CN118620875B - 一种通过形态调控提高链霉菌谷氨酰胺转氨酶酶活的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过形态调控提高链霉菌谷氨酰胺转氨酶酶活的方法,属于发酵工程技术领域。本发明提供的方法包括如下步骤:将链霉菌孢子悬液接种到含有滑石粉的种子培养基中,控制接种孢子浓度为106~108CFU/mL,培养得到种子液;将种子液接种到含有三赞胶的发酵培养基中,发酵培养获得含有谷氨酰胺转氨酶的发酵液。本发明的方法能够使谷氨酰胺转氨酶发酵阶段的最大酶活显著提高,相比于未添加滑石粉和三赞胶的生产工艺而言提升幅度最高可达近100%,且方法简单,成本低,适合大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及发酵工程技术领域,尤其涉及一种通过形态调控提高链霉菌谷氨酰胺转氨酶酶活的方法。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解,而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase,简称TGase),又名转谷氨酰胺酶,是催化蛋白质结合或肽结合赖氨酸的游离氨基(作为酰基受体)与蛋白质结合或肽结合谷氨酰胺的γ-甲酰胺基团(作为酰基供体)之间形成共价键的酶。它是一种重要的调节酶,凭借着分子内或分子间的交联反应来对蛋白质进行修饰,从而改善蛋白质的功能特性,因此被广泛应用于食品、纺织、制药等各个领域。谷氨酰胺转氨酶广泛存在于人体、动植物和微生物中,微生物谷氨酰胺转氨酶(Microbial Transglutaminase,简称MTGase)由于不需要Ca2+的激活而发生作用,有着更高的反应速率和热稳定性以及更广泛的底物特异性等特点,因此成为了商业化生产的主要来源。
目前,发酵工业生产谷氨酰胺转氨酶的过程中,仍存在产量低、成本高的缺点,而现有研究多集中在菌种优化、生产工艺优化等方面。目前,有很多研究表明,链霉菌复杂的形态分化与丰富的天然产物和某些酶的合成之间有着密切的联系。通常来说,丝状链霉菌的形态可以分为分散菌丝、聚集成簇和结球成团三种类型。对于不同的丝状链霉菌发酵最终产物,最佳菌体形态会明显不同。控制链霉菌过程形态成为了提高谷氨酰胺转氨酶酶活的一种途径,但目前尚未有现有技术报道通过调控链霉菌形态以提高谷氨酰胺转氨酶酶活的方法,因此,如何提供一种生产谷氨酰胺转氨酶的方法,获得适合谷氨酰胺转氨酶生产的菌体形态,从而提高谷氨酰胺转氨酶的生产效率,是亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了一种通过形态调控提高链霉菌谷氨酰胺转氨酶酶活的方法,解决了链霉菌发酵生产谷氨酰胺转氨酶过程中菌体形态不能人为定向控制导致菌体不在产酶最佳形态而影响产酶效率的问题。
本发明提供了一种通过形态调控提高链霉菌谷氨酰胺转氨酶酶活的方法,包括如下步骤:
将链霉菌孢子悬液接种到含有滑石粉的种子培养基中,控制接种孢子浓度为106~108CFU/mL,培养得到种子液;
将种子液接种到含有三赞胶的发酵培养基中,发酵培养获得含有谷氨酰胺转氨酶的发酵液。
优选的,所述含有滑石粉的种子培养基中,滑石粉的浓度为2~40g/L。
优选的,所述含有三赞胶的发酵培养基中,三赞胶的浓度为2~10g/L。
优选的,所述链霉菌孢子悬液的制备方法为:将链霉菌孢子分散于无菌生理盐水中,过滤后取滤液离心、重悬,重复离心和重悬的步骤2~3次,即得。
优选的,所述含有滑石粉的种子培养基包括:甘油18~22g/L,蛋白胨18~22g/L,酵母粉4~6g/L,MgSO4·7H2O 1~3g/L,K2HPO41~3g/L,KH2PO4·3H2O 1~3g/L,滑石粉10~40g/L,pH为7.0。
优选的,所述培养得到种子液步骤中,培养的条件为:在温度为28~32℃、转速为180~220rpm的条件下培养20~30h。
优选的,所述将种子液接种到含有2~10g/L三赞胶的发酵培养基的步骤中,接种量为8~12%,v/v。
优选的,所述含有三赞胶的发酵培养基包括:甘油18~22g/L,鱼粉蛋白胨18~22g/L,酵母粉4~6g/L,玉米浆干粉18~22g/L,KH2PO4·3H2O 3~5g/L,K2HPO41~3g/L,MgSO4·H2O 1~3g/L,NH4Cl 3~3.5g/L,三赞胶4~8g/L,pH为7.0。
优选的,所述发酵培养的条件为:在温度为28~32℃、转速为180~220rpm的条件下培养90~100h。
优选的,控制接种孢子浓度为106CFU/mL,滑石粉的浓度为40g/L;或,控制接种孢子浓度为108CFU/mL,滑石粉的浓度为10g/L。
与现有技术相比,本发明取得了以下有益效果:
本发明通过滑石粉调控不同浓度孢子在种子培养基中的菌体形态,使孢子逐渐分散为菌丝形态,然后在发酵培养阶段利用三赞胶维持孢子菌丝形态,使谷氨酰胺转氨酶发酵阶段的最大酶活显著提高,最高可达50U/mL以上,相比于未添加滑石粉和三赞胶的生产工艺而言,酶活提升幅度最高可达近100%,具有显著的提升效果;在5L发酵罐放大培养中谷氨酰胺转氨酶的最大酶活可达100 U/mL以上。本发明通过此种形态调控方法,优化菌体的代谢活动,促进谷氨酰胺转氨酶的合成和积累,显著提高了谷氨酰胺转氨酶的发酵水平,对工业发酵生产谷氨酰胺转氨酶具有重要意义;同时,本发明方法简单,成本低,适合大规模生产。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。显而易见地,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1不同孢子浓度下的链霉菌种子液中菌体形态显微图片,放大倍数为40倍;
图2是本发明实施例1的不同滑石粉浓度下的链霉菌种子液中菌体形态显微图片,放大倍数为40倍;
图3是本发明实施例1中添加滑石粉和不添加滑石粉在种子培养阶段和发酵培养阶段的菌体形态显微图片;其中,(a):孢子浓度为106CFU/mL;(b):孢子浓度为108CFU/mL;放大倍数均为40倍;
图4是本发明实施例1中添加滑石粉和不添加滑石粉的不同体系在菌体发酵阶段的酶活随时间的变化曲线;
图5是本发明实施例1中添加滑石粉和不添加滑石粉的不同体系在菌体发酵阶段的菌体干重(DCW)随时间的变化曲线;
图6是本发明实施例1中添加滑石粉和不添加滑石粉的不同体系在菌体发酵阶段的残糖浓度随时间的变化曲线;
图7为本发明实施例1发酵培养基中不同三赞胶添加浓度下发酵液的最大酶活数据图。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是示例性的,旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
本发明提供了一种通过形态调控提高链霉菌谷氨酰胺转氨酶酶活的方法,包括如下步骤:
将链霉菌孢子悬液接种到含有滑石粉的种子培养基中,控制接种孢子浓度为106~108CFU/mL,培养得到种子液;
将种子液接种到含有三赞胶的发酵培养基中,发酵培养获得含有谷氨酰胺转氨酶的发酵液。
本发明以谷氨酰胺转氨酶发酵生产过程中菌体形态控制为指导,通过生理手段来控制菌体形态,首先通过滑石粉调控不同浓度孢子在种子培养基中的菌体形态,使孢子逐渐分散为菌丝形态,从而在发酵阶段初期维持孢子菌丝形态,使谷氨酰胺转氨酶酶活显著提高;然后在发酵培养阶段通过三赞胶的增稠和稳定作用,维持产酶的最佳菌体形态直至发酵结束,使得谷氨酰胺转氨酶酶活最高可达50 U/mL以上,具有显著的酶活提升效果,且操作方法简单易行、成本低。
本发明所述含有滑石粉的种子培养基中,滑石粉的浓度为2~40g/L。在上述浓度下,能够使发酵液中的谷氨酰胺转氨酶酶活得到提高。
本发明所述含有三赞胶的发酵培养基中,三赞胶的浓度为2~10g/L。三赞胶具有增稠的特性,可能会影响培养基中的氧气的传递速率,同时其能使菌丝的形态维持稳定,因此控制合适的范围有利于实现发酵液中谷氨酰胺转氨酶酶活的进一步提升。
本发明中,所述链霉菌孢子悬液的制备方法为:将链霉菌孢子分散于无菌生理盐水中,过滤后取滤液离心、重悬,重复离心和重悬的步骤2~3次,即得。
本发明对链霉菌孢子的获取方法不作特殊限制,本领域技术人员可以根据常规链霉菌孢子的培养方法进行获取,本发明优选为将链霉菌菌种接种到固体培养基中培养,所述固体培养基优选包括:可溶性淀粉18~22g/L,KNO30.8~1.2g/L,NaCl 0.4~0.6g/L,KH2PO4·3H2O 0.4~0.6g/L,MgSO4·7H2O 0.4~0.6g/L,FeSO4·7H2O 0.008~0.012g/L,琼脂18~22g/L,pH为7.2~7.4。更优选的,所述固体培养基包括:可溶性淀粉20g/L,KNO31g/L,NaCl 0.5g/L,KH2PO4·3H2O 0.5g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,FeSO4·7H2O 0.01g/L,琼脂20g/L,pH为7.2~7.4。
本发明对于链霉菌孢子的培养条件不作特殊限制,优选为:将接种链霉菌菌种的固体培养基倒置于28~32℃恒温培养箱中培养5~8天;然后选取单个菌落于新的固体培养基中继续培养6~8天,所选取的单个菌落为生长良好的菌落。
本发明对链霉菌孢子分散于无菌生理盐水中的分散过程不作特殊限制,采用本领域技术人员常用的分散过程即可。本发明对过滤后取滤液离心、重悬的步骤也不作特殊限制,本发明中过滤优选采用600目无菌滤布过滤。重复离心和重悬是为了确保孢子悬液的纯净度。
本发明中,所述含有滑石粉的种子培养基包括:甘油18~22g/L,蛋白胨18~22g/L,酵母粉4~6g/L,MgSO4·7H2O 1~3g/L,K2HPO41~3g/L,KH2PO4·3H2O 1~3g/L,滑石粉10~40g/L,pH为7.0。更优选的,所述种子培养基包括:甘油20g/L,蛋白胨20g/L,酵母粉5g/L,MgSO4·7H2O 2g/L,K2HPO42g/L,KH2PO4·3H2O 2g/L,滑石粉10~40g/L,pH为7.0。
本发明中,所述培养得到种子液步骤中,培养的条件为:在温度为28~32℃、转速为180~220rpm的条件下培养20~30h,培养时间更优选为23~25h。
本发明中,所述将种子液接种到发酵培养基步骤中,接种量为8~12%(v/v)。
本发明中,控制接种孢子浓度为106CFU/mL,滑石粉的浓度为40g/L;或,控制接种孢子浓度为108CFU/mL,滑石粉的浓度为10g/L。低浓度孢子(106CFU/mL)在未添加滑石粉时呈菌丝球状,当滑石粉浓度达到40g/L时,菌丝球分解为分散的菌丝。高浓度孢子(108CFU/mL)在未添加滑石粉时所得到菌丝众多且密集,整体为菌丝团的发酵形态,当滑石粉浓度达到10g/L时,菌丝团逐渐分散为游离的菌丝。通过酶活测定,上述条件下酶活均得到了显著提高,与未添加滑石粉的方法相比,酶活提高了60%以上。
本发明中,所述含有三赞胶的发酵培养基包括:甘油18~22g/L,鱼粉蛋白胨18~22g/L,酵母粉4~6g/L,玉米浆干粉18~22g/L,KH2PO4·3H2O 3~5g/L,K2HPO41~3g/L,MgSO4·H2O 1~3g/L,NH4Cl 3~3.5g/L,三赞胶4~8g/L,pH为7.0。更优选的,所述发酵培养基包括:甘油20g/L,鱼粉蛋白胨20g/L,酵母粉5g/L,玉米浆干粉20g/L,KH2PO4·3H2O 4g/L,K2HPO42g/L,MgSO4·H2O 2g/L,NH4Cl 3.2g/L,三赞胶6g/L,pH为7.0。三赞胶的加入能够起到增稠和稳定作用,从而维持菌丝形态,有利于酶活的提高,其添加量会对酶活产生影响,随着三赞胶浓度的增加,酶活呈现先增大后减小的趋势,当三赞胶浓度达到6g/L时,酶活最高可达到50U/mL以上,相比于未添加三赞胶的方法,酶活提升幅度可高达20%以上。
本发明中,所述发酵培养的条件为:在温度为28~32℃、转速为180~220rpm的条件下培养90~100h。
下面结合具体实施例对本发明技术方案做进一步阐述。
以下实施例中的链霉菌菌种为茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis),已于2024年5月31日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCCNo. 30826。其余试剂均可由市售途径获得。
以下实施例所采用的培养基如下:
(1)高氏一号培养基(固体培养基):可溶性淀粉20g/L,KNO31g/L,NaCl 0.5g/L,KH2PO4·3H2O 0.5g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,FeSO4·7H2O 0.01g/L,琼脂20g/L,pH为7.2~7.4;
(2)种子培养基:甘油20g/L,蛋白胨20g/L,酵母粉5g/L,MgSO4·7H2O 2g/L,K2HPO42g/L,KH2PO4·3H2O 2g/L,滑石粉0~40g/L,pH为7.0;
(3)发酵培养基:甘油20g/L,鱼粉蛋白胨20g/L,酵母粉5g/L,玉米浆干粉20g/L,KH2PO4·3H2O 4g/L,K2HPO42g/L,MgSO4·H2O 2g/L,NH4Cl 3.2g/L,三赞胶0~10g/L,pH为7.0。
以下实施例中,相关测定方法如下:
(1)谷氨酰胺转氨酶(TG酶)酶活测定方法:按Grossowicz比色法测定酶活:反应液A由0.1mol/L盐酸羟胺、0.01mol/L还原型谷胱甘肽和0.03mol/L N-苄氧羰基-L-谷氨酰甘氨酸溶解于2mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液(Tris-HCl,pH6.0)中,终止液B由3mol/L盐酸、12wt%三氯乙酸、5wt%六水三氯化铁(溶解于0.1mol/L盐酸中)3种试剂等体积混合而成。样品测定时,取200μL酶液加入1mL反应液A于37℃反应10min后加入1mL终止液B终止反应,在4℃、7000r/min离心10min后在525nm处比色。对照组为200μL酶液先加终止液B后于37℃反应10min,再加反应液A,其它操作相同。1单位TG酶酶活定义为:37℃条件下反应,每1min生成1μmol的单羟肟酸所需的酶量,单位为U/mL。
(2)残糖浓度的测定:
对样品发酵上清液进行适度稀释,然后吸取2 mL稀释后的样品溶液于50 mL试管中,加入1.5 mL DNS试剂(还原糖含量测定的试剂,市售),混合均匀。混匀后沸水浴加热5min,然后迅速流水冷却并定容至25mL。以去离子水为空白对照,在540 nm处测定吸光度值。
(3)菌体干重(DCW)的测定:
准确量取发酵液10mL,用抽滤瓶加滤纸(9μm,提前烘至恒重并称重)进行真空抽滤,并用蒸馏水反复冲洗3次,抽至滤纸无水滴滴下为止,将湿滤纸放置于80℃烘箱烘至恒重并称重,通过减去提前称好的抽滤纸的质量来计算未添加滑石粉条件下的菌体干重;通过减去添加的微粒的质量和抽滤纸的质量来计算添加滑石粉条件下的菌体干重。
(4)菌体形态(菌形)观察:
用移液枪吸取1mL种子液或发酵液,然后平铺于载玻片中,在光学显微镜下进行统一大小拍照,记录菌体形态。然后用离心法获得菌丝体,洗涤三次,最后再悬浮于蒸馏水中。采用马尔文激光粒度仪3000,测定菌体中位径(D50)大小。
实施例1
1、探究不同孢子浓度在种子培养阶段(不含滑石粉)及发酵培养阶段(不含三赞胶)对链霉菌菌体形态的影响。
具体操作步骤如下:
(1)孢子悬液制备:将-80℃中保藏的链霉菌孢子进行梯度稀释,用灭菌的枪头吸取孢子悬液,将孢子悬液进行梯度稀释到一定倍数,吸取0.2 mL稀释后的孢子悬液加入到装有高氏一号培养基的平板上,用无菌的涂布棒涂匀,倒置于30℃恒温培养箱中培养7天。挑取生长较好的单个菌落于新的高氏一号培养基的平板中继续培养7天。将长满平板的孢子用无菌的刮刀轻轻刮取,然后收集于装有10 mL无菌水和数颗玻璃珠的摇瓶中,振荡30min将成团孢子打散均匀后,用600目无菌滤布过滤,通过离心进一步沉淀孢子,并将上清液弃去。用新鲜的10mL无菌生理盐水重悬沉淀的孢子,重复离心和重悬步骤3次,以确保孢子悬液的纯净度。
(2)种子培养:无菌条件下,取1mL步骤(1)中制备的孢子悬液添加至具有50mL种子培养基(不含滑石粉)的250mL摇瓶中,利用血球计数板进行孢子计数,通过梯度稀释将接种孢子浓度调整为105~109CFU/mL。在温度为30℃、转速为200rpm的条件下培养24h,得到种子液。
(3)发酵培养:将步骤(2)中获得的种子液以10%(v/v)的接种量转接到不含三赞胶的发酵培养基中,在30℃、转速为200rpm的条件下培养96h,每隔12h区间取样,获得含有谷氨酰胺转氨酶的发酵液。
通过光学显微镜拍照观察以及通过马尔文激光粒度仪3000测量菌体中直径(D50),分别考察了109、108、107、106和105CFU/mL孢子浓度在种子培养阶段对链霉菌菌体形态的影响。结果见表1和图1所示。
表1 不同孢子浓度在种子培养阶段对链霉菌菌体形态的影响情况
注:表中“D50”表示菌体中位径,指在累积粒径分布中,累积值正好为50%时所对应的菌体直径;表中“-”表示忽略不计。
链霉菌在5种条件下(109、108、107、106和105CFU/mL孢子浓度)形成的菌体形态,分别对应为图1中的S1、S2、S3、S4和S5。根据表1和图1可知,种子培养24h后,种子液中菌体中位径(D50)随初始孢子浓度的降低而增大。高浓度孢子109和108CFU/mL形成的是由众多菌丝聚集而成的菌丝团,故中位径D50忽略不计;随着孢子浓度的降低,逐渐形成较大中位径(D50)的菌丝球;当孢子浓度降低至105CFU/mL时,菌丝球的中位径达到了204.16±34.03μm。表1和图1说明了孢子浓度会对菌体形态造成明显影响。
接种不同浓度孢子的链霉菌发酵液的终了pH、酶活(U/mL)、DCW(菌体干重,g/L)和残糖浓度(g/L)如表2所示。
表2 接种不同浓度孢子的链霉菌发酵液的终了pH、酶活、DCW和残糖浓度
注:表2中的酶活指的是发酵过程中的最大酶活。
通过表2可以发现,在发酵过程中,孢子浓度几乎不会影响终了pH;DCW随孢子浓度的降低而降低,相对应的,残糖浓度则逐渐上升;酶活呈现先上升后下降的趋势,在孢子浓度108CFU/mL下,酶活最高,为25.73±0.92U/mL。
2、探究不同滑石粉浓度对种子培养阶段的菌体形态和发酵培养阶段发酵参数的影响。
具体操作步骤与前述操作步骤相同,本次探究过程中,控制种子培养基的滑石粉浓度为0~40g/L。
从前述探究中可知,106CFU/mL的孢子浓度的菌体中位径适中,因此采用106CFU/mL的孢子浓度作为考察滑石粉浓度对菌体形态影响,如表3和图2所示。
从表3和图2中可以看出,随着滑石粉浓度从0g/L不断增加到40g/L,菌丝球中位径(D50)不断减小。当不添加滑石粉时,链霉菌菌丝球的中位径为108.65±18.11μm;当滑石粉的浓度达到40g/L时,菌丝球分解为分散的菌丝,因此中位径忽略不计。从表3和图2可以得知,滑石粉浓度对链霉菌菌体形态具有显著影响。
表3 106CFU/mL的孢子浓度在不同滑石粉浓度下的菌体中位径(D50)
注:表中“-”表示忽略不计。
在不同孢子浓度的链霉菌的种子培养阶段添加不同浓度滑石粉,并对谷氨酰胺转氨酶发酵阶段的最大酶活进行测定,如表4所示。
表4 不同滑石粉浓度对谷氨酰胺转氨酶发酵中最大酶活的影响(单位:U/mL)
从表4中可以看出,滑石粉形态调控总体上来说对链霉菌生产谷氨酰胺转氨酶是有利的,不同的是,孢子浓度不同,获得最大酶活添加的滑石粉浓度也不相同,可能是与菌体形态有着密切关系。从表4中可知,孢子浓度为108和106CFU/mL,分别在添加滑石粉浓度为10g/L和40g/L的条件下获得的谷氨酰胺转氨酶最大酶活得到了显著提高,最大酶活高达42.38±0.78 U/mL和29.62±0.66 U/mL,相对于未添加滑石粉条件下的酶活分别提高了64.7%和60.6%;孢子浓度为107CFU/mL时,在滑石粉浓度为10g/L时提高幅度最大,相对于未添加滑石粉条件下的酶活提高了39.9%。
孢子浓度为106和108CFU/mL,分别在添加和不添加滑石粉条件下的种子培养阶段和发酵培养阶段的菌体形态显微图片如图3所示。从图3中的a中可以看出,低浓度孢子(106CFU/mL)在40g/L滑石粉浓度下菌体形态变化明显,从菌丝球分解为菌丝;从图3中的b中可以看出,高浓度孢子(108CFU/mL)在10g/L的滑石粉的作用下,逐渐分散为游离的菌丝。从表4可知二者酶活均得到了显著提高,可以看出,发酵过程中以菌丝的形态生产谷氨酰胺转氨酶是最有利的。
孢子浓度为108和106CFU/mL,在种子培养阶段添加滑石粉和不添加滑石粉的体系发酵过程最终参数如表5所示,不同体系菌体发酵阶段的酶活、菌体干重(DCW)、残糖浓度随时间的变化曲线分别如图4、图5和图6所示。
表5 孢子浓度为108和106CFU/mL的发酵过程最终参数
注:表5中的酶活指的是发酵阶段的最大酶活。
从表5和图4~6中可以看出,添加滑石粉后促进了菌体的生长和谷氨酰胺转氨酶的生产,两种孢子浓度108和106CFU/mL在滑石粉的作用下,菌体活力增强,DCW较未添加滑石粉分别增加了23.83%和29.65%,并分别在发酵60h和72h获得最大酶活42.38±0.78U/mL和29.62±0.66U/mL,较未添加滑石粉的体系提高了64.7%和60.6%。添加滑石粉后除了促进了菌体的生长和谷氨酰胺转氨酶的产生之外,葡萄糖消耗速度加快,缩减了发酵周期。孢子浓度为108和106CFU/mL最终残糖量分别为7.31g/L和11.94g/L,较不添加滑石粉体系的残糖量分别减少了80.85%和39.71%。
3、探究发酵培养阶段添加三赞胶对链霉菌产酶酶活的影响。
具体操作步骤与前述操作步骤相同,本次探究过程中,控制孢子浓度为108CFU/mL,种子培养基中滑石粉的含量为10g/L,发酵培养基中三赞胶的浓度为0~10g/L。
三赞胶具有增稠的特性,可能会影响培养基中的氧气的传递速率,因此在好氧发酵过程中对其浓度的控制至关重要。图7为发酵培养基中不同三赞胶添加浓度下发酵液的最大酶活数据图,从图中可以看出,随着三赞胶浓度的增加,最大酶活呈现先增大后减小的趋势,在6g/L时取得最高值,最大酶活可达51.38±0.69 U/mL,相比未添加三赞胶的方法,最大酶活提升幅度为21.2%;相比未添加滑石粉和三赞胶的方法,最大酶活提升幅度高达99.7%,具有显著的提升效果。
实施例2
本实施例提供了一种在5L发酵罐中放大化生产谷氨酰胺转氨酶的方法。
无菌条件下,在含10g/L的滑石粉种子培养基中接种孢子浓度为108CFU/mL的孢子悬液,并在温度为30℃、转速为200rpm、装液量为100/500mL的条件下培养24h,得到种子液。
利用3.5L发酵培养基(含6g/L三赞胶),在5 L发酵罐上进行发酵。取种子液,按10%(v/v)接种量,接种至含70%(v/v)装液量的发酵培养基的发酵罐中。发酵培养过程中维持pH为7.0,发酵初期加入0.2 g/L消泡剂以控制发酵过程中的泡沫,发酵转速为500 rpm,通风量为1.4 L/min,发酵温度为30℃。随后发酵过程中调整通气量及搅拌转速,维持溶氧30%左右。用2 mol/L的氨水和1 mol/L的硫酸溶液将pH维持在7.0,直至发酵结束。发酵过程中取发酵液检测谷氨酰胺转氨酶酶活,酶活在40 h最高达到101.23±0.57 U/mL。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种通过形态调控提高链霉菌谷氨酰胺转氨酶酶活的方法,其特征在于,包括如下步骤:
将链霉菌孢子悬液接种到含有滑石粉的种子培养基中,控制接种孢子浓度为106~108CFU/mL,培养得到种子液;
将种子液接种到含有三赞胶的发酵培养基中,发酵培养获得含有谷氨酰胺转氨酶的发酵液;
所述含有滑石粉的种子培养基中,滑石粉的浓度为2~40g/L;
所述含有三赞胶的发酵培养基中,三赞胶的浓度为2~10g/L;
链霉菌菌种为茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis),保藏编号为CGMCC No.30826。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述链霉菌孢子悬液的制备方法为:将链霉菌孢子分散于无菌生理盐水中,过滤后取滤液离心、重悬,重复离心和重悬的步骤2~3次,即得。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述含有滑石粉的种子培养基包括:甘油18~22g/L,蛋白胨18~22g/L,酵母粉4~6g/L,MgSO4·7H2O 1~3g/L,K2HPO4 1~3g/L,KH2PO4·3H2O1~3g/L,滑石粉10~40g/L,pH为7.0。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述培养得到种子液步骤中,培养的条件为:在温度为28~32℃、转速为180~220rpm的条件下培养20~30h。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述将种子液接种到含有三赞胶的发酵培养基的步骤中,接种量为8~12%,v/v。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述含有三赞胶的发酵培养基包括:甘油18~22g/L,鱼粉蛋白胨18~22g/L,酵母粉4~6g/L,玉米浆干粉18~22g/L,KH2PO4·3H2O 3~5g/L,K2HPO4 1~3g/L,MgSO4·H2O 1~3g/L,NH4Cl 3~3.5g/L,三赞胶4~8g/L,pH为7.0。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述发酵培养的条件为:在温度为28~32℃、转速为180~220rpm的条件下培养90~100h。
8.如权利要求1所述的方法,其特征在于,控制接种孢子浓度为106CFU/mL,滑石粉的浓度为40g/L;或,控制接种孢子浓度为108CFU/mL,滑石粉的浓度为10g/L。
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Legal Events
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GR01 | Patent grant |