嵌合多肽的受试者提供有益效果的嵌合多肽的量。
修饰的另一个实例是添加向嵌合多肽赋予不同功能的异源结构域。异源结构域可以是任何小的有机或无机分子或大分子，只要其赋予另外的功能即可。赋予不同功能的异源结构域的特别实例包括如下的氨基酸序列，其赋予靶向(例如受体配体、抗体等)、免疫增强功能(例如免疫球蛋白、佐剂)，使得能纯化、分离或检测(例如myc、T7标签、多组氨酸、亲和素、生物素、凝集素等)。
如在本文中举例的，多肽序列可包括包含嵌合多肽的多肽序列中的一者或两者的氨基酸序列的取代、变异或衍生化，只要修饰的嵌合多肽与未修饰的嵌合多肽具有基本上相同的活性或功能即可。
如在本文中使用的，术语“基本上相同的活性或功能”在用于指代如此修饰的嵌合多肽时，是指多肽保留了与未修饰的多肽相关的大多数、全部或更多的活性，如在本文中所述或本领域中所已知的。
本文中包括的“活性”或“功能性”的修饰的嵌合多肽可通过常规功能试验进行鉴定。例如，通过使用抗体结合试验或共受体结合试验，人们可以轻易地确定修饰的嵌合多肽是否具有活性。因为修饰的嵌合多肽将保留与未修饰的嵌合多肽相关的活性或功能，因此修饰的嵌合多肽将通常具有与未修饰的多肽的氨基酸序列“基本上相同”或“基本上一致”的氨基酸序列。
如在本文中使用的，术语“基本上相同”或“基本上一致”在用于指代多肽序列时，是指多肽的序列至少50％相同于参考序列。修饰的多肽和基本上相同的多肽将通常具有至少70％、或者85％、更可能90％和最可能95％的对参考多肽的同源性。
如在本文中所阐述的，基本上相同或一致的多肽包括添加、删减、内部缺失或插入、保守和非保守取代、或位于不破坏嵌合多肽的功能的氨基酸系列位置处的其它修饰(例如在本文中所述的，通过功能试验确定)。取代的特别实例是其中一个或多个氨基酸被另一个化学或生物相似的残基所取代的情况。如在本文中使用的，术语“保守取代”指的是用化学或生物相似的残基取代一个残基。保守取代的实例包括将疏水残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸用另一个替换，极性残基用另一个替换，例如精氨酸用赖氨酸取代、谷氨酸用天冬氨酸取代、或谷氨酰胺用天冬酰胺取代等。本领域的技术人员将会认识到在基本上不改变活性的情况下可以用其它化学相似的残基修饰或取代许多氨基酸。
修饰的多肽还包括“化学衍生物”，其中一个或多个其中的氨基酸具有化学地改变或衍生化的侧链。这种衍生化的多肽包括例如：如下的氨基酸，其中游离氨基形成了盐酸胺、对甲苯磺酰基、卡罗苯酰氧基(carobenzoxy)；游离羧基形成了盐、甲酯和乙酯；游离羟基形成了O-酰基或O-酰基衍生物，以及自然存在的氨基酸衍生物如脯氨酸的4-羟基脯氨酸、赖氨酸的5-羟基赖氨酸、丝氨酸的高丝氨酸、赖氨酸的鸟氨酸等。同样包括的是D-氨基酸和氨基酸衍生物，其能够改变共价键如制造环状多肽的在两个半胱氨酸残基之间形成的二硫键连接。
如在本文中使用的，术语“分离的”或“基本上纯”在用于修饰发明嵌合多肽、其序列片段和多核苷酸时，是指它们通过人类干涉而制造并从它们的自然体内细胞环境中分离。一般来讲，如此分离的多肽和多核苷酸基本上没有与它们自然相关的其它蛋白、核酸、脂质、碳酸盐或其它物质。
通过本领域技术人员已知的标准技术可制备本发明的多肽。这种技术包括但不限于从已知含有所述多肽的组织进行分离和纯化，和使用转化的细胞从编码这种多肽的克隆DNA进行表达。通过如下可获得嵌合多肽：在宿主细胞如细菌、酵母菌或哺乳动物细胞中表达编码多肽的多核苷酸，并使用典型生物化学方法(例如免疫亲和纯化、凝胶纯化、表达筛选等)通过纯化对表达的嵌合多肽进行纯化。在Deutscher等，1990中描述了其它公知的方法。或者，可以化学地合成嵌合多肽。通过任何合适的方法如聚丙烯酰胺凝胶电泳和之后的凝胶染色(如银染)或通过HPLC分析来测定纯度。
本发明还提供编码嵌合多肽、其片段和互补序列的多核苷酸序列。如在本文中使用的，术语“核酸”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“引物”可互换地用于指双链或单链、线性或环状的脱氧核酸核糖(DNA)或核糖核酸(RNA)。RNA可以是未剪接或剪接的mRNA、rRNA、tRNA或反义RNAi。DNA可以是互补DNA(cDNA)、基因组DNA或反义DNA。特别地包括的是核苷酸类似物和衍生物例如耐核酸酶降解的那些，其可以发挥作用编码发明嵌合多肽。耐核酸酶的寡核苷酸和多核苷酸特别有用于本文中描述的本发明核酸疫苗。
“分离的”或“基本上纯的”多核苷酸是指核酸不会与具有5’端或3’端的编码序列立即邻接，在获得所述核酸的自然出现的生物的基因组中所述核酸与具有5’端或3’端的编码序列立即邻接。因此该术语包括例如重组DNA(例如在克隆期间制造的通过PCR或限制性内切酶处理制造的cDNA或基因组DNA片段)，以及并入载体的重组DNA、自主复制的质粒或病毒或原核细胞或真核细胞的基因组DNA。
使用本领域已知的标准方法(例如分子克隆、化学合成)可以获得本发明的多核苷酸序列，通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳、序列分析等可以确定纯度。也可以使用本领域公知的杂交或基于电脑的技术分离多核苷酸。这种技术包括但不限于：(1)用探针对基因组DNA或cDNA文库进行杂交以检测同源核苷酸序列；(2)对由DNA序列表达的多肽进行抗体筛选(例如使用表达文库)；(3)使用能够退火至目标核酸序列的引物对基因组DNA或cDNA进行聚合酶链反应(PCR)；(4)对相关序列的序列数据库进行电脑搜索；和(5)对削减的核酸文库进行示差筛选。
本发明还包括基本上同源的多核苷酸。如在本文中使用的，术语“同源的”在用于指代核酸分子时指的是在两个核苷酸序列之间的相似性。当两个分子中的核苷酸位置被相同的核苷酸所占据，则它们在该位置是同源的。“基本上同源的”核酸序列是至少50％同源，更可能至少75％同源，最可能90％以上同源。对于基本上同源的本发明嵌合多肽，与编码嵌合多肽的本发明多核苷酸基本上同源的多核苷酸编码保留了与其同源的序列相关的大多数或全部活性或功能的多肽。对于多核苷酸，序列之间的比较长度将通常为至少30个核苷酸，或者至少50个核苷酸，更可能至少75个核苷酸，和最可能110个核苷酸以上。用于鉴定导致多核苷酸序列空隙和错配寡核苷酸的同源序列的算法在本领域是已知的，例如BLAST(参见Altschul，1990)。
如果需要，本发明的多核苷酸可以：是裸的或在适于穿透细胞膜的载体(例如多核苷酸-脂质体复合物或胶体分散体系)中，包含在载体(例如逆转录病毒载体、腺病毒载体等)中，连接至惰性珠或其它异源结构域(例如抗体、配体、生物素、链霉亲和素、凝集素等)，或是在本文中公开的或本领域已知的其它合适组合物。因此，可以实现和构想多核苷酸递送的病毒和非病毒手段。本发明的多核苷酸可还包含另外的与其连接的编码具有不同功能的多肽的核酸序列，如在本文中列出的各种异源结构域。
本发明的多核苷酸可还被修饰为例如耐核酸酶从而提高它们在药物制剂中的稳定性。所述的多核苷酸有用于编码本发明的嵌合多肽，特别是当这种多核苷酸被并入本文中公开的或本领域已知的表达系统时情况如此。因此，同样包括了包括表达载体的多核苷酸。
对于在细胞中的增殖或表达，本文中描述的多核苷酸可以被插入到载体中。术语“载体”指的是质粒、病毒或其它本领域已知的可通过插入或并入核酸来操作的载体。这种载体可用于基因操作(即“克隆载体”)或可用于转录或翻译插入的多核苷酸(即“表达载体”)。载体通常至少含有用于在细胞中增殖的复制起点和启动子。将包括了存在于表达载体内的启动子的控制元件包括进来从而促进合适的转录和翻译(例如剪接内含子的信号，保持正确的基因阅读框架以允许mRNA和终止密码子的框内翻译)。本文中描述的多核苷酸的体内或体外表达可由可操作地连接至核酸的启动子授予。
“启动子”指的是足以指导可操作地连接了启动子的核酸进行转录的最小核酸序列(参见Bitter1987)。启动子可结构性地指导转录，可以是组织特异性的，或可以赋予可诱导的或可抑制的转录；这种元件通常位于如此调节的基因的5’或3’区域中。
如在本文中使用的，术语“可操作地连接”是指选择的多核苷酸(例如编码嵌合多肽的多核苷酸)和调节序列以在合适分子(例如转录激活蛋白)结合至调节序列时允许转录的方式进行连接。通常，启动子位于多核苷酸的5’端并且可以在转录起始位点的邻近处从而允许启动子调节多核苷酸的表达。
当在细菌系统中克隆时，可以使用结构性启动子如T7等，以及可诱导的启动子如噬菌体γ的PL、plac、ptrp、ptac。当在哺乳细胞系统中克隆时，可以使用结构性启动子如SV40、RSV等，或源自哺乳动物细胞基因组的可诱导的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒的可诱导的启动子(例如小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复序列，腺病毒晚期启动子)。由重组DNA或合成技术制造的启动子也可以用于提供本发明的核酸序列的转录。
可以设计利用重组病毒或病毒元件指导表达的哺乳动物表达系统。例如，当使用腺病毒表达载体时，可以将核酸序列连接至腺病毒转录/翻译控制复合物，例如晚期启动子和三联体前导序列。或者，可以使用牛痘病毒7.5K(参见Mackett1982；Mackett1984；Panicali1982)。
对于酵母表达系统，可以使用一些含有结构性或可诱导的启动子的载体(参见Ausubel1988；Grant1987；Glover1986；Bitter1987；和Strathem1982)。可以将多核苷酸插入到体外表达用表达载体中(例如使用可商购的体外转录/翻译试剂盒)，或者插入到含有如下启动子序列的表达载体中，所述启动子序列通过将合适的核酸转移到合适的细胞、器官、组织或体内生物中而促进在原核细胞或真核细胞中的表达。
如在本文中使用的，“转基因”是用手段插入宿主细胞中的任何多核苷酸片段，并变成了从该细胞产生的生物的一部分。转基因可包括一个或多个启动子或任何其它DNA，如选择的DNA表达所必须的全部可操作地连接至选择的DNA的内含子，和可包括增强子序列。转基因可包括与转基因生物部分或完全异源的(即外来的)多核苷酸，或可表示与生物的内源基因同源的基因。转基因可整合到宿主细胞的基因组中或保持为自复制质粒。
如在本文中使用的，“宿主细胞”是向其中引入多核苷酸的细胞，其可以增殖、转录和编码表达的多肽。该术语也包括受试者宿主细胞的任何后代。要理解全部后代可能不同于亲本细胞，因为可能存在在复制期间发生的突变。宿主细胞包括但不限于细菌、酵母菌、昆虫和哺乳动物细胞。例如，用重组噬菌体多核苷酸、质粒核酸或粘粒核酸表达载体转化的细菌；用重组酵母菌表达载体转化的酵母菌；用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病病毒、CaMV；烟草花叶病病毒，TMV)感染或用重组质粒表达载体(即Ti质粒)转染的植物细胞系统，用重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统，或用重组病毒表达载体(如逆转录病毒、腺病毒、牛痘病毒)感染的动物细胞系统，或设计用于稳定表达的转化的动物细胞系统。
如在本文中使用的，术语“转化”是指在并入细胞外的多核苷酸(例如转基因)后细胞中的遗传变化。因此，“转化的细胞”是已经借助于重组技术引入了多核苷酸的细胞或细胞的后代。通过本领域技术人员已知的常规技术可以进行宿主细胞的转化。当宿主细胞是真核细胞时，DNA转化方法包括例如磷酸钙、微注入、电穿孔、脂质体和病毒载体。如在本文中描述的或另外在本领域已知的，可以用发明多核苷酸序列或其片段和编码可选择的标记物的DNA分子对真核细胞进行共转化。另一种方法是使用真核病毒载体如猿猴病毒40(SV40)或牛疣病毒以瞬时感染或转化真核细胞并表达蛋白(参见Gluzman1982)。当宿主是原核的(例如大肠杆菌)时，可由在指数生长期后并随后用本领域公知的步骤通过CaCl2法处理而收集到的细胞制备能够摄取DNA的感受态细胞。通过宿主细胞的原生质体融合可以进行原核细胞的转化。
使用标准技术可以将嵌合多肽、多核苷酸和含有本发明的多核苷酸的表达载体封装在脂质体内并引入细胞或整个生物中。优选阳离子脂质体用于递送多核苷酸。使用脂质体以体外或体内引入包括蛋白和多核苷酸的各种组合物对本领域的技术人员是已知的。
通过向脂质体添加已经识别了相应细胞受体的配体如多肽的制剂，脂质体可以靶向目标细胞类型或组织。单克隆抗体也可用于靶向；许多这种对于种种细胞表面蛋白特异的抗体对于本领域技术人员是已知的并且可获得。在预成型的脂质体或在脂质体制备期间并入的脂质体中，选择的配体共价地结合至脂质锚(参见Lee1994和Lee1995)。
因为本发明的嵌合多肽或多核苷酸将会被施用至人类，所以本发明还提供包含公开的嵌合多肽或多核苷酸的药物制剂。因此，施用到受试者的组合物将会在“药物可接受的”或“生理可接受的”制剂中。
如在本文中使用的，术语“药物可接受的”或“生理可接受的”指的是优选在没有过度不良副反应(例如恶心、头疼等)的情况下可以施用到受试者的载体、稀释剂、赋形剂等。这种用于施用的制剂包括消毒的水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂的实例是丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄榄油，可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水性溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。载体包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸化的林格氏或固定油。静脉内载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏右旋糖的那些)等。也可以存在防腐剂和其它添加剂例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。本领域已知的适合于施用到受试者的各种药物制剂在发明的方法中是适用的(例如雷明顿药物科学(Remington’sPharmaceuticalSciences)，第18版，Mack出版有限公司，伊斯顿，PA(1990)；和默克索引(TheMerckIndex)，第12版，默克出版集团，怀特豪斯，NJ(1996))。
通过将组合物并入粒子或聚合物质如聚酯、聚胺酸、水凝胶、聚乙烯基吡咯烷酮、乙烯-乙酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素、硫酸鱼精蛋白或丙交酯/乙交酯共聚物、聚丙交酯/乙交酯共聚物、或乙烯乙酸乙烯酯共聚物中，可实现控制作用时间和施用组合物的受控递送。通过改变这种大分子的浓度或组成可以控制组合物的释放速率。胶体分散体系包括大分子复合物，纳米胶囊，微球，珠，和包括水包油乳液、微团、混合微团和脂质体的脂质基系统。
通过注射，通过随时间逐渐灌注，或通过快速施用(bolusadministration)或通过微组装植入式装置可肠道外施用通过本发明的方法施用的组合物。可通过吸入、静脉内、腹腔内、肌肉内、皮下、腔内(例如阴道或肛门)、经皮、局部或血管内施用组合物。可以多剂量施用组合物。本领域技术人员可轻易确定有效量。
除非另有说明，本文中使用的所有技术和科学术语具有如本发明所属领域内的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管在本发明的实践和试验中可以使用与本文中描述的那些相似或等价的方法和材料，但是合适的方法和材料如下所述。本发明的其它特征和优点将从以下详细说明和从权利要求书显而易见。本发明进一步在以下实施例中加以描述，所述实施例不限制在权利要求书中描述的本发明的范围。
实施例
1.癌症靶标的抗-EGFRl-PD1融合蛋白构建物
抗-EGFR(西妥昔单抗)已经被批准用于鳞状头颈癌(与放射疗法结合局部或区域进行并且在铂基疗法后是转移性的)和EGFR表达转移性大肠癌(在奥沙利铂和伊立替康基化疗两者失效后患者中或在对伊立替康基化疗耐受的患者中的单一疗法)。不适用于具有K-RAS突变的大肠癌(CRC)患者。
在各种研究中约55-60％的mCRC患者在一线设置中响应西妥昔单抗，然而这一响应也是短暂的(1.5-2个月的无进展生存率(PFS)优势)(EPAR)。大量的患者要么不响应西妥昔单抗，要么对疗法变得有抗性。在复发的转移性头颈癌中，仅35％的患者响应西妥昔单抗的化疗，仅有2-3个月的整体生存率(OS)和(PFS)优势。
清楚地，在这两个适应症中存在显著未满足的需要来提高西妥昔单抗疗法的疗效。另外，EGFR也在胃癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和胰腺癌中表达。然而，西妥昔单抗没能在这些适应症中证实相对于护理标准的任何显著益处。因此，本发明通过将西妥昔单抗与免疫调节疗法组合而提供改进。
程序性死亡-1(PD-1)是在活化后在T细胞上表达的抑制性受体。其已经显示在结合其APC上的配体PD-L1时下调T细胞活性。许多肿瘤结构性地表达PD-L1并且其过表达与损害的肿瘤免疫性、更加侵略性的疾病和降低的生存率相关(参见Thompson2004)。到目前为止，PD-L1表达已经证明与患有肾细胞癌(RCC)、卵巢癌和黑素瘤的患者中的不良预后相关。从患有卵巢、肺癌和乳腺癌，肾细胞癌，头颈的鳞状细胞癌，食道癌，恶性胶质瘤，胸腺瘤，结肠癌，胰腺癌和黑素瘤的患者新分离的肿瘤试样的免疫组织化学分析发现大多数表达B7-H1(参见Flies2011；Nomi2007)。多个临床前研究显示通过阻断PD1-PDL1的相互作用增加了肿瘤排斥。近来，抗-PDl和PD-L1基治疗已经显示了在黑素瘤和一些其他实体瘤中的显著活性，证实了它们作为最有潜力的抗癌疗法之一的应用。
通过将西妥昔单抗基疗法与免疫调节组合来去除免疫抑制环境或延迟抗性的形成可改进西妥昔单抗基疗法。而且，因下游通路中的突变而形成西妥昔单抗抗性的患者可仍受益于抗-EGFRl-PD-1，因为本发明的融合蛋白结合EGFR受体并且使由肿瘤表达的PD-L1无效，从而允许T细胞上演抗肿瘤响应。因此，本发明的融合蛋白可结合至肿瘤细胞表面的EGFR和PD-L1两者。
本发明的抗-EGFRl-PD1融合蛋白构建物可用于大肠癌、鳞状头颈癌、非小细胞肺癌、胃癌和胰腺癌。
分子的设计和选择：
本发明的抗体融合分子具有双重治疗性能。一方面，分子保留抗-EGFRl(西妥昔单抗)的完整活性，同时其在肿瘤环境中具有PD-L1受体结合活性。本文中为了癌症治疗而开发的新抗-EGFRl-PD1融合蛋白分子由于上述原因而从重链的C末端缺失了氨基酸赖氨酸‘K’。融合蛋白设计的主要目的是保持抗-EGFRl分子完整并且不影响其功能并且允许PD1分子融合至抗-EGFRl抗体上的各种位置。也就是说，如在图6中所示的，融合至HCC末端、LCC末端、HCN末端和/或LCN末端和双融合在两种链上。
设计了以下构建物。
表1
以上融合构建物在CHO细胞中的表达：
对抗-EGFRl-PD1单个结构域的密码子优化的核苷酸序列进行了优化以在CHO细胞中表达。在表2中描述的引物的帮助下，这种优化的序列(SEQIDNO：1、2、3和4)在哺乳动物表达载体中组装：
表2
使用示出的以上cDNA引物组，如图11中所示组装构建物。
2.治疗癌症的抗-EGFRl-TGFβRII融合蛋白。
由包括如下的许多类型的肿瘤生产了高水平的TGFβ：黑素瘤和乳腺、结肠、食道、胃、肝、肺、胰腺和前列腺的癌，以及血液肿瘤(参见Teicher2001；Dong2006)。已知TGFβ通过阻断IL-2和包括生成调节T-reg的其它机制而对于T细胞和NK细胞是免疫抑制的。几种证据表明使TGFβ活性失效可增强抗T细胞的抗肿瘤效果(Wrzesinski2007)。而且，TGFβ可通过上皮至间质转化和促进血管生成而促进肿瘤生长。TGFβ表达也与患者中的不良预后和早期复发相关。然而，考虑到TGFβ在控制免疫应答中的多效性，已经显示广义的TGFβ活性阻断可以导致广泛的自炎症活动。因此，在肿瘤附近TGFβ的局部缺失可以是调节免疫抑制环境的可选方式。本发明的抗-EGFRl-TGFβRII融合蛋白结合至肿瘤细胞上的EGFR并将TGFβ束缚在肿瘤周围以增强对肿瘤细胞的免疫应答。
分子的设计和选择：
目的是设计具有双重治疗性能的抗体融合分子。一方面，分子应该保留抗-EGFRl(西妥昔单抗)的完整活性，同时其应在肿瘤环境中具有TGFβ结合活性。将抗-EGFRlIgG分子的氨基酸序列保留，除了赖氨酸不在重链的C末端表达。将单和双融合和表达水平两者示于表3中，其中TGFβRII与抗-EGFRl融合。
表3
以上融合构建物在CHO细胞中的表达：
对抗-EGFRl-TGFβRII单个结构域的密码子优化的核苷酸序列进行了优化以在CHO细胞中表达。这种序列(SEQIDNO：1、2、4和7)在哺乳动物表达载体中组装。表达构建物在图21中列出。
对以上载体组合进行转染以获得期望的细胞系：
使用如在图21中限定的构建物，以如在表4中所列出的以下组合将以上形成的表达构建物转染到CHO细胞中从而制造以下融合蛋白。
表4
使用蛋白A柱纯化融合单抗上清液：
融合单克隆抗体(Mab)使用重组蛋白制造CHO细胞培养物上清液。
步骤：
步骤详细描述了使用C10/10或XK26柱和使用MabSelectXtra亲和树脂对IgG的小规模纯化工艺。通过这一方案生成的试样可用于各种分析。
工艺流程：
对由在无菌条件下生产单克隆抗体或融合单克隆抗体的重组细胞系分泌的培养物上清液的效价和内毒素进行测定；
对使用MabSelectXtraProteinA树脂的亲和色谱柱进行洗涤并用结合缓冲液进行平衡；
使用0.5M磷酸盐将上清液的pH调节至与柱相同的pH；
使上清液结合至柱/以0.5ml/分钟的流速通过柱以实现最大结合；
全部融合单抗通过Fc区域结合并且通过的剩余的杂质像流过一样通过；
用平衡缓冲液洗涤柱；
使用0.1M甘氨酸、pH3.0洗脱结合的融合单抗；
将洗脱的蛋白调节回中性pH或稳定的制剂pH；
根据稳定性将纯化的蛋白储存在-20℃下或2-8℃下。
使用SDSPAGE对蛋白A纯化的融合单抗进行分析：
使用蛋白A亲和柱对获得的转染上清液进行纯化。之后，如在图22中所示，在还原和非还原SDS-PAGE上对它们进行分析以发现分子的完整性，其中蛋白A纯化的试样在12％还原SDS-PAGE上进行分析。如预期的，全部融合配对体在SDS-PAGE上给出了期望的图案。LC融合体和HC跑得很接近但是条带是分开的。这一更高的迁移率可能是由于8N-糖苷化位点(LC上的TGBRII3*2＝6+2)。
图23显示了在6％非还原SDS-PAGE上分析的蛋白A纯化试样的结果，尽管氨基酸组成相同，但是迁移率存在差异。这可能是因为基于TGFβRII位置和分子中存取的糖苷化模式的可变水平。
3.癌症靶点的抗-CTLA4-PD1融合蛋白构建物。
从患有卵巢、肺和乳腺癌，肾细胞癌，头颈的鳞状细胞癌，食道癌，恶性胶质瘤，胸腺瘤，结肠癌，胰腺癌和黑素瘤的患者新分离的肿瘤试样的免疫组织化学分析发现大多数表达B7-H1(参见Flies2011；Nomi2007)。几种临床前研究已经证明通过阻断PD1-PDL1相互作用增加了肿瘤排斥。近来，抗-PDl和PD-L1基治疗已经显示了在黑素瘤和一些其他实体瘤中的显著活性，证实了它们作为最有潜力的抗癌疗法之一的应用。
尽管抗-CTLA4可能允许T细胞的共刺激，它们可仍通过PD-L1-PD-1相互作用而受到抑制。这可能是仅少数患者对抗-CTLA4抗体具有响应的原因之一。抗-CTLA4和PD1两者的融合抗体比单独的任一个制剂更加有效，因为抗-CTLA4允许T细胞共刺激而PD1结合至肿瘤细胞上的PD-L1从而在肿瘤微环境中使T细胞的免疫抑制无效。这可以甚至比抗-CTLA4更安全，因为单独使用抗-CTLA4已经导致了免疫突破不良事件。
分子的设计和选择：
目的是设计具有双重治疗性能的抗体融合分子。一方面，分子应保留抗-CTLA4(易普利姆玛)的完整活性，同时其应在肿瘤环境中具有PDLI受体结合活性。除了去除在重链C末端的赖氨酸，使用抗-CTLA4IgG分子的完整氨基酸序列。15个氨基酸的连接子位于PD1和抗-CTLA4之间。如在图24中所示的设计如在表5中列出的以下构建物组合。以上融合蛋白构建物的详细信息在下面给出。
表5
以上融合构建物在CHO细胞中的表达：
对抗-CTLA4-PD1单个结构域的完整核苷酸序列进行了密码子优化以在CHO细胞中表达(SEQIDNO：3、4、5和6)。合成了cDNA。构建物在哺乳动物表达载体中组装。使用如在图33中列出的构建物表达抗-CTLA4-PDl融合蛋白。
以以下组合将生成并示于图33中的表达构建物转染到CHO细胞(表6)中从而制造以下融合蛋白。在最后一列提到了各个构建物获得的效价。
表6
融合蛋白的纯化和表征：
步骤描述了使用C10/10或XK26柱和使用MabSelectXtra亲和树脂对IgG的小规模纯化工艺。通过这一方案生成的试样可用于各种分析。
工艺流程：
对由在无菌条件下生产单克隆抗体或融合单克隆抗体的重组细胞系分泌的培养物上清液的效价和内毒素进行测定；
对使用MabSelectXtraProteinA树脂的亲和色谱柱进行洗涤并用结合缓冲液进行平衡；
使用0.5M磷酸盐将上清液的pH调节至与柱相同的pH；
使上清液结合至柱/以0.5ml/分钟的流速通过柱以实现最大结合；
全部融合单抗通过Fc区域结合并且通过的剩余的杂质像流过一样通过；
用平衡缓冲液洗涤柱；
使用0.1M甘氨酸、pH3.0洗脱结合的融合单抗；
将洗脱的蛋白调节回中性pH或稳定的制剂pH；
以及
根据稳定性将纯化的蛋白储存在-20℃下或2-8℃下。
4.抗-EGFRlHC-TGFβRII+抗-EGFRlLC(Fmab1)
结合ELISA-步骤：
在三种不同的ELISA中对融合单抗结合至其靶点的能力进行测定：1)EGFR1靶点结合ELISA，2)TGFβ靶点结合ELISA和3)双功能ELISA。
对于靶点结合ELISA，在4℃下将靶点(rhEGFR-Fc嵌合体或TGFβ)涂布在NUNCmaxisorb板上过夜。清洗板并然后在室温下用超封闭剂(superblock)封闭2小时。将融合单抗或阴性对照抗体的不同稀释物添加至板。将板在室温下孵育1小时。通过添加生物素化的抗-人IgGF(ab)2二级抗体，然后在室温下与过氧化物酶偶联的链霉亲和素孵育1小时来检测融合单抗的结合。添加TMB底物溶液，并且用1NH2SO4终止反应。在BioTekSynergyH4多功能读板仪上以450nm测定吸光度。
对于双功能ELISA，在4℃下将rhEGFR-Fc嵌合体涂布在NUNCmaxisorb板上过夜。清洗板并然后在室温下用超封闭剂封闭2小时。将融合单抗或阴性对照抗体的不同稀释物添加至板。将板在室温下孵育1小时。在清洗后，添加TGFβ并将板在室温下孵育1小时。清洗板并添加抗-TGFβ-生物素并且将板在室温下孵育1小时。清洗板并添加链霉亲和素-HRP并且将板在室温下孵育1小时。在清洗后，添加TMB底物溶液，并且用1NH2SO4终止反应。在BioTekSynergyH4多功能读板仪上以450nm测定吸光度。
结果：
抗-EGFRlHC-TGFβRII+抗-EGFRlLC融合单抗对靶EGFR1(图34)和TGFβ(图35)的的结合与抗-EGFRl-TGFβRII相当。在双功能ELISA中同样对抗-EGFRlHC-TGFβRII+抗-EGFRlLC融合单抗进行测定从而确定单抗的抗-EGFRl和TGFβRII结构域是否能够结合至其各自的靶点而不相互干扰。如图36中所见，抗-EGFRlHC-TGFβRII+抗-EGFRlLC融合单抗结合至其两个靶点，表明在结合至任一个靶点方面不存在由融合单抗的构造导致的相互干扰。
结合至表达EGFR1的细胞：
步骤：
A-431细胞在瓶中生长直到它们达到70-80％的融合率。对细胞进行胰蛋白酶处理并收集。用抗-EGFRlHC-TGFβRII+抗-EGFRlLC融合单抗或对照Ig的不同稀释物在2-8℃下对细胞进行染色30分钟。清洗细胞并用抗-人IgG-FITC偶联物在2-8℃下孵育30分钟。在清洗后，在流式细胞仪上分析细胞。基于细胞的FSC对SSC性质对活细胞进行分类。记录分类种群的总MFI。
结果：
抗-EGFRlHC-TGFβRII+抗-EGFRlLC融合体以剂量依赖的方式结合至表达EGFR的A-431细胞(图37)。抗-EGFRlHC-TGFβRII+抗-EGFRlLC的结合与抗-EGFRl-TGFβRII的结合相当。
抗体依赖性细胞毒活性
步骤：
A-431细胞在瓶中生长直到它们达到70-80％的融合率。对细胞进行胰蛋白酶处理、收集并接种在96孔板中。用抗-EGFRlHC-TGFβRII+抗-EGFRlLC融合单抗或对照Ig的不同稀释物在2-8℃下对细胞进行标记30分钟。将标记的细胞与新分离的人PBMC在37℃、5％CO2下共孵育24小时。使用Cyto-Tox-Glo细胞毒分析试剂盒测定细胞毒性。
结果：
抗-EGFRlHC-TGFβRII+抗-EGFRlLC融合体通过人PBMC效应细胞介导表达EGFR的A-431细胞的ADCC。ADCC是剂量依赖性的(图38)。这些结果表明融合单抗的Fc部分是完整的和功能性的。
增殖的抑制
步骤：
A-431细胞在瓶中生长直到它们达到70-80％的融合率。对细胞进行胰蛋白酶处理、收集并接种在96孔板中。将抗-EGFRlHC-TGFβRII+抗-EGFRlLC融合单抗或对照Ig的不同稀释物添加至细胞。将板在在37℃、5％CO2下孵育三天。在第三天，通过阿尔玛蓝(AlamarBlue)法测定细胞增殖。
结果：
已知抗-EGFR抗体如西妥昔单抗抑制表达EGFR1的细胞的增殖。如在图39中所见，抗-EGFRlHC-TGFβRII+抗-EGFRlLC融合单抗的抗-EGFR部分是完整的且具有抗增殖活性。
5.抗-EGFRlHC+抗-EGFRlLC-TGFβRII(Fmab2)
结合ELISA：步骤：
在三种不同的ELISA中对抗-EGFRlHC+抗-EGFRlLC-TGFβRII融合单抗结合至其靶点的能力进行测定：1)EGFR1靶点结合ELISA，2)TGFβ靶点结合ELISA和3)双功能ELISA。
对于靶点结合ELISA，在4℃下将靶点(rhEGFR-Fc嵌合体或TGFβ)涂布在NUNCmaxisorb板上过夜。清洗板并然后在室温下用超封闭剂封闭2小时。将融合单抗或阴性对照抗体的不同稀释物添加至板。将板在室温下孵育1小时。通过添加生物素化的抗-人IgGF(ab)2二级抗体，然后在室温下与过氧化物酶偶联的链霉亲和素孵育1小时来检测融合单抗的结合。添加TMB底物溶液，并且用1NH2SO4终止反应。在BioTekSynergyH4多功能读板仪上以450nm测定吸光度。
对于双功能ELISA，在4℃下将rhEGFR-Fc嵌合体涂布在NUNCmaxisorb板上过夜。清洗板并然后在室温下用超封闭剂封闭2小时。将融合单抗或阴性对照抗体的不同稀释物添加至板。将板在室温下孵育1小时。在清洗后，添加TGFβ并将板在室温下孵育1小时。清洗板并添加抗-TGFβ-生物素并且将板在室温下孵育1小时。清洗板并添加链霉亲和素-HRP并且将板在室温下孵育1小时。在清洗后，添加TMB底物溶液，并且用1NH2SO4终止反应。在BioTekSynergyH4多功能读板仪上以450nm测定吸光度。
结果：
抗-EGFRlHC+抗-EGFRlLC-TGFβRII融合单抗对两个靶点EGFR1(图40)和TGFβ(图41)的结合与抗-EGFRl-TGFβRII相当。在双功能ELISA中同样对抗-EGFRlHC+抗-EGFRlLC-TGFβRII融合单抗进行测定从而确定Mab的抗-EGFRl和TGFβRII结构域是否能够结合至其各自的靶点而不相互干扰。如图42中所见，抗-EGFRlHC+抗-EGFRlLC-TGFβRII融合单抗结合至其两个靶点，表明在结合至任一个靶点方面不存在由融合单抗的构造导致的相互干扰。
增殖的抑制
步骤：
A-431细胞在瓶中生长直到它们达到70-80％的融合率。对细胞进行胰蛋白酶处理、收集并接种在96孔板中。将抗-EGFRlHC+抗-EGFRlLC-TGFβRII融合单抗或对照Ig的不同稀释物添加至细胞。将板在在37℃、5％CO2下孵育三天。在第三天，通过阿尔玛蓝法测定细胞增殖。
结果：
已知抗-EGFR抗体如西妥昔单抗抑制表达EGFR1的细胞的增殖。如在图43中所见，抗-EGFRlHC+抗-EGFRlLC-TGFβRII融合单抗的抗-EGFR部分是完整的且具有抗增殖活性。
6.TGFβRII-抗-EGFR1HC+抗-EGFRlLC(Fmab3)
结合ELISA：步骤：
在三种不同的ELISA中对融合单抗结合至其靶点的能力进行测定：1)EGFR1靶点结合ELISA，2)TGFβ靶点结合ELISA和3)双功能ELISA。
对于靶点结合ELISA，在4℃下将靶点(rhEGFR-Fc嵌合体或TGFβ)涂布在NUNCmaxisorb板上过夜。清洗板并然后在室温下用超封闭剂封闭2小时。将融合单抗或阴性对照抗体的不同稀释物添加至板。将板在室温下孵育1小时。通过添加生物素化的抗-人IgGF(ab)2二级抗体，然后在室温下与过氧化物酶偶联的链霉亲和素孵育1小时来检测融合单抗的结合。添加TMB底物溶液，并且用1NH2SO4终止反应。在BioTekSynergyH4多功能读板仪上以450nm测定吸光度。
对于双功能ELISA，在4℃下将rhEGFR-Fc嵌合体涂布在NUNCmaxisorb板上过夜。清洗板并然后在室温下用超封闭剂封闭2小时。将融合单抗或阴性对照抗体的不同稀释物添加至板。将板在室温下孵育1小时。在清洗后，添加TGFβ并将板在室温下孵育1小时。清洗板并添加抗-TGFβ-生物素并且将板在室温下孵育1小时。清洗板并添加链霉亲和素-HRP并且将板在室温下孵育1小时。在清洗后，添加TMB底物溶液，并且用1NH2SO4终止反应。在BioTekSynergyH4多功能读板仪上以450nm测定吸光度。
结果：
TGFβRII-抗-EGFRlHC+抗-EGFRlLC融合单抗对两个靶点EGFR1(图44)和TGFβ(图45)的结合与抗-EGFRl-TGFβRII相当。在双功能ELISA中同样对TGFβRII-抗-EGFRlHC+抗-EGFRlLC融合单抗进行测定从而确定单抗的抗-EGFRl和TGFβRII结构域是否能够结合至其各自的靶点而不相互干扰。如图46中所见，TGFβRII-抗-EGFRlHC+抗-EGFRlLC融合单抗的结合相比于抗-EGFRl-TGFβRII降低，表明在结合至任一个靶点方面存在一些由融合单抗的构造导致的相互干扰。
结合至表达EGFR1的细胞：
步骤：
A-431细胞在瓶中生长直到它们达到70-80％的融合率。对细胞进行胰蛋白酶处理并收集。用TGFβRII-抗-EGFRlHC+抗-EGFRlLC融合单抗或对照Ig的不同稀释物在2-8℃下对细胞进行染色30分钟。清洗细胞并用抗-人IgG-FITC偶联物在2-8℃下孵育30分钟。在清洗后，在流式细胞仪上分析细胞。基于细胞的FSC对SSC性质对活细胞进行分类。记录分类种群的总MFI。
结果：
TGFβRII-抗-EGFR1HC+抗-EGFRlLC融合体以剂量依赖的方式结合至表达EGFR的A-431细胞。TGFβRII-抗-EGFRlHC+抗-EGFRlLC的结合与抗-EGFRl-TGFβRII的结合相当。
增殖的抑制
步骤：
A-431细胞在瓶中生长直到它们达到70-80％的融合率。对细胞进行胰蛋白酶处理、收集并接种在96孔板中。将TGFβRII-抗-EGFRlHC+抗-EGFRlLC融合单抗或对照Ig的不同稀释物添加至细胞。将板在在37℃、5％CO2下孵育三天。在第三天，通过阿尔玛蓝法测定细胞增殖。
结果：
已知抗-EGFR抗体如西妥昔单抗抑制表达EGFR1的细胞的增殖。如在图47中所见，TGFβRII-抗-EGFRlHC+抗-EGFRlLC融合单抗的抗-EGFR部分是完整的且具有抗增殖活性。
7.抗-EGFRlHC+TGFβRII-抗-EGFRlLC(Fmab4)
结合ELISA：步骤：
在三种不同的ELISA中对融合单抗结合至其靶点的能力进行测定：1)EGFR1靶点结合ELISA，2)TGFβ靶点结合ELISA和3)双功能ELISA。
对于靶点结合ELISA，在4℃下将靶点(rhEGFR-Fc嵌合体或TGFβ)涂布在NUNCmaxisorb板上过夜。清洗板并然后在室温下用超封闭剂封闭2小时。将融合单抗或阴性对照抗体的不同稀释物添加至板。将板在室温下孵育1小时。通过添加生物素化的抗-人IgGF(ab)2二级抗体，然后在室温下与过氧化物酶偶联的链霉亲和素孵育1小时来检测融合单抗的结合。添加TMB底物溶液，并且用1NH2SO4终止反应。在BioTekSynergyH4多功能读板仪上以450nm测定吸光度。
对于双功能ELISA，在4℃下将rhEGFR-Fc嵌合体涂布在NUNCmaxisorb板上过夜。清洗板并然后在室温下用超封闭剂封闭2小时。将融合单抗或阴性对照抗体的不同稀释物添加至板。将板在室温下孵育1小时。在清洗后，添加TGFβ并将板在室温下孵育1小时。清洗板并添加抗-TGFβ-生物素并且将板在室温下孵育1小时。清洗板并添加链霉亲和素-HRP并且将板在室温下孵育1小时。在清洗后，添加TMB底物溶液，并且用1NH2SO4终止反应。在BioTekSynergyH4多功能读板仪上以450nm测定吸光度。
结果：
抗-EGFRlHC+TGFβRII-抗-EGFRlLC融合单抗对两个靶点EGFR1(图48)和TGFβ(图49)的结合与抗-EGFRl-TGFβRII相当。在双功能ELISA中同样对抗-EGFRlHC+TGFβRII-抗-EGFRlLC融合单抗进行测定从而确定单抗的抗-EGFRl和TGFβRII结构域是否能够结合至其各自的靶点而不相互干扰。如图50中所见，抗-EGFRlHC+TGFβRII-抗-EGFRlLC融合单抗的结合相比于抗-EGFRl-TGFβRII降低，表明在结合至任一个靶点方面存在一些由融合单抗的构造导致的相互干扰。
结合至表达EGFR1的细胞：
步骤：
A-431细胞在瓶中生长直到它们达到70-80％的融合率。对细胞进行胰蛋白酶处理并收集。用抗-EGFRlHC+TGFβRII-抗-EGFRlLC融合单抗或对照Ig的不同稀释物在2-8℃下对细胞进行染色30分钟。清洗细胞并用抗-人IgG-FITC偶联物在2-8℃下孵育30分钟。在清洗后，在流式细胞仪上分析细胞。基于细胞的FSC对SSC性质对活细胞进行分类。记录分类种群的总MFI。
结果：
抗-EGFRlHC+TGFβRII-抗-EGFRlLC融合体以剂量依赖的方式结合至表达EGFR的A-431细胞(图51)。抗-EGFRlHC+TGFβRII-抗-EGFRlLC的结合相比于抗-EGFRl-TGFβRII的结合降低。
8.抗-EGFRlHC-TGFβRII+TGFβRII-抗-EGFRlLC(Fmab10)
结合ELISA：步骤：
在三种不同的ELISA中对融合单抗结合至其靶点的能力进行测定：1)EGFR1靶点结合ELISA，2)TGFβ靶点结合ELISA和3)双功能ELISA。
对于靶点结合ELISA，在4℃下将靶点(rhEGFR-Fc嵌合体或TGFβ)涂布在NUNCmaxisorb板上过夜。清洗板并然后在室温下用超封闭剂封闭2小时。将融合单抗或阴性对照抗体的不同稀释物添加至板。将板在室温下孵育1小时。通过添加生物素化的抗-人IgGF(ab)2二级抗体，然后在室温下与过氧化物酶偶联的链霉亲和素孵育1小时来检测融合单抗的结合。添加TMB底物溶液，并且用1NH2SO4终止反应。在BioTekSynergyH4多功能读板仪上以450nm测定吸光度。
对于双功能ELISA，在4℃下将rhEGFR-Fc嵌合体涂布在NUNCmaxisorb板上过夜。清洗板并然后在室温下用超封闭剂封闭2小时。将融合单抗或阴性对照抗体的不同稀释物添加至板。将板在室温下孵育1小时。在清洗后，添加TGFβ并将板在室温下孵育1小时。清洗板并添加抗-TGFβ-生物素并且将板在室温下孵育1小时。清洗板并添加链霉亲和素-HRP并且将板在室温下孵育1小时。在清洗后，添加TMB底物溶液，并且用1NH2SO4终止反应。在BioTekSynergyH4多功能读板仪上以450nm测定吸光度。
结果：
当与抗-EGFRl-TGFβRII的结合相比时，抗-EGFRlHC-TGFβRII+TGFβRII-抗-EGFRlLC融合单抗对靶点EGFR1的结合略微降低(图52)但对TGFβ较高(图53)。在双功能ELISA中同样对抗-EGFRl-TGFβRII+TGFβRII-抗-EGFRlLC融合单抗进行测定从而确定单抗的抗-EGFRl和TGFβRII结构域是否能够结合至其各自的靶点而不相互干扰。如图54中所见，抗-EGFRlHC-TGFβRII+TGFβRII-抗-EGFRlLC融合单抗的结合与抗-EGFRl-TGFβRII相当，表明在结合至任一个靶点方面不存在由融合单抗的构造导致的相互干扰。
9.TGFβRII-抗-EGFR1HC+TGFβRII-抗-EGFRlLC(Fmab12)
结合ELISA：步骤：
在三种不同的ELISA中对融合单抗结合至其靶点的能力进行测定：1)EGFR1靶点结合ELISA，2)TGFβ靶点结合ELISA和3)双功能ELISA。
对于靶点结合ELISA，在4℃下将靶点(rhEGFR-Fc嵌合体或TGFβ)涂布在NUNCmaxisorb板上过夜。清洗板并然后在室温下用超封闭剂封闭2小时。将融合单抗或阴性对照抗体的不同稀释物添加至板。将板在室温下孵育1小时。通过添加生物素化的抗-人IgGF(ab)2二级抗体，然后在室温下与过氧化物酶偶联的链霉亲和素孵育1小时来检测融合单抗的结合。添加TMB底物溶液，并且用1NH2SO4终止反应。在BioTekSynergyH4多功能读板仪上以450nm测定吸光度。
对于双功能ELISA，在4℃下将rhEGFR-Fc嵌合体涂布在NUNCmaxisorb板上过夜。清洗板并然后在室温下用超封闭剂封闭2小时。将融合单抗或阴性对照抗体的不同稀释物添加至板。将板在室温下孵育1小时。在清洗后，添加TGFβ并将板在室温下孵育1小时。清洗板并添加抗-TGFβ-生物素并且将板在室温下孵育1小时。清洗板并添加链霉亲和素-HRP并且将板在室温下孵育1小时。在清洗后，添加TMB底物溶液，并且用1NH2SO4终止反应。在BioTekSynergyH4多功能读板仪上以450nm测定吸光度。
结果：
当与抗-EGFRl-TGFβRII的结合相比时，TGFβRII-抗-EGFRlHC+TGFβRII-抗-EGFRlLC融合单抗对靶点EGFR1的结合略微降低(图53)但对TGFβ较高(图56)。在双功能ELISA中同样对TGFβRII-抗-EGFRlHC+TGFβRII-抗-EGFRlLC融合单抗进行测定从而确定单抗的抗-EGFRl和TGFβRII结构域是否能够结合至其各自的靶点而不相互干扰。如图57中所见，TGFβRII-抗-EGFRlHC+TGFβRII-抗-EGFRlLC融合单抗的结合相比于抗-EGFRl-TGFβRII降低，表明在结合至任一个靶点方面存在由融合单抗的构造导致的相互干扰。
参考文献
出于全部目的，将本文中引用的全部参考文献的内容通过引用并入本文中。
Altschul等，1990，基本的局部对齐搜索工具(Basiclocalalignmentsearchtool)，分子生物学期刊(J.Mol.Biol.)，15：403-10。
Ausubel等(作者)，1998，分子生物学一般指南(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，第2卷，第13章，GreenePublish.Assoc.&WileyInterscience。
Bitter等，1987，酵母菌的表达和分泌载体(ExpressionandSecretionVectorsforYeast)；酶学方法(MethodsinEnzymology)，153：516-544。
Bitter，1987，酵母菌中的异源基因表达(HeterologousGeneExpressioninYeast)，酶学方法，第152卷，第673-684页。
DongM.等，2006，转化生长因子-P在血液肿瘤中的作用(Roleoftransforminggrowthfactor-Pinhematologicmalignancies)，血液(Blood)，107：4589-4596。
Deutscher，M.等，蛋白纯化指南：酶学方法(GuidetoProteinPurification：MethodsinEnzymology)，第182卷，AcademicPress(1990)。
Flies等，2011，癌症免疫治疗的B7-H1/PD-1通路的阻断(BlockadeoftheB7-H1/PD-1PathwayforCancerImmunotherapy)，JBiolMed.，84(4)：409-421。
Glover，1986，DNA克隆(DNACloning)，第II卷，第3章，IRLPress，华盛顿地区。
Gluzman(编辑)，1982，真核病毒载体(EukaryoticViralVectors)，冷泉港，N.Y.：冷泉港实验室。
Grant等，1987，酵母菌的表达和分泌载体(ExpressionandSecretionVectorsforYeast)；酶学方法(MethodsinEnzymology)，第153卷，516-544。
Lee等，1994，通过叶酸受体介导的内吞作用输送脂质体(DeliveryofliposomesintoculturedKBcellsviafolatereceptor-mediatedendocytosis)，J.Biol.Chem.，269：3198。
Lee等，1995，体外脂质体包埋的阿霉素的叶酸介导的肿瘤细胞靶向(Folate-mediatedtumorcelltargetingofliposome-entrappeddoxorubicininvitro)，Biochem.Biophys.Actu，1233：134-144。
Mackett等，1982，牛痘病毒：可选择的真核克隆和表达载体(Vacciniavirus:aselectableeukaryoticcloningandexpressionvector)，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，79：7415-7419。
Mackett等，1984，制备和选择传染性牛痘病毒的一般方法(Generalmethodforproductionandselectionofinfectiousvacciniavirus)，病毒学期刊(J.Virol.)，49：857-864。
Nomi等，2007，程序死亡-1配体/程序死亡-1通路在人胰腺癌中的临床意义和治疗潜力(Clinicalsignificanceandtherapeuticpotentialoftheprogrammeddeath-1ligand/programmeddeath-1pathwayinhumanpancreaticcancer)，临床癌症研究(ClinCancerRes).，13：2151-7。
Okazaki等，2007，PD-1和PD-1配体：从发现到临床应用(PD-1andPD-1ligands：fromdiscoverytoclinicalApplication)，国际免疫学(InternationalImmunology)，第19卷，No.7，第813-824页。
Panicali等，1982，痘病毒作为克隆载体的构建：胸苷的插入(Constructionofpoxvirusesascloningvectors：insertionofthethymidine，美国科学院院报，USA，79：4927-4931。
Pardoll,DM.，2012，癌症免疫疗法中免疫检查点的阻断(Theblockageofimmunecheckpointsincancerimmunotherapy)，癌症自然评论(Nat.Rev.Cancer)，12(4)：252-64。
Strathem等，1982，酵母菌的分子生物学(TheMolecularBiologyoftheYeastSaccharomyces)，冷泉港出版社，第I和II卷。
ThompsonRH等，2004，肾细胞癌患者中的共刺激B7-H1：肿瘤侵袭性的指示物和潜在的治疗靶点(CostimulatoryB7-H1inrenalcellcarcinomapatients：Indicatoroftumoraggressivenessandpotentialtherapeutictarget)，美国科学院院报(ProcNatlAcadSciUSA)，101(49)：17174-9。
TeicherBA.,2001,恶性细胞，恶性过程的导演：转化生长因子β的作用(Malignantcells,directorsofthemalignantprocess:roleoftransforminggrowthfactorbeta).癌症转移综述(CancerMetastasisRev)；20:133-143。
Wrzesinski等，2007，转化生长因子-β和免疫应答：抗癌疗法的启示(TransformingGrowthFactor-PandtheImmuneResponse：ImplicationsforAnticancerTherapy)，临床癌症研究(ClinCancerRes)，13；5262。
Claims (43)
1.一种制备治疗活性融合蛋白的方法，其中所述融合蛋白包含肿瘤靶向部分和至少一个免疫调节分子，其中所述肿瘤靶向部分是结合至CTLA-4或EGFR1的抗体，并且其中通过以下步骤制备所述融合蛋白：
制备编码所述融合蛋白的密码子优化的核苷酸序列，其中所述抗体的所述密码子优化的核苷酸序列缺失用于表达在所述抗体的重链C末端的赖氨酸的核苷酸；
在能够瞬时或稳定表达的宿主细胞中克隆所述融合蛋白的所述优化的序列；
在适合生长的条件下在介质中生长所述宿主细胞，并允许所述宿主细胞表达所述融合蛋白；以及
收集分泌的融合蛋白且任选地进一步纯化。
2.权利要求1的方法，其中所述免疫调节分子削弱癌细胞的免疫耐受性。
3.权利要求1的方法，其中所述免疫调节分子通过长度足以允许所述融合蛋白的双特异结合的氨基酸序列连接至所述抗体。
4.权利要求1的方法，其中所述免疫调节分子直接或通过连接子连接至所述抗体的重链、所述抗体的轻链或这两种链。
5.权利要求1的方法，其中所述免疫调节分子直接或通过连接子连接至所述抗体的重链的N或C末端、所述抗体的轻链的N或C末端或这两种链的N和C末端两者。
6.权利要求1的方法，其中所述免疫调节分子结合至(i)转化生长因子-β(TGF-β)和/或(ii)程序性死亡-1配体1(PD-L1)。
7.权利要求1的方法，其中所述抗体结合至EGFR1并且所述免疫调节部分结合至转化生长因子β(TGF-β)。
8.权利要求7的方法，其中所述密码子优化的核苷酸序列包含SEQIDNO：1、2、4和7。
9.权利要求1的方法，其中所述抗体结合至EGFR1并且所述免疫调节部分结合至PD-1L。
10.权利要求9的方法，其中所述密码子优化的核苷酸序列包含SEQIDNO：1、2、3和4。
11.权利要求1的方法，其中所述抗体结合至CTLA4并且所述免疫调节部分结合至PD-1L。
12.权利要求11的方法，其中所述密码子优化的核苷酸序列包含SEQIDNO：5、6、3和4。
13.一种包含同源的治疗活性融合蛋白的制剂，其中所述融合蛋白包含肿瘤靶向部分和至少一个免疫调节分子，其中所述肿瘤靶向部分是结合至CTLA-4或EGFR1的抗体，并且其中通过以下步骤制备所述融合蛋白：
制备编码所述融合蛋白的密码子优化的核苷酸序列，其中所述抗体的所述密码子优化的序列缺失用于表达在所述抗体的重链C末端的赖氨酸的核苷酸；
在能够瞬时或稳定表达的宿主细胞中克隆所述融合蛋白的所述密码子优化的序列；
在适合生长的条件下在介质中生长所述宿主细胞，并允许所述宿主细胞表达所述融合蛋白；以及
收集分泌的融合蛋白以进行任选的纯化。
14.一种编码嵌合融合蛋白的核酸序列，其中所述嵌合融合蛋白包含至少一个具有癌细胞亲和力的靶向部分和至少一个削弱癌细胞的免疫耐受性的免疫调节部分，其中所述靶向部分是抗体并且所述抗体的核酸序列缺失用于表达在所述抗体的重链C末端的赖氨酸的核苷酸。
15.权利要求14的核酸序列，其中编码所述抗体的重链的核酸序列选自SEQIDNO：1或SEQIDNO：5。
16.权利要求14的核酸序列，其中嵌合融合蛋白的核酸序列包含SEQIDNO：1、2、4和7。
17.权利要求14的核酸序列，其中嵌合融合蛋白的核酸序列包含SEQIDNO：1、2、3和4。
18.权利要求14的核酸序列，其中嵌合融合蛋白的核酸序列包含SEQIDNO：5、6、3和4。
19.一种载体，所述载体包含用于治疗人类受试者中的癌症的优化的基因，其中所述优化的基因已经被修饰为增加了CG序列，其中所述载体包括用于编码至少一个靶向部分、至少一个免疫调节部分和连接部分的核苷酸序列，其中所述优化的核苷酸序列选自SEQIDNO：1-7。
20.权利要求19的载体，其中所述核苷酸序列包含SEQIDNO：1、2、4和7。
21.权利要求19的载体，其中所述核苷酸序列包含SEQIDNO：1、2、3和4。
22.权利要求19的载体，其中所述核苷酸序列包含SEQIDNO：5、6、3和4。
23.一种治疗受试者中的癌症的方法，所述方法包含：
a)制备治疗活性融合蛋白，其中所述融合蛋白包含肿瘤靶向部分和至少一个免疫调节分子，其中所述肿瘤靶向部分是结合至CTLA-4或EGFR1的抗体，并且其中通过以下步骤制备所述融合蛋白：
i)制备编码所述融合蛋白的密码子优化的核苷酸序列，其中所述抗体的所述密码子优化的核苷酸序列缺失用于表达在所述抗体的重链C末端的赖氨酸的核苷酸；
ii)在能够瞬时或稳定表达的宿主细胞中克隆所述融合蛋白的所述优化的序列；
iii)在适合生长的条件下在介质中生长所述宿主细胞并允许所述宿主细胞表达所述融合蛋白；以及
iv)收集分泌的融合蛋白以进行任选的纯化；
b)将治疗活性量的所述融合蛋白施用至受试者。
24.权利要求23的方法，其中所述融合蛋白包含SEQIDNO：15和9的氨基酸序列。
25.权利要求23的方法，其中所述融合蛋白包含SEQIDNO：8和16的氨基酸序列。
26.权利要求23的方法，其中所述融合蛋白包含SEQIDNO：17和9的氨基酸序列。
27.权利要求23的方法，其中所述融合蛋白包含SEQIDNO：8和18的氨基酸序列。
28.权利要求23的方法，其中所述融合蛋白包含SEQIDNO：27和9的氨基酸序列。
29.权利要求23的方法，其中所述融合蛋白包含SEQIDNO：8和28的氨基酸序列。
30.权利要求23的方法，其中所述融合蛋白包含SEQIDNO：29和9的氨基酸序列。
31.权利要求23的方法，其中所述融合蛋白包含SEQIDNO：8和30的氨基酸序列。
32.权利要求23的方法，其中所述融合蛋白包含SEQIDNO：31和28的氨基酸序列。
33.权利要求23的方法，其中所述融合蛋白包含SEQIDNO：31和30的氨基酸序列。
34.权利要求23的方法，其中所述融合蛋白包含SEQIDNO：29和28的氨基酸序列。
35.权利要求23的方法，其中所述融合蛋白包含SEQIDNO：29和30的氨基酸序列。
36.权利要求23的方法，其中所述融合蛋白包含SEQIDNO：32和14的氨基酸序列。
37.权利要求23的方法，其中所述融合蛋白包含SEQIDNO：13和33的氨基酸序列。
38.权利要求23的方法，其中所述融合蛋白包含SEQIDNO：34和14的氨基酸序列。
39.权利要求23的方法，其中所述融合蛋白包含SEQIDNO：13和35的氨基酸序列。
40.权利要求23的方法，其中所述融合蛋白包含SEQIDNO：32和33的氨基酸序列。
41.权利要求23的方法，其中所述融合蛋白包含SEQIDNO：32和35的氨基酸序列。
42.权利要求23的方法，其中所述融合蛋白包含SEQIDNO：34和33的氨基酸序列。
43.权利要求23的方法，其中所述融合蛋白包含SEQIDNO：34和35的氨基酸序列。
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Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018205985A1 (zh) * | 2017-05-12 | 2018-11-15 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 含有TGF-β受体的融合蛋白及其医药用途 |
| CN110563851A (zh) * | 2019-08-20 | 2019-12-13 | 启辰生生物科技(珠海)有限公司 | 具有免疫调节功能的融合蛋白、药物组合物、细胞及应用 |
| CN110734498A (zh) * | 2019-10-15 | 2020-01-31 | 上海科棋药业科技有限公司 | 一种用于解除免疫抑制的融合蛋白及其应用 |
| CN110964118A (zh) * | 2019-11-27 | 2020-04-07 | 中国药科大学 | 一种双特异性融合抗体及其在肿瘤免疫治疗中的应用 |
| CN111690070A (zh) * | 2020-05-13 | 2020-09-22 | 深圳市众循精准医学研究院 | 一种sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白及其应用 |
| CN112512550A (zh) * | 2018-11-09 | 2021-03-16 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 一种TGF-β受体融合蛋白药物组合物及其用途 |
| WO2021218883A1 (zh) * | 2020-04-28 | 2021-11-04 | 神州细胞工程有限公司 | 一种TGFβR2胞外区截短分子、其与抗EGFR抗体的融合蛋白及其抗肿瘤用途 |
Families Citing this family (33)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8815247B2 (en) * | 2012-04-30 | 2014-08-26 | Biocon Limited | Targeted/immunomodulatory fusion proteins |
| ES2704411T3 (es) * | 2013-03-12 | 2019-03-18 | Biocon Ltd | Proteínas de fusión inmunomoduladoras y procedimientos de fabricación de las mismas |
| CN116655801A (zh) | 2013-08-22 | 2023-08-29 | 阿塞勒隆制药公司 | TGF-β受体II型变体及其用途 |
| CN104403004B (zh) | 2014-11-24 | 2017-10-13 | 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 | 抗体‑干扰素异二聚体的制备和用途 |
| WO2016135041A1 (en) * | 2015-02-26 | 2016-09-01 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Fusion proteins and antibodies comprising thereof for promoting apoptosis |
| AU2016294440B2 (en) | 2015-07-13 | 2022-10-13 | Cytomx Therapeutics, Inc | Anti-PD-1 antibodies, activatable anti-PD-1 antibodies, and methods of use thereof |
| CN116327952A (zh) | 2015-08-04 | 2023-06-27 | 阿塞勒隆制药公司 | 用于治疗骨髓增生性病症的方法 |
| WO2017037634A1 (en) * | 2015-08-31 | 2017-03-09 | National Research Council Of Canada | Tgf-β-receptor ectodomain fusion molecules and uses thereof |
| AU2016331076B2 (en) | 2015-10-01 | 2020-12-03 | Kopfkino Ip, Llc | Compositions and methods for adjoining type i and type ii extracellular domains as heterologous chimeric proteins |
| EA201891178A1 (ru) * | 2015-12-14 | 2019-01-31 | Макродженикс, Инк. | Биспецифичные молекулы, обладающие иммунореактивностью в отношении pd-1 и ctla-4, и способы их применения |
| WO2017134592A1 (en) * | 2016-02-03 | 2017-08-10 | Biocon Limited | Anti-cd20/immunomodulatory fusion proteins and methods for making same |
| US11542332B2 (en) | 2016-03-26 | 2023-01-03 | Bioatla, Inc. | Anti-CTLA4 antibodies, antibody fragments, their immunoconjugates and uses thereof |
| CN118307682A (zh) * | 2016-09-27 | 2024-07-09 | 埃皮辛特瑞柯斯公司 | 免疫调节性融合蛋白 |
| EP3518953A4 (en) * | 2016-09-29 | 2020-10-28 | Aebi Ltd. | THERAPEUTIC MULTI-TARGETING CONSTRUCTS AND THEIR USES |
| WO2018157164A1 (en) | 2017-02-27 | 2018-08-30 | Shattuck Labs, Inc. | Csf1r-based chimeric proteins |
| CA3054133A1 (en) | 2017-02-27 | 2018-03-30 | Shattuck Labs, Inc. | Methods of making and using extracellular domain-based chimeric proteins |
| EP3585410B9 (en) | 2017-02-27 | 2023-10-04 | Shattuck Labs, Inc. | Vsig8-based chimeric proteins |
| CN118255902A (zh) | 2017-03-02 | 2024-06-28 | 加拿大国家研究委员会 | TGF-β受体胞外域融合分子及其用途 |
| EP4241848A3 (en) | 2017-05-04 | 2023-11-01 | Acceleron Pharma Inc. | Tgf-beta receptor type ii fusion proteins and uses thereof |
| WO2018218215A1 (en) * | 2017-05-26 | 2018-11-29 | The Johns Hopkins University | Multifunctional antibody-ligand traps to modulate immune tolerance |
| CA3068635A1 (en) * | 2017-06-30 | 2019-01-03 | Korea Advanced Institute Of Science And Technology | Conjugate of vegf-grab protein and drug, and use thereof |
| RU2020112280A (ru) * | 2017-09-02 | 2021-10-05 | Эббви Инк. | Конъюгаты анти-egfr антитело-лекарственное средство (adc) и их применение |
| CA3073331A1 (en) * | 2017-09-02 | 2019-03-07 | Abbvie Inc. | Anti-egfr antibody drug conjugates (adc) and uses thereof |
| SG11202002826VA (en) | 2017-09-27 | 2020-04-29 | Epicentrx Inc | Immunomodulatory fusion proteins |
| TWI823906B (zh) | 2018-03-09 | 2023-12-01 | 美商艾吉納斯公司 | 抗-cd73 抗體及其使用方法 |
| EP3790892A1 (en) | 2018-05-06 | 2021-03-17 | Amai Proteins Ltd. | Taste and flavor-modifier proteins |
| JP2021523096A (ja) * | 2018-05-15 | 2021-09-02 | メルク パテント ゲーエムベーハー | 未治療対象において癌を治療する際に使用するための標的ｔｇｆ−β阻害のための投与計画 |
| US10780121B2 (en) | 2018-08-29 | 2020-09-22 | Shattuck Labs, Inc. | FLT3L-based chimeric proteins |
| WO2022057061A1 (en) * | 2020-09-16 | 2022-03-24 | Suzhou Neologics Bioscience Co., Ltd. | Pd-l1 antibodies, fusion proteins, and uses thereof |
| CA3202374A1 (en) * | 2020-12-15 | 2022-06-23 | Bicara Therapeutics Inc. | Combination therapy for the treatment of cancer |
| WO2022132201A2 (en) * | 2020-12-15 | 2022-06-23 | Bicara Therapeutics Inc. | Pharmaceutical formulations for fusion proteins |
| AR124681A1 (es) | 2021-01-20 | 2023-04-26 | Abbvie Inc | Conjugados anticuerpo-fármaco anti-egfr |
| WO2023034923A2 (en) * | 2021-09-03 | 2023-03-09 | Novarock Biotherapeutics, Ltd. | Bispecific and trispecific binding proteins to pd-l1, cd137, and/or tgf-βeta and uses thereof |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009027471A1 (de) * | 2007-08-29 | 2009-03-05 | Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg | Verfahren zur steigerung von proteintitern |
| WO2011102845A1 (en) * | 2010-02-18 | 2011-08-25 | Transtech Pharma, Inc. | Rage fusion protein compositions and methods of use |
| WO2011109789A2 (en) * | 2010-03-05 | 2011-09-09 | The Johns Hopkins University | Compositions and methods for targeted immunomodulatory antibodies and fusion proteins |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL91778A (en) | 1988-09-28 | 1994-10-07 | Lilly Co Eli | A method for reducing the heterogeneity of monoclonal antibodies |
| RU2120475C1 (ru) * | 1990-05-17 | 1998-10-20 | Макс-Планк-Гезельшафт Цур Фердерунг дер Виссеншафтен е.ф. | Способ получения представляющего интерес полипептида, гибридная днк (варианты), слитый белок (варианты) |
| US20030171551A1 (en) | 1997-01-31 | 2003-09-11 | Joseph D. Rosenblatt | Chimeric antibody fusion proteins for the recruitment and stimulation of an antitumor immune response |
| ATE471344T1 (de) * | 2001-04-13 | 2010-07-15 | Biogen Idec Inc | Antikörper gegen vla-1 |
| US8198421B2 (en) | 2006-06-19 | 2012-06-12 | Asklepios Biopharmaceutical, Inc. | Modified factor VIII and factor IX genes and vectors for gene therapy |
| US20090311732A1 (en) | 2006-12-22 | 2009-12-17 | Ares Trading S.A. | Analytical method for analyzing c-terminus truncation |
| KR101759460B1 (ko) | 2007-09-21 | 2017-07-18 | 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 | 표적화된 인터페론이 강력한 아폽토시스 및 항-종양 활성을 발휘함 |
| AU2009223784A1 (en) | 2008-03-08 | 2009-09-17 | Immungene, Inc. | Engineered fusion molecules immunotherapy in cancer and inflammatory diseases |
| JP5304275B2 (ja) * | 2009-01-29 | 2013-10-02 | Ｊｎｃ株式会社 | アポクライティン−ｉｉをコードするコドン最適化核酸およびその使用方法 |
| KR101591671B1 (ko) * | 2011-04-29 | 2016-02-04 | 바이오콘 리서치 리미티드 | 항체의 이질성을 감소시키는 방법 및 그 항체의 제조방법 |
| JP6454547B2 (ja) * | 2011-07-06 | 2019-01-16 | ゲンマブ エー／エス | 抗体重鎖のｃ末端の修飾による補体依存性細胞傷害の調節 |
| US8604447B2 (en) | 2011-07-27 | 2013-12-10 | Kla-Tencor Corporation | Solar metrology methods and apparatus |
| US8815247B2 (en) * | 2012-04-30 | 2014-08-26 | Biocon Limited | Targeted/immunomodulatory fusion proteins |
| ES2704411T3 (es) * | 2013-03-12 | 2019-03-18 | Biocon Ltd | Proteínas de fusión inmunomoduladoras y procedimientos de fabricación de las mismas |
| JP2018167875A (ja) * | 2017-03-30 | 2018-11-01 | 株式会社フジシール | 容器包装体及び容器包装体の製造方法 |
-
2014
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-
2016
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-
2018
- 2018-04-30 AU AU2018202982A patent/AU2018202982B2/en active Active
- 2018-05-01 US US15/968,122 patent/US10766963B2/en active Active
- 2018-09-07 JP JP2018167875A patent/JP2019010111A/ja active Pending
-
2020
- 2020-09-02 US US17/010,178 patent/US20200399379A1/en active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009027471A1 (de) * | 2007-08-29 | 2009-03-05 | Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg | Verfahren zur steigerung von proteintitern |
| WO2011102845A1 (en) * | 2010-02-18 | 2011-08-25 | Transtech Pharma, Inc. | Rage fusion protein compositions and methods of use |
| WO2011109789A2 (en) * | 2010-03-05 | 2011-09-09 | The Johns Hopkins University | Compositions and methods for targeted immunomodulatory antibodies and fusion proteins |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018205985A1 (zh) * | 2017-05-12 | 2018-11-15 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 含有TGF-β受体的融合蛋白及其医药用途 |
| CN110050000A (zh) * | 2017-05-12 | 2019-07-23 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 含有TGF-β受体的融合蛋白及其医药用途 |
| CN110050000B (zh) * | 2017-05-12 | 2022-07-26 | 苏州盛迪亚生物医药有限公司 | 含有TGF-β受体的融合蛋白及其医药用途 |
| CN112512550A (zh) * | 2018-11-09 | 2021-03-16 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 一种TGF-β受体融合蛋白药物组合物及其用途 |
| CN110563851A (zh) * | 2019-08-20 | 2019-12-13 | 启辰生生物科技(珠海)有限公司 | 具有免疫调节功能的融合蛋白、药物组合物、细胞及应用 |
| CN110563851B (zh) * | 2019-08-20 | 2020-06-12 | 启辰生生物科技(珠海)有限公司 | 具有免疫调节功能的融合蛋白、药物组合物、细胞及应用 |
| CN110734498A (zh) * | 2019-10-15 | 2020-01-31 | 上海科棋药业科技有限公司 | 一种用于解除免疫抑制的融合蛋白及其应用 |
| CN110964118A (zh) * | 2019-11-27 | 2020-04-07 | 中国药科大学 | 一种双特异性融合抗体及其在肿瘤免疫治疗中的应用 |
| WO2021218883A1 (zh) * | 2020-04-28 | 2021-11-04 | 神州细胞工程有限公司 | 一种TGFβR2胞外区截短分子、其与抗EGFR抗体的融合蛋白及其抗肿瘤用途 |
| CN111690070A (zh) * | 2020-05-13 | 2020-09-22 | 深圳市众循精准医学研究院 | 一种sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白及其应用 |
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