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CN118515652A - 一种吡咯烷基脲衍生物的晶型及其应用 - Google Patents

一种吡咯烷基脲衍生物的晶型及其应用 Download PDF

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Publication number
CN118515652A
CN118515652A CN202410626119.3A CN202410626119A CN118515652A CN 118515652 A CN118515652 A CN 118515652A CN 202410626119 A CN202410626119 A CN 202410626119A CN 118515652 A CN118515652 A CN 118515652A
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CN
China
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plus
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Pending
Application number
CN202410626119.3A
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洪绯
陈志亮
王丽菊
林锦霞
蓝文良
张杨
伍文韬
李志祥
秦健
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhangzhou Pientzehuang Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Zhangzhou Pientzehuang Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Zhangzhou Pientzehuang Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Zhangzhou Pientzehuang Pharmaceutical Co Ltd
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Pending legal-status Critical Current

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/14—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing three or more hetero rings
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Abstract

本发明公开了一种吡咯烷基脲衍生物的晶型及其应用。具体公开了式(I)化合物的A晶型和F晶型，并公开了其在制备治疗与疼痛、癌症、炎症、神经变性疾病以及感染性疾病相关疾病的药物中的应用。

Description

一种吡咯烷基脲衍生物的晶型及其应用
本专利申请是申请号为2021800088985的专利申请的分案申请，该专利申请的申请日为2021年1月8日，其名称为《一种吡咯烷基脲衍生物的晶型及其应用》。
技术领域
本发明涉及一种TrkA抑制剂的晶型及其在制备治疗与疼痛、癌症、炎症、神经变性疾病以及感染性疾病相关疾病的药物中的应用。
背景技术
原肌球蛋白相关激酶(Trk)是由称为神经增长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子(NT)的一群可溶性增长因子所激活的高亲和力受体酪氨酸激酶，其家族由三个成员(TrkA、TrkB、TrkC)组成。NGF、BDNF、NT-4/5通过受体Trk在神经元细胞的信号维持、神经元细胞的信号传递、细胞增殖、细胞分化、细胞存活等许多生理学调节过程中发挥重要作用。有许多证据显示NGF/Trk信号通路的抑制剂在疼痛的许多临床前模型中有效；还显示NGF/Trk信号通路的抑制剂在炎症性疾病的许多临床前模型中有效。此外，Trk激酶的过度表达、激活、扩增和/或突变与许多肿瘤或癌症相关。因此，Trk成为了一类重要治疗靶点，吸引了广泛的研发兴趣。本发明所述的TrkA抑制剂可以解决疼痛、癌症、炎症、神经变性疾病以及感染性疾病的治疗需求。
WO2015175788专利中报道了对TrkA有抑制活性的单一化合物及其药学上可接受的盐。WO2012158413、WO2016116900、WO2016021629、WO2017006953专利中报道了一系列对TrkA有抑制活性的化合物，包含本发明中使用的吡咯烷基脲结构。
发明内容
本发明提供式(I)化合物的A晶型，其特征在于其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：9.34±0.20°，13.40±0.20°，14.57±0.20°，15.59±0.20°，16.95±0.20°，18.71±0.20°，19.51±0.20°，24.07±0.20°。
在本发明的一些方案中，上述A晶型的X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射：6.06°，8.30°，9.05°，9.34°，10.52°，11.86°，12.34°，13.40°，14.25°，14.57°，15.30°，15.59°，16.95°，17.74°，18.45°，18.71°，19.51°，19.88°，20.33°，21.03°，21.60°，22.61°，23.64°，24.07°，24.53°，25.37°，26.41°，27.05°，27.74°，28.10°，30.48°，34.72°，36.84°，37.60°。
在本发明的一些方案中，上述A晶型，其XRPD图谱如图1所示。
在本发明的一些方案中，上述A晶型的XRPD图谱解析数据如表1所示：
表1.A晶型的XRPD图谱解析数据
在本发明的一些方案中，上述A晶型，其差示扫描量热曲线分别在75.3±3.0℃、99.6±3.0℃和167.9±3.0℃有一个吸热峰的峰值，在132.3±3.0℃有一个放热峰的峰值。
在本发明的一些方案中，上述A晶型的DSC图谱如图2所示。
在本发明的一些方案中，上述A晶型，其热重分析曲线在55.0℃±3.0℃时失重达1.75％，在100.0±3.0℃时失重达3.08％。
在本发明的一些方案中，上述A晶型的TGA图谱如图3所示。
本发明还提供式(I)化合物的F晶型，其特征在于其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：6.30±0.20°，9.25±0.20°，13.62±0.20°，15.80±0.20°，17.16±0.20°，17.96±0.20°，18.92±0.20°，20.09±0.20°；
在本发明的一些方案中，上述F晶型的X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射：6.30°，8.48°，9.25°，9.71°，12.57°，13.62°，14.46°，15.80°，17.16°，17.96°，18.67°，18.92°，19.69°，20.09°，21.26°，22.15°，23.68°，24.29°，25.58°，26.64°，27.32°，27.95°，28.28°，30.71°，35.16°。
在本发明的一些方案中，上述F晶型，其XRPD图谱如图4所示。
在本发明的一些方案中，上述F晶型的XRPD图谱解析数据如表2所示：
表2.F晶型的XRPD图谱解析数据
在本发明的一些方案中，上述F晶型，其差示扫描量热曲线分别在100.0±3.0℃和172.7±3.0℃有一个吸热峰的峰值，在126.0±3.0℃有一个放热峰的峰值。
在本发明的一些方案中，上述F晶型的DSC图谱如图5所示。
在本发明的一些方案中，上述F晶型，其热重分析曲线在130.0℃±3.0℃时失重达3.92％。
在本发明的一些方案中，上述F晶型的TGA图谱如图6所示。
本发明还提供上述A晶型或F晶型在制备治疗与疼痛、癌症、炎症、神经变性疾病以及感染性疾病相关疾病的药物中的应用。
技术效果
本发明化合物各晶型成药前景广阔；式(I)化合物具有显著的TrkA酶抑制作用、较高的血浆蛋白未结合率、较低的药物-药物相互作用风险、较好的肝微粒体代谢稳定性。
定义和说明
除非另有说明，本文所用的下列术语和短语旨在含有下列含义。一个特定的短语或术语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照普通的含义去理解。当本文出现商品名时，旨在指代其对应的商品或其活性成分。
本发明的中间体化合物可以通过本领域技术人员所熟知的多种合成方法来制备，包括下面列举的具体实施方式、其与其他化学合成方法的结合所形成的实施方式以及本领域技术上人员所熟知的等同替换方式，优选的实施方式包括但不限于本发明的实施例。
本发明具体实施方式的化学反应是在合适的溶剂中完成的，所述的溶剂须适合于本发明的化学变化及其所需的试剂和物料。为了获得本发明的化合物，有时需要本领域技术人员在已有实施方式的基础上对合成步骤或者反应流程进行修改或选择。
本发明的化合物可以通过本领域技术人员所熟知的常规方法来确认结构，如果本发明涉及化合物的绝对构型，则该绝对构型可以通过本领域常规技术手段予以确证。例如单晶X射线衍射法(SXRD)，把培养出的单晶用Bruker D8 venture衍射仪收集衍射强度数据，光源为CuKα辐射，扫描方式：扫描，收集相关数据后，进一步采用直接法(Shelxs97)解析晶体结构，便可以确证绝对构型。
下面会通过实施例具体描述本发明，这些实施例并不意味着对本发明的任何限制。
本发明所使用的所有溶剂是市售的，无需进一步纯化即可使用。
本发明所使用的溶剂可经市售获得。本发明采用下述缩略词：EtOH代表乙醇；MeOH代表甲醇；TFA代表三氟乙酸；TsOH代表对甲苯磺酸；mp代表熔点；EtSO3H代表乙磺酸；MeSO3H代表甲磺酸；THF代表四氢呋喃；EtOAc代表乙酸乙酯。
化合物依据本领域常规命名原则或者使用软件命名，市售化合物采用供应商目录名称。
本发明粉末X-射线衍射(X-ray powder diffractometer,XRPD)方法
仪器型号：PANalytical(帕纳科)公司的X’Pert3型X-射线衍射仪
测试方法：大约10mg样品用于XRPD检测。
详细的XRPD参数如下：
射线源：Cu,kα(Kα2/Kα1强度比例：0.5)
光管电压：45kV，光管电流：40mA
发散狭缝：固定1/8deg
第一索拉狭缝：0.04rad,第二索拉狭缝：0.04rad
接收狭缝：无，防散射狭缝：7.5mm
测量时间：5min
扫描角度范围：3-40deg
步宽角度：0.0263deg
步长：46.665秒
样品盘转速：15rpm
本发明粉末X-射线衍射(X-ray powder diffractometer,XRPD)方法
衍射仪系统：PNalytical XPERT-PRO
详细的XRPD参数如下：
射线源：Cu,kα(Kα2/Kα1强度比例：0.5)
光管电压：40kV，光管电流：40mA
发散狭缝：固定0.2177deg
扫描类型：连续
扫描角度范围：3.0131～59.9791deg
步宽角度：0.0263deg
步长：0.0260
扫描步骤时间：14.0927秒
本发明差热分析(Differential Scanning Calorimeter,DSC)方法
仪器型号：TA Q2000/Discovery 2500差示扫描量热仪
测试方法：取样品(约1-5mg)置于DSC铝盘内进行测试，在50mL/min氮气条件下，以10℃/min的升温速率，加热样品从25℃(室温)到样品分解前。
本发明热重分析(Thermal Gravimetric Analyzer,TGA)方法
仪器型号：TA Q5000/Discovery 5500热重分析仪
测试方法：取样品(约1-5mg)置于TGA铝盘内进行测试，在10mL/min氮气条件下，以10℃/min的升温速率，加热样品从室温到350℃。
本发明动态蒸汽吸附分析(Dynamic Vapor Sorption,DVS)方法
仪器型号：Intrinsic动态蒸汽吸附仪
测试条件：取样品(10～30mg)置于DVS样品盘内进行测试。
详细的DVS参数如下：
温度：25℃
平衡：dm/dt＝0.002％/min(最短：10min，最长：180min)
RH(％)测试梯级：10(0-90％)，5(90-95％)
RH(％)测试梯级范围：70-95–0–95
引湿性评价分类如下：
吸湿性分类 ΔW％
潮解 吸收足量水分形成液体
极具吸湿性 ΔW％≥15％
有吸湿性 15％>ΔW％≥2％
略有吸湿性 2％>ΔW％≥0.2％
无或几乎无吸湿性 ΔW％<0.2％
注：ΔW％表示受试品在25±1℃和80±2％RH下的吸湿增重。
本发明高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatograph,HPLC)方法
详细的参数如下：
附图说明
图1为式(I)化合物A晶型的Cu-Kα辐射的XRPD谱图。
图2为式(I)化合物A晶型的DSC谱图。
图3为式(I)化合物A晶型的TGA谱图。
图4为式(I)化合物F晶型的Cu-Kα辐射的XRPD谱图。
图5为式(I)化合物F晶型的DSC谱图。
图6为式(I)化合物F晶型的TGA谱图。
具体实施方式
为了更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例来做进一步的说明，但具体的实施方式并不是对本发明的内容所做的限制。
实施例1：式(I)化合物的制备
步骤1：化合物2的合成
将化合物1(15g,60.00mmol)和三甲基硅乙烯(12.03g,120.01mmol)溶于乙腈(150mL)中，加入活化的铜粉(190.65mg,3.00mmol)，反应液升温至65℃继续搅拌15小时。冷却，减压除去有机溶剂，得到的粗品经硅胶柱层析(洗脱剂：0-5％乙酸乙酯/石油醚)分离纯化，得到化合物2。1H NMR(400MHz,CDCl3):4.18(q,J＝7.2Hz,2H),2.94-2.90(m,1H),2.52-2.37(m,2H),1.20(t,J＝7.2Hz,3H),0.00(s,9H)。
步骤2：化合物3的合成
-30℃下，将化合物2(5g,14.28mmol)溶于无水四氢呋喃(100mL)中，缓慢滴加二异丁基氢化铝(1M,28.55mL)，反应液缓慢升温至20℃继续搅拌2小时。向反应液中加入60mL0.5N的盐酸水溶液，乙酸乙酯(100mL*2)萃取，合并后的有机相用200mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去有机溶剂，得到粗品化合物3，该化合物不经进一步纯化直接用于下一步反应。
步骤3：化合物5的合成
冰水浴条件下，将化合物4(8.7g,45.02mmol)溶于二氯甲烷(60mL)中，加入三乙胺(13.67g,135.06mmol)，慢慢滴加甲烷磺酰氯(11.35g,99.05mmol)，反应液缓慢升温至25℃继续搅拌3小时。向反应液中加入80mL水，二氯甲烷(80mL*2)萃取，合并后的有机相用150mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去有机溶剂，得到的粗品经硅胶柱层析(洗脱剂：20-50％乙酸乙酯/石油醚)分离纯化，得到化合物5。1H NMR(400MHz,CDCl3):7.38-7.21(m,5H),5.12(t,J＝4.8Hz,2H),3.70-3.55(m,2H),3.14-3.08(m,2H),3.07(s,6H),2.75(dd,J＝4.0,10.8Hz,2H)。
步骤4：化合物6的合成
将化合物5(15g,42.93mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(100mL)中，加入叠氮钠(8.37g,128.78mmol)，反应液升温至100℃继续搅拌16小时。冷却，向反应液中加入200mL水，乙酸乙酯(200mL*3)萃取，合并后的有机相依次用水(300mL*2)和饱和食盐水(300mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去有机溶剂，所得粗品经硅胶柱层析(洗脱剂：0-2％乙酸乙酯/石油醚)分离纯化，得到化合物6。1H NMR(400MHz,CDCl3):7.43-7.28(m,5H),3.90(t,J＝4.4Hz,2H),3.75-3.61(m,2H),3.02(dd,J＝6.4,10.0Hz,2H),2.70-2.58(m,2H)。
步骤5：化合物7的合成
将化合物6(7g,28.77mmol)溶于四氢呋喃(60mL)中，加入水(1.04g,57.55mmol)，缓慢分批加入三苯基膦(6.79g,25.90mmol)，反应液在25℃下搅拌至不再放气，升温至80℃继续搅拌1小时。冷却，减压除去有机溶剂，向所得粗产物中加入80mL 4N的盐酸水溶液，用80mL二氯甲烷萃取，水相用氨水调节pH大约为10，用二氯甲烷(80mL*2)萃取，合并后的有机相用100mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去有机溶剂，得到粗品化合物7，该化合物不经进一步纯化直接用于下一步反应。1H NMR(400MHz,CDCl3):7.35-7.24(m,5H),3.64(q,J＝13.2Hz,2H),3.56(td,J＝3.6,6.8Hz,1H),3.48-3.40(m,1H),3.07-2.90(m,2H),2.64(dd,J＝4.4,10.4Hz,1H),2.31(dd,J＝5.2,9.6Hz,1H)。
步骤6：化合物8的合成
将化合物7(6.4g,29.46mmol)溶于二氯甲烷(60mL)中，加入三乙胺(5.96g,58.91mmol)和二碳酸二叔丁酯(7.71g,35.35mmol)，反应液在25℃下继续搅拌15小时。减压除去有机溶剂，得到的粗品经硅胶柱层析(洗脱剂：0-10％乙酸乙酯/石油醚)分离纯化，得到化合物8。1H NMR(400MHz,CDCl3):7.40-7.25(m,5H),4.87(s,1H),4.07(s,1H),3.81(s,1H),3.70-3.56(m,2H),3.07(dd,J＝6.8,10.4Hz,1H),2.93-2.77(m,1H),2.56-2.32(m,2H),1.47(s,9H)。
步骤7：化合物9的合成
将化合物8(8.8g,27.73mmol)溶于甲醇(100mL)中，加入钯碳(0.5g,27.73mmol,10％纯度)，反应液在20℃，氢气压力为15psi下继续搅拌3小时。通过硅藻土过滤，减压除去有机溶剂，得到粗品化合物9，该化合物不经进一步纯化直接用于下一步反应。1H NMR(400MHz,CDCl3):7.33-7.25(m,5H),5.04(d,J＝6.4Hz,1H),3.70(s,1H),3.63-3.54(m,2H),3.34-3.23(m,1H),3.07(t,J＝8.4Hz,1H),2.82(dd,J＝7.2,9.6Hz,1H),2.51-2.43(m,1H),2.21-2.09(m,1H),1.44(s,9H)。
步骤8：化合物10的合成
将化合物9(2.35g,8.06mmol)溶于乙腈(50mL)中，加入化合物3(1.98g,6.45mmol)，反应液升温至50℃继续搅拌15小时。冷却，减压除去有机溶剂，得到的粗品经硅胶柱层析(洗脱剂：0-30％乙酸乙酯/石油醚)分离纯化，得到化合物10。1H NMR(400MHz,CDCl3):7.40-7.27(m,5H),6.61(s,1H),6.53(s,1H),5.87(dd,J＝2.0,2.8Hz,1H),4.82(s,1H),4.29-4.17(m,1H),4.15-4.05(m,1H),3.73-3.58(m,2H),3.16-3.03(m,2H),2.85-2.76(m,1H),2.58-2.43(m,1H),1.43(s,9H)。
步骤9：化合物11的合成
将化合物10(840mg,2.34mmol)溶于甲苯(30mL)中，加入二异丙基乙胺(422.86mg,3.27mmol)，冰水浴条件下，慢慢滴加a-氯甲酸-1-氯乙酯(434.35mg,3.04mmol)，反应液升温至90℃继续搅拌1小时。冷却，减压除去有机溶剂，加入甲醇(30mL)，并在20℃下搅拌17小时。减压除去有机溶剂，得到粗品化合物11，该化合物不经进一步纯化直接用于下一步反应。MS m/z＝270.1[M+1]+。
步骤10：化合物12的合成
将化合物11(630mg,2.34mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(10mL)中，加入二异丙基乙胺(906.98mg,7.02mmol)和2-溴乙基甲基醚(536.92mg,3.51mmol)，反应液在20℃下继续搅拌64小时。反应液中加入100mL乙酸乙酯稀释，依次用60mL水和60mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去有机溶剂，得到的粗品经硅胶柱层析(洗脱剂：25％-60％乙酸乙酯/石油醚)分离纯化，得到化合物12。1H NMR(400MHz,CDCl3):6.60(s,1H),6.54(s,1H),5.88(dd,J＝2.0,2.8Hz,1H),4.91(s,1H),4.24(s,1H),4.12-4.05(m,1H),3.51(t,J＝5.6Hz,2H),3.37(s,3H),3.19(s,1H),3.08(d,J＝8.0Hz,1H),2.84-2.64(m,3H),1.43(s,9H)。
步骤11：化合物13的合成
将化合物12(100mg,305.44μmol)溶于二氯甲烷(2mL)中，加入三氟乙酸(2mL)，反应液在20℃下继续搅拌0.5小时。减压除去有机溶剂，得到粗品化合物13，该化合物不经进一步纯化直接用于下一步反应。MS m/z＝228.1[M+1]+。
步骤12：化合物15的合成
将化合物14(4.0g,14.04mmol)溶于无水四氢呋喃(40mL)中，降温至-78℃，加入氧杂环丁酮(1.2g,16.85mmol)，缓慢滴加正丁基锂(2.5M,8.4mL)溶液，反应液在该温度下继续搅拌20分钟。向反应液中缓慢加入饱和氯化铵水溶液(20mL)，乙酸乙酯(50mL*3)萃取，合并后的有机相用饱和氯化钠溶液(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去有机溶剂，所得粗品经硅胶柱层析(洗脱剂：0-20％乙酸乙酯/石油醚)分离纯化，得到化合物15。1HNMR:(400MHz,CDCl3):8.89(s,2H),5.06-4.95(m,4H)。
步骤13：化合物16的合成
冰水浴下，将化合物15(1.8g,7.75mmol)溶于二氯甲烷(13mL)中，加入二乙胺基三氟化硫(2.5g,15.50mmol)的二氯甲烷(4mL)溶液，反应液在该温度下继续搅拌20分钟。向反应液中加入水(20mL)，乙酸乙酯(50mL*3)萃取，合并后的有机相用饱和氯化钠溶液(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去有机溶剂，所得粗品经硅胶柱层析(洗脱剂：0-10％乙酸乙酯/石油醚)分离纯化，得到化合物16。1H NMR(400MHz,CDCl3):8.91(s,2H),5.20-5.05(m,4H)。
步骤14：化合物17的合成
将化合物16(300mg,1.29mmol)溶于1,4-二氧六环(8.0mL)中，依次加入联硼酸频哪醇酯(392mg,1.54mmol)和乙酸钾(379mg,3.86mmol)，氮气置换三次，再加入1,1-双(二苯基膦)二茂铁二氯化钯(94mg,128.73μmol)，反应液升温至100℃下继续搅拌11小时。冷却，减压除去有机溶剂，所得粗品经硅胶柱层析(洗脱剂：0-50％乙酸乙酯/石油醚)分离纯化，得到化合物17。1H NMR(400MHz,CDCl3):9.11(s,2H),5.24-5.05(m,4H),1.37(s,12H)。
步骤15：化合物19的合成
将化合物18(20.00g,184.95mmol)和2-氰基丙酸乙酯(23.51g,184.95mmol)溶于1,4-二氧六环(40mL)中，反应液升温至110℃继续搅拌72小时。冷却，将反应液浓缩至约20mL，析出固体，过滤，滤饼用乙酸乙酯(30mL)洗涤，收集滤饼，得到化合物19。1H NMR(400MHz,CD3OD):7.53-7.46(m,2H),7.42-7.35(m,3H),1.77(s,3H)。
步骤16：化合物20的合成
将化合物19(10.00g,52.85mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(150mL)中，随后依次加入N,N-二异丙基乙胺(20.49g,158.55mmol)和N-苯基双(三氟甲烷磺酰)亚胺(19.82g,55.49mmol)，反应液在25℃下继续搅拌16小时。将反应液倒入500mL水中，随后用乙酸乙酯(150mL*3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(300mL)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，将滤液浓缩至干，得到粗品化合物20。1H NMR(400MHz,CDCl3):7.54-7.44(m,4H),7.40-7.34(m,1H),3.76(s,2H),1.95(s,3H)。
步骤17：化合物21的合成
将化合物20(320mg,1.14mmol)溶解到二氧六环(2.5mL)和水(0.5mL)的混合溶液中，加入化合物17(293mg,912.00umol)和1,1’-二(二苯磷基)二茂铁二氯化钯(83mg,114.00umol)，最后加入碳酸钠(242mg,2.28mmol)，再用氮气置换三次，反应液升温至100℃搅拌14小时。用无水硫酸钠干燥反应液，过滤浓缩。粗品经柱层析(洗脱剂：0-25％乙酸乙酯/石油醚)分离纯化，得到化合物21。1H NMR(400MHz,CDCl3):9.11(s,2H),7.64-7.27(m,5H),5.32-4.88(m,4H),3.67(s,2H),2.10(s,3H)。
步骤18：式(I)化合物的合成
将化合物21(60mg,184.42umol)溶于二氯甲烷(5mL)中，加入三光气(43.78mg,147.54umol)和N,N-二异丙基乙胺(71.50mg,553.27umol,96.37μL)，反应液在20℃下搅拌20分钟，加入化合物13(139.72mg,184.42μmol)和N,N-二异丙基乙胺(71.50mg,553.27umol,96.37μL)，反应液在20℃下继续搅拌15小时。减压除去有机溶剂，所得粗产物经高效液相色谱法(色谱柱:Xtimate C18 150*25mm*5μm；流动相:[水(10mM碳酸氢铵)-乙腈]；乙腈％:37％-58％,10.5min)分离纯化，得到式(I)化合物。1H NMR(400MHz,CD3OD):9.28(s,2H),7.67-7.40(m,5H),6.66-6.49(m,2H),5.84(s,1H),5.33-5.20(m,2H),5.14-5.00(m,2H),4.34-4.16(m,2H),3.53(t,J＝5.2Hz,2H),3.37(s,3H),3.17-3.05(m,2H),2.87-2.78(m,1H),2.79-2.63(m,2H),2.58-2.47(m,1H),2.23(s,3H)；MS m/z＝579.4[M+1]+。
实施例2：式(I)化合物A晶型的制备
取50mg的式(I)化合物加入到4.0mL玻璃小瓶中，加入1mL的水使其成悬浊液。加入磁子后，将上述悬浊液样品置于磁力加热搅拌器上(50℃)进行试验，50℃下搅拌48小时后离心，残留物置于真空干燥箱中(60℃)干燥过夜，得式(I)化合物A晶型。
取50mg的式(I)化合物加入到4.0mL玻璃小瓶中，加入1mL的丙酮和水(1:4)的混合溶剂使其成悬浊液。加入磁子后，将上述悬浊液样品置于磁力加热搅拌器上(20℃)进行试验，20℃下搅拌96小时后离心，残留物置于真空干燥箱中(60℃)干燥过夜，得式(I)化合物A晶型。
实施例3：式(I)化合物F晶型的制备
取17g的式(I)化合物加入到1L玻璃瓶中，加入200mL乙醇和水(1:4)的混合溶剂使其成悬浊液。将上述悬浊液样品置于磁力加热搅拌器上(50℃)进行试验，50℃下搅拌24小时后过滤。收集滤饼，所得样品重复5次上述操作之后置于真空干燥箱中(60℃)干燥过夜，得式(I)化合物F晶型。
实验例1：TrkA酶活性测试
实验材料
激酶反应缓冲液
50mM Hepes(pH 7.5)，5mM MgCl2(氯化镁)，0.01mM Orthovanadate(钒酸钠)，1％BSA(牛血清蛋白)，1mM(二硫苏糖醇)
实验方法
本次试验使用Cisbio公司的均相时间分辨的荧光共轭能量转移(方法)进行活性检测。在检测板中，将酶、生物素标记的多肽底物、ATP以及检测化合物混合，孵育反应。反应后，加入乙二胺四乙酸终止反应，并同时加入Eu标记的抗体，链酶亲和素标记的XL665进行反应并检测。数据分别用荧光信号665nm和620nm的读数来表示，其中665nm/620nm的高比值表示活性较高，而665nm/620nm的低比值则表示活性受到抑制。
实验步骤
1.化合物稀释：待测化合物3倍进行稀释，共11个浓度，最终体系浓度从10μM至0.17nM；
2.在缓冲液为50mM Hepes(pH 7.5)，5mM MgCl2，0.01mM钒酸钠，1％BSA，1mM DTT的10μL反应体系中，包括0.5nM TrkA激酶，0.3μMbiotin-TK peptide(生物素标记的酪氨酸激酶底物多肽)，90μM ATP，在23℃孵育90分钟。加入10μL含有20mM EDTA，1.34nM磷酸化底物抗体，100nM链酶亲和素标记的荧光分子XL-665的终止溶液，在23℃孵育60分钟，多功能酶标仪Envision读数；
3.将仪器读取的数据计算出化合物的抑制率，然后运用IDBS的XLFIT5中mode 205计算出IC50值。
实验结果
结果见表3。
表3式(I)化合物对TrkA酶抑制的IC50值
化合物编号 TrkA IC50(nM)
式(I)化合物 0.56
结果表明：式(I)化合物具有显著的TrkA酶抑制作用。
实验例2：血浆蛋白结合率(PPB)测试
实验目的
测定受试化合物在人及SD大鼠血浆中的蛋白结合率。
实验操作
取人及SD大鼠的空白血浆796μL(血浆购买自BioreclamationIVT)，加入4μL受试化合物工作溶液(400μM)或华法林工作溶液(400μM)，使血浆样品中受试化合物与华法林终浓度均为2μM。将样品充分混合。有机相DMSO的终浓度为0.5％；移取50μL受试化合物和华法林血浆样品到样品接收板中，立即加入相应体积的对应空白血浆或缓冲液，使得每个样品孔的终体积为100μL，血浆：透析缓冲液的体积比为1:1，然后向这些样品中加入400μL终止液，此样品将作为T0样品用于回收率及稳定性测定。将T0样品存储于2℃-8℃，等待与其它透析完的样品一起进行后续处理；将150μL受试化合物和华法林血浆样品加入到每个透析孔的给药端，在透析孔对应的接收端中加入150μL空白透析缓冲液。然后将透析板封上透气膜后置于湿润的5％CO2的培养箱中，在37℃、100rpm振荡孵育4小时。透析结束后，移取50μL透析后的缓冲液样品和透析后的血浆样品到新的样品接收板。在样品中加入相应体积的对应空白血浆或缓冲液，使得每个样品孔的终体积为100μL，血浆：透析缓冲液的体积比为1:1。所有样品经过蛋白沉淀后进行LC/MS/MS分析，并通过公式：％未结合率＝100*膜缓冲液侧游离化合物浓度/膜血浆侧总化合物浓度,％蛋白结合率＝100-％未结合率,％回收率＝100*(膜缓冲液侧游离化合物浓度+膜血浆侧总化合物浓度)/透析前总化合物测定浓度，计算血浆蛋白未结合率，结合率以及回收率。
实验结果
结果见表4。
表4式(I)化合物的人、大鼠血浆蛋白未结合率
结果表明：式(I)化合物具有较高的血浆蛋白未结合率。
实验例3：细胞色素P450同工酶抑制活性测试
实验目的
测定受试化合物对人细胞色素P450同工酶不同亚型的抑制活性。
实验操作
准备受试化合物、标准抑制剂(100×最终浓度)和混合底物工作溶液；将冷冻于-80℃冰箱的微粒体取出解冻。将2μL的待测化合物和标准抑制剂溶液加至相应孔位，同时将2μL相应的溶剂加至无抑制剂对照孔位(NIC)和空白对照孔位(Blank)孔位；其次将20μL混合底物溶液加至相应孔位，Blank孔位除外(将20μL PB加至Blank孔位)；准备人肝微粒体溶液(使用后标记日期立刻放回冰箱)，随即将158μL人肝微粒体溶液加至所有孔位；将上述样品板放入37℃水浴预孵育，随即准备辅酶因子(NADPH)溶液；10分钟后，添加20μL NADPH溶液到所有孔位，样品板摇匀后，放入37℃水浴孵育10分钟；在相应时间点，加入400μL冷的乙腈溶液(内标为200ng/mL甲苯磺丁脲和拉贝洛尔)终止反应；样品板混合均匀后，4000rpm离心20分钟，沉淀蛋白质；取200μL上清加至100μL水中，摇匀后送LC/MS/MS检测。
实验结果
结果见表5。
表5式(I)化合物对P450同工酶抑制的IC50值
结果表明：式(I)化合物具有较低的药物-药物相互作用风险。
实验例4：肝微粒体中的代谢稳定性(MMS)研究
实验目的
测试供试品在人和大鼠肝微粒体中的代谢稳定性。
实验材料
供试品(10mM),睾酮(Testosterone，对照品,10mM),双氯芬酸(Diclofenac，对照品,10mM),普罗帕酮(Propafenone，对照品,10mM)。
缓冲体系
1.100mM磷酸钾缓冲剂(pH 7.4)。
2.10mM MgCl2。
化合物稀释
1.中间体溶液：采用45μL DMSO(带有450μL 1:1甲醇/水)来稀释5μL供试品或对照品。
2.工作液：采用450μL 100mM磷酸钾缓冲剂来稀释中间体溶液。
NADPH再生体系
1.β-磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸，来源于Sigma,Cat.No.N0505。
2.异柠檬酸，来源于Sigma,Cat.No.I1252。
3.异柠檬酸脱氢酶，来源于Sigma,Cat.No.I2002。
肝微粒体溶液制备(最终浓度：0.5mg蛋白/mL)
终止液
含100ng/mL甲苯磺丁脲(Tolbutamide)和100ng/mL拉贝洛尔(Labetalol)的冷乙腈作为内标物。
实验方法
加10μL供试品或对照品工作液到所有板中(T0,T5,T10,T20,T30,T60,NCF60)。
分配680μL/well肝微粒体溶液到96孔板上，然后添加80μL/well到每块板上，将上述孵育板放置于37℃预孵育大约10分钟。
在NCF60板上每孔添加10μL 100mM磷酸钾缓冲液。
预孵育结束后，分配90μL/well NADPH再生体系工作液到96孔板上，然后添加10μL/well到每块板上以启动反应。
孵化适当的时间(如5、10、20、30和60分钟)。
分别在每个样品孔中加入300μL/well终止液(于4℃冷藏，含100ng/mL甲苯磺丁脲(Tolbutamide)和100ng/mL拉贝洛尔(Labetalol))。
样品板摇匀约10分钟并在4℃下4000转离心20分钟。
离心时，加300μL HPLC水到每孔中，取100μL上清液用于LC-MS/MS分析。
数据分析
通过下面公式中计算半衰期T1/2和肝微粒固有清除率Clint(mic)
每克肝含45mg微粒体蛋白，小鼠、大鼠、犬、猴和人的肝重分别为88g/kg,40g/kg,32g/kg,30g/kg和20g/kg。
Ct为时间t时的浓度，t为孵育时间，C0为0时的浓度，ke为消除速率常数，Clint(mic)为肝微粒固有清除率，Clint(liver)为肝固有清除率。
实验结果
结果见表6。
表6式(I)化合物在人、大鼠肝微粒中的清除率
结果表明：式(I)化合物在人、大鼠两个种属上，具有较好的肝微粒体代谢稳定性。

Claims (15)

1.式(I)化合物的A晶型，其特征在于其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：9.34±0.20°，13.40±0.20°，14.57±0.20°，15.59±0.20°，16.95±0.20°，18.71±0.20°，19.51±0.20°，24.07±0.20°
2.根据权利要求1所述的A晶型，其特征在于其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：6.06°，8.30°，9.05°，9.34°，10.52°，11.86°，12.34°，13.40°，14.25°，14.57°，15.30°，15.59°，16.95°，17.74°，18.45°，18.71°，19.51°，19.88°，20.33°，21.03°，21.60°，22.61°，23.64°，24.07°，24.53°，25.37°，26.41°，27.05°，27.74°，28.10°，30.48°，34.72°，36.84°，37.60°。
3.根据权利要求1所述的A晶型，其特征在于其XRPD图谱如图1所示。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的A晶型，其特征在于其差示扫描量热曲线分别在75.3±3.0℃、99.6±3.0℃和167.9±3.0℃有一个吸热峰的峰值，在132.3±3.0℃有一个放热峰的峰值。
5.根据权利要求4所述的A晶型，其特征在于其DSC图谱如图2所示。
6.根据权利要求1-3任意一项所述的A晶型，其特征在于其热重分析曲线在55.0℃±3.0℃时失重达1.75％，在100.0±3.0℃时失重达3.08％。
7.根据权利要求6所述的A晶型，其特征在于其TGA图谱如图3所示。
8.式(I)化合物的F晶型，其特征在于其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：6.30±0.20°，9.25±0.20°，13.62±0.20°，15.80±0.20°，17.16±0.20°，17.96±0.20°，18.92±0.20°，20.09±0.20°；
9.根据权利要求8所述的F晶型，其特征在于其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射：6.30°，8.48°，9.25°，9.71°，12.57°，13.62°，14.46°，15.80°，17.16°，17.96°，18.67°，18.92°，19.69°，20.09°，21.26°，22.15°，23.68°，24.29°，25.58°，26.64°，27.32°，27.95°，28.28°，30.71°，35.16°。
10.根据权利要求9所述的F晶型，其特征在于其XRPD图谱如图4所示。
11.根据权利要求8-10任一项所述的F晶型，其特征在于其差示扫描量热曲线分别在100.0±3.0℃和172.7±3.0℃有一个吸热峰的峰值，在126.0±3.0℃有一个放热峰的峰值。
12.根据权利要求11所述的F晶型，其特征在于其DSC图谱如图5所示。
13.根据权利要求8-10任一项所述的F晶型，其特征在于其热重分析曲线在130.0℃±3.0℃时失重达3.92％。
14.根据权利要求13所述的F晶型，其特征在于其TGA图谱如图6所示。
15.根据权利要求1-7任意一项所述的A晶型或权利要求8-14任意一项所述的F晶型在制备治疗与疼痛、癌症、炎症、神经变性疾病以及感染性疾病药物中的应用。
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