CN112300953B - 枯草芽孢杆菌及其在发酵生产腺苷酸脱氨酶中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物筛选及发酵领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌及其在发酵生产腺苷酸脱氨酶中的应用。本发明提供了一种产腺苷酸脱氨酶的菌株，所述菌株为枯草芽孢杆菌菌株(Bacillus subtilis ESP710)，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M2018827。本发明提供了一种生产腺苷酸脱氨酶的方法，其使用上述所述的菌株进行液态发酵生产得到腺苷酸脱氨酶。所得到的腺苷酸脱氨酶的发酵酶活远远高于目前已报道的发酵酶活，发酵酶活为14000‑18000U/mL，液态发酵的方式更易于产品工业化生产，发酵液发酵酶活高，发酵使用常规、可溶性的原料，生产染菌风险小，产品易于分离。
Description
技术领域
本发明涉及微生物筛选及发酵领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌及其在发酵生产腺苷酸脱氨酶中的应用。
背景技术
高I+G(5′-肌苷酸钠和5′-鸟核酸钠)酵母抽提物是在原酵母抽提物的基础上，强化了产品中呈味核苷酸物质含量的酵母抽提物，作为天然、营养的高端调味品可替代味精，具有增鲜、提味和降盐等作用，符合现代人的饮食消费习惯和营养需求趋势。酵母抽提物中I+G的含量直接影响着产品的风味品质和生产成本。在国内的研究中，酵母抽提物中I+G含量在10％左右，而国外有I+G含量达到20％的酵母抽提物的专利报道。安琪酵母股份有限公司通过增加对高蛋白高核酸酵母的热提取时间和pH的改进，在抽提物溶液中酵母RNA由原来的13％提高到25％以上，再通过酶解工艺改进可以直接生产出18％以上的I+G产品，再对该产品进行超滤，产品各项性能得到明显改善，产品各项指标达到欧美高端产品质量水平，属国内首创。
高I+G酵母抽提物的生产过程中，首先使用5’-核苷酸的磷酸二酯酶对单链DNA和RNA进行水解，生成腺苷酸(AMP)和鸟苷酸(GMP)，再由5′-腺苷酸脱氨酶进行作用，将腺苷酸转化为肌苷酸(IMP)。在高I+G酵母抽提物制备过程中，5′-腺苷酸脱氨酶起着至关重要的作用，5′-腺苷酸脱氨酶的酶活力及作用性能直接影响肌苷酸生成及高I+G酵母抽提物的质量。因此，获得高催化活力、高性能的5′-腺苷酸脱氨酶是解决高I+G酵母抽提物生产的关键技术之一，具有重要的研究意义和市场价值。
5′-腺苷酸脱氨酶最早由鼠骨骼肌和人红血细胞制备，现代化工业生产中使用的酶大都使用酵母、青霉、曲霉及毛霉等微生物发酵法制备，其中使用最多的菌种是米曲霉和蜂蜜曲霉，近年日本也有用基因工程链霉菌进行生产的专利报道。脱氨酶生产早期通常使用的是固态发酵法生产，该方法的缺点是固体原料中的色素、蛋白质、糖及无机盐等被混杂到酶液中而使酶的提取纯化和使用带来困难，而且固体酶的酶活往往很低，随后人们改用液体发酵法生产，该方法虽然能有效地克服固态发酵的某些缺点，但酶的活性及稳定性仍未解决。5′-腺苷酸脱氨酶的工业化生产，目前，国际上只有日本天野酶株式会社拥有成熟的技术和产品，国内的广西科学院也有产品在试销，但产品的稳定性和应用效果还有待进一步验证。
近年来有关5′-腺苷酸脱氨酶的研究报道不多，并且主要仍集中在菌种选育和发酵条件优化方面。刘昌军等通过菌种筛选和发酵工艺优化，利用米曲霉固态发酵方式获得5′-腺苷酸脱氨酶的表达量为1543.48u/g鲜曲；普为民等从多株青霉及曲霉中筛选到一株腺苷酸脱氨酶蜂蜜曲霉产生菌，经紫外线及复合诱变处理及发酵工艺优化后，使原始菌种脱氨酶表达量提高了16倍，最终得到脱氨酶的表达量达到1300u/g；段作营等通过固态发酵方式获得米曲霉脱氨酶的表达量约1560u/g，并使用盐析沉淀方法对该酶进行了纯化并对酶学性质进行了初步研究。
中国申请号CN201510306409.0公开了一种腺苷酸脱氨酶的液态发酵方法，其包括下述步骤：(1)菌种活化：将蜂蜜曲霉孢子接入培养基培养；(2)种子制备：孢子悬浮液按1-2.5％接种量接入种子摇瓶培养基培养；(3)种子罐培养：按0.1-0.5％接种量，将种子菌液接入到种子罐中培养，其中转速为50-150rpm，通风比为1:0.3-1:1.2；(4)发酵罐生产：按2-10％的接种量，将种子培养液接入发酵罐培养，其中转速100-200rpm，通风比1:0.3-1:1.2，所得到的腺苷酸脱氨酶的酶活为2000-3100U/mL。
目前市场上腺苷酸脱氨酶主要来源为日本天野酶制剂公司产品，国内规模化生产厂商并不多，且存在发酵酶活低，造成生产成本高。
目前国内生产腺苷酸脱氨酶主要采用的是利用曲霉进行固态发酵工艺进行，发酵酶活偏低，产物纯度不够；分离纯化步骤中收率偏低，总体成本过高。另外，受限于发酵工艺限制，单次生产的产量受场地和环境限制，远达不到生产需要。
发明内容
为此，本发明所解决的技术的问题是：目前国内生产腺苷酸脱氨酶主要采用的是利用曲霉进行固态发酵工艺进行，发酵酶活偏低，产物纯度不够；分离纯化步骤中收率偏低，总体成本过高。
本发明提供一种从土壤中筛选出一株产腺苷酸脱氨酶的枯草芽孢杆菌菌株(Bacillus subtilis ESP710)，并通过紫外、ARTP等诱变技术对菌株进行诱变和驯化，获得高产酶活菌株，该菌株已送于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号是CCTCC NO:M 2018827。
本发明提供一种液态发酵生产腺苷酸脱氨酶的方法，其使用上述所述的菌株，发酵酶活水平为14000-18000U/mL；发酵酶活高，产品易于分离提取，并能大大提高生产产量，降低生产成本，提高了产品竞争力。
具体来说，本发明提出了如下技术方案。
本发明提供了一种产腺苷酸脱氨酶的菌株，所述菌株为枯草芽孢杆菌菌株(Bacillus subtilis ESP710)，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M2018827。
本发明提供了上述所述的菌株在发酵领域中的应用，优选在发酵生产腺苷酸脱氨酶中的应用。
本发明提供了一种生产腺苷酸脱氨酶的方法，其使用上述所述的菌株进行液态发酵生产得到腺苷酸脱氨酶。
优选的，对于上述所述的方法，其中，所述方法包括下述步骤：
(1)菌种活化：将所述的菌株接种在培养基中，得到活化的菌株；
(2)种子制备：将步骤(1)所得到的菌株接种到种子摇瓶培养基中进行培养，得到种子菌液；
(3)种子罐培养：将步骤(2)所得到的种子菌液接入到装有种子培养基中的种子罐中进行培养，得到种子培养液；
(4)发酵罐培养：将种子培养液接种到发酵罐中进行培养，发酵结束后得到发酵液。
优选的，对于上述所述的方法，其中，在步骤(1)中，培养温度为30-40℃，优选的，所述培养时间为1-3天。
优选的，对于上述所述的方法，其中，在步骤(2)中，培养温度为30-40℃，优选为35-38℃；进一步优选的，培养时间为16-24小时，优选为18-22小时。
优选的，对于上述所述的方法，其中，在步骤(3)中，转速为50-150rpm，优选为150-200rpm；优选的，通风比为1:0.5-1:1，优选为1:0.8-1:1；进一步优选的，培养温度为30-40℃，优选为35-37℃；进一步优选的，培养时间为10-18小时；进一步优选的，接种量为0.1％-0.5％体积比，优选为0.1-0.3％体积比。
优选的，对于上述所述的方法，其中，在步骤(4)中，转速为100-200rpm，优选的，通风比为1:0.5-1:1.2，优选为1:0.8-1：2；进一步优选的，培养温度为30-40℃，优选为35-37℃；进一步优选的，培养时间为30-42小时，优选为34-36小时；进一步优选的，接种量为2％-10％体积比，优选为6-10％体积比。
优选的，对于上述所述的方法，其中，在步骤(4)中，在培养3-6小时后补加碳源；优选的，按质量体积比计，所述碳源为含有30-60％葡萄糖的培养基。
优选的，对于上述所述的方法，其中，采用板框过滤对所得到的发酵液进行分离得到粗酶过滤液。
优选的，对于上述所述的方法，其中，对所述的粗酶过滤液进行浓缩，优选的，浓缩倍数为8-15倍，得到浓缩液。
优选的，对于上述所述的方法，其中，按质量体积比计，所述种子培养基包括酵母粉0.1-0.5％，蛋白胨0.5-1.5％和氯化钠0.5-1.5％，其余为水。
优选的，对于上述所述的方法，其中，按质量体积比计，所述发酵的培养基包括葡萄糖0.5-1.5％，蛋白胨1.5-4％，硫酸铵0.15-0.65％，氯化钙0.01-0.15％，柠檬酸钠0.01-0.2％，磷酸二氢钠0.5-1.5％，磷酸氢二钠0.5-1.5％和消泡油0.01-0.2％，其余为水。
本发明提供了上述任一项所述的方法发酵得到的腺苷酸脱氨酶，其中酶活为14000-18000U/mL。
本发明所取得的有益效果是：
本发明提供了一种产腺苷酸脱氨酶的枯草芽孢杆菌，并提供了采用所述的菌株进行液态发酵生产腺苷酸脱氨酶的方法，该方法中发酵酶活远远高于目前已报道的发酵酶活，发酵酶活为14000-18000U/mL，液态发酵的方式更易于产品工业化生产，发酵液发酵酶活高，发酵使用常规、可溶性的原料，生产染菌风险小，产品易于分离。
菌株保藏信息
本发明所用的菌种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ESP710)，于2018年11月26日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2018827，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：(027)-68754052。
具体实施方式
如上所述，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌，所述菌株是从土壤中分离，并经紫外、ARTP等诱变技术对分离得到的菌株进行诱变和驯化得到，所得到的菌株发酵生产的腺苷酸脱氨酶的活性较高，为14000-18000U/mL，该菌株已送于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号是CCTCC No：M 2018827。
本发明提供了一种使用上述所述的菌株生产腺苷酸脱氨酶的液态发酵方法，其中，所述方法包括下述步骤：
(1)菌种活化：将所述的菌株接种在培养基中，得到活化的菌株；
(2)种子制备：将步骤(1)所得到的菌株接种到种子摇瓶培养基中进行培养，得到种子菌液；
(3)种子罐培养：将步骤(2)所得到的种子菌液接入到装有种子培养基中的种子罐中进行培养，得到种子培养液；
(4)发酵罐培养：将种子培养液接种到发酵罐中进行培养，发酵结束后得到发酵液。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，在步骤(4)中，发酵pH为6.5-7.5；优选的，溶解氧(DO)为40-60％；进一步优选的，发酵过程中所述葡萄糖的含量为5-15g/L。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，在步骤(4)中，转速为100-200rpm，优选的，通风比为1:0.5-1:1.2，优选为1:0.8-1：2；进一步优选的，培养温度为30-40℃，优选为35-37℃；进一步优选的，培养时间为30-42小时，优选为34-36小时；进一步优选的，接种量为2％-10％体积比，优选为6-10％体积比。
其中，对于培养时间，其是流加碳源之前的时间与流加后的发酵时间之和。
在本发明优选的一种具体实施方式中，所述液态发酵方法包括下述步骤：
(1)菌种活化：取甘油管菌株一支，用接种环在无菌条件下接入到新鲜的培养基中，于37℃培养1天。
(2)种子制备：将活化培养好的种子接种一大环单菌落至新鲜的种子摇瓶培养基中，置于37℃恒温摇瓶中培养16-24h，
(3)种子罐培养：将种子培养基通过卡氏罐接入种子罐中，接种量为0.1％～0.5％，培养温度35～37℃，转速50～150rpm，通风比1：0.5～1：1，培养周期约10～18小时，
(4)发酵罐培养：将种子培养液按照2～8％接种接入发酵罐中进行培养，培养温度35～37℃，转速100～200rpm，培养周期约36小时，通风比1：0.5～1：1.2，发酵5小时后开始流加碳源补料，发酵结束时放罐酶活水平在14000u/ml～18000u/ml。
在本发明较优选的一种具体实施方式中，其中，所述液态发酵方法还包括离心分离、超滤浓缩、冻干或喷粉处理的步骤。
优选的，所述离心分离是采用板框分离除去菌体。
优选的，所述超滤浓缩指将粗酶过滤液通过超滤膜浓缩系统进行浓缩，浓缩倍数控制在8～15倍。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，按质量体积比计，所述种子培养基的配方为：酵母粉0.1-0.5％，蛋白胨0.5-1.5％，氯化钠0.5-1.5％，余量为水；
按质量体积比计，所述发酵培养基的配方为：葡萄糖0.5-1.5％，蛋白胨1.5-4％，硫酸铵0.15-0.65％，氯化钙0.01-0.15％，柠檬酸钠0.01-0.2％，磷酸二氢钠0.5-1.5％，磷酸氢二钠0.5-1.5％和消泡油0.01-0.2％，余量为水；
按质量体积比计，所述碳源的配方为：葡萄糖30-60％，余量为水。
下面的实施例是对本发明技术方案的详细说明。
实施例1菌株的获得
(1)获取野生型菌株：该菌株是从腐乳或者酱油工厂周边或土壤中获得，具体的步骤为：
1)样品采集：从腐乳或酱油厂区周边的土壤中或这腐乳半成品或酱油发酵半成品中采集样品；
2)微生物富集：将搜集到的样品在37℃的恒温环境中放置48h以上至干燥；取适量干燥的样品接种至新鲜的培养基中，富集培养；培养基配方为葡萄糖0.5％，蛋白胨4％，硫酸铵0.65％，氯化钙0.15％，柠檬酸钠0.2％，磷酸二氢钠0.5％，磷酸氢二钠0.5％，余量为水；
3)获得单菌落：富集后的样品通过梯度稀释后平板培养，获得单菌落。
(2)诱变
采用ARTP诱变方式对出发菌株进行诱变
设备准备：按照设备使用说明书正常操作；(ARTP-ⅡS，无锡源清天木生物科技有限公司)
菌悬液制备：将培养至对数期的菌液离心收集，生理盐水洗涤2次后，用生理盐复溶至OD在0.5左右，此时菌量在106～108左右；
于超净台将金属载片置于酒精灯外焰灼烧20s左右，冷却后方式无菌平板上，取10μL菌液均匀涂布在栽片上；
将装有样品载片的平板移至ARTP诱变系统操作仓,用无菌镊子将载片放对应孔位，调节载台下方旋钮，使载片处于气流端口2mm处,并关闭仓门；
功率设置100W，流量在10SLM，时间在31s；
样品处理完毕，用无菌镊子将载片放至装有1mL无菌水的离心管中；充分震荡均匀；形成新的菌悬液；
对新的菌悬液进行梯度稀释涂布获得单菌落；检测致死率在99.17％；
(3)生理生化鉴定和16S rDNA鉴定
1)生理生化实验：液化明胶，水解淀粉，V.P试验阳性，还原硝酸盐，卵磷脂酶试验阴性，革兰氏阳性；
2)形态学特定：菌落白色，湿润，形态不规则，有乳点状突起，不透明，边缘圆形或不规则；细胞呈长杆状或链状；
3)16S rDNA的鉴定：引物如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，其中，SEQ ID NO.2的序列为5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′SEQ ID NO.3的序列为：5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′，引物由奥科鼎盛生物科技(武汉)有限公司提供
PCR反应体系如下：
PCR扩增条件：94℃预变性4min；94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，扩增30个循环；72℃10min
将扩增得到的序列送至奥科鼎盛生物科技(武汉)有限公司测序，其16SrDNA如SEQID NO.1所示，将该序列使用NCBI网站进行BLAST核苷酸比对分析，与枯草芽孢杆菌16SrDNA序列的同源性为100％(Gene Bank:MK-183007.1和NR-112116.2)。
实施例2-1发酵生产腺苷酸脱氨酶
(1)菌株活化：挑选甘油管菌种在新鲜的平板培养基中37℃活化1d得到单菌落，其中，以100L水计，平板培养基中含有酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L；
(2)种子制备：挑选活化后的单菌落1-2个转接到装有新鲜的种子培养基(其组分和含量与步骤(1)中的相同)的三角瓶中(500mL三角瓶中装液100mL)，制备种子液，培养条件：37℃，200rpm培养18h；
(3)种子罐培养：将步骤(2)所得到的种子液以0.2％体积比的接种量接入到3L含有种子培养基的种子罐中进行培养得到成熟的种子，其中，培养温度35℃，转速150rpm，通风比1：0.8，培养周期15小时，按质量体积比计，所述种子培养基包括酵母粉0.1％，蛋白胨1.5％和氯化钠1.5％，其余为水；
(4)发酵罐培养：以6％体积比的接种量接种成熟的种子至装液量3L的5L的发酵罐中，发酵温度37℃，发酵5小时后开始流加碳源，按质量体积比计，所述碳源为含有40％葡萄糖的培养基，其余为水；控制发酵液中葡萄糖的含量在5g/L左右，pH为6.5，转速100rpm，通风比1:0.8，发酵液DO值为40％，再发酵时间为31h，然后采用板框分离除去菌体得到粗酶过滤液，将粗酶过滤液通过超滤膜浓缩系统进行浓缩，浓缩倍数为8倍，再进行冻干处理，得到固体腺苷酸脱氨酶，其中，按质量体积比计，所述发酵的培养基包括葡萄糖0.5％，蛋白胨4％，硫酸铵0.65％，氯化钙0.15％，柠檬酸钠0.2％，磷酸二氢钠0.5％，磷酸氢二钠0.5％和消泡油0.01％，其余为水。
腺苷酸脱氨酶的酶活测定方法：
准确称取13.9mg 5’-腺苷酸溶于1mL 0.08mol·L-1的NaHCO3溶液中作为原始底物，然后用0.1mol·L-1琥珀酸-NaOH(pH 6.0)稀释400倍得到浓度为0.1×10-3mol·L-1的反应底物。在试管中加入3mL反应底物，将试管放在37℃水浴锅中保温5min，加入100μL预稀释的腺苷酸脱氨酶液立即计时，将反应底物与酶液混匀，15min后加3mL、10％的高氯酸溶液终止反应。对照实验方法同上，反应底物37℃水浴后用冰水预冷，加3mL、10％的高氯酸后再加100μL酶液混匀，用紫外分光光度计在265nm处，以去离子水为参比，用石英比色皿测定吸光值。
酶活定义:在上述条件下在波长265nm下吸光值每分钟改变0.001为酶的一个活力单位。
计算公式如下：酶活(U·mL-1)＝(△A265×K×10)/(0.001×T)。
△A265为反应液与对照组吸光度的差值；K为酶液的稀释倍数；T为反应时间，min
根据上述方法进行测定，所得到的腺苷酸脱氨酶的酶活为15800U/mL。
实施例2-2发酵生产腺苷酸脱氨酶
(1)菌种活化：挑选甘油管菌种在新鲜的平板培养基中37℃活化1d得到单菌落，所述平板培养基的组分和含量与实施例2-1步骤(1)中的相同；
(2)种子制备：挑选活化后的单菌落1-2个转接到装有新鲜的种子培养基(种子培养基中的组分和含量与实施例2-1步骤(2)中的相同)的三角瓶中(500mL三角瓶装液100mL)，制备种子液，培养条件：37℃，200rpm培养20h；
(3)种子罐培养：将步骤(2)所得到的种子液以0.3w/v％体积比的接种量接入到3L含有种子培养基的种子罐中进行培养得到成熟的种子，其中，培养温度36℃，转速200rpm，通风比1：0.9，培养周期18小时，按质量体积比计，所述种子培养基包括酵母粉0.5％，蛋白胨0.5％和氯化钠1.5％，其余为水；
(4)发酵罐培养：以6％体积比的接种量接种成熟的种子至装液量3L的5L的发酵罐中，发酵温度37℃，发酵5小时后开始流加碳源，按质量体积比计，所述碳源为含有30％葡萄糖的培养基，其余为水；控制发酵液中葡萄糖的含量在5g/L左右，pH为7，转速150rpm，通风比1:1，发酵液DO为40％；再发酵31h，然后采用板框分离除去菌体得到粗酶过滤液，将粗酶过滤液通过超滤膜浓缩系统进行浓缩，浓缩倍数为10倍，再进行冻干处理，得到固体腺苷酸脱氨酶，其中，按质量体积比计，所述发酵的培养基包括葡萄糖1.5％，蛋白胨1.5％，硫酸铵0.5％，氯化钙0.15％，柠檬酸钠0.01％，磷酸二氢钠0.5％，磷酸氢二钠1.5％和消泡油0.01％，其余为水。
将所得到的腺苷酸脱氨酶按照实施例2-1所述的方法进行酶活性测试，所得到的腺苷酸脱氨酶的发酵酶活为16800U/mL。
实施例2-3发酵生产腺苷酸脱氨酶
(1)菌种活化：挑选甘油管菌种在新鲜的平板培养基中37℃活化1d得到单菌落，所述平板培养基的组分和含量与实施例2-1步骤(1)中的相同；
(2)种子制备：挑选活化后的单菌落1-2个转接到装有新鲜的种子培养基(种子培养基中的组分和含量与实施例2-1步骤(2)中的相同)的三角瓶中(500mL三角瓶装液100mL)，制备种子液，培养条件：37℃，200rpm培养20h；
(3)种子罐培养：将步骤(2)所得到的种子液以0.1％体积比的接种量接种至装液量1L的5L的种子罐中进行培养得到成熟的种子，其中，培养温度37℃，转速200rpm，通风比1:1，培养周期12h，按质量体积比计，所述种子培养基包括酵母粉0.4％，蛋白胨1％和氯化钠1％，其余为水；
(4)发酵罐培养：以6.8％体积比的接种量接种成熟的种子至装液量25L的50L发酵罐中，发酵5小时后开始流加碳源，按质量体积比计，所述碳源为含有50％葡萄糖的培养基，其余为水；控制发酵液中葡萄糖的含量在5g/L左右，pH为7.5，转速200rpm，通风比1:0.5，发酵液DO为40％；发酵周期36h，然后采用板框分离除去菌体得到粗酶过滤液，将粗酶过滤液通过超滤膜浓缩系统进行浓缩，浓缩倍数为15倍，再进行喷粉处理，得到固体腺苷酸脱氨酶，其中，按质量体积比计，所述发酵的培养基包括葡萄糖0.5％，蛋白胨1.5％，硫酸铵0.65％，氯化钙0.15％，柠檬酸钠0.2％，磷酸二氢钠1.5％，磷酸氢二钠1.5％和消泡油0.2％，其余为水。
将所得到的腺苷酸脱氨酶按照实施例2-1所述的方法进行酶活性测试，所得到的腺苷酸脱氨酶的发酵酶活为14500U/mL。
实施例2-4发酵生产腺苷酸脱氨酶
(1)菌种活化：挑选甘油管菌种在新鲜的平板培养基中37℃活化1d得到单菌落，所述平板培养基的组分和含量与实施例2-1步骤(1)中的相同；
(2)种子制备：挑选活化后的单菌落1-2个转接到装有新鲜的种子培养基的三角瓶中(500mL三角瓶装液100mL)，制备种子液，培养条件：37℃，200rpm培养20h；
(3)种子罐培养：将步骤(2)所得到的种子液以0.1％体积比的接种量接种至装液量1L的5L的种子罐中进行培养得到成熟的种子，其中，培养温度37℃，转速200rpm，通风比1:0.9，培养周期14h，按质量体积比计，所述种子培养基包括酵母粉5％，蛋白胨0.5％和氯化钠0.5％，其余为水；
(4)发酵罐培养：以8％体积比的接种量接种成熟的种子至装液量30L的50L发酵罐中，发酵4.5小时后开始流加碳源，按质量体积比计，所述碳源为含有60％葡萄糖的培养基，其余为水；控制发酵液中葡萄糖的含量在5g/L左右，pH为6.5，转速120rpm，通风比1:0.5，发酵液DO为40％；发酵周期36h，然后采用板框分离除去菌体得到粗酶过滤液，将粗酶过滤液通过超滤膜浓缩系统进行浓缩，浓缩倍数为12倍，再进行喷粉处理，得到固体腺苷酸脱氨酶，其中，按质量体积比计，所述发酵的培养基包括葡萄糖1％，蛋白胨1.5-3％，硫酸铵0.5％，氯化钙0.1％，柠檬酸钠0.1％，磷酸二氢钠1％，磷酸氢二钠1％和消泡油0.1％，其余为水。
将所得到的腺苷酸脱氨酶按照实施例2-1所述的方法进行酶活性测试，所得到的腺苷酸脱氨酶的发酵酶活为15500U/mL。
实施例2-5发酵生产腺苷酸脱氨酶
(1)菌种活化：挑选甘油管菌种在新鲜的平板培养基中37℃活化1d得到单菌落，所述平板培养基的组分和含量与实施例2-1步骤(1)中的相同；
(2)种子制备：挑选活化后的单菌落1-2个转接到装有新鲜的种子培养基(种子培养基中的组分和含量与实施例2-1步骤(2)中的相同)的三角瓶中(2000mL三角瓶装液400mL)，制备种子液，培养条件：37℃，200rpm培养20h；
(3)种子罐培养：将步骤(2)所得到的种子液以0.2％体积比的接种量接种至装液量1.5m3的5m3的种子罐中进行培养得到成熟的种子，其中，培养温度37℃，转速150rpm，通风比1：0.8，培养周期12h，按质量体积比计，所述种子培养基包括酵母粉0.4％，蛋白胨1％和氯化钠1％，其余为水；
(4)发酵罐培养：以10％体积比的接种量接种成熟的种子至装液量15m3的25m3发酵罐中，发酵5小时后开始流加碳源，按质量体积比计，所述碳源为含有30％葡萄糖的培养基，其余为水；控制发酵液中葡萄糖的含量在5g/L左右，pH为7.5，转速100rpm，通风比1：0.5，发酵液DO为40％；发酵周期34h，然后采用板框分离除去菌体得到粗酶过滤液，将粗酶过滤液通过超滤膜浓缩系统进行浓缩，浓缩倍数为8倍，再进行喷粉处理，得到固体腺苷酸脱氨酶，其中，按质量体积比计，所述发酵的培养基包括葡萄糖1.5％，蛋白胨3％，硫酸铵0.65％，氯化钙0.15％，柠檬酸钠0.01％，磷酸二氢钠1.5％，磷酸氢二钠1.5％和消泡油0.01％，其余为水。
将所得到的腺苷酸脱氨酶按照实施例2-1所述的方法进行酶活性测试，所得到的腺苷酸脱氨酶的发酵酶活为17700U/mL。
实施例2-6发酵生产腺苷酸脱氨酶
(1)菌种活化：挑选甘油管菌种在新鲜的平板培养基中37℃活化1d得到单菌落，所述平板培养基的组分和含量与实施例2-1步骤(1)中的相同；
(2)种子制备：挑选活化后的单菌落1-2个转接到装有新鲜的种子培养基(种子培养基中的组分和含量与实施例2-1步骤(2)中的相同)的三角瓶中(2000mL三角瓶装液400mL)，制备种子液，培养条件：37℃，200rpm培养18h；
(3)种子罐培养：将步骤(2)所得到的种子液以0.3％体积比的接种量接种至装液量1.5m3的5m3的种子罐中进行培养得到成熟的种子，其中，培养温度37℃，转速150rpm，通风比1：0.8，培养周期11h，按质量体积比计，所述种子培养基包括酵母粉0.5％，蛋白胨1.5％和氯化钠1％，其余为水；
(4)发酵罐培养：以10％体积比的接种量接种成熟的种子至装液量15m3的25m3发酵罐中，发酵4.5小时后开始流加碳源，按质量体积比计，所述碳源为含有45％葡萄糖的培养基，其余为水；控制发酵液中葡萄糖的含量在5g/L左右，pH为7，转速150rpm，通风比1：1，发酵液DO为40％；发酵周期34h，然后采用板框分离除去菌体得到粗酶过滤液，将粗酶过滤液通过超滤膜浓缩系统进行浓缩，浓缩倍数为15倍，再进行冻干处理，得到固体腺苷酸脱氨酶，其中，按质量体积比计，所述发酵的培养基包括葡萄糖1％，蛋白胨4％，硫酸铵0.5％，氯化钙0.01％，柠檬酸钠0.01％，磷酸二氢钠0.5％，磷酸氢二钠1.5％和消泡油0.2％，其余为水。
将所得到的腺苷酸脱氨酶按照实施例2-1所述的方法进行酶活性测试，所得到的腺苷酸脱氨酶的发酵酶活为16700U/mL。
实施例2-7发酵生产腺苷酸脱氨酶
(1)菌种活化：挑选甘油管菌种在新鲜的平板培养基中37℃活化1d得到单菌落，所述平板培养基的组分和含量与实施例2-1步骤(1)中的相同；
(2)种子制备：挑选活化后的单菌落1-2个转接到装有新鲜的种子培养基(种子培养基中的组分和含量与实施例2-1步骤(2)中的相同)的三角瓶中(2000mL三角瓶装液400mL)，制备种子液，培养条件：37℃，200rpm培养22h；
(3)种子罐培养：将步骤(2)所得到的种子液以0.1％体积比的接种量接种至装液量1.5m3的5m3的种子罐中进行培养得到成熟的种子，其中，培养温度37℃，转速150rpm，通风比1：0.8，培养周期16h，按质量体积比计，所述种子培养基包括酵母粉0.3％，蛋白胨0.8％和氯化钠1％，其余为水；
(4)发酵罐培养：以10％体积比的接种量接种成熟的种子至装液量15m3的25m3发酵罐中，发酵5小时后开始流加碳源，按质量体积比计，所述碳源为含有40％葡萄糖的培养基，其余为水；控制发酵液中葡萄糖的含量在5g/L左右，pH为7，转速200rpm，通风比1：1.2，发酵液DO为40％，发酵周期36h，然后采用板框分离除去菌体得到粗酶过滤液，将粗酶过滤液通过超滤膜浓缩系统进行浓缩，浓缩倍数为12倍，再进行冻干处理，得到固体腺苷酸脱氨酶，其中，按质量体积比计，所述发酵的培养基包括葡萄糖0.5％，蛋白胨3％，硫酸铵0.65％，氯化钙0.15％，柠檬酸钠0.2％，磷酸二氢钠1.5％，磷酸氢二钠0.5％和消泡油0.01％，其余为水。
将所得到的腺苷酸脱氨酶按照实施例2-1所述的方法进行酶活性测试，所得到的腺苷酸脱氨酶的发酵酶活为17900U/mL。
实施例2-8发酵生产腺苷酸脱氨酶
(1)菌种活化：挑选甘油管菌种在新鲜的平板培养基中30℃活化3d得到单菌落，所述平板培养基的组分和含量与实施例2-1步骤(1)中的相同；
(2)种子制备：挑选活化后的单菌落1-2个转接到装有新鲜的种子培养基(种子培养基中的组分和含量与实施例2-1步骤(2)中的相同)的三角瓶中(2000mL三角瓶装液400mL)，制备种子液，培养条件：30℃，200rpm培养24h；
(3)种子罐培养：将步骤(2)所得到的种子液以0.5％体积比的接种量接种至装液量1.5m3的5m3的种子罐中进行培养得到成熟的种子，其中，培养温度30℃，转速50rpm，通风比1：1，培养周期18h，按质量体积比计，所述种子培养基包括酵母粉0.2％，蛋白胨1.2％和氯化钠1.2％，其余为水；
(4)发酵罐培养：以10％体积比的接种量接种成熟的种子至装液量15m3的25m3发酵罐中，发酵6小时后开始流加碳源，按质量体积比计，所述碳源为含有60％葡萄糖的培养基，其余为水；控制发酵液中葡萄糖的含量在5g/L左右，pH为6.5，转速150rpm，通风比1：1，发酵液DO为60％，再发酵36h，然后采用板框分离除去菌体得到粗酶过滤液，将粗酶过滤液通过超滤膜浓缩系统进行浓缩，浓缩倍数为10倍，再进行冻干处理，得到固体腺苷酸脱氨酶，其中，按质量体积比计，所述发酵的培养基包括葡萄糖1.5％，蛋白胨2％，硫酸铵0.15％，氯化钙0.15％，柠檬酸钠0.01％，磷酸二氢钠0.5％，磷酸氢二钠1.5％和消泡油0.2％，其余为水。
将所得到的腺苷酸脱氨酶按照实施例2-1所述的方法进行酶活性测试，所得到的腺苷酸脱氨酶的发酵酶活为14800U/mL。
实施例2-9发酵生产腺苷酸脱氨酶
(1)菌种活化：挑选甘油管菌种在新鲜的平板培养基中40℃活化1d得到单菌落，所述平板培养基的组分和含量与实施例2-1步骤(1)中的相同；
(2)种子制备：挑选活化后的单菌落1-2个转接到装有新鲜的种子培养基(种子培养基中的组分和含量与实施例2-1步骤(2)中的相同)的三角瓶中(2000mL三角瓶装液400mL)，制备种子液，培养条件：40℃，200rpm培养16h；
(3)种子罐培养：将步骤(2)所得到的种子液以0.1％体积比的接种量接种至装液量1.5m3的5m3的种子罐中进行培养得到成熟的种子，其中，培养温度40℃，转速100rpm，通风比1：0.5，培养周期10h，按质量体积比计，所述种子培养基包括酵母粉0.5％，蛋白胨1.2％和氯化钠1％，其余为水；
(4)发酵罐培养：以2％体积比的接种量接种成熟的种子至装液量15m3的25m3发酵罐中，发酵3小时后开始流加碳源，按质量体积比计，所述碳源为含有50％葡萄糖的培养基，其余为水；控制发酵液中葡萄糖的含量在5g/L左右，pH为7.5，转速100rpm，通风比1：1.2，发酵液DO为50％；再发酵27h，然后采用板框分离除去菌体得到粗酶过滤液，将粗酶过滤液通过超滤膜浓缩系统进行浓缩，浓缩倍数为15倍，再进行喷粉处理，得到固体腺苷酸脱氨酶，其中，按质量体积比计，所述发酵的培养基包括葡萄糖0.5％，蛋白胨4％，硫酸铵0.3％，氯化钙0.15％，柠檬酸钠0.2％，磷酸二氢钠1.5％，磷酸氢二钠1.5％和消泡油0.2％，其余为水。
将所得到的腺苷酸脱氨酶按照实施例2-1所述的方法进行酶活性测试，所得到的腺苷酸脱氨酶的发酵酶活为15700U/mL。
实施例2-10发酵生产腺苷酸脱氨酶
(1)菌种活化：挑选甘油管菌种在新鲜的平板培养基中35℃活化2d得到单菌落，所述平板培养基的组分和含量与实施例2-1步骤(1)中的相同；
(2)种子制备：挑选活化后的单菌落1-2个转接到装有新鲜的种子培养基(种子培养基中的组分和含量与实施例2-1步骤(2)中的相同)的三角瓶中(2000mL三角瓶装液400mL)，制备种子液，培养条件：35℃，200rpm培养20h；
(3)种子罐培养：将步骤(2)所得到的种子液以0.4％体积比的接种量接种至装液量1.5m3的5m3的种子罐中进行培养得到成熟的种子，其中，培养温度33℃，转速155rpm，通风比1：0.9，培养周期12h，按质量体积比计，所述种子培养基包括酵母粉0.1％，蛋白胨0.5％和氯化钠0.5％，其余为水；
(4)发酵罐培养：以5％体积比的接种量接种成熟的种子至装液量15m3的25m3发酵罐中，发酵4小时后开始流加碳源，按质量体积比计，所述碳源为含有30％葡萄糖的培养基，其余为水；控制发酵液中葡萄糖的含量在5g/L左右，pH为7，转速200rpm，通风比1：0.5，发酵液DO为40％；再发酵34h，然后采用板框分离除去菌体得到粗酶过滤液，将粗酶过滤液通过超滤膜浓缩系统进行浓缩，浓缩倍数为8倍，再进行冻干处理，得到固体腺苷酸脱氨酶，其中，按质量体积比计，所述发酵的培养基包括葡萄糖1.5％，蛋白胨4％，硫酸铵0.65％，氯化钙0.08％，柠檬酸钠0.2％，磷酸二氢钠0.5％，磷酸氢二钠1％和消泡油0.2％，其余为水。
将所得到的腺苷酸脱氨酶按照实施例2-1所述的方法进行酶活性测试，所得到的腺苷酸脱氨酶的发酵酶活为17770U/mL。
实施例2-11发酵生产腺苷酸脱氨酶
(1)菌种活化：挑选甘油管菌种在新鲜的平板培养基中38℃活化1d得到单菌落，所述平板培养基的组分和含量与实施例2-1步骤(1)中的相同；
(2)种子制备：挑选活化后的单菌落1-2个转接到装有新鲜的种子培养基(种子培养基中的组分和含量与实施例2-1步骤(2)中的相同)的三角瓶中(2000mL三角瓶装液400mL)，制备种子液，培养条件：38℃，200rpm培养22h；
(3)种子罐培养：将步骤(2)所得到的种子液以0.3％体积比的接种量接种至装液量1.5m3的5m3的种子罐中进行培养得到成熟的种子，其中，培养温度37℃，转速200rpm，通风比1：1，培养周期14h，按质量体积比计，所述种子培养基包括酵母粉0.4％，蛋白胨1.5％和氯化钠1％，其余为水；
(4)发酵罐培养：以10％体积比的接种量接种成熟的种子至装液量15m3的25m3发酵罐中，发酵4.5小时后开始流加碳源，按质量体积比计，所述碳源为含有45％葡萄糖的培养基，其余为水；控制发酵液中葡萄糖的含量在5g/L左右，pH为7，转速140rpm，通风比1：1.2，发酵液DO为55％，发酵周期31.5h，然后采用板框分离除去菌体得到粗酶过滤液，将粗酶过滤液通过超滤膜浓缩系统进行浓缩，浓缩倍数为15倍，再进行冻干处理，得到固体腺苷酸脱氨酶，其中，按质量体积比计，所述发酵的培养基包括葡萄糖1％，蛋白胨1.5％，硫酸铵0.5％，氯化钙0.1％，柠檬酸钠0.2％，磷酸二氢钠1.5％，磷酸氢二钠1.5％和消泡油0.01％，其余为水。
将所得到的腺苷酸脱氨酶按照实施例2-1所述的方法进行酶活性测试，所得到的腺苷酸脱氨酶的发酵酶活为16527U/mL。
对比例1
(1)菌种活化：挑选甘油管菌种(野生型菌株，即实施例1中突变之前的菌株)在新鲜的平板培养基中37℃活化1d得到单菌落，所述平板培养基的组分和含量与实施例2-1步骤(1)中的相同；
(2)种子制备：挑选活化后的单菌落1-2个转接到装有新鲜的种子培养基(种子培养基中的组分和含量与实施例2-1步骤(2)中的相同)的三角瓶中(500mL三角瓶装液100mL)，制备种子液，培养条件：37℃，200rpm培养20h；
(3)种子罐培养：将步骤(2)所得到的种子液以0.1％体积比的接种量接种至装液量1L的5L的种子罐中进行培养得到成熟的种子，其中，培养温度37℃，转速200rpm，通风比1:1，培养周期12h，按质量体积比计，所述种子培养基包括酵母粉0.4％，蛋白胨1％和氯化钠1％，其余为水；
(4)发酵罐培养：以6.8％体积比的接种量接种成熟的种子至装液量25L的50L发酵罐中，发酵5小时后开始流加碳源，按质量体积比计，所述碳源为含有50％葡萄糖的培养基，其余为水；控制发酵液中葡萄糖的含量在5g/L左右，pH为7.5，转速200rpm，通风比1:0.5，发酵液DO为40％；发酵周期36h，然后采用板框分离除去菌体得到粗酶过滤液，将粗酶过滤液通过超滤膜浓缩系统进行浓缩，浓缩倍数为15倍，再进行喷粉处理，得到固体腺苷酸脱氨酶，其中，按质量体积比计，所述发酵的培养基包括葡萄糖0.5％，蛋白胨1.5％，硫酸铵0.65％，氯化钙0.15％，柠檬酸钠0.2％，磷酸二氢钠1.5％，磷酸氢二钠1.5％和消泡油0.2％，其余为水。
将所得到的腺苷酸脱氨酶按照实施例2-1所述的方法进行酶活性测试，所得到的腺苷酸脱氨酶的发酵酶活为3233U/mL。
对比例2
(1)菌种活化：挑选甘油管菌种一支，用10μL接种环挑取一环，在无菌环境中接入200gPDA培养基，置于28℃环境中培养3天，并用500mL无菌水洗脱，得到单菌落。
(2)种子制备：将单菌落按照2％的接种量接入共计2.7L的种子摇瓶培养基中，置于28℃培养22小时，得到种子菌液，其中，种子摇瓶培养基的配方同步骤(3)中种子培养基的配方。
(3)种子罐培养：按照0.3％的接种量，将种子菌液接入到装有900L种子培养基的种子罐(储存量为1吨)中培养，得到种子培养液，培养温度30℃，转速100rpm，通风比1:0.7，培养周期26小时。其中种子培养基以重量％及，由下述组分制成：黄豆汁10％，蔗糖2％，K2HP040.5％,酵母粉0.2％，其余组分为水，灭菌前调pH为6.0。
(4)发酵生产：按照6％的接种量，将种子培养液接入装有15吨发酵培养基的发酵罐(储存量为25吨)中进行培养，培养温度29℃，转速150rpm，通风比1:0.7，培养周期115小时，发酵结束后放罐测定酶活水平。其中发酵培养基以重量％计，由下述组分制成：葡萄糖3％，蛋白胨2％，三水柠檬酸二钠0.3％，MgSO4·7H2O 0.05％，微量元素母液5％，吐温-800.12％，其余组分为水，灭菌前调pH6.0。以重量％计，微量元素母液由下述组分制成：硫酸锌2％，氯化钙2％，其余为水。
(5)板框处理：采用板框过滤除去菌体得到粗酶过滤液。
(6)超滤浓缩：将粗酶过滤液通过超滤浓缩设备进行浓缩，浓缩倍数控制在10倍，得到浓缩液。
(7)冻干处理：对浓缩液通过冻干处理，得到固体脱氨酶。
将所得到的腺苷酸脱氨酶按照实施例2-1所述的方法进行酶活性测试，所得到的腺苷酸脱氨酶的发酵酶活为3466U/mL。
将对比例1和实施例2-3进行相比，其区别在于所使用的菌株不同，对比例1使用的是诱变之前的菌株，即野生型菌株，而实施例2-3所使用的菌株是诱变之后的菌株，进行液态发酵，所得到的腺苷酸脱氨酶的酶活有显著的不同，实施例2-3所得到的腺苷酸脱氨酶的酶活为14500U/mL，对比例1所得到的腺苷酸脱氨酶的酶活为3233U/mL,说明使用诱变之后的菌株所得到的腺苷酸脱氨酶的酶活性较高。
将对比例2和实施例2-3进行对比，其区别在于，液态发酵方法不同，所得到的腺苷酸脱氨酶的酶活性也不同，对比例2所得到的腺苷酸脱氨酶的酶活为3466U/mL，而实施例2-3所得到的腺苷酸脱氨酶的酶活为14500U/mL，其酶活为对比例2的4倍以上，说明本发明所述的菌株在本发明所述的发酵方法工艺条件下所得到的腺苷酸脱氨酶的酶活高。
以上所述，仅是本发明实施的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡在本发明的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等，均需要包含在本发明的保护范围之内。
Claims (46)
1.一种产腺苷酸脱氨酶的菌株，其特征在于，所述菌株为枯草芽孢杆菌菌株（Bacillus subtilis）ESP710，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2018827。
2.权利要求1所述的菌株在发酵生产腺苷酸脱氨酶中的应用。
3.一种生产腺苷酸脱氨酶的方法，其中，使用权利要求1所述的菌株进行液态发酵生产得到腺苷酸脱氨酶。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述方法包括下述步骤：
（1）菌种活化：将权利要求1所述的菌株接种在培养基中，得到活化的菌株；
（2）种子制备：将步骤（1）所得到的菌株接种到种子摇瓶培养基中进行培养，得到种子菌液；
（3）种子罐培养：将步骤（2）所得到的种子菌液接入到装有种子培养基中的种子罐中进行培养，得到种子培养液；
（4）发酵罐培养：将种子培养液接种到发酵罐中进行培养，发酵结束后得到发酵液。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，在步骤（1）中，培养温度为30-40℃。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，在步骤（1）中，培养时间为1-3天。
7.根据权利要求4所述的方法，其中，在步骤（2）中，培养温度为30-40℃。
8.根据权利要求5所述的方法，其中，在步骤（2）中，培养温度为30-40℃。
9.根据权利要求4所述的方法，其中，在步骤（2）中，培养温度为35-38℃。
10.根据权利要求4所述的方法，其中，在步骤（2）中，培养时间为16-24小时。
11.根据权利要求5所述的方法，其中，在步骤（2）中，培养时间为16-24小时。
12.根据权利要求7所述的方法，其中，在步骤（2）中，培养时间为16-24小时。
13.根据权利要求4所述的方法，其中，在步骤（2）中，培养时间为18-22小时。
14.根据权利要求4所述的方法，其中，在步骤（3）中，转速为50-150rpm。
15.根据权利要求5所述的方法，其中，在步骤（3）中，转速为50-150rpm。
16.根据权利要求7所述的方法，其中，在步骤（3）中，转速为50-150rpm。
17.根据权利要求10所述的方法，其中，在步骤（3）中，转速为50-150rpm。
18.根据权利要求4所述的方法，其中，在步骤（3）中，转速为150-200rpm。
19.根据权利要求4所述的方法，其中，在步骤（3）中，通风比为1:0.5-1:1。
20.根据权利要求5所述的方法，其中，在步骤（3）中，通风比为1:0.5-1:1。
21.根据权利要求7所述的方法，其中，在步骤（3）中，通风比为1:0.5-1:1。
22.根据权利要求10所述的方法，其中，在步骤（3）中，通风比为1:0.5-1:1。
23.根据权利要求14所述的方法，其中，在步骤（3）中，通风比为1:0.5-1:1。
24.根据权利要求4所述的方法，其中，在步骤（3）中，通风比为1:0.8-1:1。
25.根据权利要求4所述的方法，其中，在步骤（3）中，培养温度为30-40℃。
26.根据权利要求4所述的方法，其中，在步骤（3）中，培养温度为35-37℃。
27.根据权利要求4所述的方法，其中，在步骤（3）中，培养时间为10-18小时。
28.根据权利要求4所述的方法，其中，在步骤（3）中，接种量为0.1%-0.5%体积比。
29.根据权利要求4所述的方法，其中，在步骤（3）中，接种量为0.1-0.3%体积比。
30.根据权利要求4-29任一项所述的方法，其中，在步骤（4）中，转速为100-200rpm。
31.根据权利要求4-29任一项所述的方法，其中，在步骤（4）中，通风比为1:0.5-1:1.2。
32.根据权利要求4-29任一项所述的方法，其中，在步骤（4）中，通风比为1:0.8-1：2。
33.根据权利要求4-29任一项所述的方法，其中，在步骤（4）中，培养温度为30-40℃。
34.根据权利要求4-29任一项所述的方法，其中，在步骤（4）中，培养温度为35-37℃。
35.根据权利要求4-29任一项所述的方法，其中，在步骤（4）中，培养时间为30-42小时。
36.根据权利要求4-29任一项所述的方法，其中，在步骤（4）中，培养时间为34-36小时。
37.根据权利要求4-29任一项所述的方法，其中，在步骤（4）中，接种量为2%-10%体积比。
38.根据权利要求4-29任一项所述的方法，其中，在步骤（4）中，接种量为6-10%体积比。
39.根据权利要求4-29任一项所述的方法，其中，在步骤（4）中，在培养3-6小时后补加碳源。
40.根据权利要求39所述的方法，其中，按质量体积比计，所述碳源为含有30-60%葡萄糖的培养基。
41.根据权利要求4-29任一项所述的方法，其中，采用板框过滤对所得到的发酵液进行分离得到粗酶过滤液。
42.根据权利要求41所述的方法，其中，对所述的粗酶过滤液进行浓缩。
43.根据权利要求42所述的方法，其中，浓缩倍数为8-15倍，得到浓缩液。
44.根据权利要求4-29任一项所述的方法，其中，按质量体积比计，所述种子培养基包括酵母粉0.1-0.5%，蛋白胨0.5-1.5%和氯化钠0.5-1.5%，其余为水。
45.根据权利要求4-29任一项所述的方法，其中，按质量体积比计，所述发酵的培养基包括葡萄糖 0.5-1.5%，蛋白胨1.5-4%，硫酸铵0.15-0.65%，氯化钙0.01-0.15%，柠檬酸钠0.01-0.2%，磷酸二氢钠0.5-1.5%，磷酸氢二钠0.5-1.5%和消泡油0.01-0.2%，其余为水。
46.权利要求4-45任一项所述的方法发酵得到的腺苷酸脱氨酶，其中酶活为14000-18000U/mL。
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