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CN118576613A - Pnpla3表达的调节剂 - Google Patents

Pnpla3表达的调节剂 Download PDF

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CN118576613A
CN118576613A CN202410627066.7A CN202410627066A CN118576613A CN 118576613 A CN118576613 A CN 118576613A CN 202410627066 A CN202410627066 A CN 202410627066A CN 118576613 A CN118576613 A CN 118576613A
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CN
China
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compound
modified
oligonucleotide
seq
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CN202410627066.7A
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English (en)
Inventor
S·M·弗雷尔
H-H·裴
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Ionis Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Ionis Pharmaceuticals Inc
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Publication date
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Abstract

本发明涉及PNPLA3表达的调节剂。具体地，本发明提供了可用于抑制PNPLA3表达的方法、化合物、和组合物，这些方法、化合物、和组合物可用于治疗、预防、或缓解与PNPLA3相关联的疾病。

Description

PNPLA3表达的调节剂
本申请是申请日为2019年9月18目的中国专利申请201980060349.5，“PNPLA3表达的调节剂”的分案申请。
序列表
本申请连同电子格式的序列表一起提交。该序列表被提供为创建于2018年9月13日的、标题为BIOL0317USLSEQ_ST25.txt的文件，该文件大小是480kb。将电子格式的序列表的信息通过引用以其全文并入本文。
技术领域
本发明实施例提供了方法、化合物和组合物，这些方法、化合物和组合物可用于抑制PNPLA3(含有磷脂酶结构域的马铃薯糖蛋白样3；假定蛋白dJ796I17.1；脂肪营养蛋白；DJ796I17.1)表达，并且在某些情况下减少细胞或动物中PNPLA3蛋白的量，可用于治疗、预防、或缓解与PNPLA3相关联的疾病。
背景技术
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)涵盖从脂肪变性到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和肝硬化的一系列肝病。NAFLD被定义为在肝脏中脂肪堆积超过按重量计5％、缺乏显著的酒精消耗、脂肪生成药物治疗或遗传性障碍(Kotronen等人，Arterioscler Thromb.Vasc.Biol.[动脉粥样硬化、血栓形成和血管生物学]2008，28：27-38)。
非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是具有炎症和肝损伤迹象的NAFLD。NASH在组织学上通过大泡性脂肪变性、肝细胞气球样变性和小叶炎性浸润来定义(Sanyal，Hepatol.Res.[肝脏病学研究]2011.41：670-4)。据估计，NASH影响普通人群的2％-3％。在存在其他病变的情况下，如肥胖或糖尿病，估计的患病率分别增加至7％和62％(Hashimoto等人，J.Gastroenterol.[胃肠病学杂志]2011.46(1)：63-69)。
PNPLA3是含有磷脂酶结构域的马铃薯糖蛋白样家族的481个氨基酸的成员，其在ER中和在脂滴上表达。在人中，PNPLA3在肝脏中高度表达，而在脂肪组织表达低五倍(Huang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]2010.107：7892-7)。
发明内容
本文提供的某些实施例是用于减少PNPLA3 mRNA的量或降低其活性，并且在某些实施例中减少细胞或动物中PNPLA3蛋白的量的化合物和方法。在某些实施例中，该动物患有肝病。在某些实施例中，该疾病是NASH。在某些实施例中，该疾病是NAFLD。在某些实施例中，该疾病是肝性脂肪变性。在某些实施例中，该疾病是肝硬化。在某些实施例中，该疾病是肝细胞癌。在某些实施例中，该疾病是酒精性肝病。在某些实施例中，该疾病是酒精性脂肪性肝炎(ASH)。在某些实施例中，该疾病是HCV肝炎。在某些实施例中，该疾病是慢性肝炎。在某些实施例中，该疾病是遗传性血色素沉着症。在某些实施例中，该疾病是原发性硬化性胆管炎。本文提供的某些化合物涉及降低动物中肝损伤、脂肪变性、肝纤维化、肝脏炎症、肝瘢痕化或硬化、肝功能衰竭、肝肿大、转氨酶升高、或肝脏脂肪堆积的化合物和组合物。
本文提供的某些实施例涉及用于抑制PNPLA3表达的强效且可耐受的化合物和组合物，这些化合物和组合物可用于治疗、预防、缓解肝病，或减缓肝病的进展。本文提供的某些实施例涉及相比公开披露的化合物更强效或具有更高治疗价值的化合物和组合物。
具体实施方式
应理解的是，前面的概述和下面的详述两者都只是示例性和说明性的，并且不限制如所要求的实施例。在本文中，单数的使用包括复数，除非另外明确说明。如本文使用的，“或”的使用意指“和/或”，除非另外说明。此外，术语“包括(including)”以及其他形式(如“包括”(includes)和“包括”(included))的使用没有限制性。
本文使用的章节标题只是出于组织的目的，而不应被解释为限制所描述的主题。在本申请中引用的所有文献、或文献的部分(包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、论文、以及GenBank和NCBI参考序列记录)都针对本文讨论的文献的部分并且以其全文通过引用而清楚地特此结合。
应理解的是，本文包含的实例中的每个SEQ ID NO中列出的序列独立于对糖部分、核苷间连接、或核碱基的任何修饰。因此，由SEQ ID NO定义的化合物可以独立地包含对糖部分、核苷间连接、或核碱基的一种或多种修饰。通过ION编号描述的化合物指示核碱基序列、化学修饰、和基序的组合。
定义
除非另外指明，以下术语具有以下含义：
“2’-脱氧核苷”意指包含2’-H(H)呋喃糖基糖部分的核苷，如在天然存在的脱氧核糖核酸(DNA)中发现的。在某些实施例中，2’-脱氧核苷可以包含修饰的核碱基或者可以包含RNA核碱基(尿嘧啶)。
“2’-O-甲氧基乙基”(亦称2’-MOE)是指2’-O(CH2)2-OCH3)代替核糖基环的2’-OH基团。2’-O-甲氧基乙基修饰的糖是修饰的糖。
“2’-MOE核苷”(亦是2’-O-甲氧基乙基核苷)意指包含2′-MOE修饰的糖部分的核苷。
“2’-取代的核苷”或“2-修饰的核苷”意指包含2’-取代的或2’-修饰的糖部分的核苷。如本文使用的，关于糖部分的“2’-取代的”或“2-修饰的”意指包含除H或OH之外的至少一种2′-取代基基团的糖部分。
“3’靶位点”是指与特定化合物的最3’核苷酸互补的靶核酸的核苷酸。
“5’靶位点”是指与特定化合物的最5’-核苷酸互补的靶核酸的核苷酸。
“5-甲基胞嘧啶”意指具有附接至5位的甲基基团的胞嘧啶。
“约”意指在某值的±10％内。例如，如果指出“这些化合物影响PNPLA3的约70％抑制”，则暗示PNPLA3水平被抑制在60％和80％的范围内。
“施用(administration)”或“施用(administering)”是指将本文提供的化合物或组合物引入个体体内以执行其预定功能的途径。可以使用的施用途径的实例包括但不限于胃肠外施用，如皮下、静脉内、或肌内注射或输注。
“同时施用”或“共施用”意指以任何方式施用两种或更多种化合物，以此方式，两种药物的药理作用在患者体内显现。同时施用不要求以单个药物组合物、以相同剂型、通过相同施用途径、或同时施用两种化合物。两种化合物的作用本身不需要同时显现出来。这些作用仅需重叠一段时间并且不需同延。同时施用或共施用涵盖并行地或顺序地施用。
“缓解”是指相关疾病、障碍、或病症的至少一种指标、体征、或症状的改善或减轻。在某些实施例中，缓解包括病症或疾病的一种或多种指标的进展或严重性的延迟或减缓。指标的进展或严重性可以通过本领域技术人员已知的主观或客观量度来确定。
“动物”是指人或非人动物，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、狗、猫、猪、以及非人灵长类动物(包括但不限于猴和黑猩猩)。
“反义活性”意指可归因于反义化合物与其靶核酸的杂交的任何可检测的和/或可测量的活性。在某些实施例中，反义活性是与不存在靶标的反义化合物的情况下的靶核酸水平或由这样的靶核酸编码的靶蛋白水平相比，该靶核酸或该靶蛋白的量或表达降低。
“反义化合物”意指包含寡核苷酸和任选地一种或多种另外的特征(如缀合物基团或端基)的化合物。反义化合物的实例包括单链的和双链的化合物，如寡核苷酸、核糖酶、siRNA、shRNA、ssRNA、以及基于占用的化合物。
“反义抑制”意指与不存在与靶核酸互补的反义化合物的情况下的靶核酸水平相比，在存在该反义化合物的情况下的靶核酸水平的降低。
“反义机制”是涉及化合物与靶核酸的杂交的所有那些机制，其中杂交的结果或作用是靶标降解或靶标占用，同时伴随涉及例如转录或剪接的细胞机器的停转。
“反义寡核苷酸”意指具有与靶核酸或其区域或区段互补的核碱基序列的寡核苷酸。在某些实施例中，反义寡核苷酸可特异性地与靶核酸或其区域或区段杂交。
“二环核苷”或“BNA”意指包含二环糖部分的核苷。“二环糖”或“二环糖部分”意指包含两个环的经修饰的糖部分，其中第二环经由连接第一环中的原子中的两个的桥而形成，由此形成二环结构。在某些实施例中，二环糖部分的第一环是呋喃糖基部分。在某些实施例中，该二环糖部分不包括呋喃糖基部分。
“分支基团”意指具有至少3个以下位置的一组原子，这些位置能够与至少3个基团形成共价键。在某些实施例中，分支基团提供了用于经由缀合物接头和/或可切割的部分将系链配体连接至寡核苷酸的多个反应性位点。
“靶向细胞的部分”意指能够结合至一种特定细胞类型或多种特定细胞类型的缀合物基团或缀合物基团的部分。
“cEt”或“受约束的乙基”意指核糖基二环糖部分，其中该二环糖的第二环经由连接4′-碳和2′-碳的桥形成，其中该桥具有式：4′-CH(CH3)-O-2′，并且其中该桥的甲基基团是S构型。
“cEt核苷”意指包含cEt修饰的糖部分的核苷。
化合物中的“化学修饰”描述了相对于这样的单位的初始状态，通过该化合物中的任何单位的化学反应的取代或改变。“修饰的核苷”意指独立地具有修饰的糖部分和/或修饰的核碱基的核苷。“修饰的寡核苷酸”意指包含至少一种修饰的核苷间连接、修饰的糖、和/或修饰的核碱基的寡核苷酸。
“化学上不同的区域”是指化合物的在某种程度上来说与同一化合物的另一个区域在化学上不同的区域。例如，具有2’-O-甲氧基乙基核苷酸的区域在化学上不同于具有没有2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸的区域。
“嵌合反义化合物”意指具有至少2个化学上不同的区域的反义化合物，每个位置具有多个亚单位。
“可切割的键”意指能够被分离的任何化学键。在某些实施例中，可切割的键选自：酰胺、聚酰胺、酯、醚、磷酸二酯的一个酯或两个酯、磷酸酯、氨基甲酸酯、二硫化物、或肽。
“可切割的部分”意指在例如细胞、动物或人内的生理条件下被切割的键或原子基团。
关于寡核苷酸的“互补”意指当将两个核碱基序列在相反方向上进行比对时，这样的寡核苷酸或其一个或多个区域的核碱基序列匹配另一个寡核苷酸或核酸或其一个或多个区域的核碱基序列。如本文描述的，核碱基匹配或互补核碱基限于以下碱基对：腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)和尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)、以及5-甲基胞嘧啶(mC)和鸟嘌呤(G)，除非另外说明。互补寡核苷酸和/或核酸无需在每个核苷处都具有核碱基互补性，并且可以包括一个或多个核碱基错配。相比之下，关于寡核苷酸的“完全互补”或“100％互补”意指此类寡核苷酸在每个核苷处都具有核碱基匹配而没有任何核碱基错配。
“缀合物基团”意指附接至寡核苷酸的一组原子。缀合物基团包括缀合物部分和将缀合物部分附接至寡核苷酸的缀合物接头。
“缀合物接头”意指包含将缀合物部分连接至寡核苷酸的至少一个键的一组原子。
“缀合物部分”意指通过缀合物接头附接至寡核苷酸的一组原子。
在寡核苷酸的背景下，“连续”是指彼此紧邻的核苷、核碱基、糖部分、或核苷间连接。例如，“连续核碱基”意指在序列中彼此紧邻的核碱基。
“设计”或“被设计为”是指设计与所选核酸分子特异性杂交的化合物的过程。
“稀释剂”意指组合物中缺少药理活性，但是在药学上是必需的或所希望的成分。例如，注射组合物中的稀释剂可以是液体，例如盐水溶液。
“不同修饰的”意指彼此不同的化学修饰或化学取代基，包括不存在修饰。因此，例如，MOE核苷和未经修饰的DNA核苷是“不同修饰的”，虽然该DNA核苷是未经修饰的。同样地，DNA和RNA是“不同修饰的”，即使两者都是天然存在的未经修饰的核苷。除包含不同的核碱基以外相同的核苷不是不同修饰的。例如，包含2′-OMe修饰的糖和未经修饰的腺嘌呤核碱基的核苷与包含2′-OMe修饰的糖和未经修饰的胸腺嘧啶核碱基的核苷不是不同修饰的。
“剂量”意指在单次施用中、或在指定的时间段内提供的化合物或药剂的指定量。在某些实施例中，剂量可以按两个或更多个大丸剂、片剂或注射剂形式施用。例如，在某些实施例中，在希望皮下施用的情况下，所希望的剂量可以要求不是通过单次注射容易地提供的体积。在此类实施例中，可以使用两次或更多次注射达到所希望的剂量。在某些实施例中，剂量可以按两次或更多次注射施用，以使个体体内的注射部位反应最小化。在其他实施例中，经延长的时间段或连续地通过输注施用化合物或药剂。可以将剂量指明为每小时、每天、每周或每月的药剂的量。
“给药方案”是被设计为实现一种或多种所希望的效果的剂量的组合。
“双链反义化合物”意指包含两种寡聚化合物的反义化合物，这两种寡聚化合物彼此互补并且形成双链体，并且其中这两种所述寡聚化合物之一包括寡核苷酸。
“有效量”意指足以在对化合物有需要的个体体内实现所希望的生理学结果的化合物的量。有效量在个体之间可以根据有待治疗的个体的健康和身体状况、有待治疗的个体的分类群、组合物的配方、个体的医学症状的评估、以及其他相关因素而变化。
“功效”意指产生所希望的效果的能力。
“表达”包括借此以将基因的编码信息转变成存在于细胞中并且在细胞中运转的结构的所有功能。此类结构包括但不限于转录和翻译的产物。
“缺口体(Gapmer)”意指寡核苷酸，该寡核苷酸包含多个核苷的内部区域，这些核苷支持被定位在具有一个或多个核苷的外部区域之间的RNA酶H切割，其中这些包含内部区域的核苷在化学上不同于包含外部区域的该一个核苷或多个核苷。内部区域可以被称作“缺口(gap)”并且外部区域可以被称作“翼(wing)”。
“杂交”意指寡核苷酸和/或核酸的退火。虽然不局限于具体的机制，但最常见的杂交机制包括在互补核碱基之间的氢键合，所述氢键合可以是沃森-克里克(Watson-Crick)、胡斯坦(Hoogsteen)或反向胡斯坦氢键合。在某些实施例中，互补核酸分子包括但不限于反义化合物和核酸靶标。在某些实施例中，互补核酸分子包括但不限于寡核苷酸和核酸靶标。
“紧邻”意指在相同种类的紧邻元件之间不存在间插元件(例如在紧邻核碱基之间没有间插核碱基)。
“个体”意指选择用于治疗或疗法的人或非人动物。
“抑制表达或活性”是指相对于未经处理的或对照样品中的表达或活性，表达或活性的降低或阻断，并且不一定指示表达或活性的彻底消除。
“核苷间连接”意指在寡核苷酸中的相邻核苷之间形成共价连接的基团或键。“修饰的核苷间连接”意指除天然存在的、磷酸酯核苷间连接之外的任何核苷间连接。非磷酸酯连接在此意指修饰的核苷间连接。
“加长的寡核苷酸”是相对于在此披露的寡核苷酸(例如母体寡核苷酸)具有一个或多个另外的核苷的那些。
“连接的核苷”意指通过核苷间连接而连接在一起的相邻核苷。
“接头-核苷”意指将寡核苷酸连接至缀合物部分的核苷。接头-核苷位于化合物的缀合物接头内。不认为接头-核苷是化合物的寡核苷酸部分的一部分(即使它们与寡核苷酸邻接)。
“错配”或“非互补”意指当将第一和第二寡核苷酸进行比对时，该第一寡核苷酸的核碱基不与该第二寡核苷酸或靶核酸的相应核碱基互补。例如，核碱基(包括但不限于通用核碱基、肌苷、和次黄嘌呤)能够与至少一个核碱基杂交，但是相对于它所杂交的核碱基仍是错配的或非互补的。作为另一个实例，当将第一和第二寡核苷酸进行比对时，不能够杂交到该第二寡核苷酸或靶核酸的相应核碱基上的该第一寡核苷酸的核碱基是错配或非互补核碱基。
“调节”是指改变或调整细胞、组织、器官或生物体中的特征。例如，调节PNPLA3RNA可以意指升高或降低PNPLA3 RNA和/或PNPLA3蛋白在细胞、组织、器官或生物体中的水平。“调节剂”在该细胞、组织、器官或生物体中实现该改变。例如，PNPLA3化合物可以是降低细胞、组织、器官或生物体中的PNPLA3 RNA和/或PNPLA3蛋白的量的调节剂。
“MOE”意指甲氧基乙基。
“单体”是指寡聚体的单个单位。单体包括但不限于核苷和核苷酸。
“基序”意指未经修饰的和/或修饰的糖部分、核碱基、和/或核苷间连接在寡核苷酸中的模式。
“天然的”或“天然存在的”意指在自然界中发现的。
“非-二环修饰的糖”或“非二环修饰的糖部分”意指修饰的糖部分，该糖部分包含不形成该糖的两个原子之间的桥从而形成第二环的修饰(如取代)。
“核酸”是指由单体核苷酸组成的分子。核酸包括但不限于核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、单链核酸、以及双链核酸。
“核碱基”意指能够与另一个核酸的碱基配对的杂环部分。如本文使用的，“天然存在的核碱基”是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)、和鸟嘌呤(G)。“修饰的核碱基”是经化学修饰的天然存在的核碱基。“通用碱基”或“通用核碱基”是除了天然存在的核碱基和修饰的核碱基之外的核碱基，并且能够与任何核碱基配对。
“核碱基序列”意指在核酸或寡核苷酸中独立于任何糖或核苷间连接的连续核碱基的顺序。
“核苷”意指包含核碱基和糖部分的化合物。核碱基和糖部分各自独立地是未经修饰的或修饰的。“修饰的核苷”意指包含修饰的核碱基和/或修饰的糖部分的核苷。修饰的核苷包括缺少核碱基的无碱基核苷。
“寡聚化合物”意指包含单个寡核苷酸和任选地一种或多种另外的特征(如缀合物基团或端基)的化合物。
“寡核苷酸”意指连接的核苷的聚合物，这些核苷中的每个核苷都可以彼此独立地被修饰或不被修饰。除非另有说明，寡核苷酸由8-80个连接的核苷组成。“修饰的寡核苷酸”意指寡核苷酸，其中至少一个糖、核碱基、或核苷间连接是被修饰的。“未经修饰的寡核苷酸”意指不包含任何糖、核碱基、或核苷间修饰的寡核苷酸。
“母体寡核苷酸”意指其序列被用作具有类似的序列但不同的长度、基序、和/或化学的更多的寡核苷酸的设计基础的寡核苷酸。新设计的寡核苷酸可以具有与母体寡核苷酸相同的或重叠的序列。
“胃肠外施用”意指通过注射或输注施用。胃肠外施用包括皮下施用、静脉内施用、肌内施用、动脉内施用、腹膜内施用、或颅内施用(例如鞘内或脑室内施用)。
“药学上可接受的载体或稀释剂”意指适合于在施用个体中使用的任何物质。例如，药学上可接受的载体可以是无菌水溶液，如PBS或注射用水。
“药学上可接受的盐”意指化合物(如寡聚化合物或寡核苷酸)的生理学和药学上可接受的盐，即保留母体化合物的所希望的生物学活性并且不对其赋予不希望的毒理学效应的盐。
“药剂”意指当施用至个体时提供治疗益处的化合物。
“药物组合物”意指适合施用个体的物质的混合物。例如，药物组合物可以包括一种或多种化合物或其盐和无菌水溶液。
“硫代磷酸酯连接”意指修饰的磷酸酯连接，其中非桥氧原子之一被硫原子替换。硫代磷酸酯核苷间连接是修饰的核苷间连接。
“磷部分”意指包含磷原子的一组原子。在某些实施例中，磷部分包括单-、二-、或三-磷酸酯、或硫代磷酸酯。
“部分”意指核酸的限定数目的连续(即，连接的)核碱基。在某些实施例中，一个部分是靶核酸的限定数目的连续核碱基。在某些实施例中，一个部分是寡聚化合物的限定数目的连续核碱基。
“预防”是指在从数分钟到无限期的时间段内，延迟或预先阻止疾病、障碍或病症的发病、发展或进展。
“前药”意指处于身体外形式的化合物，当施用至个体时，被代谢为其身体或细胞内的另一种形式。在某些实施例中，代谢形式是该化合物(例如，药物)的具有活性、或更具活性形式。通常，通过存在于细胞或组织中的一种或多种酶(例如内源性或病毒性酶)或一种或多种化学物质的作用，和/或通过生理条件促进前药在体内的转化。
“减少”意味着降低至更小程度、规模、数量或数目。
“RefSeq No.”是分配给序列的字母和数字的唯一组合，从而表示该序列是针对特定靶转录物(例如，靶基因)。关于靶基因的这种序列和信息(统称为基因记录)可以在遗传序列数据库中找到。遗传序列数据库包括NCBI参考序列数据库、基因库、欧洲核苷酸存档、和日本DNA数据库(后三者形成国际核苷酸序列数据库合作或INSDC)。
“区域”被定义为具有至少一种可辨认的结构、功能、或特征的靶核酸部分。
“RNAi化合物”意指至少部分地通过RISC或Ago2而非通过RNA酶H起作用以调节靶核酸和/或由靶核酸编码的蛋白的反义化合物。RNAi化合物包括但不限于双链siRNA、单链RNA(ssRNA)、和微小RNA(包括微小RNA模拟物)。
“区段”被定义为核酸内的更小的区域或区域的子部分。
“副作用”意指除所希望的作用以外的可归因于治疗的生理疾病和/或病症。在某些实施例中，副作用包括注射部位反应、肝功能测试异常、肾功能异常、肝毒性、肾毒性、中枢神经系统异常、肌肉疾病、以及不适。例如，血清中的转氨酶水平增加可以指示肝毒性或肝功能异常。例如，胆红素增加可以指示肝毒性或肝功能异常。
关于化合物的“单链的”意指该化合物仅具有一种寡核苷酸。“自我互补”意指寡核苷酸至少部分地与其自身杂交。由一种寡核苷酸组成的化合物(其中该化合物的寡核苷酸是自我互补的)是单链化合物。单链的化合物能够与互补化合物结合，以形成双链体。
“位点”被定义为靶核酸内的独特核碱基位置。
“可特异性杂交”是指寡核苷酸在该寡核苷酸与靶核酸之间具有足够的互补程度以诱导所希望的效应，同时对非靶核酸展现出最小效应或没有效应。在某些实施例中，特异性杂交在生理条件下发生。
关于靶核酸的“特异性抑制”意指，当对非靶核酸展示出较少、最低、或无影响时，减少或阻断靶核酸的表达。减少并不一定表明完全消除了靶核酸的表达。
“标准细胞测定”意指在实例中描述的一种或多种测定及其合理变化。
“标准体内实验”意指一个或多个实例中描述的一个或多个程序及其合理变化。
在具有同一分子式的分子群体的背景下，“立体随机手性中心(Stereorandomchiral center)”是指具有随机立体化学构型的手性中心。例如，在包含立体随机手性中心的分子群体中，具有立体随机手性中心的(S)构型的分子的数量可以但不一定与具有立体随机手性中心的(R)构型的分子的数量相同。当手性中心的立体化学构型是未设计用于控制立体化学构型的合成方法的结果时，其被认为是随机的。在某些实施例中，立体随机手性中心是立体随机硫代磷酸酯核苷间连接。
“糖部分”意指未经修饰的糖部分或经修饰的糖部分。“未经修饰的糖部分”或“未经修饰的糖”意指如在RNA中发现的2’-OH(H)核糖基部分(“未经修饰的RNA糖部分”)或如在DNA中发现的2'-H(H)部分(“未经修饰的DNA糖部分”)。“修饰的糖部分”或“修饰的糖”意指修饰的呋喃糖基糖部分或糖代用品。“修饰的呋喃糖基糖部分”意指呋喃糖基糖，其包含代替未经修饰的糖部分的至少一个氢或羟基的非氢取代基。在某些实施例中，修饰的呋喃糖基糖部分是2’-取代的糖部分。此类修饰的呋喃糖基糖部分包括二环糖和非二环糖。
“糖代用品”意指具有不同于呋喃糖基部分的修饰的糖部分，该修饰的糖部分可以将核碱基连接至另一个基团(如寡核酸中的核苷间连接、缀合物基团、或端基)。包含糖代用品的修饰的核苷可以掺入到寡核苷酸内的一个或多个位置，并且此类寡核苷酸能够与互补化合物或核酸杂交。
“协同作用(synergy)”或“起协同作用(synergize)”是指组合的效果大于在相同剂量下单独各组分的作用的相加。
“PNPLA3”意指PNPLA3的任何核酸或蛋白质。“PNPLA3核酸”意指编码PNPLA3的任何核酸。例如，在某些实施例中，PNPLA3核酸包括编码PNPLA3的DNA序列、从编码PNPLA3的DNA(包括含有内含子和外显子的基因组DNA)转录的RNA序列、以及编码PNPLA3的mRNA序列。“PNPLA3 mRNA”意指编码PNPLA3蛋白的mRNA。靶标可以用大写字母或小写字母来表示。
“PNPLA3特异性抑制剂”是指能够在分子水平上特异性地抑制PNPLA3 RNA和/或PNPLA3蛋白的表达或活性的任何试剂。例如，PNPLA3特异性抑制剂包括能够抑制PNPLA3RNA和/或PNPLA3蛋白表达的核酸(包括反义化合物)、肽、抗体、小分子、以及其他试剂。
“靶基因”是指编码靶标的基因。
“靶向”意指化合物与靶核酸的特异性杂交以便引起所希望的效果。
“靶核酸”、“靶RNA”、“靶RNA转录物”以及“核酸靶标”全部意指能够被本文描述的化合物靶向的核酸。
“靶区域”意指一种或多种化合物所靶向的靶核酸部分。
“靶区段”意指化合物所靶向的靶核酸的核苷酸序列。“5’靶位点”是指靶区段的最5’核苷酸。“3’靶位点”是指靶区段的最3’核苷酸。
“端基”意指共价地连接至寡核苷酸的末端的化学基团或一组原子。
“治疗有效量”意指为个体提供治疗益处的化合物、药剂、或组合物。
“治疗”是指向动物施用化合物或药物组合物，以便实现该动物的疾病、障碍或病症的改变或改善。
某些实施例
某些实施例提供了用于抑制PNPLA3(PNPLA3)表达的方法、化合物和组合物。
某些实施例提供了靶向PNPLA3核酸的化合物。在某些实施例中，该PNPLA3核酸具有在以下各项中列出的序列：RefSeq或基因库登录号NM_025225.2(通过引用并入，在本文中被披露为SEQ ID NO：1)；从核苷酸43921001至43954500截短的NC_000022.11(通过引用并入，在本文中被披露为SEQ ID NO：2)；AK123806.1(通过引用并入，在本文中被披露为SEQID NO：3)；BQ686328.1(通过引用并入，在本文中被披露为SEQ ID NO：4)；BF762711.1(通过引用并入，在本文中被披露为SEQ ID NO：5)；DA290491.1(通过引用并入，在本文中被披露为SEQ ID NO：6)；以及列出为SEQ ID No 7、8、9、和10的序列。在某些实施例中，该化合物是反义化合物或寡聚化合物。在某些实施例中，该化合物是单链的。在某些实施例中，该化合物是双链的。
在某些实施例中，该化合物包含长16个连接的核苷的、修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，该化合物是反义化合物或寡聚化合物。
某些实施例提供了包含修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸长12至30个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO：17-2169中任一项的核碱基序列的核碱基序列。在某些实施例中，该化合物是反义化合物或寡聚化合物。在某些实施例中，该化合物是单链的。在某些实施例中，该化合物是双链的。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸长16至30个连接的核苷。
某些实施例提供了包含修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由SEQ IDNO：17-2169中任一项的核碱基序列组成。在某些实施例中，该化合物是反义化合物或寡聚化合物。在某些实施例中，该化合物是单链的。在某些实施例中，该化合物是双链的。
某些实施例提供了包含修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸长12至30个连接的核苷，并且在SEQ ID NO：2的核碱基5567-5642、5644-5731、5567-5731、5567-5620、13697-13733、20553-20676、20664-20824、20553-20824、和25844-25912中是互补的，其中所述修饰的寡核苷酸与SEQ ID NO：2是至少85％、至少90％、至少95％、或100％互补的。在某些实施例中，该化合物是反义化合物或寡聚化合物。在某些实施例中，该化合物是单链的。在某些实施例中，该化合物是双链的。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸长16至30个连接的核苷。
在某些实施例中，化合物靶向PNPLA3核酸的核苷酸5567-5620。在某些实施例中，化合物靶向具有SEQ ID NO：2的核碱基序列的PNPLA3核酸的核苷酸5567-5642、5644-5731、5567-5731、5567-5620内。在某些实施例中，化合物具有至少8、9、10、11、12、13、14、15、或16个连续的核碱基部分，该部分与具有SEQ ID NO：2的核碱基序列的PNPLA3核酸的核苷酸5567-5642、5644-5731、5567-5731、5567-5620内的等长部分互补。在某些实施例中，这些化合物是反义化合物、寡聚化合物、或寡核苷酸。
在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸长12至30个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO：1089、1757、141、1982、330、1665、408、830、和899中任一项的至少8、9、10、11、12、13、14、15、或16个连续核碱基部分的核碱基序列。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸长16至30个连接的核苷。
在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸长12至30个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO：1089、1757、141、1982、330、1665、408、830、和899中任一项的核碱基序列。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸长16至30个连接的核苷。
在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸具有由SEQ IDNO：1089、1757、141、1982、330、1665、408、830、和899中任一项组成的核碱基序列。
在某些实施例中，靶向PNPLA3的化合物是ION 975616、994284、975605、994282、975613、975617、975735、975736、或975612。在如以下实例部分中所述而筛选的超过2,384种化合物中，ION 975616、994284、975605、994282、975613、975617、975735、975736、和975612作为靠前的先导化合物出现。
在某些实施例中，上述修饰的寡核苷酸中任一种包含至少一种修饰的核苷间连接、至少一种修饰的糖、和/或至少一种修饰的核碱基。
在某些实施例中，上述修饰的寡核苷酸中任一种包含至少一种修饰的糖。在某些实施例中，至少一种修饰的糖包含2’-O-甲氧基乙基基团。在某些实施例中，至少一种修饰的糖是二环糖，如4’-CH(CH3)-O-2’基团、4’-CH2-O-2’基团、或4’-(CH2)2-O-2’基团。
在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸包含至少一种修饰的核苷间连接，如硫代磷酸酯核苷间连接。
在某些实施例中，上述修饰的寡核苷酸中任一种包含至少一种修饰的核碱基，如5-甲基胞嘧啶。
在某些实施例中，上述修饰的寡核苷酸中的任一种包含：
由连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由连接的核苷组成的5’翼区段；以及
由连接的核苷组成的3’翼区段；
其中该缺口区段位于该5’翼区段与该3’翼区段之间并且其中每个翼区段的每个核苷包含修饰的糖。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸长12至30个连接的核苷，并且具有包含SEQ ID NO：1089、1757、141、1982、330、1665、408、830、和899中任一项列举的序列的核碱基序列。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸长16至30个连接的核苷，并且具有包含SEQID NO：1089、1757、141、1982、330、1665、408、830、和899中任一项列举的序列的核碱基序列。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸长16个连接的核苷，并且具有由SEQ ID NO：1089、1757、141、1982、330、1665、408、830、和899中任一项列举的序列组成的核碱基序列。
在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸或由其组成，该修饰的寡核苷酸长12-30个连接的核碱基并且具有包含SEQ ID NO：1089、1757、141、1982、330、1665、408、830、和899中任一项列举的序列的核碱基序列，其中该修饰的寡核苷酸包含
由十个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由三个连接的核苷组成的5’翼区段；以及
由三个连接的核苷组成的3’翼区段；
其中该缺口区段位于该5’翼区段与该3’翼区段之间，其中每个翼区段的每个核苷包含cEt糖；其中每个核苷间连接都是硫代磷酸酯连接并且其中每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由16-30个连接的核苷组成。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由16个连接的核苷组成。
在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸或由其组成，其中该修饰的寡核苷酸长16个连接的核苷并且由SEQ ID NO：1089的序列组成，其中该修饰的寡核苷酸包含：
由十个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由三个连接的核苷组成的5’翼区段；以及
由三个连接的核苷组成的3’翼区段；
其中该缺口区段位于该5’翼区段与该3’翼区段之间，其中每个翼区段的每个核苷包含cEt糖；其中每个核苷间连接都是硫代磷酸酯连接；并且其中每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施例中，化合物由修饰的寡核苷酸和缀合物基团组成，其中该修饰的寡核苷酸长16个连接的核苷并且由SEQ ID NO：1089的序列组成，其中该修饰的寡核苷酸包含：
由十个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由三个连接的核苷组成的5’翼区段；以及
由三个连接的核苷组成的3’翼区段；
其中该缺口区段位于该5’翼区段与该3’翼区段之间，其中每个翼区段的每个核苷包含cEt糖；其中每个核苷间连接都是硫代磷酸酯连接；其中每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶；并且其中该缀合物基团位于该修饰的寡核苷酸的5’端，并且是
在某些实施例中，化合物包含ION 916333或其盐或由它们组成，该ION 916333或其盐具有以下化学结构：
在某些实施例中，化合物包含ION 975616或其盐或由它们组成，该ION 975616或其盐具有以下化学结构：
在某些实施例中，化合物包含975616的钠盐或由其组成，该975616的钠盐具有以下化学结构：
在某些实施例中，化合物包含ION 975613或其盐或由它们组成，该ION 975613或其盐具有以下化学结构：
在某些实施例中，化合物包含975613的钠盐或由其组成，该975613的钠盐具有以下化学结构：
在某些实施例中，化合物包含ION 975612或其盐或由它们组成，该ION 975612或其盐具有以下化学结构：
在某些实施例中，化合物包含975612的钠盐或由其组成，该975612的钠盐具有以下化学结构：
在某些实施例中，化合物包含ION 916789或其盐或由它们组成，该ION 916789或其盐具有以下化学结构：
在某些实施例中，化合物包含916789的钠盐或由其组成，该916789的钠盐具有以下化学结构：
在某些实施例中，化合物包含ION 916602或其盐或由它们组成，该ION 916602或其盐具有以下化学结构：
在某些实施例中，化合物包含916602的钠盐或由其组成，该916602的钠盐具有以下化学结构：
在上述实施例的任一项中，该化合物或寡核苷酸可以与编码PNPLA3的核酸是至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、或100％互补的。
在上述实施例的任一项中，该化合物可以是单链的。在某些实施例中，该化合物包含脱氧核糖核苷酸。在某些实施例中，该化合物是双链的。在某些实施例中，该化合物是双链的并且包含核糖核苷酸。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是反义化合物或寡聚化合物。
在上述实施例的任一项中，该化合物的长度可以是8至80、10至30、12至50、13至30、13至50、14至30、14至50、15至30、15至50、16至30、16至50、17至30、17至50、18至22、18至24、18至30、18至50、19至22、19至30、19至50、或20至30个连接的核苷。在某些实施例中，该化合物包含寡核苷酸或由其组成。
在某些实施例中，化合物包含本文描述的修饰的寡核苷酸、和缀合物基团。在某些实施例中，该缀合物基团在该修饰的寡核苷酸的5’端连接至该修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，该缀合物基团在该修饰的寡核苷酸的3’端连接至该修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，该缀合物基团包括至少一个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、至少两个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、或至少三个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。
在某些实施例中，本文提供的化合物或组合物包含该修饰的寡核苷酸的药学上可接受的盐。在某些实施例中，该盐是钠盐。在某些实施例中，该盐是钾盐。
在某些实施例中，如本文描述的化合物或组合物由于具有小于2μM、小于1.5μM、小于1μM、小于0.9μM、小于0.8μM、小于0.7μM、小于0.6μM、小于0.5μM、小于0.4μM、小于0.3μM、小于0.2μM、小于0.1μM、小于0.05μM、小于0.04μM、小于0.03μM、小于0.02μM、或小于0.01μM的体外IC50中的至少之一而是有活性的。
在某些实施例中，如本文描述的化合物或组合物是可高度耐受的，如通过具有相对于对照动物丙氨酸转氨酶(ALT)或天冬氨酸转氨酶(AST)值不超过4倍、3倍、或2倍的增加，或与对照动物相比肝、脾、或肾重量不超过30％、20％、15％、12％、10％、5％、或2％的增加中至少一者所证明的。在某些实施例中，如本文描述的化合物或组合物是可高度耐受的，如通过相对于对照动物ALT或AST没有增加所证明的。在某些实施例中，如本文描述的化合物或组合物是可高度耐受的，如通过相对于对照动物肝、脾、或肾重量没有增加所证明的。
某些实施例提供了组合物，该组合物包含前述提及的实施例中任一项所述的化合物或其任一种药学上可接受的盐以及至少一种药学上可接受的载体或稀释剂。在某些实施例中，该组合物具有小于约40厘泊(cP)、小于约30厘泊(cP)、小于约20厘泊(cP)、小于约15厘泊(cP)、或小于约10厘泊(cP)的黏度。在某些实施例中，具有前述提及的黏度中任一种的组合物包含约100mg/mL、约125mg/mL、约150mg/mL、约175mg/mL、约200mg/mL、约225mg/mL、约250mg/mL、约275mg/mL、或约300mg/mL浓度的本文提供的化合物。在某些实施例中，具有前述提及的粘度和/或化合物浓度中任一种的组合物的温度为室温或约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、或约30℃。
某些适应症
本文提供的某些实施例涉及抑制PNPLA3表达的方法，该方法通过施用靶向PNPLA3的化合物，可用于治疗、预防、或缓解个体中与PNPLA3相关联的疾病。在某些实施例中，该化合物可以是PNPLA3特异性抑制剂。在某些实施例中，该化合物可以是靶向PNPLA3的反义化合物、寡聚化合物、或寡核苷酸。
使用本文提供的方法可治疗的、可预防的、和/或可改善的与PNPLA3相关联的疾病的实例包括肝病，NAFLD、肝性脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、肝细胞癌、酒精性肝病、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、HCV肝炎、慢性肝炎、遗传性血色素沉着症、或原发性硬化性胆管炎。本文提供的某些化合物涉及降低动物中肝损伤、脂肪变性、肝纤维化、肝脏炎症、肝瘢痕化或硬化、肝功能衰竭、肝肿大、转氨酶升高、或肝脏脂肪堆积的化合物和组合物。
在某些实施例中，治疗、预防、或缓解个体中与PNPLA3相关联的疾病的方法包括向个体施用包含PNPLA3特异性抑制剂的化合物，从而治疗、预防、或缓解疾病。在某些实施例中，该个体被鉴定为患有与PNPLA3相关联的疾病或处于患该疾病的风险中。在某些实施例中，该疾病是肝病。在某些实施例中，该化合物包含靶向PNPLA3的反义化合物。在某些实施例中，该化合物包含靶向PNPLA3的寡核苷酸。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸长12至30个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO：17-2169的核碱基序列中任一项的至少8个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸长12至30个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO：17-2169中任一项的核碱基序列的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸由SEQ ID NO：17-2169中任一项的核碱基序列组成。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸长16至30个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO：1089、1757、141、1982、330、1665、408、830、和899中任一项的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸具有由SEQ ID NO：1089、1757、141、1982、330、1665、408、830、和899中任一项组成的核碱基序列。在某些实施例中，该化合物是ION975616、994284、975605、994282、975613、975617、975735、975736、或975612。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是单链或双链的。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是反义化合物或寡聚化合物。在某些实施例中，将该化合物胃肠外地施用至个体。在某些实施例中，施用该化合物改善、维持、或预防动物中肝损伤、脂肪变性、肝纤维化、肝硬化、转氨酶升高、或肝脏脂肪堆积。
在某些实施例中，治疗、预防、或缓解动物中肝损伤、脂肪变性、肝纤维化、肝脏炎症、肝瘢痕化或硬化、肝功能衰竭、肝肿大、转氨酶升高、或肝脏脂肪堆积的方法包括向个体施用包含PNPLA3特异性抑制剂的化合物，从而治疗、预防、或缓解肝损伤、脂肪变性、肝纤维化、肝脏炎症、肝瘢痕化或硬化、肝功能衰竭、肝肿大、转氨酶升高、或肝脏脂肪堆积。在某些实施例中，该化合物包含靶向PNPLA3的反义化合物。在某些实施例中，该化合物包含靶向PNPLA3的寡核苷酸。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸长12至30个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO：17-2169的核碱基序列中任一项的至少8个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸长12至30个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO：17-2169中任一项的核碱基序列的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸由SEQ ID NO：17-2169中任一项的核碱基序列组成。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸长16至30个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO：1089、1757、141、1982、330、1665、408、830、和899中任一项的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸具有由SEQ ID NO：1089、1757、141、1982、330、1665、408、830、和899中任一项组成的核碱基序列。在某些实施例中，该化合物是ION 975616、994284、975605、994282、975613、975617、975735、975736、或975612。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是单链或双链的。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是反义化合物或寡聚化合物。在某些实施例中，将该化合物胃肠外地施用至个体。在某些实施例中，施用该化合物改善、维持、或预防肝损伤、脂肪变性、肝纤维化、肝脏炎症、肝瘢痕化或硬化、肝功能衰竭、肝肿大、转氨酶升高、或肝脏脂肪堆积。在某些实施例中，该个体被鉴定为患有与PNPLA3相关联的疾病或处于患该疾病的风险中。
在某些实施例中，在患有与PNPLA3相关联的疾病或处于患该疾病的风险中的个体中抑制PNPLA3表达的方法包括向该个体施用包含PNPLA3特异性抑制剂的化合物，从而在个体中抑制PNPLA3的表达。在某些实施例中，施用该化合物抑制肝中PNPLA3的表达。在某些实施例中，该疾病是肝病。在某些实施例中，该个体患有以下疾病或处于患以下疾病的风险中：NAFLD、肝性脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、肝细胞癌、酒精性肝病、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、HCV肝炎、慢性肝炎、遗传性血色素沉着症、或原发性硬化性胆管炎。在某些实施例中，该个体患有以下疾病或处于患以下疾病的风险中：肝损伤、脂肪变性、肝纤维化、肝脏炎症、肝瘢痕化或硬化、肝功能衰竭、肝肿大、转氨酶升高、或肝脏脂肪堆积。在某些实施例中，该化合物包含靶向PNPLA3的反义化合物。在某些实施例中，该化合物包含靶向PNPLA3的寡核苷酸。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸长12至30个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO：17-2169的核碱基序列中任一项的至少8个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸长12至30个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO：17-2169中任一项的核碱基序列的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸由SEQ ID NO：17-2169中任一项的核碱基序列组成。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸长16至30个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO：1089、1757、141、1982、330、1665、408、830、和899中任一项的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸具有由SEQ ID NO：1089、1757、141、1982、330、1665、408、830、和899中任一项组成的核碱基序列。在某些实施例中，该化合物是ION 975616、994284、975605、994282、975613、975617、975735、975736、或975612。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是单链或双链的。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是反义化合物或寡聚化合物。在某些实施例中，将该化合物胃肠外地施用至个体。在某些实施例中，施用该化合物改善、维持、或预防肝损伤、脂肪变性、肝纤维化、肝脏炎症、肝瘢痕化或硬化、肝功能衰竭、肝肿大、转氨酶升高、或肝脏脂肪堆积。
在某些实施例中，抑制细胞中PNPLA3表达的方法包括用包含PNPLA3特异性抑制剂的化合物接触细胞，从而抑制细胞中PNPLA3的表达。在某些实施例中，该细胞是肝细胞。在某些实施例中，该细胞在肝中。在某些实施例中，该细胞是在个体的肝中，该个体患有以下疾病或处于患以下疾病的风险中：肝损伤、脂肪变性、肝纤维化、肝脏炎症、肝瘢痕化或硬化、肝功能衰竭、肝肿大、转氨酶升高、或肝脏脂肪堆积。在某些实施例中，该化合物包含靶向PNPLA3的反义化合物。在某些实施例中，该化合物包含靶向PNPLA3的寡核苷酸。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸长12至30个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO：17-2169的核碱基序列中任一项的至少8个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸长12至30个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO：17-2169中任一项的核碱基序列的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸由SEQ ID NO：17-2169中任一项的核碱基序列组成。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸长16至30个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO：1089、1757、141、1982、330、1665、408、830、和899中任一项的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸具有由SEQID NO：1089、1757、141、1982、330、1665、408、830、和899中任一项组成的核碱基序列。在某些实施例中，该化合物是ION 975616、994284、975605、994282、975613、975617、975735、975736、或975612。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是单链或双链的。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是反义化合物或寡聚化合物。
在某些实施例中，在患有与PNPLA3相关联的疾病或处于患该疾病的风险中的个体中减少或抑制肝损伤、脂肪变性、肝纤维化、肝脏炎症、肝瘢痕化或硬化、肝功能衰竭、肝肿大、转氨酶升高、或肝脏脂肪堆积的方法包括向个体施用包含PNPLA3特异性抑制剂的化合物，从而减少或抑制个体的肝损伤、脂肪变性、肝纤维化、肝脏炎症、肝瘢痕化或硬化、肝功能衰竭、肝肿大、转氨酶升高、或肝脏脂肪堆积。在某些实施例中，该个体患有以下疾病或处于患以下疾病的风险中：NAFLD、肝性脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、肝细胞癌、酒精性肝病、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、HCV肝炎、慢性肝炎、遗传性血色素沉着症、或原发性硬化性胆管炎。在某些实施例中，该化合物包含靶向PNPLA3的反义化合物。在某些实施例中，该化合物包含靶向PNPLA3的寡核苷酸。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸长12至30个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO：17-2169的核碱基序列中任一项的至少8个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸长12至30个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO：17-2169中任一项的核碱基序列的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸由SEQ ID NO：17-2169中任一项的核碱基序列组成。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸长16至30个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO：1089、1757、141、1982、330、1665、408、830、和899中任一项的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸具有由SEQ ID NO：1089、1757、141、1982、330、1665、408、830、和899中任一项组成的核碱基序列。在某些实施例中，该化合物是ION975616、994284、975605、994282、975613、975617、975735、975736、或975612。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是单链或双链的。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是反义化合物或寡聚化合物。在某些实施例中，将该化合物胃肠外地施用至个体。在某些实施例中，该个体被鉴定为患有与PNPLA3相关联的疾病或处于患该疾病的风险中。
某些实施例涉及包含PNPLA3特异性抑制剂的化合物，该化合物用于在治疗与PNPLA3相关联的疾病中使用。在某些实施例中，该疾病是NAFLD、肝性脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、肝细胞癌、酒精性肝病、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、HCV肝炎、慢性肝炎、遗传性血色素沉着症、或原发性硬化性胆管炎。在某些实施例中，该化合物包含靶向PNPLA3的反义化合物。在某些实施例中，该化合物包含靶向PNPLA3的寡核苷酸。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸长12至30个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO：17-2169的核碱基序列中任一项的至少8个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸长12至30个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO：17-2169中任一项的核碱基序列的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸由SEQ ID NO：17-2169中任一项的核碱基序列组成。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸长16至30个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO：1089、1757、141、1982、330、1665、408、830、和899中任一项的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸具有由SEQ IDNO：1089、1757、141、1982、330、1665、408、830、和899中任一项组成的核碱基序列。在某些实施例中，该化合物是ION 975616、994284、975605、994282、975613、975617、975735、975736、或975612。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是单链或双链的。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是反义化合物或寡聚化合物。在某些实施例中，将该化合物胃肠外地施用至个体。
某些实施例涉及包含PNPLA3特异性抑制剂的化合物，该化合物用于在个体中减少或抑制肝损伤、脂肪变性、肝纤维化、肝脏炎症、肝瘢痕化或硬化、肝功能衰竭、肝肿大、转氨酶升高、或肝脏脂肪堆积，该个体患有以下疾病或处于患以下疾病的风险中：NAFLD、肝性脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、肝细胞癌、酒精性肝病、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、HCV肝炎、慢性肝炎、遗传性血色素沉着症、或原发性硬化性胆管炎。在某些实施例中，该化合物包含靶向PNPLA3的反义化合物。在某些实施例中，该化合物包含靶向PNPLA3的寡核苷酸。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸长12至30个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO：17-2169的核碱基序列中任一项的至少8个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸长12至30个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO：17-2169中任一项的核碱基序列的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸由SEQ ID NO：17-2169中任一项的核碱基序列组成。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸长16至30个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO：1089、1757、141、1982、330、1665、408、830、和899中任一项的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸具有由SEQ ID NO：1089、1757、141、1982、330、1665、408、830、和899中任一项组成的核碱基序列。在某些实施例中，该化合物是ION 975616、994284、975605、994282、975613、975617、975735、975736、或975612。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是单链或双链的。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是反义化合物或寡聚化合物。
某些实施例涉及包含PNPLA3特异性抑制剂的化合物用于生产或制备用于治疗与PNPLA3相关联的疾病的药物的用途。某些实施例涉及包含PNPLA3特异性抑制剂的化合物用于制备用于治疗与PNPLA3相关联的疾病的药物的用途。在某些实施例中，该疾病是肝病。在某些实施例中，该疾病是NAFLD、肝性脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、肝细胞癌、酒精性肝病、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、HCV肝炎、慢性肝炎、遗传性血色素沉着症、或原发性硬化性胆管炎。在某些实施例中，该化合物包含靶向PNPLA3的反义化合物。在某些实施例中，该化合物包含靶向PNPLA3的寡核苷酸。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸长12至30个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO：17-2169的核碱基序列中任一项的至少8个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸长12至30个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO：17-2169中任一项的核碱基序列的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸由SEQ ID NO：17-2169中任一项的核碱基序列组成。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸长16至30个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO：1089、1757、141、1982、330、1665、408、830、和899中任一项的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸具有由SEQ ID NO：1089、1757、141、1982、330、1665、408、830、和899中任一项组成的核碱基序列。在某些实施例中，该化合物是ION975616、994284、975605、994282、975613、975617、975735、975736、或975612。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是单链或双链的。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是反义化合物或寡聚化合物。
某些实施例涉及在患有与PNPLA3相关联的肝病或处于患该病的风险中的个体中，包含PNPLA3特异性抑制剂的化合物用于生产或制备用于减少或抑制肝损伤、脂肪变性、肝纤维化、肝脏炎症、肝瘢痕化或硬化、肝功能衰竭、肝肿大、转氨酶升高、或肝脏脂肪堆积的药物中的用途。在某些实施例中，该肝病是NAFLD、肝性脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、肝细胞癌、酒精性肝病、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、HCV肝炎、慢性肝炎、遗传性血色素沉着症、或原发性硬化性胆管炎。某些实施例涉及包含PNPLA3特异性抑制剂的化合物用于制备用于治疗与PNPLA3相关联的疾病的药物的用途。在某些实施例中，该疾病是NAFLD、肝性脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、肝细胞癌、酒精性肝病、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、HCV肝炎、慢性肝炎、遗传性血色素沉着症、或原发性硬化性胆管炎。在某些实施例中，该化合物包含靶向PNPLA3的反义化合物。在某些实施例中，该化合物包含靶向PNPLA3的寡核苷酸。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸长12至30个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO：17-2169的核碱基序列中任一项的至少8个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸长12至30个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO：17-2169中任一项的核碱基序列的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸由SEQ ID NO：17-2169中任一项的核碱基序列组成。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸长16至30个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO：1089、1757、141、1982、330、1665、408、830、和899中任一项的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸具有由SEQ ID NO：1089、1757、141、1982、330、1665、408、830、和899中任一项组成的核碱基序列。在某些实施例中，该化合物是ION 975616、994284、975605、994282、975613、975617、975735、975736、或975612。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是单链或双链的。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是反义化合物或寡聚化合物。
在上述方法或用途的任一项中，该化合物可以靶向PNPLA3。在某些实施例中，该化合物包含修饰的寡核苷酸或由其组成，例如，修饰的寡核苷酸长8至80个连接的核苷、10至30个连接的核苷、12至30个连接的核苷、或20个连接的核苷。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸与SEQ ID NO：1-10中列举的核碱基序列中任一项是至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％互补的。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸包含至少一种修饰的核苷间连接、至少一种修饰的糖和/或至少一种修饰的核碱基。在某些实施例中，该修饰的核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接，该修饰的糖是二环糖或2’-O-甲氧基乙基修饰的糖，并且该修饰的核碱基是5-甲基胞嘧啶。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸包含由连接的脱氧核苷组成的缺口区段；由连接的核苷组成的5’翼区段；和由连接的核苷组成的3’翼区段，其中该缺口区段被定位成紧邻该5’翼区段和该3’翼区段并且位于它们之间，并且其中每个翼区段的每个核苷都包括修饰的糖。
在任何上述实施例中，该修饰的寡核苷酸长12至30、15至30、15至25、15至24、16至24、17至24、18至24、19至24、20至24、19至22、20至22、16至20、或16个或20个连接的核苷。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸与SEQ ID NO：1-10中列举的核碱基序列中任一项是至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％互补的。
在上述方法或用途的任一项中，该化合物包含修饰的寡核苷酸或由其组成，该修饰的寡核苷酸长16至30个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO：17-2169中的任一项的核碱基序列，其中该修饰的寡核苷酸包含：
由连接的2’-脱氧核苷组成的缺口区段；
由连接的核苷组成的5’翼区段；以及
由连接的核苷组成的3’翼区段；
其中该缺口区段位于该5’翼区段与该3’翼区段之间并且其中每个翼区段的每个核苷包含修饰的糖。
在上述方法或用途的任一项中，该化合物包含修饰的寡核苷酸或由其组成，该修饰的寡核苷酸长16个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO：1089、1757、141、1982、330、1665、408、830、和899中任一项列举的序列的核碱基序列，其中该修饰的寡核苷酸包含
由十个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由三个连接的核苷组成的5’翼区段；以及
由三个连接的核苷组成的3’翼区段；
其中该缺口区段位于该5’翼区段与该3’翼区段之间，其中每个翼区段的每个核苷包含cEt糖；其中每个核苷间连接都是硫代磷酸酯连接并且其中每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸长16-30个连接的核苷。
在某些实施例中，化合物包含ION 916333或其盐或由它们组成，该ION 916333或其盐具有以下化学结构：
在某些实施例中，化合物包含ION 975616或其盐或由它们组成，该ION 975616或其盐具有以下化学结构：
在某些实施例中，化合物包含975616的钠盐或由其组成，该975616的钠盐具有以下化学结构：
在某些实施例中，化合物包含ION 975613或其盐或由它们组成，该ION 975613或其盐具有以下化学结构：
在某些实施例中，化合物包含975613的钠盐或由其组成，该975613的钠盐具有以下化学结构：
在某些实施例中，化合物包含ION 975612或其盐或由它们组成，该ION 975612或其盐具有以下化学结构：
在某些实施例中，化合物包含975612的钠盐或由其组成，该975612的钠盐具有以下化学结构：
在某些实施例中，化合物包含ION 916789或其盐或由它们组成，该ION 916789或其盐具有以下化学结构：
在某些实施例中，化合物包含916789的钠盐或由其组成，该916789的钠盐具有以下化学结构：
在某些实施例中，化合物包含ION 916602或其盐或由它们组成，该ION 916602或其盐具有以下化学结构：
在某些实施例中，化合物包含916602的钠盐或由其组成，该916602的钠盐具有以下化学结构：
在上述方法或用途的任一项中，可以将该化合物胃肠外地施用。例如，在某些实施例中，可以将该化合物通过注射或输注施用。胃肠外施用包括皮下施用、静脉内施用、肌内施用、动脉内施用、腹膜内施用、或颅内施用(例如鞘内或脑室内施用)。
某些化合物
在某些实施例中，本文描述的化合物可以是反义化合物。在某些实施例中，该反义化合物包括寡聚化合物或由其组成。在某些实施例中，该寡聚化合物包括修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸具有与靶核酸的核碱基序列互补的核碱基序列。
在某些实施例中，本文描述的化合物包括修饰的寡核苷酸或由其组成。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸具有与靶核酸的核碱基序列互补的核碱基序列。
在某些实施例中，化合物或反义化合物是单链的。这样的单链化合物或反义化合物包括寡聚化合物或由其组成。在某些实施例中，这样的寡聚化合物包括寡核苷酸以及任选地缀合物基团，或由其组成。在某些实施例中，该寡核苷酸是反义寡核苷酸。在某些实施例中，该寡核苷酸被修饰。在某些实施例中，单链反义化合物或寡聚化合物的寡核苷酸包括自我互补的核碱基序列。
在某些实施例中，化合物是双链的。此类双链化合物包括具有与靶核酸互补的区域的第一修饰的寡核苷酸以及具有与第一修饰的寡核苷酸互补的区域的第二修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸是RNA寡核苷酸。在此类实施例中，在修饰的寡核苷酸中的胸腺嘧啶核碱基被尿嘧啶核碱基替换。在某些实施例中，化合物包括缀合物基团。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸中的一种是缀合的。在某些实施例中，两种修饰的寡核苷酸均是缀合的。在某些实施例中，第一修饰的寡核苷酸是缀合的。在某些实施例中，第二修饰的寡核苷酸是缀合的。在某些实施例中，第一修饰的寡核苷酸长16-30个连接的核苷，并且第二修饰的寡核苷酸长16-30个连接的核苷。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸中的一种具有包含SEQ ID NO：17-2169中任一项的至少8个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施例中，反义化合物是双链的。此类双链反义化合物包括具有与靶核酸互补的区域的第一寡聚化合物以及具有与第一寡聚化合物互补的区域的第二寡聚化合物。此类双链反义化合物的第一寡聚化合物通常包括修饰的寡核苷酸和任选地缀合物基团，或由修饰的寡核苷酸和任选地缀合物基团组成。此类双链反义化合物的第二寡聚化合物的寡核苷酸可以是修饰的或未修饰的。双链反义化合物的任一寡聚化合物或两种寡聚化合物可以包括缀合物基团。双链反义化合物的这些寡聚化合物可以包括非互补突出的核苷。
单链的和双链的化合物的实例包括但不限于寡核苷酸、siRNA、靶向寡核苷酸的微小RNA、以及单链RNAi化合物，如小发夹RNA(shRNA)、单链siRNA(ssRNA)、和微小RNA模拟物。
在某些实施例中，本文描述的化合物具有以下核碱基序列，当按5’至3’方向编写时，该核碱基序列包括所靶向的靶核酸的靶区段的反向互补序列。
在某些实施例中，本文描述的化合物包括长12至30个连接的亚单位的寡核苷酸。在某些实施例中，本文描述的化合物包括长12至22个连接的亚单位的寡核苷酸。在某些实施例中，本文描述的化合物包括长14至30个连接的亚单位的寡核苷酸。在某些实施例中，本文描述的化合物包括长14至20个连接的亚单位的寡核苷酸。在某些实施例中，本文描述的化合物包括长15至30个连接的亚单位的寡核苷酸。在某些实施例中，本文描述的化合物包括长15至20个连接的亚单位的寡核苷酸。在某些实施例中，本文描述的化合物包括长16至30个连接的亚单位的寡核苷酸。在某些实施例中，本文描述的化合物包括长16至20个连接的亚单位的寡核苷酸。在某些实施例中，本文描述的化合物包括长17至30个连接的亚单位的寡核苷酸。在某些实施例中，本文描述的化合物包括长17至20个连接的亚单位的寡核苷酸。在某些实施例中，本文描述的化合物包括长18至30个连接的亚单位的寡核苷酸。在某些实施例中，a本文描述的化合物包括长18至20个连接的亚单位的寡核苷酸。在某些实施例中，a本文描述的化合物包括长20至30个连接的亚单位的寡核苷酸。换言之，此类寡核苷酸分别长12至30个连接的亚单位、14至30个连接的亚单位、14至20个亚单位、15至30个亚单位、15至20个亚单位、16至30个亚单位、16至20个亚单位、17至30个亚单位、17至20个亚单位、18至30个亚单位、18至20个亚单位、或20至30个亚单位。在某些实施例中，本文描述的化合物包括长14个连接的亚单位的寡核苷酸。在某些实施例中，本文描述的化合物包括长16个连接的亚单位的寡核苷酸。在某些实施例中，本文描述的化合物包括长17个连接的亚单位的寡核苷酸。在某些实施例中，本文描述的化合物包括长18个连接的亚单位的寡核苷酸。在某些实施例中，本文描述的化合物包括长19个连接的亚单位的寡核苷酸。在某些实施例中，本文描述的化合物包括长20个连接的亚单位的寡核苷酸。在其他实施例中，本文描述的化合物包括长8至80、12至50、13至30、13至50、14至30、14至50、15至30、15至50、16至30、16至50、17至30、17至50、18至22、18至24、18至30、18至50、19至22、19至30、19至50、或20至30个连接的亚单位的寡核苷酸。在某些这样的实施例中，本文所述的化合物包括长8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个连接的亚单位的寡核苷酸，或由以上值中任两个所限定的范围的寡核苷酸。在一些实施例中，这些连接的亚单位是核苷酸、核苷、或核碱基。
在某些实施例中，该化合物可以进一步包括另外的附接至该寡核苷酸的特征或元件，如缀合物基团。在某些实施例中，此类化合物是反义化合物。在某些实施例中，此类化合物是寡聚化合物。在缀合物基团包括核苷(即将该缀合物基团连接至该寡核苷酸的核苷)的实施例中，该缀合物基团的核苷未被算在该寡核苷酸的长度中。
在某些实施例中，化合物可以被缩短或截短。例如，可以从5’端(5’截短)、或可替代地从3’端(3’截短)删除单个亚单位。靶向PNPLA3核酸的缩短的或截短的化合物可以具有从该化合物的5’端删除的两个亚单位，或可替代地，可以具有从该化合物的3’端删除的两个亚单位。可替代地，被删除的核苷可以分散遍及该化合物。
当单个的另外的亚单位存在于加长的化合物中时，该另外的亚单位可以位于该化合物的5’或3’端。当两个或更多个另外的亚单位存在时，所添加的亚单位可以彼此相邻，例如，在向该化合物的5’端(5’添加)、或可替代地向3’端(3’添加)添加了两个亚单位的化合物中。可替代地，经添加的亚单位可以分散遍及该化合物。
增加或减少化合物(如寡核苷酸)的长度和/或引入错配碱基而不消除活性是可能的(Woolf等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]1992，89：7305-7309；Gautschi等人J.Natl.Cancer Inst.[美国国家癌症研究所杂志]2001年3月，93：463-471；Maher和Dolnick Nuc.Acid.Res.[核酸研究]1998，16：3341-3358)。然而，表面上看来，寡核苷酸序列、化学和基序中的小变化可以在临床开发所需的许多特性的一者或多者中造成较大的差异(Seth等人J.Med.Chem.[药物化学杂志]2009，52，10；Egli等人J.Am.Chem.Soc.[美国化学会志]2011，133，16642)。
在某些实施例中，本文描述的化合物是干扰RNA化合物(RNAi)，其包括双链RNA化合物(也称为短干扰RNA或siRNA)和单链RNAi化合物(或ssRNA)。此类化合物至少部分地通过RISC途径起作用，以降解和/或螯合靶核酸(因此，包括微小RNA/微小RNA模拟化合物)。如本文使用的，术语siRNA意在与用于描述能够介导序列特异性RNAi的核酸分子的其他术语是等效的，这些核酸分子是例如短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、短干扰寡核苷酸、短干扰核酸、短干扰修饰的寡核苷酸、化学修饰的siRNA、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)、以及其他。另外，如本文使用的，术语RNAi意在与用于描述序列特异性RNA干扰(如转录后基因沉默、翻译抑制、或表观遗传学)的其他术语是等效的。
在某些实施例中，本文所述的化合物可以包含靶向本文所述的PNPLA3的寡核苷酸序列中的任一个。在某些实施例中，该化合物可以是双链的。在某些实施例中，该化合物包括第一链和第二链，该第一链包含SEQ ID NO：17-2169中任一项的至少8、9、10、11、12、13、14、15、或16个连续核碱基部分。在某些实施例中，该化合物包括第一链和第二链，该第一链包含SEQ ID NO：17-2169中任一项的核碱基序列。在某些实施例中，该化合物包括核糖核苷酸，在这些核糖核苷酸中第一链具有代替SEQ ID NO：17-2169的任一项中的胸腺嘧啶(T)的尿嘧啶(U)。在某些实施例中，该化合物包括(i)第一链，其包含与SEQ ID NO：17-2169中任一项所靶向的PNPLA3上的位点互补的核碱基序列，和(ii)第二链。在某些实施例中，该化合物包括一个或多个修饰的核苷酸，在这些核苷酸中，糖的2’位包含卤素(如氟基团；2'-F)或包含烷氧基基团(如甲氧基基团；2’-OMe)。在某些实施例中，该化合物包括至少一个2'-F糖修饰和至少一个2’-OMe糖修饰。在某些实施例中，对于沿着该dsRNA化合物的链的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个连续核碱基而言，该至少一个2'-F糖修饰和至少一个2’-OMe糖修饰被布置成交替模式。在某些实施例中，该化合物在相邻核苷酸之间包括除天然存在的磷酸二酯连接之外的一种或多种连接。此类连接的实例包括磷酰胺、硫代磷酸酯、和二硫代磷酸酯连接。这些化合物还可以是化学修饰的核酸分子，如在美国专利号6,673,661中所传授的。在其他实施例中，该化合物包含一条或两条加帽链，如由例如2000年4月19日提交的WO 00/63364所披露的。
在某些实施例中，该化合物的第一链是siRNA引导链，并且该化合物的第二链是siRNA随从链(passenger strand)。在某些实施例中，该化合物的第二链与第一链互补。在某些实施例中，该化合物的每条链长16、17、18、19、20、21、22、或23个连接的核苷。在某些实施例中，该化合物的第一链或第二链可以包括缀合物基团。
在某些实施例中，本文所述的化合物可以包含靶向本文所述的PNPLA3的寡核苷酸序列中的任一个。在某些实施例中，该化合物是单链的。在某些实施例中，这样的化合物是单链RNAi(ssRNAi)化合物。在某些实施例中，该化合物包括SEQ ID NO：17-2169中任一项的至少8、9、10、11、12、13、14、15、或16个连续的核碱基部分。在某些实施例中，该化合物包括SEQ ID NO：17-2169中任一项的核碱基序列。在某些实施例中，该化合物包括核糖核苷酸，在这些核糖核苷酸中尿嘧啶(U)代替SEQ ID NO：17-2169的任一项中的胸腺嘧啶(T)。在某些实施例中，该化合物包括与SEQ ID NO：17-2169中任一项所靶向的PNPLA3上的位点互补的核碱基序列。在某些实施例中，该化合物包括一个或多个修饰的核苷酸，在这些核苷酸中，糖的2’位包含卤素(如氟基团；2'-F)或包含烷氧基基团(如甲氧基基团；2’-OMe)。在某些实施例中，该化合物包括至少一个2'-F糖修饰和至少一个2’-OMe糖修饰。在某些实施例中，对于沿着该化合物的链的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个连续核碱基而言，该至少一个2’-F糖修饰和至少一个2’-OMe糖修饰被布置成交替模式。在某些实施例中，该化合物在相邻核苷酸之间包括除天然存在的磷酸二酯连接之外的一种或多种连接。此类连接的实例包括磷酰胺、硫代磷酸酯、和二硫代磷酸酯连接。这些化合物还可以是化学修饰的核酸分子，如在美国专利号6,673,661中所传授的。在其他实施例中，该化合物包含加帽链，如由例如2000年4月19日提交的WO 00/63364所披露的。在某些实施例中，该化合物由16、17、18、19、20、21、22、或23个连接的核苷组成。在某些实施例中，该化合物可以包括缀合物基团。
某些机制
在某些实施例中，本文描述的化合物包括修饰的寡核苷酸或由其组成。在某些实施例中，本文描述的化合物是反义化合物。在某些实施例中，化合物包括寡聚化合物。在某些实施例中，本文描述的化合物能够杂交到靶核酸上，从而产生至少一种反义活性。在某些实施例中，本文描述的化合物选择性地影响一个或多个靶核酸。此类化合物包括杂交到一个或多个靶核酸上的核碱基序列，从而产生一种或多种所希望的反义活性，并且不杂交到一个或多个非靶核酸上或不以产生显著所不希望的反义活性的这样一种方式杂交到一个或多个非靶核酸上。
在某些反义活性中，本文描述的化合物与靶核酸的杂交导致募集切割该靶核酸的蛋白。例如，本文描述的某些化合物导致RNA酶H介导的靶核酸切割。RNA酶H是一种切割RNA：DNA双链体的RNA链的细胞内切核酸酶。这样的RNA：DNA双链体中的DNA不必是未经修饰的DNA。在某些实施例中，本文描述的化合物具有足够的“DNA样(DNA-like)”以引起RNA酶H活性。进一步地，在某些实施例中，在缺口体的缺口中耐受一个或多个非DNA样核苷。
在某些反义活性中，将本文描述的化合物或化合物的一部分加载到RNA诱导沉默复合体(RISC)中，从而最终导致靶核酸的切割。例如，本文描述的某些化合物导致该靶核酸被Argonaute切割。加载到RISC中的化合物是RNAi化合物。RNAi化合物可以是双链(siRNA)或单链(ssRNA)的。
在某些实施例中，本文描述的化合物与靶核酸的杂交不导致募集切割该靶核酸的蛋白。在某些这样的实施例中，该化合物与靶核酸的杂交导致该靶核酸的剪接的改变。在某些实施例中，该化合物与靶核酸的杂交导致该靶核酸与蛋白或其他核酸之间的结合相互作用的抑制。在某些这样的实施例中，该化合物与靶核酸的杂交导致该靶核酸的翻译的改变。
可以直接地或间接地观察到反义活性。在某些实施例中，反义活性的观察或检测涉及观察或检测靶核酸或由这样的靶核酸编码的蛋白的量的变化、核酸或蛋白的剪接变体的比率的变化、和/或细胞或动物中的表型变化。
靶核酸、靶区域以及核苷酸序列
在某些实施例中，本文描述的这些化合物包括寡核苷酸或由其组成，该寡核苷酸包含与靶核酸互补的区域。在某些实施例中，该靶核酸是内源RNA分子。在某些实施例中，该靶核酸编码蛋白。在某些这样的实施例中，该靶核酸选自：mRNA和前mRNA，包括内含子区、外显子区和非翻译区。在某些实施例中，该靶RNA是mRNA。在某些实施例中，该靶核酸是前mRNA。在某些这样的实施例中，该靶区域整个在内含子内。在某些实施例中，该靶区域跨内含子/外显子接点。在某些实施例中，该靶区域的至少50％在内含子内。
编码PNPLA3的核苷酸序列包括但不限于以下：RefSeq或基因库登录号NM_025225.2(通过引用并入，在本文中被披露为SEQ ID NO：1)；从核苷酸43921001至43954500截短的基因库登录号NC_000022.11(通过引用并入，在本文中被披露为SEQ ID NO：2)；AK123806.1(通过引用并入，在本文中被披露为SEQ ID NO：3)；BQ686328.1(通过引用并入，在本文中被披露为SEQ ID NO：4)；BF762711.1(通过引用并入，在本文中被披露为SEQ IDNO：5)；DA290491.1(通过引用并入，在本文中被披露为SEQ ID NO：6)；以及列出为SEQ IDNo.7、8、9、和10的序列。
杂交
在一些实施例中，杂交发生在本文披露的化合物与PNPLA3核酸之间。最常见的杂交机制涉及核酸分子的互补核碱基之间的氢键合(例如，沃森-克里克(Watson-Crick)、胡斯坦(Hoogsteen)或反向胡斯坦氢键合)。
杂交能在不同的条件下发生。杂交条件是序列依赖性的，并且由待杂交的核酸分子的性质和组成决定。
测定序列是否可与靶核酸特异性地杂交的方法是本领域熟知的。在某些实施例中，本文提供的化合物与PNPLA3核酸特异性地杂交。
互补性
当将两个核碱基序列在相反方向上进行比对时，这样的寡核苷酸或其一个或多个区域的核碱基序列匹配另一个寡核苷酸或核酸或其一个或多个区域的核碱基序列，则寡核苷酸被说成与另一个核酸互补。如本文描述的，核碱基匹配或互补核碱基限于以下对：腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)和尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)、以及5-甲基胞嘧啶(mC)和鸟嘌呤(G)，除非另外说明。互补寡核苷酸和/或核酸无需在每个核苷处都具有核碱基互补性，并且可以包括一个或多个核碱基错配。当此类寡核苷酸在每个核苷处都具有核碱基匹配而没有任何核碱基错配时，寡核苷酸是完全互补的或100％互补的。
在某些实施例中，本文描述的化合物包括修饰的寡核苷酸或由其组成。在某些实施例中，本文描述的化合物是反义化合物。在某些实施例中，化合物包括寡聚化合物。化合物和PNPLA3核酸之间的非互补核碱基可以被接受，只要该化合物仍然能够与靶核酸特异性地杂交。此外，化合物可以杂交到PNPLA3核酸的一个或多个区段上，使得间插或相邻区段不包括在杂交事件中(例如，环结构、错配或发夹结构)。
在某些实施例中，本文提供的化合物、或其指定部分与PNPLA3核酸、其靶区域、靶区段、或指定部分是至少或至多70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％互补的。在某些实施例中，本文提供的化合物、或其指定部分与PNPLA3核酸、其靶区域、靶区段、或指定部分是70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至100％、或这些范围之间的任何数字互补的。化合物与靶核酸的百分比互补性可以使用常规方法测定。
例如，在化合物的20个核碱基中有18个与靶区域互补并且因此特异性杂交的化合物代表90％互补性。在这个实例中，剩余的非互补核碱基可以与互补核碱基成簇或散布，并且不需要彼此连续或与互补核碱基连续。因此，长18个核碱基、具有由与靶核酸完全互补的两个区域侧接的四个非互补核碱基的化合物与靶核酸具有77.8％的总体互补性。使用本领域已知的BLAST程序(基本局部比对搜索工具)和PowerBLAST程序(Altschul等人，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]，1990，215，403 410；Zhang和Madden，Genome Res.[基因组研究]，1997，7，649 656)可以常规地确定化合物与靶核酸区域的互补性百分比。可以通过例如使用Smith和Waterman的算法(Adv.Appl.Math.[应用数学进展]，1981，2，482 489)的Gap程序(威斯康星序列分析软件包(Wisconsin Sequence Analysis Package)，用于Unix的版本8，遗传学计算机集团(Genetics Computer Group)，威斯康星州麦迪逊市大学科技园(University Research Park，Madison Wis.))，使用默认设置确定百分比同源性、序列同一性或互补性。
在某些实施例中，本文描述的化合物或其指定部分与靶核酸、或其指定部分完全互补(即100％互补)。例如，化合物可以与PNPLA3核酸、或其靶区域、或靶区段或靶序列完全互补。如本文使用的.“完全互补”意指化合物的每个核碱基与靶核酸的对应核碱基是互补的。例如，20个核碱基的化合物与400个核碱基长的靶序列完全互补，只要存在与该化合物完全互补的靶核酸的相应的20个核碱基部分。完全互补也可以关于第一和/或第二核酸的指定部分来使用。例如，30个核碱基的化合物的20个核碱基部分可以与400个核碱基长的靶序列“完全互补”。30个核碱基的化合物的20个核碱基部分与该靶序列完全互补，如果该靶序列具有相应的20个核碱基部分、其中每个核碱基与该化合物的20个核碱基部分互补的话。同时，整个30个核碱基的化合物可以完全或可以不完全与该靶序列互补，这取决于该化合物的剩余10个核碱基是否也与该靶序列互补。
在某些实施例中，相对于该靶核酸，本文描述的化合物包括一个或多个错配的核碱基。在某些这样的实施例中，针对该靶标的反义活性被此类错配降低，但是针对非靶标的活性被降低更大的量。因此，在某些这样的实施例中，该化合物的选择性得以改进。在某些实施例中，该错配特别地位于具有缺口体基序的寡核苷酸内。在某些这样的实施例中，该错配在离该缺口区域的5’-端的位置1、2、3、4、5、6、7、或8处。在某些这样的实施例中，该错配在离该缺口区域的3’-端的位置9、8、7、6、5、4、3、2、1处。在某些这样的实施例中，该错配在离翼区域的5’-端的位置1、2、3、或4处。在某些这样的实施例中，该错配在离翼区域的3’-端的位置4、3、2、或1处。在某些实施例中，该错配特别地位于不具有缺口体基序的寡核苷酸内。在某些这样的实施例中，该错配在离寡核苷酸的5’-端的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12处。在某些这样的实施例中，该错配在离寡核苷酸的3’-端的位置2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12处。
非互补核碱基的位置可以在该化合物的5’端或3’端。可替代地，非互补核碱基或核碱基可以在该化合物的内部位置处。当存在两个或更多个非互补核碱基时，它们可以是连续的(即连接的)或不连续的。在一个实施例中，非互补核碱基位于缺口体寡核苷酸的翼区段中。
在某些实施例中，长或至多长11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个核碱基的本文描述的化合物相对于靶核酸(如PNPLA3核酸)或其指定部分包括不超过4、不超过3、不超过2、或不超过1个非互补核碱基。
在某些实施例中，长或至多长11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个核碱基的本文描述的化合物相对于靶核酸(如PNPLA3核酸)或其指定部分包括不超过6、不超过5、不超过4、不超过3、不超过2、或不超过1个非互补核碱基。
在某些实施例中，本文描述的化合物还包括与靶核酸的一部分互补的那些。如本文使用的，“部分”是指靶核酸的区域或区段内确定数目的连续的(即连接的)核碱基。“部分”也可以指化合物的确定数目的连续核碱基。在某些实施例中，这些化合物与靶区段的至少8个核碱基部分互补。在某些实施例中，这些化合物与靶区段的至少9个核碱基部分互补。在某些实施例中，这些化合物与靶区段的至少10个核碱基部分互补。在某些实施例中，这些化合物与靶区段的至少11个核碱基部分互补。在某些实施例中，这些化合物与靶区段的至少12个核碱基部分互补。在某些实施例中，这些化合物与靶区段的至少13个核碱基部分互补。在某些实施例中，这些化合物与靶区段的至少14个核碱基部分互补。在某些实施例中，这些化合物与靶区段的至少15个核碱基部分互补。在某些实施例中，这些化合物与靶区段的至少16个核碱基部分互补。还考虑了与靶区段的至少9、10、17、18、19、20、或更多个核碱基部分、或由这些值中任两个所限定的范围互补的化合物。
同一性
本文提供的这些化合物也可以与特定核苷酸序列、SEQ ID NO、或由特定ION编号代表的化合物、或其部分具有确定的百分比同一性。在某些实施例中，本文描述的化合物是反义化合物或寡聚化合物。在某些实施例中，本文描述的化合物是修饰的寡核苷酸。如本文使用的，如果化合物具有与本文披露的序列相同的核碱基配对能力，则该化合物与本文披露的序列是相同的。例如，代替披露的DNA序列中的胸腺嘧啶而包含尿嘧啶的RNA被认为与该DNA序列是相同的，因为尿嘧啶和胸腺嘧啶两者均与腺嘌呤配对。还考虑了本文描述的化合物的缩短和加长形式、以及相对于本文提供的化合物具有非同一碱基的化合物。这些非同一碱基可以彼此相邻或分散遍及该化合物。化合物的百分比同一性根据相对于与它正在进行比较的序列具有同一碱基配对的碱基数来计算。
在某些实施例中，本文描述的化合物或其部分与本文披露的化合物或SEQ ID NO、或其部分的一个或多个具有，或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施例中，本文描述的化合物与特定核苷酸序列、SEQ ID NO、或由特定ION编号代表的化合物、或其部分具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％，或这些值之间的任何百分比的同一性，其中这些化合物包括具有一个或多个错配核碱基的寡核苷酸。在某些这样的实施例中，该错配在离寡核苷酸的5’-端的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12处。在某些这样的实施例中，该错配在离寡核苷酸的3’-端的位置2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12处。
在某些实施例中，本文描述的化合物包括反义化合物或由其组成。在某些实施例中，将该反义化合物的一部分与该靶核酸的等长部分进行比较。在某些实施例中，将8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25个核碱基的部分与该靶核酸的等长部分进行比较。
在某些实施例中，本文描述的化合物包括寡核苷酸或由其组成。在某些实施例中，将该寡核苷酸的一部分与该靶核酸的等长部分进行比较。在某些实施例中，将8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25个核碱基的部分与该靶核酸的等长部分进行比较。
某些修饰的化合物
在某些实施例中，本文描述的化合物包括寡核苷酸或由其组成，该寡核苷酸由连接的核苷组成。寡核苷酸可以是未经修饰的寡核苷酸(RNA或DNA)或可以是修饰的寡核苷酸。相对于未经修饰的RNA或DNA，修饰的寡核苷酸包括至少一种修饰(即，包括至少一种修饰的核苷(包含修饰的糖部分和/或修饰的核碱基)和/或至少一种修饰的核苷间连接)。
A.修饰的核苷
修饰的核苷包括修饰的糖部分或修饰的核碱基或同时包括修饰的糖部分和修饰的核碱基。
1.修饰的糖部分
在某些实施例中，糖部分是非二环修饰的糖部分。在某些实施例中，修饰的糖部分是二环的或三环的糖部分。在某些实施例中，修饰的糖部分是糖代用品。此类糖代用品可以包括对应于修饰的糖部分其他类型的那些的一个或多个取代。
在某些实施例中，修饰的糖部分是非二环修饰的呋喃糖基糖部分，这些非二环修饰的呋喃糖基糖部分包含一个或多个非环状取代基(包括但不限于2’、4’、和/或5’位置处的取代基)。在某些实施例中，该呋喃糖基糖部分是核糖基糖部分。在某些实施例中，非二环修饰的糖部分的一个或多个非环状取代基是支链的。适合非二环修饰的糖部分的2’-取代基基团的实例包括但不限于：2’-F、2’-OCH3(“OMe”或“O-甲基”)、和2’-O(CH2)2OCH3(“MOE”)。在某些实施例中，2’-取代基基团选自：卤素、烯丙基、氨基、叠氮基、SH、CN、OCN、CF3、OCF3、O-C1-C10烷氧基、O-C1-C10取代的烷氧基、O-C1-C10烷基、O-C1-C10取代的烷基、S-烷基、N(Rm)-烷基、O-烯基、S-烯基、N(Rm)-烯基、O-炔基、S-炔基、N(Rm)-炔基、O-烷基烯基(alkylenyl)-O-烷基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、O-芳烷基、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2ON(Rm)(Rn)或OCH2C(＝O)-N(Rm)(Rn)，其中每个Rm和Rn独立地是H、氨基保护基团、或取代的或未取代的C1-C10烷基，以及在Cook等人，U.S.6,531,584；Cook等人，U.S.5,859,221；以及Cook等人，U.S.6,005,087中描述的2’-取代基基团。这些2’-取代基基团的某些实施例可以进一步被独立地选自以下项的一个或多个取代基基团取代：羟基、氨基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基(NO2)、硫醇、硫代烷氧基、硫代烷基、卤素、烷基、芳基、烯基以及炔基。适合线性非二环修饰的糖部分的4’-取代基基团的实例包括但不限于烷氧基(例如，甲氧基)、烷基以及在Manoharan等人，WO 2015/106128中描述的那些。适于非二环修饰的糖部分的5’-取代基基团的实例包括但不限于：5’-甲基(R或S)、5’-乙烯基、和5’-甲氧基。在某些实施例中，非二环修饰的糖包含超过一个非桥接糖取代基，例如2'-F-5’-甲基糖部分，以及描述于Migawa等人，WO 2008/101157和Rajeev等人，US 2013/0203836中的修饰的糖部分和修饰的核苷。
在某些实施例中，2’-取代的核苷或2’-非二环修饰的核苷包括包含选自以下项的线性2’-取代基基团的糖部分：F、NH2、N3、OCF3、OCH3、O(CH2)3NH2、CH2CH＝CH2、OCH2CH＝CH2、OCH2CH2OCH3、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2ON(Rm)(Rn)、O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2、和N-取代的乙酰胺(OCH2C(＝O)-N(Rm)(Rn))，其中每个Rm和Rn独立地是H、氨基保护基团、或取代的或未取代的C1-C10烷基。
在某些实施例中，2’-取代的核苷或2’-非二环修饰的核苷包括包含选自以下项的线性2’-取代基基团的糖部分：F、OCF3、OCH3、OCH2CH2OCH3、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2ON(CH3)2、O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2、和OCH2C(＝O)-N(H)CH3(“NMA”)。
在某些实施例中，2’-取代的核苷或2’-非二环修饰的核苷包括包含选自以下项的线性2’-取代基基团的糖部分：F、OCH3、和OCH2CH2OCH3。
包含修饰的糖部分(如非二环修饰的糖部分)的核苷通过该核苷的糖部分上的一个或多个取代的位置来提及。例如，包含2′-取代的或2-修饰的糖部分的核苷被称为2′-取代的核苷或2-修饰的核苷。
某些修饰的糖部分包括形成第二环的桥接糖取代基，从而产生二环糖部分。在某些这样的实施例中，该二环糖部分在4′与2′呋喃糖环原子之间包括桥。在某些这样的实施例中，呋喃糖环是核糖环。此类4′到2′桥接糖取代基的实例包括但不限于：4′-CH2-2′、4′-(CH2)2-2′、4′-(CH2)3-2′、4′-CH2-O-2′(“LNA”)、4′-CH2-S-2′、4′-(CH2)2-O-2′(“ENA”)、4′-CH(CH3)-O-2′(当处于S构型时，被称为“受约束的乙基”或“cEt”)、4′-CH2-O-CH2-2′、4′-CH2-N(R)-2′、4′-CH(CH2OCH3)-O-2′(“受约束的MOE”或“cMOE”)及其类似物(参见，例如Seth等人，U.S.7,399,845；Bhat等人，U.S.7,569,686；Swayze等人，U.S.7,741,457，和Swayze等人，U.S.8,022,193)、4′-C(CH3)(CH3)-O-2′及其类似物(参见，例如Seth等人，U.S.8,278,283)、4′-CH2-N(OCH3)-2′及其类似物(参见，例如Prakash等人，U.S.8,278,425)、4′-CH2-O-N(CH3)-2′(参见，例如Allerson等人，U.S.7,696,345和Allerson等人，U.S.8,124,745)、4′-CH2-C(H)(CH3)-2′(参见，例如Zhou等人，J.Org.Chem[有机化学杂志]，2009，74，118-134)、4′-CH2-C(＝CH2)-2′及其类似物(参见，例如Seth等人，U.S.8,278,426)、4′-C(RaRb)-N(R)-O-2′、4′-C(RaRb)-O-N(R)-2′、4′-CH2-O-N(R)-2′、和4′-CH2-N(R)-O-2′，其中每个R、Ra、和Rb独立地是H、保护基团、或C1-C12烷基(参见，例如Imanishi等人，U.S.7,427,672)。
在某些实施例中，此类4’到2’桥独立地包含1到4个连接的基团，这些基团独立地选自：-[C(Ra)(Rb)]n-、-[C(Ra)(Rb)]n-O-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-C(＝NRa)-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-O-、-Si(Ra)2-、-S(＝O)x-、和-N(Ra)-；
其中：
x是0、1、或2；
n是1、2、3、或4；
每个Ra和Rb独立地是H、保护基团、羟基、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、C5-C7脂环基、取代的C5-C7脂环基、卤素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、CN、磺酰基(S(＝O)2-J1)、或次硫酸基(sulfoxyl，S(＝O)-J1)；并且每个J1和J2独立地是H、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、杂环基、取代的杂环基、C1-C12氨基烷基、取代的C1-C12氨基烷基、或保护基团。
另外的二环糖部分是本领域已知的，参见，例如：Freier等人，Nucleic AcidsResearch[核酸研究]，1997，25(22)，4429-4443；Albaek等人，J.Org.Chem.[有机化学杂志]，2006，71，7731-7740；Singh等人，Chem.Commun.[化学通讯]，1998，4，455-456；Koshkin等人，Tetrahedron[四面体]，1998，54，3607-3630；Wahlestedt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.US.A.[美国国家科学院院刊]，2000，97，5633-5638；Kumar等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.[生物有机化学与医药化学快报]，1998，8，2219-2222；Singh等人，J.Org.Chem.[有机化学杂志]，1998，63，10035-10039；Srivastava等人，J.Am.Chem.Soc.[美国化学会志]，2007，129，8362-8379；Elayadi等人，Curr.Opinion Invens.Drugs[研究药物的最新观点]，2001，2，558-561；Braasch等人，Chem.Biol.[化学生物学]，2001，8，1-7；Orum等人，Curr.Opinion Mol.Ther.[分子疗法的最新观点]，2001，3，239-243；Wengel等人，U.S.7,053,207，Imanishi等人，U.S.6,268,490，Imanishi等人，U.S.6,770,748，Imanishi等人，U.S.RE44，779；Wengel等人，U.S.6,794,499，Wengel等人，U.S.6,670,461；Wengel等人，U.S.7,034,133，Wengel等人，U.S.8,080,644；Wengel等人，U.S.8,034,909；Wengel等人，U.S.8,153,365；Wengel等人，U.S.7,572,582；和Ramasamy等人，U.S.6,525,191，Torsten等人，WO 2004/106356，Wengel等人，WO 1999/014226；Seth等人，WO 2007/134181；Seth等人，U.S.7,547,684；Seth等人，U.S.7,666,854；Seth等人，U.S.8,088,746；Seth等人，U.S.7,750,131；Seth等人，U.S.8,030,467；Seth等人，U.S.8,268,980；Seth等人，U.S.8,546,556；Seth等人，U.S.8,530,640；Migawa等人，U.S.9,012,421；Seth等人，U.S.8,501,805；Allerson等人，US 2008/0039618；和Migawa等人，US2015/0191727。
在某些实施例中，二环糖部分和掺入此类二环糖部分的核苷进一步通过同分异构构型来定义。例如，LNA核苷(本文描述的)可以处于α-L构型或处于β-D构型。
α-L-亚甲基氧基(4’-CH2-O-2’)或α-L-LNA二环核苷已经被掺入显示反义活性的寡核苷酸中(Frieden等人，Nucleic Acids Research[核酸研究]，2003，21，6365-6372)。本文，二环核苷的概述包括两种同分异构构型。当在本文的示例实施例中鉴定具体二环核苷(例如，LNA或cEt)的位置时，它们处于β-D构型，除非另外说明。
在某些实施例中，修饰的糖部分包括一个或多个非桥接糖取代基和一个或多个桥接糖取代基(例如，5’-取代的和4’-2’桥接的糖)。
在某些实施例中，修饰的糖部分是糖代用品。在某些这样的实施例中，该糖部分的氧原子被例如硫、碳或氮原子替换。在某些这样的实施例中，此类修饰的糖部分还包括本文描述的桥接和/或非桥接取代基。例如，某些糖代用品包括4’-硫原子和在2’-位(参见，例如Bhat等人，U.S.7,875,733和Bhat等人，U.S.7,939,677)和/或5’位处的取代。
在某些实施例中，糖代用品包括具有不是5个原子的环。例如，在某些实施例中，糖代用品包括六元四氢吡喃(“THP”)。此类四氢吡喃可以被进一步修饰或取代。包含此类修饰的四氢吡喃的核苷包括但不限于己糖醇核酸(“HNA”)、安尼妥(anitol)核酸(“ANA”)、甘露醇核酸(“MNA”)(参见，例如，Leumann，CJ.Bioorg.&Med.Chem.[生物有机化学与医药化学]2002，10，841-854)、氟HNA：
(“F-HNA”，参见例如，Swayze等人，U.S.8,088,904；Swayze等人，U.S.8,440,803；和Swayze等人，U.S.9,005,906，F-HNA还可以称为F-THP或3’-氟四氢吡喃)、以及构成另外的经修饰的THP化合物的、具有下式的核苷：
其中，独立地，对于所述修饰的THP核苷中的每者：
Bx是核碱基部分；
T3和T4各自独立地是将该修饰的THP核苷连接至寡核苷酸的剩余部分的核苷间连接基团，或T3和T4之一是将该修饰的THP核苷连接至寡核苷酸的剩余部分的核苷间连接基团，并且T3和T4中另一者是H、羟基保护基团、连接的缀合物基团、或5’或3’-端基；q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自独立地是H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基、或取代的C2-C6炔基；并且R1和R2各自独立地选自：氢、卤素、取代的或未取代的烷氧基、NJ1J2、SJ1、N3、OC(＝X)J1、OC(＝X)NJ1J2、NJ3C(＝X)NJ1J2、和CN，其中X是O、S或NJ1，并且每个J1、J2、和J3独立地是H或C1-C6烷基。
在某些实施例中，提供了修饰的THP核苷，其中q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自是H。在某些实施例中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7中至少一个不是H。在某些实施例中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7中至少一个是甲基。在某些实施例中，提供了修饰的THP核苷，其中R1和R2之一是F。在某些实施例中，R1是F，并且R2是H。在某些实施例中，R1是甲氧基，并且R2是H，并且在某些实施例中，R1是甲氧基乙氧基，并且R2是H。
在某些实施例中，糖代用品包括具有超过5个原子和超过一个杂原子的环。例如，已经报道了包含吗啉基糖部分的核苷及其在寡核苷酸中的使用(参见，例如，Braasch等人，Biochemistry[生物化学]，2002，41，4503-4510和Summerton等人，U.S.5,698,685；Summerton等人，U.S.5,166,315；Summerton等人，U.S.5,185,444；以及Summerton等人，U.S.5,034,506)。如本文使用的，术语“吗啉基”意指具有以下结构的糖代用品：
在某些实施例中，可以例如通过添加或改变来自以上吗啉基结构的不同取代基基团来修饰吗啉基。此类糖代用品在本文中被称为“修饰的吗啉基”。
在某些实施例中，糖代用品包括非环状部分。包含此类非环状糖代用品的核苷和寡核苷酸的实例包括但不限于：肽核酸(“PNA”)、非环状丁基核酸(参见，例如，Kumar等人，Org.Biomol.Chem.[有机化学与生物分子化学]，2013，11，5853-5865)，并且核苷和寡核苷酸描述于Manoharan等人，US2013/130378中。
在本领域中已知许多其他可以用于修饰的核苷中的二环和三环糖以及糖代用品环系统。
2.修饰的核碱基
核碱基(或碱基)修饰或取代在结构上可与天然存在的或合成的未经修饰的核碱基区别，但是在功能上可与其互换。天然的和修饰的核碱基两者都能够参与氢键合。此类核碱基修饰可以赋予反义化合物以核酸酶稳定性、结合亲和力或一些其他有益的生物学特性。
在某些实施例中，本文描述的化合物包括修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸包括一个或多个包含未经修饰的核碱基的核苷。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸包括一个或多个包含经修饰的核碱基的核苷。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸包括一个或多个不包含核碱基的核苷(被称为无碱基核苷)。
在某些实施例中，修饰的核碱基选自：5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶、烷基或炔基取代的嘧啶、烷基取代的嘌呤、以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤。在某些实施例中，修饰的核碱基选自：2-氨丙基腺嘌呤、5-羟甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-N-甲基鸟嘌呤、6-N-甲基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-丙炔基(C≡C-CH3)尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-核糖基尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基、8-氮杂和其他8-取代的嘌呤、5-卤代(特别是5-溴、5-三氟甲基、5-卤代尿嘧啶、和5-卤代胞嘧啶)、7-甲基鸟嘌呤、7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、7-去氮杂鸟嘌呤、7-去氮杂腺嘌呤、3-去氮杂鸟嘌呤、3-去氮杂腺嘌呤、6-N-苯甲酰基腺嘌呤、2-N-异丁酰基鸟嘌呤、4-N-苯甲酰基胞嘧啶、4-N-苯甲酰基尿嘧啶、5-甲基4-N-苯甲酰基胞嘧啶、5-甲基4-N-苯甲酰基尿嘧啶、通用碱基、疏水性碱基、混杂的碱基、大小扩大的碱基、以及氟化的碱基。另外的修饰的核碱基包括三环嘧啶，如1，3-二氮杂吩噁嗪-2-酮、1，3-二氮杂吩噻嗪-2-酮和9-(2-氨基乙氧基)-1，3-二氮杂吩噁嗪-2-酮(G-钳)。修饰的核碱基还可以包括其中的嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环替换的那些，例如7-去氮杂-腺嘌呤、7-去氮杂鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。另外的核碱基包括披露于Merigan等人，U.S.3,687,808中的那些，披露于The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering[高分子科学与工程简明百科]，Kroschwitz，J.I.编辑，约翰·威利父子公司(John Wiley&Sons)，1990，858-859；Englisch等人，Angewandte Chemie[应用化学]，国际版，1991，30，613；Sanghvi，Y.S.，第15章，Antisense Research and Applications[反义研究与应用]，Crooke，S.T.和Lebleu，B.，编辑，CRC出版社，1993，273-288中的那些；以及披露于Antisense Drug Technology[反义药物技术]第6和第15章，Crooke S.T.编辑，CRC出版社，2008，163-166和442-443中的那些。
传授了上文指出的修饰的核碱基中的某些以及其他修饰的核碱基的制备的公开物包括但不限于Manoharan等人，US2003/0158403，Maroharan等人，US2003/0175906；Dinh等人，U.S.4,845,205；Spielvogel等人，U.S.5,130,302；Rogers等人，U.S.5,134,066；Bischofberger等人，U.S.5,175,273；Urdea等人，U.S.5,367,066；Benner等人，U.S.5,432,272；Matteucci等人，U.S.5,434,257；Gmeiner等人，U.S.5,457,187；Cook等人，U.S.5,459,255；Froehler等人，U.S.5,484,908；Matteucci等人，U.S.5,502,177；Hawkins等人，U.S.5,525,711；Haralambidis等人，U.S.5,552,540；Cook等人，U.S.5,587,469；Froehler等人，U.S.5,594,121；Switzer等人，U.S.5,596,091；Cook等人，U.S.5,614,617；Froehler等人，U.S.5,645,985；Cook等人，U.S.5,681,941；Cook等人，U.S.5,811,534；Cook等人，U.S.5,750,692；Cook等人，U.S.5,948,903；Cook等人，U.S.5,587,470；Cook等人，U.S.5,457,191；Matteucci等人，U.S.5,763,588；Froehler等人，U.S.5,830,653；Cook等人，U.S.5,808,027；Cook等人，U.S.6,166,199；以及Matteucci等人，U.S.6,005,096。
在某些实施例中，靶向PNPLA3核酸的化合物包含一个或多个修饰的核碱基。在某些实施例中，该修饰的核碱基是5-甲基胞嘧啶。在某些实施例中，每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。
修饰的核苷间连接
RNA和DNA中天然存在的核苷间连接是3′到5′的磷酸二酯连接。在某些实施例中，由于所希望的特性，例如像，增强的细胞摄取、对靶核酸的增强的亲和力、和在核酸酶存在下增加的稳定性，具有一个或多个修饰的(即，非天然存在的)核苷间连接的本文描述的化合物被选择为优于具有天然存在的核苷间连接的化合物。
具有手性中心的代表性的核苷间连接包括但不限于烷基膦酸酯和硫代磷酸酯。包含具有手性中心的核苷间连接的修饰的寡核苷酸可以制备为包含立体随机核苷间连接的修饰的寡核苷酸群体，或者制备为包含呈特定的立体化学构型的硫代磷酸酯连接的修饰寡核苷酸群体。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸群体包含硫代磷酸酯核苷间连接，其中所有硫代磷酸酯核苷间连接是立体随机的。可以使用合成方法产生这种修饰的寡核苷酸，该合成方法导致每个硫代磷酸酯连接的立体化学构型的随机选择。尽管如此，如本领域技术人员所熟知的，每个单独的寡核苷酸分子的每个单独的硫代磷酸酯具有确定的立体构型。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸群体富含以下修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸包含以特定的、独立选择的立体化学构型的一个或多个特定的硫代磷酸酯核苷间连接。在某些实施例中，特定硫代磷酸酯连接的特定构型存在于群体中至少65％的分子中。在某些实施例中，特定硫代磷酸酯连接的特定构型存在于群体中至少70％的分子中。在某些实施例中，特定硫代磷酸酯连接的特定构型存在于群体中至少80％的分子中。在某些实施例中，特定硫代磷酸酯连接的特定构型存在于群体中至少90％的分子中。在某些实施例中，特定硫代磷酸酯连接的特定构型存在于群体中至少99％的分子中。这种手性富集的修饰的寡核苷酸群体可以使用本领域已知的合成方法产生，例描述于Oka等人，JACS125，8307(2003)，Wan等人Nuc.Acid.Res.[核酸研究]42，13456(2014)，和WO 2017/015555中的方法。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸群体富含具有至少一个呈(Sp)构型的指示的硫代磷酸酯的修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸群体富含具有至少一个呈(Rp)构型的硫代磷酸酯的修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，包含(Rp)和/或(Sp)硫代磷酸酯的修饰的寡核苷酸分别包含下式中的一个或多个，其中“B”指示核碱基：
除非另有说明，否则本文所述的修饰的寡核苷酸的手性核苷间连接可以是立体随机的或以特定的立体化学构型。
在某些实施例中，靶向PNPLA3核酸的化合物包含一个或多个修饰的核苷间连接。在某些实施例中，该修饰的核苷间连接是硫代磷酸酯连接。在某些实施例中，反义化合物的每个核苷间连接均为硫代磷酸酯核苷间连接。
在某些实施例中，本文描述的化合物包括寡核苷酸。具有修饰的核苷间连接的寡核苷酸包括保留磷原子的核苷间连接以及不具有磷原子的核苷间连接。代表性的含磷核苷间连接包括但不限于磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、以及硫代磷酸酯。制备含磷连接和非含磷连接的方法是熟知的。
在某些实施例中，可以使用任何核苷间连接将修饰的寡核苷酸的核苷连接在一起。通过存在或不存在磷原子来定义两类主要的核苷间连接基团。代表性的含磷核苷间连接包括但不限于包含磷酸二酯键(“P＝O”)的磷酸酯(也被称为未经修饰的或天然存在的连接)、磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、以及硫代磷酸酯(“P＝S”)和二硫代磷酸酯(“HS-P＝S”)。代表性的非含磷核苷间连接基团包括但不限于亚甲基甲亚氨基(-CH2-N(CH3)-O-CH2)、硫代二酯、硫氨酯(-O-C(＝O)(NH)-S-)；硅氧烷(-O-SiH2-O-)；和N，N’-二甲基肼(-CH2-N(CH3)-N(CH3)-)。与天然存在的磷酸酯连接相比，修饰的核苷间连接可以用于改变(典型地是增加)寡核苷酸的核酸酶抗性。在某些实施例中，具有手性原子的核苷间连接可以被制备为外消旋混合物，或制备为单独的对映异构体。代表性的手性核苷间连接包括但不限于烷基膦酸酯和硫代磷酸酯。制备含磷核苷间连接和非含磷核苷间连接的方法是本领域的技术人员所熟知的。
中性核苷间连接包括但不限于磷酸三酯、甲基膦酸酯、MMI(3′-CH2-N(CH3)-O-5′)、酰胺-3(3′-CH2-C(＝O)-N(H)-5′)、酰胺-4(3′-CH2-N(H)-C(＝O)-5′)、缩甲乙醛(formacetal)(3′-O-CH2-O-5′)、甲氧丙基、以及硫代缩甲乙醛(3′-S-CH2-O-5′)。另外的中性核苷间连接包括包含硅氧烷(二烷基硅氧烷)、羧酸酯、羧酰胺、硫化物、磺酸酯和酰胺的非离子连接(参见例如：Carbohydrate Modifications in Antisense Research[反义研究中的碳水化合物修饰]；Y.S.Sanghvi和P.D.Cook编辑，ACS Symposium Series[ACS研讨会文集]580；第3和第4章，40-65)。另外的中性核苷间连接包括包含混合的N、O、S和CH2组成部分的非离子连接。
在某些实施例中，寡核苷酸包括沿着该寡核苷酸或其区域布置成限定模式或修饰的核苷间连接基序的修饰的核苷间连接。在某些实施例中，核苷间连接被布置成带缺口的基序。在这样的实施例中，两个翼区域的每个中的核苷间连接与缺口区域中的核苷间连接是不同的。在某些实施例中，翼中的核苷间连接是磷酸二酯，并且缺口中的核苷间连接是硫代磷酸酯。独立地选择核苷基序，所以具有带缺口的核苷间连接基序的此类寡核苷酸可以具有或可以没有带缺口的核苷基序，并且如果它的确具有带缺口的核苷基序，则翼和缺口长度可以相同或可以不相同。
在某些实施例中，寡核苷酸包括具有交替的核苷间连接基序的区域。在某些实施例中，寡核苷酸包括一致修饰的核苷间连接的区域。在某些这样的实施例中，该寡核苷酸包括通过硫代磷酸酯核苷间连接均匀地连接的区域。在某些实施例中，该寡核苷酸通过硫代磷酸酯均匀地连接。在某些实施例中，该寡核苷酸的每个核苷间连接都选自磷酸二酯和硫代磷酸酯。在某些实施例中，该寡核苷酸的每个核苷间连接选择磷酸二酯和硫代磷酸酯，并且至少一种核苷间连接是硫代磷酸酯。
在某些实施例中，该寡核苷酸包括至少6个硫代磷酸酯核苷间连接。在某些实施例中，该寡核苷酸包括至少8个硫代磷酸酯核苷间连接。在某些实施例中，该寡核苷酸包括至少10个硫代磷酸酯核苷间连接。在某些实施例中，该寡核苷酸包括至少6个连续硫代磷酸酯核苷间连接的至少一个嵌段。在某些实施例中，该寡核苷酸包括至少8个连续硫代磷酸酯核苷间连接的至少一个嵌段。在某些实施例中，该寡核苷酸包括至少10个连续硫代磷酸酯核苷间连接的至少一个嵌段。在某些实施例中，该寡核苷酸包括至少12个连续硫代磷酸酯核苷间连接的至少一个嵌段。在某些这样的实施例中，至少一个此类嵌段位于该寡核苷酸的3’端。在某些这样的实施例中，至少一个此类嵌段位于该寡核苷酸的3’端的3个核苷内。
在某些实施例中，寡核苷酸包括一个或多个甲基膦酸酯连接。在某些实施例中，具有缺口体核苷基序的寡核苷酸包括包含除一个或两个甲基膦酸酯连接之外的所有硫代磷酸酯连接的连接基序。在某些实施例中，一个甲基膦酸酯连接在具有缺口体核苷基序的寡核苷酸的中心缺口中。
在某些实施例中，令人希望的是将硫代磷酸酯核苷间连接和磷酸二酯核苷间连接的数目布置成维持核酸酶抗性。在某些实施例中，令人希望的是将硫代磷酸酯核苷间连接的数目和位置以及磷酸二酯核苷间连接的数目和位置布置成维持核酸酶抗性。在某些实施例中，可以减少硫代磷酸酯核苷间连接的数目，并且可以增加磷酸二酯核苷间连接的数目。在某些实施例中，可以减少硫代磷酸酯核苷间连接的数目，并且可以增加磷酸二酯核苷间连接的数目，同时仍维持核酸酶抗性。在某些实施例中，令人希望的是减少硫代磷酸酯核苷间连接的数目，同时保留核酸酶抗性。在某些实施例中，令人希望的是增加磷酸二酯核苷间连接的数目，同时保留核酸酶抗性。
3.某些基序
在某些实施例中，本文描述的化合物包括寡核苷酸。寡核苷酸可以具有基序，例如未经修饰的和/或修饰的糖部分、核碱基、和/或核苷间连接的模式。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸包括一个或多个修饰的核苷，这些核苷包含修饰的糖。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸包括一个或多个修饰的核苷，这些核苷包含修饰的核碱基。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸包括一个或多个修饰的核苷间连接。在这样的实施例中，修饰的寡核苷酸的修饰的、未经修饰的、和不同修饰的糖部分、核碱基、和/或核苷间连接限定了模式或基序。在某些实施例中，糖部分、核碱基、和核苷间连接的模式是各自彼此独立的。因此，修饰的寡核苷酸可以由其糖基序、核碱基基序和/或核苷间连接基序来描述(如本文使用的，独立于核碱基的序列，核碱基基序描述了对这些核碱基的修饰)。
a.某些糖基序
在某些实施例中，本文描述的化合物包括寡核苷酸。在某些实施例中，寡核苷酸包括一种或多种类型的沿着该寡核苷酸或其区域布置成限定模式或糖基序的修饰的糖和/或未经修饰的糖部分。在某些情况下，此类糖基序包括但不限于本文讨论的糖修饰中的任一种。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸包括具有缺口体基序的区域或由其组成，该缺口体基序包括两个外部区域或“翼”和中心或内部区域或“缺口”。缺口体基序的这三个区域(5’-翼、缺口、和3’-翼)形成连续序列的核苷，其中这些翼中每者的核苷的糖部分中的至少一些不同于该缺口的核苷的糖部分中的至少一些。具体地，至少每个翼的离缺口最近的核苷(5’-翼的最3’核苷和3’-翼的最5’核苷)的糖部分不同于相邻缺口核苷的糖部分，因此在翼与缺口之间限定了边界(即，翼/缺口接点)。在某些实施例中，缺口内的糖部分彼此相同。在某些实施例中，该缺口包括一个或多个具有以下糖部分的核苷，该糖部分不同于该缺口的一个或多个其他核苷的糖部分。在某些实施例中，这两个翼的糖基序彼此相同(对称缺口体)。在某些实施例中，5’-翼的糖基序不同于3’-翼的糖基序(不对称缺口体)。
在某些实施例中，缺口体的翼包括1-5个核苷。在某些实施例中，缺口体的翼包括2-5个核苷。在某些实施例中，缺口体的翼包括3-5个核苷。在某些实施例中，缺口体的核苷全部是修饰的核苷。
在某些实施例中，缺口体的缺口包括7-12个核苷。在某些实施例中，缺口体的缺口包括7-10个核苷。在某些实施例中，缺口体的缺口包括8-10个核苷。在某些实施例中，缺口体的缺口包括10个核苷。在某些实施例中，缺口体的缺口的每个核苷都是未经修饰的2’-脱氧核苷。
在某些实施例中，该缺口体是脱氧缺口体。在这样的实施例中，每个翼/缺口接点的缺口侧上的核苷是未经修饰的2’-脱氧核苷，并且每个翼/缺口接点的翼侧上的核苷是修饰的核苷。在某些这样的实施例中，该缺口的每个核苷都是未经修饰的2’-脱氧核苷。在某些这样的实施例中，每个翼的每个核苷都是修饰的核苷。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸具有完全修饰的糖基序，其中修饰的寡核苷酸的每个核苷包含修饰的糖部分。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸包括具有完全修饰的糖基序的区域，或由该区域组成，其中该区域的每个核苷包含修饰的糖部分。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸包括具有完全修饰的糖基序的区域或由其组成，其中该完全修饰的区域内的每个核苷都包括相同的修饰的糖部分，本文被称为一致修饰的糖基序。在某些实施例中，完全修饰的寡核苷酸是一致修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，一致修饰的寡核苷酸的每个核苷都包括相同的2’-修饰。
b.某些核碱基基序
在某些实施例中，本文描述的化合物包括寡核苷酸。在某些实施例中，寡核苷酸包括沿着该寡核苷酸或其区域布置成限定模式或基序的修饰的和/或未经修饰的核碱基。在某些实施例中，每个核碱基都被修饰。在某些实施例中，这些核碱基都未被修饰。在某些实施例中，每个嘌呤或每个嘧啶被修饰。在某些实施例中，每个腺嘌呤被修饰。在某些实施例中，每个鸟嘌呤被修饰。在某些实施例中，每个胸腺嘧啶被修饰。在某些实施例中，每个尿嘧啶被修饰。在某些实施例中，每个胞嘧啶被修饰。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸中的一些或全部胞嘧啶核碱基是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸包括修饰的核碱基的嵌段。在某些这样的实施例中，该嵌段在该寡核苷酸的3’-端处。在某些实施例中，该嵌段在该寡核苷酸的3’-端的3个核苷内。在某些实施例中，该嵌段在该寡核苷酸的5’-端处。在某些实施例中，该嵌段在该寡核苷酸的5’-端的3个核苷内。
在某些实施例中，具有缺口体基序的寡核苷酸包括包含修饰的核碱基的核苷。在某些这样的实施例中，包含修饰的核碱基的一个核苷在具有缺口体基序的寡核苷酸的中心缺口中。在某些这样的实施例中，该核苷的糖部分是2’-脱氧核糖基部分。在某些实施例中，该修饰的核碱基选自：2-硫代嘧啶和5-丙炔嘧啶。
c.某些核苷间连接基序
在某些实施例中，本文描述的化合物包括寡核苷酸。在某些实施例中，寡核苷酸包括沿着该寡核苷酸或其区域布置成限定模式或基序的修饰的和/或未经修饰的核苷间连接。在某些实施例中，基本上每个核苷间连接基团都是磷酸酯核苷间连接(P＝O)。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的每个核苷间连接基团都是硫代磷酸酯(P＝S)。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的每个核苷间连接基团独立地选自硫代磷酸酯和磷酸酯核苷间连接。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的糖基序是缺口体，并且该缺口内的核苷间连接全部是修饰的。在某些这样的实施例中，这些翼中的一些或所有核苷间连接是未经修饰的磷酸酯连接。在某些实施例中，末端核苷间连接是修饰的。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的糖基序是缺口体，并且核苷间连接基序在至少一个翼中包含至少一个磷酸二酯核苷间连接，其中该至少一个磷酸二酯连接不是末端核苷间连接，并且剩余的核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接。在某些这样的实施例中，所有硫代磷酸酯连接都是立体随机的。在某些实施例中，翼中的所有硫代磷酸酯连接是(Sp)硫代磷酸酯，并且缺口包含至少一个Sp、Sp、Rp基序。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸群体富含包含此类核苷间连接基序的修饰的寡核苷酸。
4.某些修饰的寡核苷酸
在某些实施例中，本文描述的化合物包括修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，将以上这些修饰(糖、核碱基、核苷间连接)掺入修饰的寡核苷酸中。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸通过其修饰、基序、和总长度来表征。在某些实施例中，此类参数各自彼此独立。因此，除非另外指明，具有缺口体糖基序的寡核苷酸的每个核苷间连接都可以是修饰的或未经修饰的，并且可以或可以不遵循这些糖修饰的缺口体修饰模式。例如，糖缺口体的翼区域内的核苷间连接可以彼此相同或不同，并且可以与糖基序的缺口区域的核苷间连接相同或不同。同样地，独立于这些糖修饰的缺口体模式，此类缺口体寡核苷酸可以包括一个或多个修饰的核碱基。此外，在某些情况下，通过总长度或范围并且通过两个或更多个区域(例如，具有指定糖修饰的核苷的区域)的长度或长度范围来描述寡核苷酸。在此类情况下，可以针对每个范围选择以下数值，这些数值导致具有超出指定范围的总长度的寡核苷酸。在此类情况下，两种因素必需满足。例如，在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由15-20个连接的核苷组成并具有由三个区域(A、B、和C)组成的糖基序，其中区域A由具有指定糖基序的2-6个连接的核苷组成，区域B由具有指定糖基序的6-10个连接的核苷组成，并且区域C由具有指定糖基序的2-6个连接的核苷组成。此类实施例不包括修饰的寡核苷酸，其中A和C各自由6个连接的核苷组成，并且B由10个连接的核苷组成(即使核苷的那些数量在A、B、和C的要求内允许)，因为这样的寡核苷酸的总长度将是22，该长度超过修饰的寡核苷酸的总长度的上限(20)。在此，如果相对于一个或多个参数，寡核苷酸的描述是未提及的，则这样的参数不受限。因此，仅被描述为具有缺口体糖基序而没有进一步描述的修饰的寡核苷酸可以具有任何长度、核苷间连接基序、和核碱基基序。除非另外指明，所有修饰都独立于核碱基序列。
某些缀合的化合物
在某些实施例中，在此描述的这些化合物包括寡核苷酸(修饰的或未修饰的)以及任选地一个或多个缀合物基团和/或端基，或由其组成。缀合物基团由一个或多个缀合物部分和缀合物接头组成，该缀合物接头将缀合物部分连接至寡核苷酸。缀合物基团可以附接至寡核苷酸的任一端或两端和/或附接在任何内部位置处。在某些实施例中，缀合物基团附接至修饰的寡核苷酸的核苷的2’-位。某些实施例中，附接至寡核苷酸的任一端或两端的缀合物基团是端基。在某些这样的实施例中，缀合物基团或端基附接在寡核苷酸的3’和/或5’-端处。在某些这样的实施例中，缀合物基团(或端基)附接在寡核苷酸的3’-端处。在某些实施例中，缀合物基团附接在寡核苷酸的3’-端附近。在某些实施例中，缀合物基团(或端基)附接在寡核苷酸的5’-端处。在某些实施例中，缀合物基团附接在寡核苷酸的5’-端附近。
在某些实施例中，该寡核苷酸被修饰。在某些实施例中，化合物的寡核苷酸具有与靶核酸互补的核碱基序列。在某些实施例中，寡核苷酸与信使RNA(mRNA)互补。在某些实施例中，寡核苷酸与前mRNA互补。在某些实施例中，寡核苷酸与有义转录物互补。
端基的实例包括但不限于缀合物基团、加帽基团、磷酸酯部分、保护基团、修饰的或未经修饰的核苷、以及两个或更多个独立地修饰的或未经修饰的核苷。
A.某些缀合物基团
在某些实施例中，寡核苷酸共价地附接至一个或多个缀合物基团。在某些实施例中，缀合物基团修饰所附接的寡核苷酸的一种或多种特性，包括但不限于药效动力学、药代动力学、稳定性、结合、吸收、组织分布、细胞分布、细胞摄取、电荷以及清除。在某些实施例中，缀合物基团赋予所附接的寡核苷酸新的特性，例如使得能够检测该寡核苷酸的荧光团或报告基团。
先前已经描述了某些缀合物基团和缀合物部分，例如：胆固醇部分(Letsinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]，1989，86，6553-6556)，胆酸(Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.[生物有机化学与医药化学快报]，1994，4，1053-1060)，硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.[纽约科学院年鉴]，1992，660，306-309；Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.[生物有机化学与医药化学快报]，1993，3，2765-2770)，巯基胆固醇(Oberhauser等人，Nucl.Acids Res.[核酸研究]，1992，20，533-538)，脂肪链例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等人，EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]，1991，10，1111-1118；Kabanov等人，FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]，1990，259，327-330；Svinarchuk等人，Biochimie[生物化学]，1993，75，49-54)，磷脂例如二-十六烷基-外消旋-丙三醇或三乙铵1，2-二-O-十六烷基-外消旋-丙三基-3-H-磷酸酯(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.[四面体快报]，1995，36，3651-3654；Shea等人，Nucl.Acids Res.[核酸研究]，1990，18，3777-3783)，聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等人，Nucleosides&Nucleotides[核苷和核苷酸]1995，14，969-973)，或金刚烷乙酸，棕榈基部分(Mishra等人，Biochim.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学学报]，1995，1264，229-237)，十八胺或己基氨基-羰基-羟胆固醇部分(Ctooke等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.[药理学和实验治疗学杂志]，1996，i，923-937)，生育酚基团(Nishina等人，Molecular Therapy Nucleic Acids[分子治疗-核酸]，2015，4，e220；doi：10.1038/mtna.2014.72和Nishina等人，Molecular Therapy[分子治疗]，2008，16，734-740)，或GalNAc簇(例如，WO 2014/179620)。
1.缀合物部分
缀合物部分包括但不限于，嵌入剂、报告分子、聚胺、聚酰胺、肽、碳水化合物(例如，GalNAc)、维生素部分、聚乙二醇、硫醚、聚醚、胆固醇、巯基胆固醇、胆酸部分、叶酸、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、菲啶、蒽醌、金刚烷、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素、荧光团、以及染料。
在某些实施例中，缀合物部分包括活性药品，例如，阿司匹林、华法令、保泰松、布洛芬、舒洛芬、芬布芬、酮洛芬、(S)-(+)-普拉洛芬、卡洛芬、丹肌氨酸、2，3，5-三碘苯甲酸、芬戈莫德、氟芬那酸、亚叶酸、苯并噻二嗪、氟噻嗪、二氮杂卓、吲哚美辛、巴比妥、头孢菌素、磺胺类药物、抗糖尿病药、抗菌药或抗生素。
2.缀合物接头
缀合物部分通过缀合物接头附接至寡核苷酸。在某些实施例中，缀合物基团是单一化学键(即，通过单键，缀合物部分经缀合物接头附接至寡核苷酸)。在某些实施例中，该缀合物接头包括链结构(如烃基链)，或重复单位(如乙二醇、核苷、或氨基酸单位)的寡聚体。
在某些实施例中，缀合物接头包括一个或多个选自以下项的基团：烷基、氨基、氧代、酰胺、二硫化物、聚乙二醇、醚、硫醚、以及羟基氨基。在某些这样的实施例中，该缀合物接头包括选自以下项的基团：烷基、氨基、氧代、酰胺以及醚基。在某些实施例中，该缀合物接头包括选自烷基和酰胺基团的基团。在某些实施例中，该缀合物接头包括选自烷基和醚基的基团。在某些实施例中，该缀合物接头包括至少一个磷部分。在某些实施例中，该缀合物接头包括至少一个磷酸酯基团。在某些实施例中，该缀合物接头包括至少一个中性连接基团。
在某些实施例中，缀合物接头(包括上文描述的缀合物接头)是双功能连接部分，例如本领域中已知的可用于将缀合物基团附接至母体化合物(如本文提供的寡核苷酸)的那些。通常，双功能连接部分包括至少两个官能团。官能团之一被选择为结合至化合物上的特定位点，并且另一官能团被选择为结合至缀合物基团。用于双功能连接部分中的官能团的实例包括但不限于用于与亲核基团反应的亲电子试剂和用于与亲电子基团反应的亲核试剂。在某些实施例中，双功能连接部分包括一个或多个选自以下项的基团：氨基、羟基、羧酸、硫醇、烷基、烯基、以及炔基。
缀合物接头的实例包括但不限于吡咯烷、8-氨基-3，6-二氧杂辛酸(ADO)、琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)和6-氨基己酸(AHEX或AHA)。其他缀合物接头包括但不限于取代的或未取代的C1-C10烷基、取代的或未取代的C2-C10烯基或取代的或未取代的C2-C10炔基，其中优选取代基基团的非限制性列表包括羟基、氨基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基、硫醇、硫代烷氧基、卤素、烷基、芳基、烯基以及炔基。
在某些实施例中，缀合物接头包括1-10个接头-核苷。在某些实施例中，此类接头-核苷是修饰的核苷。在某些实施例中，此类接头-核苷包括修饰的糖部分。在某些实施例中，接头-核苷是未修饰的。在某些实施例中，接头-核苷包括选自以下项的任选地受保护的杂环碱基：嘌呤、取代的嘌呤、嘧啶或取代的嘧啶。在某些实施例中，可切割的部分是选自以下项的核苷：尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、4-N-苯甲酰基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、4-N-苯甲酰基-5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤、6-N-苯甲酰基腺嘌呤、鸟嘌呤以及2-N-异丁酰基鸟嘌呤。通常理想的是接头-核苷在其到达靶组织后从该化合物上被切割下来。因此，接头-核苷通常通过可切割键彼此连接并与化合物的剩余部分连接。在某些实施例中，此类可切割的键是磷酸二酯键。
本文，不认为接头-核苷是该寡核苷酸的一部分。因此，在以下实施例中，其中化合物包括由指定数目或范围的连接的核苷组成的和/或对于参考核酸的指定百分比互补性的寡核苷酸，并且该化合物还包括包含缀合物接头的缀合物基团，该缀合物接头含有接头-核苷，那些接头-核苷不计入寡核苷酸的长度并且不用于确定寡核苷酸对于参考核酸的百分比互补性。例如，化合物可以包括(1)由8-30个核苷组成的修饰的寡核苷酸，和(2)包含1-10个接头-核苷的缀合物基团，这些接头-核苷与修饰的寡核苷酸的核苷邻接。在这样的化合物中的连续连接的核苷的总数超过30个。可替代地，化合物可以包括修饰的寡核苷酸，该寡核苷酸由8-30个核苷组成并且没有缀合物基团。在这样的化合物中的连续连接的核苷的总数不超过30个。除非另有说明，缀合物接头包括不超过10个接头-核苷。在某些实施例中，缀合物接头包括不超过5个接头-核苷。在某些实施例中，缀合物接头包括不超过3个接头-核苷。在某些实施例中，缀合物接头包括不超过2个接头-核苷。在某些实施例中，缀合物接头包括不超过1个接头-核苷。
在某些实施例中，理想的是缀合物基团从寡核苷酸上切割下来。例如，在某些情况下，包含特定缀合物部分的化合物被特定细胞类型更好地吸收，但是一旦化合物被吸收，则理想的是缀合物基团被切割以释放未缀合的或母体寡核苷酸。因此，某些缀合物可以包含一个或多个可切割部分，典型地在缀合物接头内。在某些实施例中，可切割的部分是可切割的键。在某些实施例中，可切割的部分是包含至少一个可切割的键的一组原子。在某些实施例中，可切割的部分包括具有一个、两个、三个、四个、或超过四个可切割的键的一组原子。在某些实施例中，可切割的部分被选择性地在细胞或亚细胞区室(如溶酶体)内切割。在某些实施例中，可切割的部分被内源酶(如核酸酶)选择性地切割。
在某些实施例中，可切割的键选自：酰胺、酯、醚、磷酸二酯的一个酯或两个酯、磷酸酯、氨基甲酸酯、或二硫化物。在某些实施例中，可切割的键是磷酸二酯的一个酯或两个酯。在某些实施例中，可切割的部分包括磷酸酯或磷酸二酯。在某些实施例中，该可切割的部分是寡核苷酸与缀合物部分或缀合物基团之间的磷酸酯连接。
在某些实施例中，可切割的部分包括一个或多个接头-核苷或由其组成。在某些这样的实施例中，一个或多个接头-核苷通过可切割的键彼此连接和/或与化合物的剩余部分连接。在某些实施例中，此类可切割的键是未经修饰的磷酸二酯键。在某些实施例中，可切割的部分是2′-脱氧核苷，该脱氧核苷通过磷酸酯核苷间连接附接至寡核苷酸的3′或5′-末端核苷并且通过磷酸酯或硫代磷酸酯连接共价地附接至缀合物接头或缀合物基团的剩余部分。在某些这样的实施例中，该可切割的部分是2′-脱氧腺苷。
3.某些靶向细胞的缀合物部分
在某些实施例中，缀合物基团包括靶向细胞的缀合物部分。在某些实施例中，缀合物基团具有以下通式：
其中n是从1至约3(当n是1时m是0；当n是2或更大时m是1)，j是1或0，并且k是1或0。
在某些实施例中，n是1，j是1并且k是0。在某些实施例中，n是1，j是0并且k是1。在某些实施例中，n是1，j是1并且k是1。在某些实施例中，n是2，j是1并且k是0。在某些实施例中，n是2，j是0并且k是1。在某些实施例中，n是2，j是1并且k是1。在某些实施例中，n是3，j是1并且k是0。在某些实施例中，n是3，j是0并且k是1。在某些实施例中，n是3，j是1并且k是1。
在某些实施例中，缀合物基团包括具有至少一个系链配体的靶向细胞的部分。在某些实施例中，靶向细胞的部分包括两个共价地附接至分支基团的系链配体。在某些实施例中，靶向细胞的部分包括三个共价地附接至分支基团的系链配体。
在某些实施例中，该靶向细胞的部分包括包含一个或多个选自以下项的基团的分支基团：烷基、氨基、氧代、酰胺、二硫化物、聚乙二醇、醚、硫醚以及羟基氨基基团。在某些实施例中，该分支基团包括包含选自以下项的基团的分支的脂族基：烷基、氨基、氧代、酰胺、二硫化物、聚乙二醇、醚、硫醚以及羟基氨基基团。在某些这样的实施例中，该分支的脂族基包括选自以下项的基团：烷基、氨基、氧代、酰胺以及醚基。在某些这样的实施例中，该分支的脂族基包括选自以下项的基团：烷基、氨基和醚基。在某些这样的实施例中，该分支的脂族基包括选自烷基和醚基的基团。在某些实施例中，该分支基团包括单环的或多环的环系统。
在某些实施例中，靶向细胞的部分的每个系链以任何组合包括一个或多个选自以下项的基团：烷基、取代的烷基、醚、硫醚、二硫化物、氨基、氧代、酰胺、磷酸二酯、以及聚乙二醇。在某些实施例中，每个系链是以任何组合包含一个或多个选自以下项的基团的直链脂族基：烷基、醚、硫醚、二硫化物、氨基、氧代、酰胺、以及聚乙二醇。在某些实施例中，每个系链是以任何组合包含一个或多个选自以下项的基团的直链脂族基：烷基、磷酸二酯、醚、氨基、氧代、以及酰胺。在某些实施例中，每个系链是以任何组合包含一个或多个选自以下项的基团的直链脂族基：烷基、醚、氨基、氧代、以及酰胺。在某些实施例中，每个系链是以任何组合包含一个或多个选自以下项的基团的直链脂族基：烷基、氨基、和氧代。在某些实施例中，每个系链是以任何组合包含一个或多个选自烷基和氧代的基团的直链脂族基。在某些实施例中，每个系链是以任何组合包含一个或多个选自烷基和磷酸二酯的基团的直链脂族基。在某些实施例中，每个系链包括至少一个磷连接基团或中性连接基团。在某些实施例中，每个系链包括长约6至约20个原子的链。在某些实施例中，每个系链包括长约10至约18个原子的链。在某些实施例中，每个系链包括的链长约10个原子。
在某些实施例中，靶向细胞的部分的每个配体都对靶细胞上的至少一种类型的受体具有亲和力。在某些实施例中，每个配体都对哺乳动物肝细胞表面上的至少一种类型的受体具有亲和力。在某些实施例中，每个配体都对肝脱唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)具有亲和力。在某些实施例中，每个配体都是碳水化合物。在某些实施例中，每个配体都独立地选自半乳糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、甘露糖、葡萄糖、葡糖胺以及海藻糖。在某些实施例中，每个配体都是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。在某些实施例中，该靶向细胞的部分包括3个GalNAc配体。在某些实施例中，该靶向细胞的部分包括2个GalNAc配体。在某些实施例中，该靶向细胞的部分包括1个GalNAc配体。
在某些实施例中，靶向细胞的部分的每个配体都是碳水化合物、碳水化合物衍生物、修饰的碳水化合物、多糖、修饰的多糖、或多糖衍生物。在某些这样的实施例中，该缀合物基团包括碳水化合物簇(参见，例如，Maier等人，“Synthesis of AntisenseOligonucleotides Conjugated to a Multivalent Carbohydrate Cluster forCellular Targeting[缀合至用于细胞靶向的多价碳水化合物簇的反义寡核苷酸的合成]，”Bioconjugate Chemistry[生物缀合物化学]，2003，14，18-29，或Rensen等人，“Design and Synthesis of Novel N-Acetylgalactosamine-Terminated G1ycolipidsfor Targeting of Lipoproteins to the Hepatic Asiaglycoprotein Receptor[用于将脂蛋白靶向肝脱唾液酸糖蛋白受体的新颖N-乙酰半乳糖胺封端的糖脂的设计与合成]，”J.Med.Chem.[药物化学杂志]2004，47，5798-5808，这些文献通过引用以其全文并入)。在某些这样的实施例中，每个配体都是氨基糖或硫糖。例如，氨基糖可以选自本领域已知的任何数目的化合物，如唾液酸、α-D-半乳糖胺、β-胞壁酸、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡糖、4，6-二脱氧-4-甲酰胺基-2，3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡糖和N-磺基-D-葡糖胺、以及N-乙醇酰基-α-神经氨酸。例如，硫糖可以选自5-硫代-β-D-吡喃葡糖、甲基2，3，4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡糖苷、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、以及乙基3，4，6，7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1，5-二硫代-α-D-葡-庚吡喃糖苷(heptopyranoside)。
在某些实施例中，缀合物基团包括具有以下化学式的靶向细胞的部分：
在某些实施例中，缀合物基团包括具有以下化学式的靶向细胞的部分：
在某些实施例中，缀合物基团包括具有以下化学式的靶向细胞的部分：
在某些实施例中，本文描述的化合物包括本文描述为“LICA-1”的缀合物基团。以下显示LICA-1在缀合物接头末端没有任选的可切割的部分：
在某些实施例中，本文描述的化合物包括LICA-1和缀合物接头内的可切割的部分，该化合物具有下式：
其中‘oligo’是寡核苷酸。
传授了上文指出的缀合物基团，以及包含缀合物基团、系链、缀合物接头、分支基团、配体、可切割的部分以及其他修饰的化合物中某些的制备的代表性公开物包括但不限于US 5,994,517、US 6,300,319、US 6,660,720、US 6,906,182、US 7,262,177、US 7,491,805、US 8,106,022、US 7,723,509、US 9,127,276、US 2006/0148740、US 2011/0123520、WO2013/033230和WO 2012/037254，Biessen等人，J.Med.Chem.[药物化学杂志]1995，38，1846-1852，Lee等人，Bioorganic&Medicinal Chemistry[生物有机化学与医药化学]2011，19，2494-2500，Rensen等人，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]2001，276，37577-37584，Rensen等人，J.Med.Chem.[药物化学杂志]2004，47，5798-5808，Sliedregt等人，J.Med.Chem.[药物化学杂志]1999，42，609-618，和Valentijn等人，Tetrahedron[四面体]1997，53，759-770，将其各自通过引用以其全文并入。
在某些实施例中，本文描述的化合物包括包含缺口体或完全修饰的基序的修饰的寡核苷酸以及包含至少一个、两个、或三个GalNAc配体的缀合物基团。在某些实施例中，本文描述的化合物包括在以下参考文献任一项中所发现的缀合物基团：Lee，Carbohydr Res[碳水化合物研究]，1978，67，509-514；Connolly等人，J Biol Chem[生物化学杂志]，1982，257，939-945；Pavia等人，Int JPep Protein Res[肽与蛋白质研究国际杂志]，1983，22，539-548；Lee等人，Biochem[生物化学]，1984，23，4255-4261；Lee等人，Glycoconjugate J[糖缀合物杂志]，1987，4，317-328；Toyokuni等人，Tetrahedron Lett[四面体快报]，1990，31，2673-2676；Biessen等人，J Med Chem[药物化学杂志]，1995，38，1538-1546；Valentijn等人，Tetrahedron[四面体]，1997，53，759-770；Kim等人，Tetrahedron Lett[四面体快报]，1997，38，3487-3490；Lee等人，Bioconjug Chem[生物缀合物化学]，1997，8，762-765；Kato等人，Glycobiol[糖生物学]，2001，11，821-829；Rensen等人，J Biol Chem[生物化学杂志]，200l，276，37577-37584；Lee等人，Methods Enzymol[酶学方法]，2003，362，38-43；Westerlind等人，Glycoconj J[糖缀合物杂志]，2004，21，227-241；Lee等人，Bioorg MedChem Lett[生物有机化学与医药化学快报]，2006，16(19)，5132-5135；Maierhofer等人，Bioorg Med Chem[生物有机化学与医药化学]，2007，15，7661-7676；Khorev等人，BioorgMed Chem[生物有机化学与医药化学]，2008，16，5216-5231；Lee等人，Bioorg Med Chem[生物有机化学与医药化学]，2011，19，2494-2500；Komilova等人，Analyt Biochem[分析生物化学]，2012，425，43-46；Pujol等人，Angew Chemie Int Ed Engl[应用化学-英文国际版]，2012，51，7445-7448；Biessen等人，J Med Chem[药物化学杂志]，1995，38，1846-1852；Sliedregt等人，J Med Chem[药物化学杂志]，1999，42，609-618；Rensen等人，J Med Chem[药物化学杂志]，2004，47，5798-5808；Rensen等人，Arterioscler Thromb Vasc Biol[动脉硬化血栓与血管生物学]，2006，26，169-175；van Rossenberg等人，Gene Ther[基因治疗]，2004，11，457-464；Sato等人，J Am Chem Soc[美国化学会志]，2004，126，14013-14022；Lee等人，J Org Chem[有机化学杂志]，2012，77，7564-7571；Biessen等人，FASEB J[美国实验生物学会联合会会志]，2000，14，1784-1792；Rajur等人，Bioconjug Chem[生物缀合物化学]，1997，8，935-940；Duff等人，Methods Enzymol[酶学方法]，2000，313，297-321；Maier等人，Bioconjug Chem[生物缀合物化学]，2003，14，18-29；Jayaprakash等人，Org Lett[有机快报]，2010，12，5410-5413；Manoharan，Antisense Nucleic Acid DrugDev[反义核酸药物开发]，2002，12，103-128；Merwin等人，Bioconjug Chem[生物缀合物化学]，1994，5，612-620；Tomiya等人，Bioorg Med Chem[生物有机化学与医药化学]，2013，21，5275-5281；国际申请WO1998/013381；WO 2011/038356；WO 1997/046098；WO 2008/098788；WO 2004/101619；WO 2012/037254；WO 2011/120053；WO 2011/100131；WO 2011/163121；WO 2012/177947；WO 2013/033230；WO 2013/075035；WO 2012/083185；WO 2012/083046；WO 2009/082607；WO 2009/134487；WO 2010/144740；WO 2010/148013；WO 1997/020563；WO 2010/088537；WO 2002/043771；WO 2010/129709；WO 2012/068187；WO 2009/126933；WO 2004/024757；WO 2010/054406；WO 2012/089352；WO 2012/089602；WO 2013/166121；WO 2013/165816；美国专利4,751,219；8,552,163；6,908,903；7,262,177；5,994,517；6,300,319；8,106,022；7,491,805；7,491,805；7,582,744；8,137,695；6,383,812；6,525,031；6,660,720；7,723,509；8,541,548；8,344,125；8,313,772；8,349,308；8,450,467；8,501,930；8,158,601；7,262,177；6,906,182；6,620,916；8,435,491；8,404,862；7,851,615；公开的美国专利申请公开US 2011/0097264；US 2011/0097265；US 2013/0004427；US 2005/0164235；US 2006/0148740；US 2008/0281044；US 2010/0240730；US2003/0119724；US 2006/0183886；US 2008/0206869；US 2011/0269814；US 2009/0286973；US 2011/0207799；US 2012/0136042；US 2012/0165393；US 2008/0281041；US 2009/0203135；US 2012/0035115；US 2012/0095075；US 2012/0101148；US 2012/0128760；US2012/0157509；US 2012/0230938；US 2013/0109817；US 2013/0121954；US 2013/0178512；US 2013/0236968；US 2011/0123520；US 2003/0077829；US 2008/0108801；以及US 2009/0203132；将其各自通过引用以其全文而结合。
组合物和用于配制药物组合物的方法
可以将本文描述的化合物与药学上可接受的活性或惰性物质混合以制备药物组合物或配制品。组合物和用于配制药物组合物的方法取决于多个标准，包括但不限于施用途径、疾病程度、或待施用的剂量。
某些实施例提供了包含一种或多种化合物或其盐的药物组合物。在某些实施例中，这些化合物是反义化合物或寡聚化合物。在某些实施例中，这些化合物包括修饰的寡核苷酸或由其组成。在某些这样的实施例中，该药物组合物包括合适的药学上可接受的稀释剂或载体。在某些实施例中，药物组合物包括无菌盐溶液和一种或多种化合物。在某些实施例中，这样的药物组合物由无菌盐溶液和一种或多种化合物组成。在某些实施例中，该无菌盐水是药用级盐水。在某些实施例中，药物组合物包括一种或多种化合物和无菌水。在某些实施例中，药物组合物由一种化合物和无菌水组成。在某些实施例中，该无菌水是药用级水。在某些实施例中，药物组合物包括一种或多种化合物和磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在某些实施例中，药物组合物由一种或多种化合物和无菌PBS组成。在某些实施例中，该无菌PBS是药用级PBS。组合物和用于配制药物组合物的方法取决于多个标准，包括但不限于施用途径、疾病程度、或待施用的剂量。
可以在药物组合物中利用靶向PNPLA3核酸的本文描述的化合物，这些药物组合物通过将该化合物与合适的药学上可接受的稀释剂或载体组合而获得。在某些实施例中，药学上可接受的稀释剂是水，如适于注射的无菌水。因此，在一个实施例中，本文描述的方法中采用的是包含靶向PNPLA3核酸的化合物和药学上可接受的稀释剂的药物组合物。在某些实施例中，该药学上可接受的稀释剂是水。在某些实施例中，该化合物包括本文提供的修饰的寡核苷酸或由其组成。
包含本文提供的化合物的药物组合物涵盖任何药学上可接受的盐、酯、或此类酯的盐、或任何其他寡核苷酸，它们在被施用动物(包括人)后能够提供(直接地或间接地)生物上具有活性的代谢物或其残余物。在某些实施例中，这些化合物是反义化合物或寡聚化合物。在某些实施例中，该化合物包括修饰的寡核苷酸或由其组成。因此，例如，本披露还涉及化合物的药学上可接受的盐、前药、这些前药的药学上可接受的盐、以及其他生物等效物。合适的药学上可接受的盐包括但不限于钠盐和钾盐。
前药可以包括在化合物的一端或两端掺入另外的核苷，所述核苷在体内被内源核酸酶切割，以形成活性化合物。
在某些实施例中，这些化合物或组合物进一步包括药学上可接受的载体或稀释剂。
某些选择的化合物
在若干细胞类型中在体外对具有各种长度、化学成分、和基序的大约2,384种新设计的化合物测试其对人PNPLA3 mRNA的影响(实例1)。在体外以单剂量针对效力测试的2,384种化合物中，在A431细胞中针对剂量依赖性抑制测试超过400种选择的化合物(实例2)。在通过剂量反应测定法测试的超过400种化合物中，在BALB/c小鼠模型中进一步筛选化合物的高剂量耐受性，并且在PNPLA3转基因小鼠模型中选择87种寡核苷酸用于体内功效。
在转基因小鼠模型中测试的87种寡核苷酸中，选择23种寡核苷酸以进一步测试临床前罗德尔(rodel)模型中的耐受性。在体内啮齿动物耐受性模型中测量体重和器官重量、肝功能标记物(如丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶和胆红素)、肾功能标记物(例如BUN和肌酸酐)。在CD1小鼠模型和斯普拉-道来(Sprague-Dawley)大鼠模型中，发现ION 975591、975605、975612、975613、975616、975617、975735、975736、994282、和994284是耐受的(实例5和6)。
在PNPLA3转基因小鼠中在多剂量测定中进一步测试这些化合物的功效(实例7)。
测试了ION 994284、97605、975616、994282、975613、975617、975735、975736、和975612在食蟹猴中的耐受性(实例8)。在猴子中用化合物治疗是耐受良好的。
因此，本文提供的是具有任何一种或多种改进特性的化合物。在某些实施例中，如本文描述的这些化合物是强效和可耐受的。
实例
以下实例描述了用于鉴定靶向PNPLA3的先导化合物的筛选过程。ION 994284、97605、975616、994282、975613、975617、975735、975736、975612导致高效力和耐受性。
非限制性披露和通过引用并入
虽然本文件所附序列表将每个序列根据需要鉴定为“RNA”或“DNA”，但实际上那些序列可以用化学修饰的任何组合进行修饰。本领域的技术人员应容易地意识到，如“RNA”或“DNA”这样的名称描述修饰的寡核苷酸在某些情况下是任意的。例如，包含含有2’-OH糖部分和胸腺嘧啶碱基的核苷的寡核苷酸可以被描述为具有修饰的糖(针对DNA的天然2’-H为2’-OH)的DNA或具有修饰的碱基(针对RNA的天然尿嘧啶为胸腺嘧啶(甲基化的尿嘧啶))的RNA。
因此，本文提供的核酸序列(包括但不限于在序列表中的那些)旨在涵盖含有任何组合的天然或修饰的RNA和/或DNA的核酸，包括但不限于具有修饰的核碱基的此类核酸。作为另外的实例而非限制，具有核碱基序列“ATCGATCG”的寡核苷酸涵盖具有这样的核碱基序列的任何寡核苷酸，无论是修饰的还是未经修饰的，包括但不限于包含RNA碱基的此类化合物，如具有序列“AUCGAUCG”的那些以及具有一些DNA碱基和一些RNA碱基如“AUCGATCG”的那些，以及具有其他修饰的核碱基例如“ATmCGAUCG”的化合物(其中mC表示含有在5-位置处的甲基基团的胞嘧啶碱)。
本文描述的某些化合物(例如，修饰的寡核苷酸)具有一个或多个不对称中心并且因此产生对映异构体、非对映异构体、和其他立体异构构型，就绝对立体化学而言，它们可以被定义为(R)或(S)，或定义为α或β(如针对糖异头物)，或定义为(D)或(L)(如针对氨基酸)等。本文提供的被撰写或描述为具有某些立体异构构型的化合物仅包括所示化合物。用未定义的立体化学撰写或描述的本文提供的化合物包括所有这些可能的异构体，包括它们的立体随机和光学纯形式。同样地，除非另有说明，否则包括本文提供的化合物的所有互变异构形式。除非另有说明，否则本文描述的寡聚化合物和修饰的寡核苷酸旨在包括相应的盐形式。
本文描述的化合物包括其中一个或多个原子被表明元素的非放射性同位素或放射性同位素替换的变体。例如，包含氢原子的本文的化合物涵盖对于每个1H氢原子的所有可能的氘取代。由本文的化合物涵盖的同位素取代包括但不限于：2H或3H代替1H、13C或14C代替12C、15N代替14N、17O或18O代替16O、以及33S、34S、35S、或36S代替32S。
尽管本文描述的某些化合物、组合物和方法已经根据某些实施例具体地进行了描述，但以下实例仅用以说明本文描述的化合物并不旨在限制它们。在本申请中引用的各个参考文献通过引用以其全文并入本文。
实例1：A431细胞中人PNPLA3的反义抑制
设计靶向PNPLA3核酸的反义寡核苷酸，并且针对其在体外对PNPLA3 mRNA的作用进行测试。在一系列具有类似培养条件的实验中对这些反义寡核苷酸进行测试。将每个实验的结果呈现在如下所示的单独的表中。
将下表中的新设计的嵌合反义寡核苷酸设计为3-10-3cEt缺口体。这些缺口体长16个核苷，其中中心缺口区段由十个2’-脱氧核苷构成并且在5’方向和3’方向上侧接翼区段，翼区段包括三个核苷。5’翼区段中的每个核苷和3’翼区段中的每个核苷都具有cEt糖修饰。遍及每个缺口体的核苷间连接都是硫代磷酸酯(P＝S)连接。遍及每个缺口体的所有胞嘧啶残基都是5-甲基胞嘧啶。
“起始位点”指示缺口体所靶向的人类基因序列中的最5’核苷。“终止位点”指示缺口体所靶向的人类基因序列中的最3’核苷。下表中所列的每个缺口体都靶向人PNPLA3mRNA(在本文中指定为SEQ ID NO：1(基因库登录号NM_025225.2))或人PNPLA3基因组序列(本文指定为SEQ ID NO：2(从核苷酸43921001至43954500截短的基因库登录号NC_000022.11))。‘n/a’指示反义寡核苷酸并未以100％互补性靶向该特定基因序列。
研究1
通过自由摄取，用4,000nM反义寡核苷酸转染以20,000个细胞/孔的密度培养的A431细胞。在大约24小时的处理期之后，从细胞中分离RNA，并且通过定量实时PCR测量PNPLA3 mRNA水平。将人引物探针组RTS36070(正向序列CCTTGGTATGTTCCTGCTTCA，在本文指定为SEQ ID NO：11；反向序列GTTGTCACTCACTCCTCCATC，在本文指定为SEQ ID NO：12；探针序列TGGCCTTATCCCTCCTTCCTTCAGA，在本文指定为SEQ ID NO：13)用于测量mRNA水平。如通过所测量的，根据总RNA含量调整PNPLA3 mRNA水平。将结果呈现为相对于未经处理的对照细胞的PNPLA3的抑制百分比。
表1
靶向SEQ ID NO：1和2的3-10-3 cEt缺口体对PNPLA3 mRNA的抑制
表2
靶向SEQ ID NO：1和2的3-10-3 cEt缺口体对PNPLA3 mRNA的抑制
表3
靶向SEQ ID NO：1和2的3-10-3 cEt缺口体对PNPLA3 mRNA的抑制
表4
靶向SEQ ID NO：1和2的3-10-3 cEt缺口体对PNPLA3 mRNA的抑制
表5
靶向SEQ ID NO：1和2的3-10-3 cEt缺口体对PNPLA3 mRNA的抑制
表6
靶向SEQ ID NO：1和2的3-10-3 cEt缺口体对PNPLA3 mRNA的抑制
表7
靶向SEQ ID NO：1和2的3-10-3 cEt缺口体对PNPLA3 mRNA的抑制
表8
靶向SEQ ID NO：1和2的3-10-3 cEt缺口体对PNPLA3 mRNA的抑制
表9
靶向SEQ ID NO：1和2的3-10-3 cEt缺口体对PNPLA3 mRNA的抑制
表10
靶向SEQ ID NO：1和2的3-10-3 cEt缺口体对PNPLA3 mRNA的抑制
表11
靶向SEQ ID NO：1和2的3-10-3 cEt缺口体对PNPLA3 mRNA的抑制
表12
靶向SEQ ID NO：1和2的3-10-3 cEt缺口体对PNPLA3 mRNA的抑制
表13
靶向SEQ ID NO：1和2的3-10-3 cEt缺口体对PNPLA3 mRNA的抑制
表14
靶向SEQ ID NO：1和2的3-10-3 cEt缺口体对PNPLA3 mRNA的抑制
表15
靶向SEQ ID NO：1和2的3-10-3 cEt缺口体对PNPLA3 mRNA的抑制
表16
靶向SEQ ID NO：1和2的3-10-3 cEt缺口体对PNPLA3 mRNA的抑制
表17
靶向SEQ ID NO：1和2的3-10-3 cEt缺口体对PNPLA3 mRNA的抑制
表18
靶向SEQ ID NO：1和2的3-10-3 cEt缺口体对PNPLA3 mRNA的抑制
表19
靶向SEQ ID NO：1和2的3-10-3 cEt缺口体对PNPLA3 mRNA的抑制
表20
靶向SEQ ID NO：1和2的3-10-3 cEt缺口体对PNPLA3 mRNA的抑制
表21
靶向SEQ ID NO：1和2的3-10-3 cEt缺口体对PNPLA3 mRNA的抑制
表22
靶向SEQ ID NO：1和2的3-10-3 cEt缺口体对PNPLA3 mRNA的抑制
表23
靶向SEQ ID NO：1和2的3-10-3 cEt缺口体对PNPLA3 mRNA的抑制
表24
靶向SEQ ID NO：1和2的3-10-3 cEt缺口体对PNPLA3 mRNA的抑制
还将人引物探针组RTS36075(正向序列TGAGGCTGGAGGGAGATG，在本文指定为SEQID NO：14；反向序列GCTCATGTATCCACCTITGTCT，在本文指定为SEQ ID NO：15；探针序列CTAGACCACCTGCGTCTCAGCATC，在本文指定为SEQ ID NO：16)用于测量mRNA水平。如通过所测量的，根据总RNA含量调整PNPLA3 mRNA水平。将结果呈现为相对于未经处理的对照细胞的PNPLA3的抑制百分比。
表25
靶向SEQ ID NO：1和2的3-10-3 cEt缺口体对PNPLA3 mRNA的抑制
表26
靶向SEQ ID NO：1和2的3-10-3 cEt缺口体对PNPLA3 mRNA的抑制
研究2
通过自由摄取，用1,000nM反义寡核苷酸转染以5,000个细胞/孔的密度培养的A431细胞。在大约24小时的处理期之后，从细胞中分离RNA，并且通过定量实时PCR测量PNPLA3 mRNA水平。将人引物探针组RTS36070用于测量mRNA水平。如通过所测量的，根据总RNA含量调整PNPLA3 mRNA水平。将结果呈现为相对于未经处理的对照细胞的PNPLA3的抑制百分比。
表27
靶向SEQ ID NO：1和2的3-10-3 cEt缺口体对PNPLA3 mRNA的抑制
表28
靶向SEQ ID NO：1和2的3-10-3 cEt缺口体对PNPLA3 mRNA的抑制
表29
靶向SEQ ID NO：1和2的3-10-3 cEt缺口体对PNPLA3 mRNA的抑制
表30
靶向SEQ ID NO：1和2的3-10-3 cEt缺口体对PNPLA3 mRNA的抑制
表31
靶向SEQ ID NO：1和2的3-10-3 cEt缺口体对PNPLA3 mRNA的抑制
表32
靶向SEQ ID NO：1和2的3-10-3 cEt缺口体对PNPLA3 mRNA的抑制
表33
靶向SEQ ID NO：1和2的3-10-3 cEt缺口体对PNPLA3 mRNA的抑制
表34
靶向SEQ ID NO：1和2的3-10-3 cEt缺口体对PNPLA3 mRNA的抑制
表35
靶向SEQ ID NO：1和2的3-10-3 cEt缺口体对PNPLA3 mRNA的抑制
表36
靶向SEQ ID NO：1和2的3-10-3 cEt缺口体对PNPLA3 mRNA的抑制
实例2：A431细胞中人PNPLA3的剂量依赖性反义抑制
选择来自实例1的、展示显著PNPLA3 mRNA体外抑制的缺口体，并且在A431细胞中以不同剂量进行测试。在一系列具有类似培养条件的实验中对这些反义寡核苷酸进行测试。将每个实验的结果呈现在如下所示的单独的表中。将细胞以10,000个细胞/孔的密度铺板，并用如下表所指定的不同浓度的反义寡核苷酸自由摄取进行转染。在大约16小时的处理期之后，从细胞中分离RNA，并且通过定量实时PCR测量PNPLA3 mRNA水平。将人引物探针组RTS36070用于测量mRNA水平。如通过所测量的，根据总RNA含量调整PNPLA3 mRNA水平。将结果呈现为相对于未经处理的对照细胞的PNPLA3的抑制百分比。
还呈现了每个寡核苷酸的半最大抑制浓度(IC50)。在反义寡核苷酸处理的细胞中PNPLA3 mRNA水平以剂量依赖性方式显著降低。
表37
A431细胞中3-10-3 cEt缺口体的多剂量测定
表38
A431细胞中3-10-3 cEt缺口体的多剂量测定
表39
A431细胞中3-10-3 cEt缺口体的多剂量测定
表40
A431细胞中3-10-3 cEt缺口体的多剂量测定
表41
A431细胞中3-10-3 cEt缺口体的多剂量测定
表42
A431细胞中3-10-3 cEt缺口体的多剂量测定
表43
A431细胞中3-10-3 cEt缺口体的多剂量测定
表44
A431细胞中3-10-3 cEt缺口体的多剂量测定
表45
A431细胞中3-10-3 cEt缺口体的多剂量测定
表46
A431细胞中3-10-3 cEt缺口体的多剂量测定
表47
A431细胞中3-10-3 cEt缺口体的多剂量测定
表48
A431细胞中3-10-3 cEt缺口体的多剂量测定
表49
A431细胞中3-10-3 cEt缺口体的多剂量测定
表50
A431细胞中3-10-3 cEt缺口体的多剂量测定
表51
A431细胞中3-10-3 cEt缺口体的多剂量测定
表52
A431细胞中3-10-3 cEt缺口体的多剂量测定
表53
A431细胞中3-10-3 cEt缺口体的多剂量测定
表54
A431细胞中3-10-3 cEt缺口体的多剂量测定
表55
A431细胞中3-10-3 cEt缺口体的多剂量测定
表56
A431细胞中3-10-3 cEt缺口体的多剂量测定
表57
A431细胞中3-10-3 cEt缺口体的多剂量测定
表58
A431细胞中3-10-3 cEt缺口体的多剂量测定
表59
A431细胞中3-10-3 cEt缺口体的多剂量测定
实例3：在BALB/c小鼠中靶向人PNPLA3的修饰的寡核苷酸的耐受性
BALB/c小鼠是多重目的的小鼠模型，频繁用于安全性和功效测试。用从以上描述的研究中选择的反义寡核苷酸治疗小鼠，并且评估不同血浆化学标记物的水平的变化。
将从以上研究中选择的Ionis寡核苷酸与3’-THA-C6-GalNAc3-(3R，5S)-5-(羟甲基)吡咯烷-3-醇磷酸酯端帽(此后被称为3’-THA)缀合。
治疗
用200me/kg的修饰的寡核苷酸对6至7周龄雄性小鼠组皮下注射一次。一组雄性BALB/c小鼠注射PBS。在单剂量之后72-96小时，使小鼠安乐死，并且收获血浆用于进一步分析。
为评估修饰的寡核苷酸对肝功能的影响，使用自动临床化学分析仪(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)AU480，布雷亚(Brea)，加利福尼亚州)测量转氨酶的血浆水平。将导致超出反义寡核苷酸的预期范围的转氨酶的水平变化的修饰的寡核苷酸在进一步研究中排除。将在本研究中被认为可耐受的并被选择用于进一步评估的寡核苷酸列于下表中。‘母体寡核苷酸’表明已经在上述研究中描述的、并且与3’-THA是缀合的、并在此研究中进行测试的Ionis寡核苷酸。
表60
BALB/c小鼠研究中的反义寡核苷酸
实例4：转基因小鼠模型中PNPLA3的反义抑制的作用
使用来自由加利福尼亚大学欧文分校(University of Califomia，Irvine)产生的野生型C57BL/6的PNPLA3转基因小鼠模型。该小鼠模型包含含有整个PNPLA3基因福斯质粒的基因组构建体，该基因组构建体由华盛顿大学慷慨提供。在该模型中评估Ionis寡核苷酸的功效。
治疗
将转基因小鼠保持在12小时光暗循环，并以任意量喂养正常的Purina小鼠食物。在开始实验之前，使动物在研究设备中适应至少7天。在缓冲盐水(PBS)中制备反义寡核苷酸(ASO)并将其通过0.2微米过滤器过滤而进行灭菌。将寡核苷酸溶解于0.9％PBS中用于注射。
将hPNPLA3 Tg小鼠分成每组2只小鼠的组。在第1天和第8天，各组接受2.5mg/kg剂量的Ionis寡核苷酸的皮下注射。在第1天和第8天，4只小鼠的一组接受PBS的皮下注射。将盐水注射的组作为对照组，将寡核苷酸处理的组与其进行比较。
RNA分析
在第10天，从肝中提取RNA用于PNPLA3的mRNA表达的测量的实时PCR分析。将引物探针组RTS36070和RTS36075用于测量PNPLA3 mRNA水平。结果呈现为相对于PBS对照，用标准化的mRNA变化的百分比。如下表中所呈现的，与PBS对照相比，用Ionis反义寡核苷酸的治疗导致PNPLA3 mRNA的显著降低。‘0’表示这些寡核苷酸不抑制mRNA表达。
表61
相对于PBS对照，在转基因小鼠肝中PNPLA3 mRNA的抑制百分比
实例5：在CD1小鼠中靶向人PNPLA3的修饰的寡核苷酸的耐受性
小鼠(查尔斯河公司(Charles River)，马萨诸塞州)是多重目的的小鼠模型，频繁用于安全性和功效测试。用从以上描述的研究中选择的Ionis反义寡核苷酸治疗小鼠，并且评估不同血浆化学标记物的水平的变化。
将从以上研究中选择的Ionis寡核苷酸与5’-三己基氨基-(THA)-C6GalNAC3端帽(此后被称为5’-THA)缀合。将测试的Ionis寡核苷酸呈现在下表中。‘未缀合的母体ION编号’是指在上述体外研究中描述的具有相同序列的Ionis寡核苷酸。‘3’-THA对应物ION编号’是指具有相同序列并且在上述小鼠研究中进行评估的3’-THA缀合的寡核苷酸。
表62
在CD1小鼠耐受性研究中测试的5’-THA寡核苷酸
治疗
将每组四只CD1小鼠的各组每周皮下注射15mg/kg的Ionis寡核苷酸，持续6周，其中在第4天注射一个负荷剂量(总共8个剂量)。将一组雄性CD1小鼠用PBS皮下注射，持续6周。在最后给药之后48小时，使小鼠安乐死，并且收获器官和血浆用于进一步分析。
血浆化学标记物
为评估Ionis寡核苷酸对肝和肾功能的影响，使用自动临床化学分析仪(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)AU480，布雷亚(Brea)，加利福尼亚州)在第3周测量转氨酶(ALT和AST)、白蛋白、总胆红素、和肌酸酐的血浆水平。结果呈现在下表中。将导致超出反义寡核苷酸的预期范围的任何肝或肾功能标记物的水平变化的Ionis寡核苷酸在进一步的研究中排除。
表63
在第3周CD1小鼠中的血浆化学标记物水平
血液学测定
在第6周将从所选小鼠组中获得的血液送至爱德士生物研究公司(IDEXXBioResearch)进行血小板计数的测量。结果呈现在下表中。将导致超出反义寡核苷酸的预期范围的血小板计数的变化的Ionis寡核苷酸在进一步研究中排除。
表64
CD1小鼠中的血小板计数
实例6：在斯普拉-道来大鼠中靶向人PNPLA3的修饰的寡核苷酸的耐受性
斯普拉-道来大鼠是用于安全性和功效评估的、多重目的的模型。用来自以上实例中描述的研究中的Ionis反义寡核苷酸治疗大鼠，并且评估不同血浆化学标记物的水平的变化。
治疗
将雄性斯普拉-道来大鼠保持在12小时光暗循环中，并以任意量喂养正常的Purina大鼠食物，饮食5001。将每组4只斯普拉-道来大鼠的各组每周皮下注射15mg/kg的Ionis寡核苷酸，持续6周，其中在第4天注射一个负荷剂量(总共8个剂量)。在最后给药之后48小时，使大鼠安乐死，并且收获器官和血浆用于进一步分析。
血浆化学标记物
为评估Ionis寡核苷酸对肝功能的影响，使用自动临床化学分析仪(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)AU480，布雷亚(Brea)，加利福尼亚州)测量转氨酶的血浆水平。测量ALT(丙氨酸转氨酶)和AST(天冬氨酸转氨酶)的血浆水平，并且将这些结果呈现在下表中，以IU/L表示。使用相同的临床化学分析仪还测量了胆红素、肌酸酐、白蛋白、和BUN的血浆水平，并且也将这些结果呈现在下表中，以mg/dL表示。将导致超出反义寡核苷酸的预期范围的任何肝功能标记物的水平变化的Ionis寡核苷酸在进一步的研究中排除。
表65
斯普拉-道来大鼠中的血浆化学标记物
肾功能
为评估Ionis寡核苷酸对肾功能的影响，使用自动临床化学分析仪(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)AU480，布雷亚(Brea)，加利福尼亚州)测量尿蛋白水平和尿肌酸酐水平。将总蛋白与肌酸酐的比率呈现在下表中。将导致超出反义寡核苷酸的预期范围的比率水平变化的Ionis寡核苷酸在进一步研究中排除。
表66
斯普拉-道来大鼠中总蛋白与肌酸酐的比率
PBS 1.5
975591 2.0
975605 1.6
975612 1.9
975613 2.3
975616 2.0
975617 1.4
975735 2.2
975736 1.1
994282 2.1
994284 2.1
器官重量
在研究结束时测量肝、心脏、脾和肾的重量，并且呈现在下表中。将导致超出反义寡核苷酸的预期范围的器官重量的任何变化的Ionis寡核苷酸从进一步的研究中排除。
表67
器官重量(g)
肝 肾 脾
盐水 16 3 1
975591 16 4 1
975605 21 3 1
975612 12 3 1
975613 16 3 1
975616 15 3 1
975617 19 4 2
975735 14 4 1
975736 15 3 1
994282 14 3 1
994284 15 3 1
实例7：转基因小鼠模型中PNPLA3的反义抑制的作用
在hPNPLA3 Tg模型中在多剂量测定中测试Ionis寡核苷酸。
治疗
将转基因小鼠保持在12小时光暗循环，并以任意量喂养正常的Purina小鼠食物。在开始实验之前，使动物在研究设备中适应至少7天。在缓冲盐水(PBS)中制备反义寡核苷酸(ASO)并将其通过0.2微米过滤器过滤而进行灭菌。将寡核苷酸溶解于0.9％PBS中用于注射。
研究1
将hPNPLA3 Tg小鼠分成每组4只小鼠的组。在第1、5、8、15、和23天，各组接受5mg/kg、1mg/kg、或0.25mg/kg的每周剂量的Ionis寡核苷酸的皮下注射。在第1、5、8、15、和23天，4只小鼠的一组接受PBS的皮下注射。将盐水注射的组作为对照组，将寡核苷酸处理的组与其进行比较。
RNA分析
在第26天，从肝中提取RNA用于PNPLA3的mRNA表达的测量的实时PCR分析。将引物探针组RTS36070和RTS36075用于测量PNPLA3 mRNA水平。结果呈现为相对于PBS对照，用标准化的mRNA变化的百分比。如下表中所呈现的，与PBS对照相比，用Ionis反义寡核苷酸的治疗导致PNPLA3 mRNA的显著剂量依赖性降低。
表68
相对于PBS对照，在转基因小鼠肝中PNPLA3 mRNA的抑制百分比
研究2
将hPNPLA3 Tg小鼠分成每组4只小鼠的组。在第1、5、8、15、和23天，各组接受5mg/kg、2.5mg/kg、1mg/kg、0.5mg/kg、或0.25mg/kg的每周剂量的Ionis寡核苷酸的皮下注射。在第1、5、8、15、和23天，4只小鼠的一组接受PBS的皮下注射。将盐水注射的组作为对照组，将寡核苷酸处理的组与其进行比较。
RNA分析
在第26天，从肝中提取RNA用于PNPLA3的mRNA表达的测量的实时PCR分析。将引物探针组RTS36070和RTS36075用于测量PNPLA3 mRNA水平。结果呈现为相对于PBS对照，用标准化的mRNA变化的百分比。如下表中所呈现的，与PBS对照相比，用Ionis反义寡核苷酸的治疗导致PNPLA3 mRNA的显著剂量依赖性降低。
表69
相对于PBS对照，在转基因小鼠肝中PNPLA3 mRNA的抑制百分比
实例8：在食蟹猴中靶向人PNPLA3的修饰的寡核苷酸的作用
用从以上实例中描述的研究中选择的Ionis反义寡核苷酸治疗食蟹猴。评估反义寡核苷酸的耐受性。
治疗
在研究之前，将猴保持隔离，在此期间每天观察这些动物的一般健康状况。这些猴子年龄是2-4岁，并且重2-4kg。将每组随机分配有5只雄性食蟹猴的9组以在背部四个不同部位之间以顺时针方向旋转用Ionis寡核苷酸或PBS进行皮下注射。在最初的两周，用10mg/kg的Ionis寡核苷酸对这些猴子每周给药两次(第1、5、9、和14天)，并然后一周一次，持续10周(在第21、28、35、42、49、56、63、70、77、和84天)。以类似的方式用PBS注射5只食蟹猴的对照组，并作为对照组。
在研究期间，每天观察两次猴子，看是否有疾病或痛苦迹象。由于治疗、伤害或疾病而经历短暂或轻微疼痛或痛苦的任何动物，在与研究负责人协商后由兽医工作人员使用经批准的镇痛药或药剂来缓解疼痛。任何健康状况不佳或处于可能濒死状态的动物都被确定进行进一步监测和可能的安乐死。深度麻醉下，在第86天最后一次给药后大约48小时通过放血进行动物的预定安乐死。在该实例中描述的方案得到了研究机构动物护理和使用委员会(IACUC)的批准。
体重和器官重量测量值
为评估Ionis寡核苷酸对这些动物的整体健康状况的影响，测量体重和器官重量。在第86天测量体重和器官重量，并且将数据呈现在下表中。这些结果表明用反义寡核苷酸治疗对体重和器官重量的影响是在反义寡核苷酸的预期范围内。具体地，就猴的体重和器官重量而言，用ION 945616治疗是耐受良好的。
表70
食蟹猴的最终体重和器官重量
肝功能
为评估Ionis寡核苷酸对肝功能的影响，在第86天从所有研究组中采集血液样品。在血液采集之前，使猴禁食过夜。将血液采集在管中，无需用于血清分离的抗凝剂。将这些管在室温下保持最少90分钟，并然后以3000rpm离心10分钟以获得血清。使用Toshiba200FR NEO化学分析仪(东芝公司(Toshiba Co.)，日本)测量各种肝功能标记物的水平。测量ALT和AST的血浆水平，并且将这些结果呈现在下表中，以IU/L表示。类似地测量胆红素(肝功能标记物)并呈现在下表中，以mg/dL表示。这些结果表明反义寡核苷酸对肝功能没有超过反义寡核苷酸的预期范围的影响。
表71
食蟹猴血浆中的肝功能标记物
肾功能
为评估Ionis寡核苷酸对肾功能的影响，在第86天从所有研究组中采集血液样品。在血液采集之前，使猴禁食过夜。将血液采集在管中，无需用于血清分离的抗凝剂。将这些管在室温下保持最少90分钟，并然后以3000rpm离心10分钟以获得血清。使用Toshiba200FR NEO化学分析仪(东芝公司(Toshiba Co.)，日本)测量BUN和肌酸酐的水平。结果呈现在下表中，以mg/dL表示。
血浆化学数据表明大多数Ionis寡核苷酸对肾功能不具有超过反义寡核苷酸预期范围的任何影响。
表72
食蟹猴中的血浆BUN和肌酸酐水平(mg/dL)
BUN 肌酸酐
PBS对照 23 0.8
994284 24 0.8
975605 27 0.7
975616 21 0.8
994282 24 0.8
975613 23 0.9
975617 21 0.7
975735 20 0.8
975736 23 0.8
975612 20 0.8
血液学
为评估在食蟹猴中Ionis寡核苷酸对血液学参数的任何影响，在第86天从可用的研究动物中的每一种中采集大约0.5mL血液的血液样品。将样品采集在含有K2-EDTA的管中。使用ADVIA2120i血液学分析仪(西门子公司(Siemens)，美国)针对红细胞(RBC)计数、白细胞(WBC)计数、各种白血细胞计数(例如单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞的计数)，并且针对血小板计数、血红蛋白含量和血细胞比容对样品进行分析。
数据表明这些寡核苷酸没有导致超出在这个剂量下的反义寡核苷酸的预期范围的血液学参数的任何变化。
表73
食蟹猴中的血细胞计数
表74
食蟹猴中的血液学参数
促炎蛋白分析
为评估Ionis寡核苷酸在食蟹猴中的任何炎症效应，采集血液样品用于分析。在血液采集之前，使猴禁食过夜。从每只动物采集大约1.5mL的血液并放进没有抗凝剂的管中，用于血清分离。将这些管在室温下保持最少90min，并然后在室温下以3,000rpm离心10min以获得血清。使用Toshiba 200FR NEO化学分析仪(东芝公司(Toshiba Co.)，日本)测量在肝中合成并作为炎症标记物的C-反应蛋白(CRP)、以及补体C3。
实例9：靶向人PNPLA3的反义寡核苷酸的粘度的测量
测量从以上描述的研究中选择的反义寡核苷酸的粘度，其目的是筛选出具有高于40厘泊(cP)的粘度的反义寡核苷酸。具有粘度高于40cP的寡核苷酸将具有小于最佳的粘度。
将寡核苷酸(32-35mg)称量到玻璃小瓶中，添加120μL水，并且通过在50℃下加热该小瓶将反义寡核苷酸溶解到溶液中。将预加热的样品的一部分(75μL)用移液管移至微粘度计(剑桥)中。将微粘度计的温度设置为25℃，并且测量该样品的粘度。将预加热的样品的另一部分(20μL)用移液管移至10mL水中用于在85℃下在260nM处进行UV读数(卡里UV仪器(Cary UV instrument))。将这些结果呈现在下表中，其中每种反义寡核苷酸的浓度是200mg/ml，并且表明大多数的反义寡核苷酸溶液在上述标准下处于其最佳粘度。
表75
200mg/mL的反义寡核苷酸的粘度
实例10：在ION 975616的位点处设计寡核苷酸
设计靶向与ION 916333的靶位点重叠的PNPLA3核酸的、另外的反义寡核苷酸，该靶位点是ION 975616的未缀合形式并且具有不同的化学修饰和基序。
将下表中的新设计的嵌合反义寡核苷酸设计为3-10-3cEt缺口体或脱氧寡核苷酸、MOE寡核苷酸和cEt寡核苷酸。这些3-10-3cEt缺口体长16个核苷，其中中心缺口区段由十个2’-脱氧核苷组成并且在5’方向和3’方向上侧接翼区段，每个翼区段包括三个核苷。5’翼区段中的每个核苷和3’翼区段中的每个核苷都具有cEt糖修饰。遍及每个缺口体的核苷间连接都是硫代磷酸酯(P＝S)连接。遍及每个缺口体的所有胞嘧啶残基都是5-甲基胞嘧啶。这些脱氧寡核苷酸、MOE寡核苷酸和(S)-cEt寡核苷酸长16个核苷，其中这些核苷具有MOE糖修饰、(S)-cEt糖修饰、或脱氧修饰。‘化学’栏描述了每个寡核苷酸的糖修饰。‘k’指示(S)-cEt糖修饰；‘d’指示脱氧核糖；‘d’之后的数字指示脱氧核糖的数目；并且‘e’指示MOE修饰。遍及每个缺口体的核苷间连接都是硫代磷酸酯(P＝S)连接。遍及每个缺口体的所有胞嘧啶残基都是5-甲基胞嘧啶。“起始位点”指示缺口体所靶向的人基因序列(SEQ ID NO：2)中的最5’核苷。
表76
靶向人PNPLA3的修饰的寡核苷酸
在一系列实验中测试寡核苷酸。使用自由摄取，用稀释至不同浓度的修饰的寡核苷酸处理以10,000个细胞/孔的密度培养的A-431细胞。在大约48小时的治疗期后，如前所述使用人PNPLA3引物探针组RTS36070测量PNPLA3 mRNA水平。如通过所测量的，根据总RNA含量调整PNPLA3 mRNA水平。该测定的IC50的比率呈现在下表中，该比率是基准寡核苷酸的IC50与该寡核苷酸的IC50的比率。因此，该比率的较大值表明该寡核苷酸比基准更具活性。
表XX
靶向人PNPLA3的修饰的寡核苷酸的功效
起始位点 终止位点 化合物编号 化学 IC50比率
5600 5615 959437 kkk-d10-kkk 1.42
5601 5616 959438 kkk-d10-kkk 0.49
5602 5617 959439 kkk-d10-kkk 0.36
5603 5618 959440 kkk-d10-kkk 0.55
5603 5618 995906 kk-d9-eeekk 1.42
5604 5619 959441 kkk-d10-kkk 1.66
5605 5620 916333 kkk-d10-kkk 1.96
5605 5620 995908 kk-d9-eeekk 0.70
5606 5621 916334 kkk-d10-kkk 0.95
5606 5621 995909 kk-d9-eeekk 1.47

Claims (10)

1.一种化合物或其药学上可接受的盐在制备用于抑制PNPLA3表达的组合物中或在制备用于治疗、预防、或缓解个体中与PNPLA3相关联的疾病的药物中的用途，其中该化合物的阴离子形式具有下式(SEQ ID NO：1089)：
2.一种附接至缀合物基团的修饰的寡核苷酸在制备用于抑制PNPLA3表达的组合物中或在制备用于治疗、预防、或缓解个体中与PNPLA3相关联的疾病的药物中的用途，其中该修饰的寡核苷酸长16个连接的核苷并且具有SEQ ID NO：1089的核碱基序列，其中该修饰的寡核苷酸包括：
由十个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由三个连接的核苷组成的5’翼区段；以及
由三个连接的核苷组成的3’翼区段；
其中该缺口区段位于该5’翼区段与该3’翼区段之间，其中每个翼区段的每个核苷包含cEt糖；其中每个核苷间连接都是硫代磷酸酯连接；其中每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶；并且其中该缀合物基团位于该修饰的寡核苷酸的5’-端，并且为
3.一种化合物或其药学上可接受的盐在制备用于抑制PNPLA3表达的组合物中或在制备用于治疗、预防、或缓解个体中与PNPLA3相关联的疾病的药物中的用途，其中该化合物的阴离子形式具有下式(SEQ ID NO：1089)：
4.一种附接至缀合物基团的修饰的寡核苷酸在制备用于抑制PNPLA3表达的组合物中或在制备用于治疗、预防、或缓解个体中与PNPLA3相关联的疾病的药物中的用途，其中该修饰的寡核苷酸长16个连接的核苷并且具有SEQ ID NO：1089的核碱基序列，其中该修饰的寡核苷酸包括：
由十个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由三个连接的核苷组成的5’翼区段；以及
由三个连接的核苷组成的3’翼区段；
其中该缺口区段位于该5’翼区段与该3’翼区段之间，其中每个翼区段的每个核苷包含cEt糖；其中至少一个核苷间连接是硫代磷酸酯连接；其中每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
5.一种化合物在制备用于抑制PNPLA3表达的组合物中或在制备用于治疗、预防、或缓解个体中与PNPLA3相关联的疾病的药物中的用途，该化合物包含修饰的寡核苷酸和缀合物基团，其中该修饰的寡核苷酸长16个连接的核苷并且具有SEQ ID NO：1089的核碱基序列，其中该修饰的寡核苷酸包括：
由十个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由三个连接的核苷组成的5’翼区段；以及
由三个连接的核苷组成的3’翼区段；
其中该缺口区段位于该5’翼区段与该3’翼区段之间，其中每个翼区段的每个核苷包含cEt糖；其中每个核苷间连接都是硫代磷酸酯连接；其中每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。
6.一种修饰的寡核苷酸在制备用于抑制PNPLA3表达的组合物中或在制备用于治疗、预防、或缓解个体中与PNPLA3相关联的疾病的药物中的用途，其中该修饰的寡核苷酸由16个连接的核苷组成并且具有由SEQ ID NO：1089组成的核碱基序列，其中该修饰的寡核苷酸包括：
由十个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由三个连接的核苷组成的5’翼区段；以及
由三个连接的核苷组成的3’翼区段；
其中该缺口区段位于该5’翼区段与该3’翼区段之间，其中每个翼区段的每个核苷包含cEt糖；其中每个核苷间连接都是硫代磷酸酯连接；其中每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。
7.如权利要求1或3所述的用途，其中该药学上可接受的盐是钠盐。
8.如权利要求1或3所述的用途，其中该药学上可接受的盐是钾盐。
9.如权利要求1-8中任一项所述的用途，其中该疾病是肝病、NAFLD、肝性脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、肝细胞癌、酒精性肝病、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、HCV肝炎、慢性肝炎、遗传性血色素沉着症、或原发性硬化性胆管炎。
10.如权利要求1-9中任一项所述的用途，其中该化合物抑制或减少或改善个体中的肝损伤、脂肪变性、肝纤维化、肝脏炎症、肝瘢痕化或硬化、肝功能衰竭、肝肿大、转氨酶升高、或肝脏脂肪堆积。
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