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CN118159305A - 脱糖基化抗体的放射性复合物和放射性药物 - Google Patents

脱糖基化抗体的放射性复合物和放射性药物 Download PDF

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CN118159305A
CN118159305A CN202280071610.3A CN202280071610A CN118159305A CN 118159305 A CN118159305 A CN 118159305A CN 202280071610 A CN202280071610 A CN 202280071610A CN 118159305 A CN118159305 A CN 118159305A
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武田拓也
成田雄大
河谷稔
井泽彰宏
垂水勇太
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Nihon Medi Physics Co Ltd
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Abstract

本发明提供“复合物，其是螯合有放射性核素的螯合剂与脱糖基化的抗体的复合物，该螯合剂经由接头位点特异性地修饰前述抗体的Fc区域”。该复合物改善了效果的降低和副作用的风险。

Description

脱糖基化抗体的放射性复合物和放射性药物
技术领域
本发明涉及脱糖基化的抗体与放射性核素的复合物、包含该复合物的放射性药物和它们的制造方法。
背景技术
抗体一直以来在各种研究/开发中被大量用于靶分子的检测，其作为检测试剂、诊断药物在产业方面也变得极其重要。另外，抗体由于对其靶分子的特异性高，作为用于治疗疾病的药物也备受关注。
抗体因其与免疫细胞所表达的FcγR的相互作用而具有在细胞内皮系组织中聚集的特性。因而，报告了出于改善抗体体内动态这一目的而对抗体的糖链断裂后的抗体(以下也简称为脱糖基化抗体)进行放射标记的技术(非专利文献1)。另外，专利文献1中公开了基于经放射标记(89Zr)的脱糖基化抗体的PET实验。
另一方面，作为用于附加功能而不影响抗体对靶分子的特异性的位点特异性化学修饰，迄今为止报告了与抗体特异性结合或选择性结合的抗体修饰肽(也称为CCAP(Chemical conjugationby affinitypeptide，亲和肽化学偶联)肽)(专利文献2)，进而，本申请人报道了下述技术：向CCAP肽中导入能够与交联剂结合的氨基酸，借助该氨基酸与交联剂的结合，利用包含与交联剂结合的放射性核素的络合物等标记物质或抗癌剂等药剂来修饰抗体(专利文献3、4)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利申请公开第2019/0389966号说明书
专利文献2：国际公开第2016/186206号
专利文献3：国际公开第2017/217347号
专利文献4：国际公开第2021/075546号
非专利文献
非专利文献1：Vivier D.et al.,J Nucl Med.2019Aug；60(8):1174-1182。
发明内容
发明所要解决的课题
RI标记抗体在正常组织中的聚集和肿瘤聚集的降低成为课题。
非专利文献1和专利文献1的经89Zr标记的脱糖基化抗体的修饰个数的控制成为课题。另外，其没有着眼于基于脱糖基化抗体的放射线治疗。
并且，脱糖基化抗体能否用CCAP肽进行修饰尚属未知。
因此，提供降低在正常组织中的聚集而使肿瘤聚集性提高的RI标记抗体成为课题。
用于解决课题的手段
本发明的一个方式为复合物，其是脱糖基化抗体与螯合剂的复合物，放射性金属核素螯合于螯合剂，该螯合剂经由接头(L)位点特异性地修饰前述抗体的Fc区域。本发明的另一方式为复合物，其是脱糖基化抗体与螯合剂的复合物，放射性金属核素螯合于螯合剂，放射性金属核素为发射α射线的核素。
本发明的其它方式为上述复合物的制造方法。
本发明的其它方式为含有上述复合物作为有效成分的放射性药物。
需要说明的是，本发明中提及的“连结”在没有特别说明的情况下，是指直接连接或间接连接这两者。
发明效果
根据本发明，提供在正常组织中的聚集降低、肿瘤聚集性提高的RI标记抗体。
附图说明
图1是按照实施例1(PNGase F-treated Trastuzumab)和比较例1(Trastuzumab)的记载进行制造并制剂化而得到的放射性复合物相对于HER2的结合活性的评价结果的示意图。
图2是按照实施例1(89Zr-CCAP-Trastuzumab-PNGaseF)和比较例1(89Zr-CCAP-Trastuzumab)的记载进行制造并制剂化而得到的放射性复合物在生物体内的各组织(血液、心脏、肺、肝脏、脾脏、胰脏、胃、小肠、大肠、肾脏、膀胱、大腿肌肉、大腿骨、皮肤、肿瘤、剩余全身)中的分布的确认结果的示意图。
图3是按照实施例1(89Zr-CCAP-Trastuzumab-PNGaseF)和比较例1(89Zr-CCAP-Trastuzumab)的记载进行制造并制剂化而得到的放射性复合物在生物体内的各组织(血液、肝脏、脾脏、肿瘤)中的分布的确认结果的示意图。
图4是按照实施例2(PNGase F-treated Trastuzumab)和比较例2(Trastuzumab)的记载而制造的放射性复合物的抗原结合活性的评价结果的示意图。
图5是放射性复合物(实施例2)10kBq给药组(225Ac-Trastuzumab-PNGaseF_10KBq)、放射性复合物(实施例2)5kBq给药组(225Ac-Trastuzumab-PNGaseF_5KBq)、放射性复合物(比较例2)10kBq给药组(225Ac-Trastuzumab_10KBq)、放射性复合物(比较例2)5kBq给药组(225Ac-Trastuzumab_5KBq)和溶剂对照组在荷瘤小鼠中的经时性肿瘤体积推移的示意图。
图6是放射性复合物(实施例2)10kBq给药组(225Ac-Tmab-PNG._10KBq)、放射性复合物(实施例2)5kBq给药组(225Ac-Tmab-PNG._5KBq)、放射性复合物(比较例2)10kBq给药组(225Ac-Tmab-Cont._10KBq)、放射性复合物(比较例2)5kBq给药组(225Ac-Tmab-Cont._5KBq)和溶剂对照组在荷瘤小鼠中的经时性体重推移的示意图。
图7是放射性复合物(实施例2)10kBq给药组(225Ac-Trastuzumab-PNGaseF_10KBq)、放射性复合物(实施例2)5kBq给药组(225Ac-Trastuzumab-PNGaseF_5KBq)、放射性复合物(比较例2)10kBq给药组(225Ac-Trastuzumab_10KBq)、放射性复合物(比较例2)5kBq给药组(225Ac-Trastuzumab_5KBq)和溶剂对照组在荷瘤小鼠中的经时性存活个体数的示意图。
图8是按照实施例3(PNGase F-treated Cetuximab)和比较例3(Cetuximab)的记载而制造的放射性复合物的抗原结合活性的评价结果的示意图。
图9是按照实施例3(89Zr-CCAP-Cetuximab-PNGaseF)和比较例3(89Zr-CCAP-Cetuximab)的记载而制造的放射性复合物在生物体内的各组织(血液、心脏、肺、脾脏、胰脏、胃、小肠、大肠、大腿肌肉(muscle)、大腿骨(bone)、皮肤、肿瘤、肾脏、肝脏、剩余全身)中的分布的确认结果的示意图。
图10是按照实施例3和比较例3的记载而制造的放射性复合物在生物体内的各组织(血液、肝脏、脾脏、肿瘤)中的分布的确认结果的示意图。
具体实施方式
(1)放射性复合物1
本发明提供复合物(以下也称为本发明的放射性复合物或简称为复合物)，其为螯合有放射性核素的螯合剂与脱糖基化的抗体的复合物，该螯合剂经由接头位点特异性地修饰前述抗体的Fc区域。
(1-1)放射性金属核素
本发明的放射性复合物中包含的放射性金属核素为发射α射线的放射性核素、发射β射线的放射性核素、发射正电子的放射性核素或发射γ射线的放射性核素。将本发明的放射性复合物用于癌症治疗的情况下，优选使用发射α射线的放射性核素或发射β射线的放射性核素。另外，将本发明的放射性复合物用于癌症的诊断或检测的情况下，优选使用发射正电子的放射性核素或发射γ射线的放射性核素。作为发射α射线的放射性核素，可例示出Bi-212、Bi-213、Ac-225、Th-227。另外，作为发射β射线的放射性核素，可例示出Co-60、Fe-59、Cu-64、Cu-67、Sr-89、Y-90、Tc-99m、Ru-103、Sm-153、Dy-165、Hο-166、Lu-177、Re-186、Re-188、Au-198、Hg-203、Bi-212、Bi-213或Pb-212。另外，作为发射正电子的放射性核素，可例示出Cu-64、Ga-68、Y-86、Zr-89。另外，作为发射γ射线的放射性核素，可例示出Tc-99m或In-111。本发明的放射性复合物1中包含的放射性金属核素更优选为Ac-225、Y-90、Lu-177或Zr-89。本发明的放射性复合物1中包含的放射性金属核素特别优选为Ac-225或Zr-89。
(1-2)抗体
本发明的复合物中包含的抗体只要是糖链断裂后的抗体、即脱糖基化抗体就没有特别限定。本发明中使用的抗体可以为多克隆抗体，也可以为单克隆抗体，优选为单克隆抗体。抗体的来源没有特别限定，可列举出例如非人动物的抗体、非人哺乳动物的抗体和人抗体，可优选例示出人、大鼠、小鼠和兔。在抗体来自除人之外的物种的情况下，优选使用公知技术来进行嵌合化或人源化，本发明中使用的抗体可以为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。另外，本发明中使用的抗体可以为双特异性抗体。本发明的复合物中使用的脱糖基化抗体更优选为人IgG抗体。人IgG抗体可以是例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
人源化抗体(IgG)中，在重链的Fc部分的Asn残基(EU编号：第297个残基)具有N连结型糖链。另外，N连结型糖链、O连结型糖链有时也会与除Asn297之外的氨基酸残基结合。本发明中使用的脱糖基化抗体是这些糖链发生断裂而得到的，优选N连结型糖链发生了断裂，更优选Asn残基(第297个残基)的N连结型糖链发生了断裂。
抗体的脱糖基化可通过本领域中通常使用的方法来实施，可以化学实行或酶实行。化学脱糖基化可以参照Hakimuddin et al.,1987,Arch.Biochem.Biophys.259：52和Edge et al.,1981,Anal.Biochem.118：131的记载。酶断裂可以参照Thotakura et al.,1987,Meth.Enzymol.138：350的记载，可以使用各种糖链分解酶。酶的来源没有特别限定，可列举出源自植物、细菌或酵母的酶。优选为使N连结型糖链发生断裂(游离)的酶，可列举出被分类为EC3.5.1.52的肽-N4-(N-乙酰基-β-葡糖胺基)-天冬酰胺酰胺酶(PNGaseF、PNGaseA等)、被分类为EC3.2.1.96的糖苷内切酶等。作为糖苷内切酶，具体而言，可列举出内切-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶D(糖苷内切酶D、Endo-D、endo-D)、内切-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶H(糖苷内切酶H、Endo-H、endo-H)、糖苷内切酶S(EndoS、Endo-S、endo-S)、内切-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶M(糖苷内切酶M、Endo-M、endo-M)、内切-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶LL(糖苷内切酶LL、EndoLL、Endo-LL、endo-LL)、内切-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶F1(糖苷内切酶F1、Endo-F1、endo-F1)、内切-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶F2(糖苷内切酶F2、Endo-F2、endo-F2)和内切-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶F3(糖苷内切酶F3、Endo-F3、endo-F3)。
抗体的脱糖基化处理(反应温度、反应时间等)可根据糖链断裂(游离)所使用的手段，并按照本领域中实施的方法来实施。
作为本发明的复合物中使用的抗体的优选具体例，可列举出抗HER2抗体(例如曲妥珠单抗、帕妥珠单抗)、抗EGFR抗体(例如西妥昔单抗、帕尼单抗)、抗CD20抗体(例如利妥昔单抗、替伊莫单抗、奥瑞珠单抗)。
其均可利用自身公知的方法来制备或者进行商业获取。
需要说明的是，本发明的复合物中使用的抗体可以为WO2017/141604、WO2021/075545中记载的抗体。
(1-3)螯合剂
本发明中，螯合剂只要在结构中具有放射性金属核素进行配位的部位即可，没有特别限定。作为螯合剂，可列举出例如CB-TE2A(1,4,8,11-四氮杂双环[6.6.2]十六烷-4,11-二乙酸)、CDTA(环己烷-反式-1,2-二胺四乙酸)、CDTPA(4-氰基-4-[[(十二烷硫基)硫代甲酰基]硫基]戊酸)、DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、DOTMA((1R,4R,7R,10R)-α,α’,α”,α”’四甲基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、DOTAM(1,4,7,10-四(氨甲酰基甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷)、DOTPA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四丙酸)、1,4,7,10-四(吡啶-2-基甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷(Lpy)、DOTA-GA(α-(2-羧乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、DOTP(((1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四基)四(亚甲基))四膦酸)、DOTMP(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四(亚甲基膦酸))、DOTA-4AMP(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四(乙酰胺基亚甲基膦酸))、D02P(四氮杂环十二烷二甲烷膦酸)、去铁胺(DFO)、DTPA(甘氨酸,N,N-双[2-[双(羧甲基)氨基]乙基]-)、CHX-A”-DTPA(2,2'-((2-(((1S,2R)-2-(双(羧甲基)氨基)环己基)(羧甲基)氨基)乙基)氮烷二基)二乙酸)、DTPA-BMA(5,8-双(羧甲基)-11-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基]-3-氧代-2,5,8,11-四氮杂十三烷-13-酸)、EDTA(2,2',2”,2’”-(乙烷-1,2-二基双(氮烷三基))四乙酸)、NOTA(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸)、NOTP(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三基三(亚甲基膦酸))、TETPA(1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四丙酸)、TETA(1,4,8,11-四氮杂环十四烷-N,N',N”,N’”-四乙酸)、TTHA(3,6,9,12-四(羧甲基)-3,6,9,12-四氮杂十四烷二酸)、HEHA(1,2,7,10,13-六氮杂环十八烷-1,4,7,10,13,16-六乙酸)、1,2-HOPO(N,N’,N”,N’”-四(1,2-二氢-1-羟基-2-氧代吡啶-6-羰基)-1,5,10,14-四氮杂十四烷)、PEPA(1,4,7,10,13-五氮杂环十五碳-N,N’,N”,N’”,N””-五乙酸)、H4octapa(N,N’-双(6-羧基-2-吡啶基甲基)乙二胺-N,N’-二乙酸)、H2bispa2(6,6’-({9-羟基-1,5-双(甲氧基羰基)-2,4-二(吡啶-2-基)-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3,7-二基}双(亚甲基))二吡啶甲酸)、H2dedpa(1,2-[{6-(羧基)-吡啶-2-基}-甲基氨基]乙烷)、H2macropa(6-(1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-N,N’-甲基)吡啶甲酸)、H5decapa(N,N”-双(6-羧基-2-吡啶基甲基)-二亚乙基三胺-N,N’,N”-三乙酸)、H6phospa(N,N’-(亚甲基膦酸酯)-N,N’-[6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基]-甲基-1,2-二氨基乙烷)、HP-D03A(羟基丙基四氮杂环十二烷三乙酸)、卟啉之类的物质，优选为下述式(A)所示的化合物。
[化1]
(A)
式(A)中，R11、R12、R13和R14各自独立地为包含-(CH2)pCOOH、-(CH2)pC5H5N、-(CH2)pPO3H2、-(CH2)pCONH2或-(CHCOOH)(CH2)pCOOH的基团，R15为氢原子，p为0以上且3以下的整数。
作为式(A)所示的化合物，优选为包含来自1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)或其衍生物的结构的化合物，具体而言，可以在结构中包含来自选自DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、DOTMA((1R,4R,7R,10R)-α,α’,α”,α’”-四甲基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、DOTAM(1,4,7,10-四(氨甲酰基甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷)、DOTPA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四丙酸)、1,4,7,10-四(吡啶-2-基甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷(Lpy)、DOTA-GA(α-(2-羧乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、DOTP(((1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四基)四(亚甲基))四膦酸)、DOTMP(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四(亚甲基膦酸))、DOTA-4AMP(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四(乙酰胺基亚甲基膦酸)、D02P(四氮杂环十二烷二甲烷膦酸)中的一种螯合剂的结构，可更优选列举出下式(A-1)～(A-6)所示的化合物。本发明的放射性复合物中使用的螯合剂更优选为DOTA-GA(式(A-6)所示的化合物)。
[化2]
本发明的复合物中，螯合剂可以经由接头(L)与抗体连接。作为接头(L)，可列举出取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、聚乙二醇(PEG)基、肽、糖链、二硫醚基和它们的组合等。
本发明的复合物中，螯合剂与接头(L)优选通过共价键连接。因此，在本发明的复合物中，前述螯合剂的化合物内的一部分基团任选被取代成与接头(L)形成共价键的基团。例如，在本发明中使用的螯合剂为式(A)所示化合物的情况下，R12或R15任选被替换成与接头(L)形成共价键的基团。优选的是：R12被替换成与接头(L)形成共价键的基团时，R15为氢原子，R12为包含-(CH2)pCOOH、-(CH2)pC5H5N、-(CH2)pPO3H2、-(CH2)pCONH2或-(CHCOOH)(CH2)pCOOH的基团时，R15被替换成与接头(L)形成共价键的基团。
螯合剂与接头(L)的连接通过例如下述式(A-7)、(A-8)的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)基或下述式(A-9)的2,6-二氧代四氢-2H-吡喃基与接头(L)的伯胺的反应来形成。
[化3]
本发明的复合物1中，螯合剂相对于1分子抗体至少存在1分子以上即可。其中，从维持抗体自身的活性(抗原识别作用、中和作用、补体活化作用和/或调理素作用)的观点出发，优选向抗体的Fc区域(恒定区)位点特异性地导入螯合剂，本发明的复合物1中，螯合剂相对于1分子抗体更优选存在1分子或2分子。
(1-4)抗体修饰肽
优选的是：本发明中使用的脱糖基化抗体用抗体修饰肽位点特异性地修饰，优选对Fc区域进行修饰，在该情况下，本发明中使用的螯合剂可以使用经由接头(L)而包含下述式(i)所示的由13个以上且17个以下的氨基酸残基组成的肽(以下也称为“抗体修饰肽”)，并且通过用交联剂修饰的抗体修饰肽与抗体的交联反应而形成的物质。需要说明的是，在式(i)中，氨基酸序列的纸面左侧表示N末端侧，氨基酸序列的纸面右侧表示C末端侧，用以进行说明。在螯合剂经由作为接头的抗体修饰肽而与抗体连接的情况下，螯合剂与抗体修饰肽的连接位置没有特别限定，可以直接连接或间接连接于例如抗体修饰肽的N末端或C末端、优选为N末端。另外，抗体修饰肽的C末端为了提高其稳定性等而可以受到酰胺化等修饰。
(Xa)-Xaa1-(Xb)-Xaa2-(Xc)-Xaa3-(Xd)…(i)
式(i)中，Xa、Xb、Xc和Xd分别表示连续的a个X、连续的b个X、连续的c个X和连续的d个X；
X为在侧链上不具有硫醇基和卤代乙酰基的氨基酸残基，
a、b、c和d各自独立地为1以上且5以下的整数，并且满足a+b+c+d≤14；
Xaa1和Xaa3各自独立地表示来自在侧链上具有硫醇基的氨基酸的氨基酸残基，或者，
Xaa1和Xaa3中的一者表示来自在侧链上具有硫醇基的氨基酸的氨基酸残基，另一者表示来自在侧链上具有卤代乙酰基的氨基酸的氨基酸残基，Xaa1与Xaa3连接，
Xaa2为赖氨酸残基、精氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，其用交联剂修饰。
作为上述式(i)中的X可包含的氨基酸残基，可列举出例如来自甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、蛋氨酸等氨基酸的氨基酸残基，X可以为由同一种类的氨基酸构成的氨基酸残基，也可以为由彼此不同种类的氨基酸构成的氨基酸残基。
式(i)中的a、b、c和d只要是上述范围的数即可，没有特别限定，从肽与抗体的结合稳定性的观点出发，以a+b+c+d≤14为条件，a优选为1以上且3以下的整数，b优选为1以上且3以下的整数，c优选为3以上且5以下的整数，并且，d优选为1以上且3以下的整数。
Xaa1和Xaa3为来自在侧链上具有硫醇基的氨基酸的氨基酸残基，该氨基酸彼此可以相同也可以不同。作为在侧链上具有硫醇基的氨基酸，可列举出例如半胱氨酸、同半胱胺酸。这种氨基酸残基优选通过二硫键结合、或者硫醚基经由下述式(4)所示的接头而结合。式(4)中，波浪线部分表示与硫醚基的结合部分。
[化4]
(4)
关于Xaa1和Xaa3，代替上述组合，可以是Xaa1和Xaa3之中的一者为来自在侧链上具有硫醇基的氨基酸的氨基酸残基，另一者为来自在侧链上具有卤代乙酰基的氨基酸的氨基酸残基。它们借助硫醚键而结合。卤代乙酰基的末端被碘等卤素取代，通过与另一个侧链中的硫醇基的反应而使卤素脱离，形成硫醚键。
式(i)所示的抗体修饰肽的具体的氨基酸序列可列举出例如国际公开2016/186206号单行本、国际公开2017/217347号单行本和国际公开2018/230257号单行本中记载的肽，也可以使用它们。
这些之中，作为抗体修饰肽的氨基酸序列，优选具有下述序列(1)～(18)中的任一者，进一步优选具有下述序列(1)、(2)、(13)或(14)。在下述氨基酸序列(1)～(18)中，(Xaa2)表示赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，(Xaa1)和(Xaa3)均表示同半胱氨酸残基。同半胱氨酸彼此可以相互形成二硫键。另外，在下述氨基酸序列(1)～(18)中，除(Xaa1)、(Xaa2)和(Xaa3)之外的氨基酸用单字母缩写来表述。
(1)DCAYH(Xaa2)GELVWCT(SEQ ID NO:1)、
(2)GPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFH(SEQ ID NO:2)、
(3)RCAYH(Xaa2)GELVWCS(SEQ ID NO:3)、
(4)GPRCAYH(Xaa2)GELVWCSFH(SEQ ID NO:4)、
(5)SPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFH(SEQ ID NO:5)、
(6)GDDCAYH(Xaa2)GELVWCTFH(SEQ ID NO:6)、
(7)GPSCAYH(Xaa2)GELVWCTFH(SEQ ID NO:7)、
(8)GPDCAYH(Xaa2)GELVWCSFH(SEQ ID NO:8)、
(9)GPDCAYH(Xaa2)GELVWCTHH(SEQ ID NO:9)、
(10)GPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFY(SEQ ID NO:10)、
(11)SPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFY(SEQ ID NO:11)、
(12)SDDCAYH(Xaa2)GELVWCTFY(SEQ ID NO:12)、
(13)RGNCAYH(Xaa2)GQLVWCTYH(SEQ ID NO:13)、
(14)G(Xaa1)DCAYH(Xaa2)GELVWCT(Xaa3)H(SEQ ID NO:14)
(15)DCTYH(Xaa2)GNLVWCT(SEQ ID NO:15)、
(16)DCAYH(Xaa2)GNLVWCT(SEQ ID NO:16)、
(17)DCTYH(Xaa2)GELVWCT(SEQ ID NO:17)、和
(18)DCAWH(Xaa2)GELVWCT(SEQ ID NO:18)。
(1-5)接头(L)
接头(L)只要是在本发明的放射性复合物中能够将螯合剂与肽连接的接头即可，没有特别限定。可列举出取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、聚乙二醇(PEG)基、肽、糖链、二硫醚基、酰胺基、以及它们的组合等。
本说明书中，接头(L)是指在用肽修饰的脱糖基化抗体与螯合剂的连接中使用的接头的统称，是包括抗体修饰接头(L1)和螯合接头(L2)在内的术语。抗体修饰接头(L1)详见后述，其是向(1-4)中说明的肽的N末端侧导入的接头，螯合接头(L2)也详见后述，其是向(1-3)中说明的螯合剂的官能团中导入的接头。
本发明中使用的接头(L)可以包含通过点击反应而形成的结合部位，抗体修饰接头(L1)与螯合接头(L2)优选通过点击反应而结合。此处，可以认为通过点击反应而形成的结合部位优选为下述式(10a)或(10b)所示的含有三唑骨架的结构或下述式(10c)所示的含有哒嗪骨架的结构。式(10a)与式(10b)处于异构体的关系，因此，可以以任意的比例来包含。
[化5]
式(10a)和式(10b)中，R1A表示与螯合剂的连接部位，R2A表示与抗体修饰肽的连接部位。式(10c)中，R3A和R4A中的一者表示氢原子、甲基、苯基或吡啶基，另一者表示与螯合剂的连接部位，R5A表示与抗体修饰肽的连接部位。在式(10a)、式(10b)和式(10c)中，与抗体修饰肽的连接部位经由抗体修饰接头(L1)而与肽连接，与螯合剂的连接部位经由螯合接头(L2)而与螯合剂连接。
本发明的放射性复合物位点特异性地用肽修饰抗体，肽与螯合剂经由接头(L)连接，因此，使1分子或2分子的螯合剂与1分子的脱糖基化抗体复合化。
(1-6)复合物的制造方法
本发明的复合物的制造方法中，可以由下述的两个工序进行制造：偶联工序，将螯合剂与抗体进行偶联；以及络合物形成工序，形成放射性核素与螯合剂的络合物。偶联工序可以在络合物形成工序之前，也可以在络合物形成工序之后。
在偶联工序中，可以使用各种对于抗体而言的位点特异性化学修饰法，可列举出例如用具有前述(1-4)所示的抗体修饰肽的螯合剂或接头位点特异性地修饰抗体的Fc区域的方法。
在络合物形成工序中，使放射性金属核素螯合于螯合剂(形成络合物)。从提高络合物形成效率的观点出发，此处使用的放射性金属核素优选以能够电离的方式来使用，进一步优选以离子方式来使用。络合物形成工序只要能够与放射性金属核素形成络合物即可，向螯合剂中添加放射性金属核素的顺序没有限定。例如，可以将在以水为主体的溶剂中溶解有放射性金属离子的溶液用作放射性核素。
在形成络合物后，可以使用过滤过滤器、膜滤器、填充有各种填充剂的柱、色谱等对所得络合物进行纯化。
本发明的复合物的制造方法中，优选在络合物形成工序之后实施偶联工序。
在更优选的方式中，在络合物形成工序(A)中，在放射性核素与螯合剂之间形成络合物，所述螯合剂具有能够发生点击反应的第一原子团作为用于能够与抗体复合化的取代基。接着，在偶联工序(B)中，在肽修饰抗体与工序(A)中得到的络合物形成的螯合剂之间实施点击反应，得到本发明的复合物，所述肽修饰抗体是使用具有前述式(i)所示的抗体修饰肽和能够发生点击反应的第二原子团的抗体修饰接头(L1)位点特异性地修饰Fc区域而得到的。
以下，针对工序(A)和(B)进行详述。
作为能够发生点击反应的第一原子团与第二原子团的组合，根据点击反应的种类来选择适当的组合，可列举出例如炔烃与叠氮的组合、1,2,4,5-四嗪与烯烃的组合等。这些原子团只要第一原子团具有上述原子团的组合之中的一者且第二原子团具有上述原子团的组合之中的与第一原子团不同的一种原子团即可。从兼顾螯合剂和抗体的稳定性和它们的结合效率的提高的观点出发，优选的是：螯合接头(L2)为炔烃且抗体修饰接头(L1)为叠氮，或者，螯合接头(L2)为1,2,4,5-四嗪且抗体修饰接头(L1)为烯烃。作为基于这种原子团的组合的点击反应的具体例，可列举出Huisgen环化加成反应或反电子需求型Diels-Alder反应等。
能够能够发生点击反应的原子团的组合的具体例，如下式所示那样，可列举出：包含二苄基环辛炔(DBCO)作为第一原子团的炔烃的原子团(式(1a))与包含叠氮基作为第二原子团的叠氮的原子团(式(2a))的组合、或者、第一原子团包含1,2,4,5-四嗪的原子团(式(1b))与包含反式环辛烯(TCO)作为第二原子团的烯烃的原子团(式(2b))的组合。优选为式(1a)与式(2a)的组合。
[化6]
(1a)
式(1a)中，R1表示与螯合剂的连接部位，式(2a)中，R2表示与抗体中的抗体修饰肽的连接部位。
[化7]
(1b)
式(1b)中，R3和R4之中的一者表示与螯合剂或抗体中的抗体修饰肽中任一者的连接部位，另一者表示氢原子、甲基、苯基或吡啶基；式(2b)中，R5根据R3或R4而表示与螯合剂或抗体中的抗体修饰肽中任一者的连接部位。
使用上述式(1a)所示的包含DBCO作为第一原子团的炔烃的原子团时，可列举出市售的各种DBCO试剂。具体而言，可以选择例如DBCO-C6-酸、二苄基环辛炔-胺、二苄基环辛炔马来酰亚胺、DBCO-PEG-酸、DBCO-PEG-NHS-酯、DBCO-PEG-醇、DBCO-PEG-胺、DBCO-PEG-NH-Boc、羧基罗丹明-PEG-DBCO、磺基罗丹明-PEG-DBCO、TAMRA-PEG-DBCO、DBCO-PEG-生物素、DBCO-PEG-DBCO、DBCO-PEG-马来酰亚胺、TCO-PEG-DBCO、DBCO-mPEG等，优选使用二苄基环辛炔马来酰亚胺。
在工序(A)中，更优选使用具有下述式(ii)所示结构的螯合剂。
A-B-C…(ii)
式(ii)中，A为下述式(iia)所示的螯合物部。
[化8]
(iia)
式(iia)中，Ra、Rb和Rc独立地为包含-(CH2)pCOOH、-(CH2)pC5H5N、-(CH2)pPO3H2、-(CH2)pCONH2或-(CHCOOH)(CH2)pCOOH的基团，p为0以上且3以下的整数，Rd或Re中的任一者为与B的结合部位(*)，另一者为氢原子；或者，Ra、Rb和Rc独立地为包含-(CH2)pCOOH、-(CH2)pC5H5N、-(CH2)pPO3H2、-(CH2)pCONH2或-(CHCOOH)(CH2)pCOOH的基团，p为0以上且3以下的整数。
式(ii)中，B用下述式(iib)表示。
[化9]
(iib)
式(iib)中，La和Lb独立地是至少包含酰胺键或硫脲键的碳原子数1以上且50以下的结合接头，t为0以上且30以下的整数，s为0或1，*为与A的结合部位，**为与C的结合部位。
式(ii)中，C为下述式(iic)所示的炔烃衍生物或式(iid)所示的四嗪衍生物中的任一者。
[化10]
(iic)(iid)/>
式(iic)中，X为CHRk-**或N-**，Y为CHRk或C＝O，Rk独立地为氢原子或者碳原子数1以上且5以下的烷基，在X为CHRk-**且Y为CHRk的情况下，Rk部分任选一同形成环烷基，Rf、Rg、Rh和Ri独立地为氢原子、卤素原子、碳原子数1以上且5以下的烷基，Rf与Rg任选一同形成烃环，或者，Rh与Ri任选一同形成烃环，**表示与B的结合部位，式(iid)中，**表示与B的结合部位，Rj表示氢原子、甲基、苯基或吡啶基。
作为工序(A)中使用的螯合剂，更优选为上述式(iia)中的Ra～Rd为-(CH2)pCOOH、p为1、Re为与B的结合部位(*)的DOTA衍生物；或者，Ra～Rc为-(CH2)pCOOH、p为1、Rd为与B的结合部位(*)、Re为氢原子的DO3A衍生物；或者DOTAGA衍生物中的任一者。
式(ii)中，在A为上述DOTA衍生物的情况下，B更进一步优选为下述DOTA-PEGt-DBCO衍生物，其中，La为包含硫脲键的碳原子数1以上且50以下的结合接头，s为0或1，s为1时，t为0以上且30以下的整数，Lb为包含酰胺键或硫脲键的碳原子数1以上且50以下的结合接头，C为式(iic)所示的炔烃衍生物，式(iic)中，X为N-**，Y为CHRk，Rk为氢原子，Rf与Rg一同形成苯环，Rh与Ri一同形成苯环，**为与B的结合部位；或者，B更进一步优选为下述DOTA-PEGt-Tz衍生物，其中，La为包含硫脲键的碳原子数1以上且50以下的结合接头，s为0或1，s为1时，t为0以上且30以下的整数，Lb为包含酰胺键或硫脲键的碳原子数1以上且50以下的结合接头，C为式(iid)所示的四嗪衍生物。
式(ii)中，在A为上述DO3A衍生物的情况下，B更进一步优选为下述DO3A-PEGt-DBCO衍生物，其中，La为包含酰胺键或硫脲键的碳原子数1以上且50以下的结合接头，s为0或1，s为1时，t为0以上且30以下的整数，Lb为包含酰胺键的碳原子数1以上且50以下的结合接头，C为式(iic)所示的炔烃衍生物，式(iic)中，X为N-**，Y为CHRk，Rk为氢原子，Rf与Rg一同形成苯环，Rh与Ri一同形成苯环，**为与B的结合部位。
式(ii)中，在A为上述DOTAGA衍生物的情况下，B更进一步优选为下述DOTAGA-PEGt-DBCO衍生物，其中，La为包含酰胺键或硫脲键的碳原子数1以上且50以下的结合接头，s为0或1，s为1时，t为0以上且30以下的整数，Lb为包含酰胺键或包含硫脲键的碳原子数1以上且50以下的结合接头，C为式(iic)所示的炔烃衍生物，式(iic)中，X为N-**，Y为CHRk，Rk为氢原子，Rf与Rg一同形成苯环，Rh与Ri一同形成苯环，**为与B的结合部位。
螯合剂与放射性核素的摩尔比率以螯合物部/放射性核素计，下限优选为10/1以上，更优选为100/1以上，进一步优选为500/1以上，上限优选为15000/1以下，更优选为10000/1以下，进一步优选为7000/1以下，例如，优选为100/1以上且7000/1以下的范围，更优选为500/1以上且7000/1以下的范围。
络合物形成反应优选在溶剂中进行。作为溶剂，可以使用例如水、生理盐水、或者乙酸钠缓冲液、乙酸铵缓冲液、磷酸缓冲液、磷酸缓冲生理盐水、三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris缓冲液)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES缓冲液)或四甲基乙酸铵缓冲液等缓冲液等。
溶剂的液量没有特别限定，从制造工序中的实用性的观点出发，在工序(A)开始时，下限为0.01mL以上、优选为0.1mL以上、更优选为1.0mL以上、进一步优选为10mL以上、更进一步优选为100mL以上，上限优选为1000mL以下、更优选为100mL以下、进一步优选为10mL以下、更进一步优选为1.0mL以下，例如为0.01mL以上且100mL以下的范围。
关于络合物形成反应的反应液中的螯合剂的浓度，从作为目标的螯合剂的收率的观点出发，在工序(A)开始时，下限各自独立地优选为0.001μmol/L以上、更优选为0.01μmol/L以上、进一步优选为0.1μmol/L以上、更优选为1μmol/L以上，上限各自独立地优选为1000μmol/L以下、更优选为100μmol/L以下、进一步优选为10μmol/L以下，可列举出例如1μmol/L以上且100μmol/L以下的范围。
作为络合物形成反应的温度，例如可以为室温(25℃)，也可以为在加热条件下，从兼顾螯合剂的分解抑制和络合物的形成效率提高的观点出发，下限优选为20℃以上、更优选为30℃以上、进一步优选为35℃以上、更进一步优选为37℃以上、特别优选为45℃以上，上限优选为150℃以下、更优选为120℃以下、进一步优选为100℃以下、更进一步优选为90℃以下，例如优选为30℃以上且100℃以下的范围，更优选为35℃以上且90℃以下的范围。
关于反应时间，以呈现上述反应温度为条件，下限优选为5分钟以上、更优选为10分钟以上、进一步优选为20分钟以上、更进一步优选为30分钟以上、特别优选为45分钟以上，上限优选为180分钟以下、更优选为150分钟以下、进一步优选为120分钟以下、更进一步优选为90分钟以下、特别优选为60分钟以下，例如，优选为10分钟以上且150分钟以下的范围，更优选为10分钟以上且60分钟以下的范围。
工序(B)中使用的抗体是使用具有前述式(i)所示的抗体修饰肽和能够发生点击反应的第二原子团的抗体修饰接头(L2)，位点特异性地修饰在上述“(1-2)抗体”一项中详述的人源化抗体的Fc区域(恒定区)而得到的肽修饰抗体。
抗体修饰肽可通过组合使用氨基酸(天然氨基酸和非天然氨基酸均可)，并供于例如液相合成法、固相合成法、自动肽合成法、基因重组法和噬菌体展示法等肽合成法来制造。在肽的合成中，根据需要可以进行所使用的氨基酸的官能团的保护。它们可按照例如国际公开2017/217347号单行本和国际公开2018/230257号单行本中记载的方法来进行。
抗体修饰接头(L2)可以为抗体修饰肽与下述式(S1)所示的接头结合而成的接头。
*-((L1)m-Z)k-L2-AG2…(S1)
式中，*表示与肽的N末端或C末端的结合部位，
L1为聚乙二醇(PEG)接头部，
m为1以上且50以下的整数，
Z为将(L1)m与L2结合的第二接头部，
k为0或1，
L2为第二PEG接头部，
AG2为第二原子团。
在前述式(S1)中，Z的结构只要是将(L1)m与L2彼此结合的接头结构即可，没有特别限定，可以包含例如由1个以上且5个以下的氨基酸残基构成的氨基酸序列。在该情况下，Z中包含的氨基酸序列优选包含半胱氨酸残基，更优选为借助通过半胱氨酸残基的硫醇基与马来酰亚胺基的结合而形成的硫醚基，与L2结合。
本发明中，构成L2的PEG接头部优选具有下述式(P2)所示的结构。在式(P2)中，n为整数，优选为1以上且50以下，更优选为1以上且20以下，进一步优选为2以上且10以下，更进一步优选为2以上且6以下。
[化11]
(P2)
PEG接头部的结构的一端可以用来自市售的PEG化试剂的结构或者来自在PEG化时通常使用的试剂的结构进行修饰，没有特别限定，可例示出例如来自二甘醇酸或其衍生物、马来酰亚胺或其衍生物的结构。
向抗体修饰接头(L2)中导入前述第二原子团的方法可列举出下述方法：通过上述方法而得到具有期望的氨基酸序列的抗体修饰肽后，将该肽溶解于添加有溶解辅助剂和还原剂、以及根据需要的酸的溶液中，向该溶液中添加作为第二原子团的包含叠氮基或反式-环辛烯(TCO)的原子团的有机溶剂溶液，并在室温下进行搅拌来导入。
在导入包含叠氮基的原子团作为第二原子团的情况下，可以使用市售的叠氮基导入试剂，并按照常规方法向肽的N末端或C末端直接导入叠氮基；或者，借助上述接头结构来导入包含叠氮基的原子团。作为所使用的叠氮基导入试剂，可列举出例如甲硅烷基叠氮化物、磷酸叠氮化物、烷基铵叠氮化物、无机叠氮化物、磺酰基叠氮化物或PEG叠氮化物等。
另外，在导入包含TCO的原子团作为第二原子团的情况下，可以使用包含TCO的市售的点击化学用试剂，并按照常规方法，向肽的N末端或C末端直接导入TCO；或者，经由上述接头结构来导入包含TCO的原子团。
使抗体修饰肽与脱糖基化抗体进行结合而得到肽修饰抗体的方法可按照国际公开2017/217347号单行本的记载，使例如上述抗体修饰肽、脱糖基化抗体、交联剂和根据需要的催化剂分散至适当的缓冲液中来进行。此处，交联剂可以使用上述交联剂。另外，在使抗体修饰肽与脱糖基化抗体进行结合时，根据需要在实施1次或2次以上的将包含脱糖基化抗体的溶液用超滤过滤器等进行处理并使其分散至缓冲液中的缓冲液置换后，再与抗体修饰肽结合。
本发明的抗体修饰肽结合于抗体、例如IgG的Fc区。在该情况下，本发明的抗体修饰肽也称为IgG结合肽。本申请的IgG结合肽在上述Xaa1处接近IgGFc的特定区域、即人IgGFc中的依照Eu编号的Lys248残基或Lys246残基、优选为Lys248残基所对应的Fc区域的赖氨酸残基。因此，通过将本申请的IgG结合肽的Xaa1用交联剂修饰，并使其与IgG发生交联反应，从而IgG结合肽的Xaa1与上述赖氨酸残基所对应的本申请的IgG Fc的赖氨酸残基之间能够位点特异性地形成交联结构。
本申请中，“交联剂”是指用于使本申请的IgG结合肽与IgG Fc借助共价键进行连接的化学物质。只要是本领域技术人员，就可以适当选择本申请的交联剂，可以制成具有至少2个能够与期望的氨基酸残基(例如赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸、以及精氨酸残基等)结合的部位的化合物。作为其例子，没有限定，可列举出：DSG(disuccinimidyl glutarate、二琥珀酰亚胺基戊二酸酯)、DSS(disuccinimidyl suberate、二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)等优选包含2个以上琥珀酰亚胺基的交联剂；DMA(dimethyl adipimidate·2HCl、己二亚氨酸二甲酯二盐酸盐)、DMP(dimethyl pimelimidate·2HCl、庚二亚氨酸二甲酯二盐酸盐)和DMS(dimethylsuberimidate·2HCl、辛二亚氨酸二甲酯二盐酸盐)等优选包含2个以上亚胺酸部分的交联剂；以及DTBP(dimethyl 3,3’-dithiobispropionimidate·2HCl、3,3’-二硫代丙亚氨酸二甲酯二盐酸盐)和DSP(dithiobis(succinimidylpropionate)、二硫代双琥珀酰亚胺丙酸)等具有SS键的交联剂。
例如，DSS或DSG等包含琥珀酰亚胺基的交联剂与存在于赖氨酸残基的侧链和多肽的N末端的伯胺发生反应，因此，在对IgG结合肽的N末端进行封端的基础上，使其与DSS或DSG发生反应，由此，能够用DSS或DSG仅特异性地修饰赖氨酸残基的侧链。这种氨基酸残基与交联剂的组合只要是本领域技术人员就可以适当选择。
IgG结合肽与本申请的抗体之间的交联反应尤其可以在IgG结合肽的上述Xaa1的氨基酸残基与人IgG Fc中的EU编号：Lys248或Lys246、优选为Lys248之间位点特异性地发生。
关于该混合工序的条件，只要在本申请的IgG结合肽与本申请的抗体之间发生交联反应的条件下进行即可，没有特别限定。例如，通过将本申请的IgG结合肽与本申请的抗体在适当的缓冲液中在室温(例如约15℃～30℃)下混合，从而能够进行反应。该混合工序根据需要可以添加适量促进交联反应的催化剂来进行。
作为一例，至少添加包含水的溶剂而将本申请的抗体溶解。该溶剂除水之外，可列举出例如二甲基亚砜、乙腈、生理盐水、或者乙酸钠缓冲液、乙酸铵缓冲液、磷酸缓冲液、磷酸缓冲生理盐水、Tris缓冲液、HEPES缓冲液或四甲基乙酸铵缓冲液等缓冲液等。在使用缓冲液的情况下，从抗体稳定性的观点出发，25℃下的pH优选设为4.0以上且10.0以下、更优选设为5.5以上且8.5以下。关于抗体的浓度，在交联反应开始时，优选将下限设为1.0μmol/L以上且将上限设为1000μmol/L以下，关于上限，优选设为500μmol/L以下。
接着，可以添加用交联剂修饰的IgG结合肽和根据需要的催化剂，使其在10℃以上且30℃以下发生分散来进行。
该混合工序中的本申请的IgG结合肽与本申请的抗体的混合比率没有特别限定。本申请的IgG结合肽与本申请的抗体的摩尔比率例如可以设为1:1～20:1、优选设为2:1～20:1或5:1～10:1。
在某个优选方式中，在上述混合工序中，可以以IgG结合肽相对于本申请的抗体(摩尔比)为0.5～2.2、优选为0.8～1.8来进行混合。通过这样操作，从而能够高效地获得一价修饰抗体(即，相对于抗体包含1个IgG结合肽的复合物)。
该混合工序中的混合时间(反应时间)只要在本申请的IgG结合肽与本申请的抗体之间发生交联反应即可，没有限定，例如可以设为1分钟～5小时、优选设为10分钟～2小时。
历经上述工序而得到的肽修饰抗体是以任意比例含有相对于1分子脱糖基化抗体结合有1分子抗体修饰肽的抗体(以下称为“一价抗体”)以及相对于1分子脱糖基化抗体结合有2分子抗体修饰肽的抗体(以下称为“二价抗体”)的混合物，可以将其直接供于后续工序，也可以利用过滤过滤器、膜滤器、填充有各种填充剂的柱、各种色谱等方法对未修饰抗体、一价抗体和二价抗体进行分离纯化后，仅将任意价数的抗体供于后续工序。
经纯化的结果，在未修饰抗体与其它价数的抗体无法分离的情况下，可以以含有它们的混合物的形式供于之后的工序。
在对未修饰抗体、一价抗体和二价抗体进行分离纯化的情况下，可以利用上述的任意纯化方法进行分离纯化，可以使用填充有各种填充剂的柱，可以使用例如填充有蛋白质A、蛋白质G或上述抗体修饰肽等蛋白质结合于载体而得到的填充剂的柱。作为向这种柱中填充的填充剂的载体的形状，可列举出凝胶(例如柱用凝胶)、颗粒、珠、纳米颗粒、微粒和大珠等形状，作为载体的材质，可列举出磁性物质、胶乳、琼脂糖、玻璃、纤维素、Sepharose、硝基纤维素、聚苯乙烯、其它高分子材料。具体而言，可例示出使上述抗体修饰肽结合于柱用凝胶而得到的IgG-BP柱(参照WO2021/080008)。
使用该IgG-BP柱，利用各自对抗体修饰肽的相互作用的不同，可分别分离纯化包含相对较多的未修饰抗体和一价抗体的第一抗体组合物和包含相对较多的二价抗体的第二抗体组合物。关于第一抗体组合物，在某个优选方式中，未修饰抗体与一价修饰抗体的摩尔比为4～47:53～96、优选为4～30:70～96、更优选为4～20:80～96、进一步优选为4～10:90～96。
经分离纯化的第一抗体组合物或第二抗体组合物可以直接用于随后的工序(B)中的点击反应，也可以在调节所含有的肽修饰抗体的蛋白质浓度后，再用于工序(B)中的点击反应。
工序(B)中的点击反应是在螯合剂所具有的能够进行点击反应的第一原子团与肽修饰抗体所具有的能够进行点击反应的第二原子团之间实施的。通过该点击反应，形成将螯合剂与抗体连接的结合基团(能够与抗体复合化的取代基)。
只要肽修饰抗体与工序(A)中得到的络合物能够进行点击反应即可，对它们的添加顺序没有限定，例如，可以向收纳有溶剂的反应容器内添加该络合物和该肽修饰抗体中的一者，接着添加另一者并使其反应，也可以在将该螯合剂和该抗体中的一者分散于溶剂而得到的分散液中添加另一者并使其反应。或者，可以向收纳有溶剂的反应容器内同时添加它们并使其反应。
作为在工序(B)的点击反应中使用的溶剂，可以使用包括水在内的溶剂，可以使用例如水、生理盐水、或者乙酸钠缓冲液、乙酸铵缓冲液、磷酸缓冲液、磷酸缓冲生理盐水、Tris缓冲液、HEPES缓冲液或四甲基乙酸铵缓冲液等缓冲液等。在使用缓冲液的情况下，从兼顾络合物和抗体的稳定性以及它们的结合效率的观点来看，将25℃下的pH优选设为4.0以上且10.0以下、进一步优选设为5.5以上且8.5以下。
反应液量没有特别限定，从制造工序中的实用性的观点来看，在工序(B)开始时，下限优选为0.001mL以上、更优选为0.01mL以上、进一步优选为0.1mL以上、更进一步优选为1mL以上，上限优选为1000mL以下、更优选为100mL以下、进一步优选为10mL以下、更进一步优选为1mL以下，例如优选为0.001mL以上且1000mL以下的范围、更优选为0.1mL以上且10mL以下的范围。
另外，关于螯合剂和抗体在反应液中的浓度，在工序(B)开始时，作为下限，各自独立地优选为0.001μmol/L以上、更优选为0.01μmol/L以上、进一步优选为0.1μmol/L以上、更进一步优选为1.0μmol/L以上，作为上限，各自独立地优选为1000μmol/L以下、更优选为100μmol/L以下，例如优选为0.1μmol/L以上且1000μmol/L以下的范围，从作为目标的复合物的收量的观点出发，更优选为1μmol/L以上且100μmol/L以下的范围。
从防止抗体的不希望的变性且提高反应效率的观点来看，关于工序(B)中的点击反应，反应温度的上限优选为50℃以下、更优选为40℃以下。另外，反应温度的下限只要是发生反应的温度即可，没有特别限定，优选为15℃以上。点击反应的反应时间以上述反应温度为条件，优选为5分钟以上、更优选为10分钟以上，且优选为24小时以下、更优选为20小时以下，例如优选为5分钟以上且24小时以下的范围、更优选为10分钟以上且20小时以下的范围。
所得到的复合物可以直接使用，或者，也可以利用过滤过滤器、膜滤器、填充有各种填充剂的柱、色谱等进行纯化。
通过工序(A)和(B)而制造的复合物是脱糖基化抗体的Fc区的赖氨酸残基用螯合剂特异性修饰而得到的复合物。该复合物中，相对于1分子的该抗体，具备1分子或2分子的前述螯合剂。螯合剂经由接头(L)位点特异性地修饰本发明的抗体的Fc区。该接头(L)由与螯合剂连接的螯合接头(L2)、与该接头(L2)连接的第一原子团、能够与第一原子团进行点击反应的第二原子团、与第二原子团连接的抗体修饰接头(L1)(包含上述式(i)所示的抗体修饰肽)构成。因此，该接头(L)具有来自第一原子团和第二原子团的化学结构。作为这种化学结构，可以考虑前述式(10a)或(10b)所示的含有三唑骨架的结构或前述式(10c)所示的含有哒嗪骨架的结构。由于式(10a)与式(10b)处于异构体的关系，因此，可以以任意的比例来包含。
(1-7)放射性药物
放射性药物是指包含本发明的复合物且制成适合向对象生物体内给药的形态的组合物。放射性药物例如可以将按照上述(1-6)所示的方法而制造的复合物直接溶解或者将其纯化后溶解于以水为主体且与生物体大致等渗的溶剂来制造。在该情况下，放射性药物优选为水溶液的形态，根据需要可以包含药学上可接受的其它成分。放射性药物以口服或静脉内、皮下、腹腔内或肌肉内等非口服的方式对生物体给药有效量，其用于癌症的治疗、癌症的诊断或病灶的检测等。
这里，作为给药对象，有人或小鼠、大鼠、猴、豚鼠、黑猩猩、绵羊、山羊、狗、猫、猪、牛或马等动物，没有特别限定。优选为人。
对象疾病根据所使用的抗体特性来确定，在抗HER2抗体的情况下，可列举出HER2过度表达的疾病。具体而言，可列举出确认到HER2过度表达的乳腺癌、确认到HER2过度表达的无法治愈切除的进行性/再发性胃癌等。在抗EGFR抗体的情况下，可列举出EGFR过度表达的疾病。具体而言，可列举出无法切除的进行性/再发大肠癌、头颈部癌等。在抗CD20抗体的情况下，可列举出CD20过度表达的疾病。具体而言，可列举出CD20阳性的B细胞性非霍奇金淋巴瘤、免疫抑制状态下的CD20阳性的B细胞性淋巴增殖性疾病、韦格纳肉芽肿、显微镜下多血管炎、难治性肾病综合征、肾移植/肝移植时的ABO血液型不匹配移植中的抗体相关型排斥反应的抑制等。
此处的“有效量”是指在给药对象的诊断方面或治疗方面能够获得有效效果的量。应该对对象给药的有效量因对象的种类、对象的体重、给药的剂型(片剂、注射剂等)和途径(口服给药、非口服给药等)、以及疾病(例如癌症)的严重程度等而异。医生或兽医可考虑这些因素来确定适当的有效量。
作为放射性金属核素，通过选择具有治疗效果的核素、具体而言，选择发射α射线的核素或发射β射线的核素(优选为Ac-225、Y-90、Lu-177，更优选为Ac-225)，从而本发明的放射性药物可用于癌症的放射线内用疗法。在该放射线内用疗法中，可通过静注或口服给药本发明的放射性药物，从而能够使本发明的放射性复合物聚集于癌原发灶或转移灶那样的病灶部位，利用由放射性金属核素发射的放射线破坏病灶部位的癌细胞。本发明的放射性药物的给药量、剂量根据有效成分的有效性、给药的方式/途径、癌症的进展阶段、患者的体型/体重/年龄、并用的其它疾病的治疗药的种类或量来适当选择。
另外，作为放射性金属核素，通过选择发射正电子的放射性核素、发射γ射线的放射性核素(优选为Zr-89)，从而可用于癌症的诊断或病灶的检测。在使用发射正电子的放射性核素的放射性药物的情况下，可适合地用于PET(Positron Emission Tomography：正电子发射断层成像术)检查，在使用发射γ射线的放射性核素的放射性药物的情况下，可适合地用于SPECT(Single Photon Emission Computed Tomography：单光子发射计算机断层成像术)检查。可以将其与上述癌症的放射线内用疗法中的癌症的诊断或病灶的检测加以并用。本发明的癌症诊断用放射性药物可用于癌症的进行放射线内用疗法之前的诊断，也可以用于癌症的进行放射线内用疗法之后的诊断。通过用于癌症的进行放射线内用疗法之前的诊断，从而可用于判断是否执行使用具备发射α射线的金属核素的本发明的放射性药物进行的癌症的放射线内用疗法的治疗选择。另外，通过用于癌症的进行了放射线内用疗法之后的诊断，从而可用于判定使用本发明的放射性药物进行的癌症的放射线内用疗法是否具有效果或者给药量的增减等治疗计划的适当化。
(2)复合物2
作为另一实施方式，本发明提供复合物，其是螯合有放射性核素的螯合剂与脱糖基化的抗体的复合物，上述放射性核素为α射线核素。
本发明的复合物中，螯合剂可以随机地修饰抗体，在该情况下，优选具备1分子以上且8分子以下的抗体。
在随机修饰抗体的情况下，在螯合剂或接头与抗体的偶联工序中，可以使用各种抗体的化学修饰法。具体而言，可列举出(a)～(e)的方法。
(a)胺偶联法(使用具有被N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)基活化的羧基的螯合剂或螯合物来修饰抗体的赖氨酸残基的氨基的方法)；
(b)利用具有对SH基具有反应性的马来酰亚胺基的螯合剂或接头，对通过将位于抗体的关键部位的多肽链之间的二硫键(SS键)进行部分还原而产生的巯(SH)基进行修饰；
(c)对于通过基于基因工程学的氨基酸突变而向抗体中新导入的半胱氨酸，修饰具有马来酰亚胺基的螯合剂或接头的方法；
(d)对于通过基于基因工程学的氨基酸变异而向抗体中新导入的叠氮化赖氨酸的叠氮基，利用点击反应来修饰具有炔烃(例如二苯并环辛炔：DBCO)的螯合剂或接头的方法；
(e)对于利用转谷氨酰胺酶向抗体的特定位置导入的谷氨酰胺，修饰具有赖氨酸的侧链的螯合剂或接头的方法。
螯合剂中的放射性核素为α射线核素，螯合剂可以随机修饰抗体，除此之外，应用与上述“(1)复合物1”相同的定义。
本发明的技术思想中还包括以下方案。
(1)复合物，其是螯合有放射性核素的螯合剂与脱糖基化的抗体的复合物，
该螯合剂经由接头位点特异性地修饰前述抗体的Fc区域。
(2)根据(1)所述的复合物，其中，该接头包含抗体修饰肽，所述抗体修饰肽用下述式(i)表示且由13个以上且17个以下的氨基酸残基组成。
(Xa)-Xaa1-(Xb)-Xaa2-(Xc)-Xaa3-(Xd)…(i)
式中，Xa、Xb、Xc和Xd分别表示连续的a个X、连续的b个X、连续的c个X和连续的d个X；
X为在侧链上不具有硫醇基和卤代乙酰基的氨基酸残基；
a、b、c和d各自独立地为1以上且5以下的整数，并且满足a+b+c+d≤14；
Xaa1和Xaa3各自独立地表示来自在侧链上具有硫醇基的氨基酸的氨基酸残基，且经由二硫键结合或者硫醚基经由接头结合，或者，
Xaa1和Xaa3中的一者表示来自在侧链上具有硫醇基的氨基酸的氨基酸残基，另一者表示来自在侧链上具有卤代乙酰基的氨基酸的氨基酸残基，且经由硫醚键结合，
Xaa2为赖氨酸残基、精氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸。
(3)根据(2)所述的复合物，其中，在前述式(i)中，该抗体修饰肽的Xaa2为赖氨酸残基。
(4)根据(2)或(3)所述的复合物，其中，该抗体修饰肽包含由SEQ ID NO:2(其中，Xaa2为赖氨酸残基)所示的氨基酸序列组成的抗体修饰肽。
(5)根据(1)～(4)中任一项所述的复合物，其中，该螯合剂具有来自下述式(A)所示的化合物或其盐的结构。
[化12]
(A)
式(A)中，R11、R13和R14各自独立地为包含-(CH2)pCOOH、-(CH2)pC5H5N、-(CH2)pPO3H2、-(CH2)pCONH2或-(CHCOOH)(CH2)pCOOH的基团，R12或R15中的一者为氢原子、羧基、或者碳原子数2或3的羧基烷基，另一者为用于与前述抗体复合化的取代基，p为0以上且3以下的整数，R12为用于与前述抗体复合化的取代基时，R15为氢原子，R12不是用于与前述抗体复合化的取代基时，R15为用于与前述抗体复合化的取代基。
(6)根据(1)～(5)中任一项所述的复合物，其中，该接头具有通过点击反应而形成的结合基团。
(7)根据(1)～(6)中任一项所述的复合物，其中，该放射性金属核素为Ac-225、Y-90、Lu-177或Zr-89。
(8)复合物，其是螯合有放射性核素的螯合剂与脱糖基化的抗体的复合物，
该放射性核素为发射α射线的核素。
(9)根据(8)所述的复合物，其中，发射α射线的核素为Ac-225。
(10)根据(1)～(9)中任一项所述的复合物，其中，该脱糖基化的抗体为人IgG抗体。
(11)根据(1)～(10)中任一项所述的复合物，其中，脱糖基化基于N型糖链的断裂。
(12)根据(11)所述的复合物，其中，N型糖链的断裂基于用PNGaseF进行的处理。
(13)放射性药物，其含有(1)～(12)中任一项所述的复合物作为有效成分。
(14)根据(13)所述的放射性药物，其用于癌症的RI内服疗法。
(15)根据(13)所述的放射性药物，其用于癌症的诊断。
(16)根据(1)～(12)中任一项所述的复合物的制造方法，其包括：
将螯合有放射性核素的螯合剂与脱糖基化的抗体进行复合化，生成该螯合剂与该抗体的复合物的复合化工序。
(17)根据(16)所述的制造方法，其中，该复合化工序通过实行点击反应来实施。
(18)根据(17)所述的制造方法，其中，该复合化工序通过使该抗体与下述式所示的DOTAGA-DBCO的放射性金属络合物进行点击反应来实施。
[化13]
实施例
以下，通过实施例更详细地说明本发明。然而，本发明的范围不限定于该实施例。
[实施例1]使用89Zr标记DOTAGA-DBCO来制造脱糖基化抗体-RI偶联物
(1.抗体组合物的制造)(工序1)
(1-1.抗体修饰接头的制造)
利用国际公开2017/217347号单行本中记载的方法，得到下述(P3)所示的包含17个氨基酸残基的肽(SEQ ID NO:19)。该肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的Xaa2为赖氨酸残基的序列相同，赖氨酸残基的侧链末端氨基用R1所示的结构修饰。另外，两个半胱氨酸残基彼此进行二硫结合，肽的N末端经由具有二甘醇酸和8个PEG的接头(L1)结构而结合有乙基叠氮来作为原子团，所述原子团包含作为第二原子团的叠氮基。
[化14]
式(P3)中，Lys表示赖氨酸，Gly表示甘氨酸，Pro表示脯氨酸，Asp表示天冬氨酸，Cys表示半胱氨酸，Ala表示丙氨酸，Tyr表示酪氨酸，His表示组氨酸，Glu表示谷氨酸，Leu表示亮氨酸，Val表示缬氨酸，Thr表示苏氨酸，Trp表示色氨酸，Phe表示苯基丙氨酸。
(1-2.利用抗体修饰接头来修饰抗体)
按照国际公开2017/217347号单行本中记载的方法，使上述肽DSG(二琥珀酰亚胺基戊二酸酯)发生反应。将所得含有DSG修饰肽的溶液与通过J.Nucl.Med.2019,60,1174中记载的方法而得到的含有利用PNGaseF进行了脱糖基化的抗体(Trastuzumab)的溶液混合至0.02mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液(pH6.0)中，在室温下使其反应60分钟，得到包含肽修饰抗体的溶液。该肽修饰抗体利用上述肽位点特异性地修饰抗体的Fc区域。
(1-3.一价抗体的分离纯化)
接着，对IgG-BP柱通液，得到包含相对较多的未标记抗体和一价抗体的第一抗体组合物。以回收的级分中包含的一价抗体的浓度成为15mg/mL的方式，用含有0.1mol/L氯化钠的0.02mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)调整浓度。将所得包含第一抗体组合物的溶液供于后述标记工序。
(2.络合物形成工序)(工序2)
根据Chem.Eur.J.2012,18,7834-7841中记载的方法，制造下述式所示的DOTAGA-DBCO。使DOTAGA-DBCO分散于作为溶剂的0.156mol/L乙酸钠缓冲液(pH5.5)，制成包含螯合剂0.3mmol/L的分散液。使将该分散液0.03mL、含有0.15mol/L龙胆酸的0.156mol/L乙酸钠缓冲液(pH5.5)0.03mL和含有89Zr离子作为放射性金属源的溶液(通过89Y(p,n)89Zr法而生成的89Zr为0.1mol/L的盐酸水溶液，将放射能量浓度调整至910MBq/mL，液量为0.03mL)27.3MBq混合而得到的反应液在加热条件下发生反应，得到89Zr络合物溶液。螯合剂与放射性金属离子的摩尔比率为螯合剂:89Zr离子＝约1500:1，反应液的加热温度设为70℃，加热时间设为1小时。
[化15]
利用下述方法测定所得89Zr络合物的放射化学纯度。即，将一部分89Zr络合物溶液用薄层色谱(Agilent公司制、型号：SGI0001、展开溶剂为乙腈:0.1mol/L EDTA溶液(pH5.0)的混合液(体积比为1:1))展开，其后，利用放射性-γ-TLC分析仪(raytest公司制、MODELGITA Star)进行测定。将在原点附近检测到的峰的放射能量(计数)相对于检测到的总放射能量(计数)的百分率设为89Zr络合物的标记率(％)。其结果，89Zr络合物的标记率为96.0％。此处，标记率(％)是指89Zr络合物的放射能量相对于络合物形成工序中的投料放射能量。所得89Zr络合物溶液直接用于标记工序。
(3.标记工序)(工序3)
向历经上述工序2而得到的未纯化状态的89Zr络合物的溶液中添加上述工序1中得到的包含肽修饰抗体(一价抗体)的溶液，在37℃下使其进行2小时的点击反应，得到89Zr络合物标记抗体。反应时的DBCO基与叠氮基的摩尔比为约1:2.4。未纯化时的89Zr络合物标记抗体的反应率(％)为89.9％。此处，反应率(％)是指89Zr络合物标记抗体的放射化学纯度(RCP)(％)相对于络合物形成工序中的标记率(％)。
进而，针对在37℃下反应2小时而得到的89Zr络合物标记抗体的溶液，使用超滤过滤器(Merck公司制、型号：UFC505096)进行纯化。纯化后的89Zr络合物标记抗体的RCP为96.5％，放射化学的收率(RCY)为66.7％。
(4.制剂化工序)(工序4)
分别选取一部分上述工序3中制造的89Zr络合物标记抗体，置于5mL微量离心管(LoBind、Eppendorf公司制)中，用保存缓冲液(含有84mg/L PS20的19g/L海藻糖水合物、470mg/L L-组氨酸盐酸盐、300mg/L L-组氨酸水溶液)进行稀释。
[比较例1]使用89Zr标记DOTAGA-DBCO来制造其与抗体(未经脱糖基化)的复合物
(1.抗体制备工序)(工序1)
抗体使用未经脱糖基化的曲妥珠单抗。抗体修饰接头使用与实施例1中记载的接头相同的接头，一价抗体的分离纯化也与实施例1同样地实施。
(2.络合物形成工序)(工序2)
使DOTAGA-DBCO分散于作为溶剂的0.156mol/L乙酸钠缓冲液(pH5.5)，制成包含螯合剂0.3mmol/L的分散液。使将该分散液0.03mL、含有0.15mol/L龙胆酸的0.156mol/L乙酸钠缓冲液(pH5.5)0.03mL和含有89Zr离子作为放射性金属源的溶液(通过89Y(p,n)89Zr法而生成的89Zr为0.1mol/L的盐酸水溶液，将放射能量浓度调整至890MBq/mL，液量为0.03mL)26.7MBq混合而得到的反应液在加热条件下发生反应，得到89Zr络合物溶液。螯合剂与放射性金属离子的摩尔比率为螯合剂:89Zr离子＝约1500:1，反应液的加热温度设为70℃，加热时间设为1小时。
与实施例1同样地测定所得89Zr络合物的放射化学纯度。其结果，89Zr络合物的标记率为97.7％。将所得89Zr络合物溶液直接用于标记工序。
(3.标记工序)(工序3)
向历经上述工序2而得到的未纯化状态的89Zr络合物溶液中添加与实施例1同样操作而得到的包含肽修饰抗体(一价抗体)的溶液，在37℃下使其进行2小时的点击反应，得到89Zr络合物标记抗体。反应时的DBCO与叠氮的摩尔比为约1:2.4。未纯化时的89Zr络合物标记抗体的反应率(％)为88.9％。
进而，针对在37℃下反应2小时而得到的89Zr络合物标记抗体的溶液，使用超滤过滤器(Merck公司制、型号：UFC505096)进行纯化。纯化后的89Zr络合物标记抗体的RCP为97.1％、RCY为73％。89Zr络合物标记抗体的RCP和RCY的测定方法与实施例1同样进行。
(4.制剂化工序)(工序4)
分别选取一部分上述工序3中制造的89Zr络合物标记抗体，置于5mL微量离心管(LoBind、Eppendorf公司制)中，用保存缓冲液(含有84mg/L PS20的19g/L海藻糖水合物、470mg/L L-组氨酸盐酸盐、300mg/L L-组氨酸水溶液)进行稀释。
[评价1]聚集体的比例
利用尺寸排阻色谱(SEC)来确认89Zr络合物标记抗体中包含的聚集体的比例。作为液相色谱装置，使用Water公司制的2695型分离模块或e2695型分离模块，作为UV检测器，使用Waters公司制的2489型UV/Vis检测器，利用下述条件进行分析。将制造结束后的各成分的比例示于表1。
[表1]
〔HPLC条件〕
柱：TOSOH TSKgel guardcolumnSWXL(6mm×4cm),TOSOH TSKgel G3000SWXL(5μm、7.8×30cm)×2根(串联)
柱温度：25℃附近的恒定温度
流动相：含有0.2mol/L精氨酸盐酸盐的0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.8)
流量：每分钟1.0mL
面积测定范围：30分钟
检测波长：280nm
[评价2]对于抗原的结合性
对于抗原的结合活性利用体外自动射线照相术(ARG)进行确认。对雌性SCIDBeige小鼠(日本チャールス·リバー公司)的侧腹皮下分别给药5×106cells的由ATCC(American Type Culture Collection)购入的HER2阳性的人卵巢癌细胞株即SKOV3细胞和HER2阴性的人乳腺癌细胞株即MDA-MB-231细胞，制作荷瘤小鼠。其后，摘出SKOV3肿瘤和MDA-MB-231肿瘤，并包埋于ティシュー·テックO.C.T.复合物(サクラファインテックジャパン公司)，制作冷冻切片。将实施例1和比较例1中得到的放射性复合物分别以成为5kBq/mL的方式添加至含有1％牛血清白蛋白的PBS中，对SKOV3肿瘤切片和MDA-MB-231肿瘤切片进行浸渍。使切片接触成像板后，利用扫描仪类型的图像分析装置(GEヘルスケアジャパン公司制、Typhoon FLA 7000)进行读取，评价与切片结合的放射能量。将结果示于图1。图中的纵轴表示：在组织中设定任意的关注区域(ROI)，对该每单位面积的强度进行定量，并除以标准线源Std.的强度而得到的值(标准射线源：点取5μL浸渍有切片的包含放射性复合物的溶液)。ROI在组织中设定10个，取其标准偏差。
按照实施例1和比较例1的记载而制造的任意放射性复合物均确认到其对于HER2的结合活性。按照实施例1和比较例1的记载而制造的放射性复合物更强烈地结合于HER2为阳性的SKOV3肿瘤切片，不结合于HER2为阴性的MDA-MB-231肿瘤切片，显示出HER2选择性结合。
另一方面，糖链发生断裂的抗体和糖链未发生断裂的抗体对于HER2的结合能力没有差异。
[评价3]体内分布评价
使用小鼠，制作SKOV3细胞的皮下荷瘤模型，确认按照实施例1和比较例1的记载而制造的放射性复合物在生物体内的各组织中的分布。将SKOV3细胞悬浮于包含50％基质胶的PBS中，向5周龄的雌性NSG(正式系统名：NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)小鼠(日本チャールス·リバー公司)的左鼠颈部皮下移植5×106cells，制作荷瘤小鼠。饲育荷瘤小鼠直至肿瘤体积成为约50～200mm3为止，以0.5～0.6MBq/只(各n＝3)的用量向尾静脉内给药按照实施例1或比较例1的记载而制造的放射性复合物。在给药各放射性复合物24、48和120小时后，在异氟烷麻醉下从心脏进行采血，采取心脏、肺、肝脏、脾脏、胰脏、胃、小肠、大肠、肾脏、膀胱、大腿肌肉、大腿骨、皮肤、肿瘤，回收除此之外的组织作为剩余全身。在代谢笼中饲育给药各放射性复合物后的小鼠直至解剖时间点为止，采取粪便和尿。测定所采取的各组织、血液的重量，利用γ射线闪烁测定装置(JDC-1712、日立制作所)来测定各组织、血液、粪便和尿的计数率。根据所得组织重量和计数率来计算每单位重量的聚集率(％ID/g)。将结果示于图2。
与按照比较例1的记载而制造的89Zr标记糖链未处理抗体(未经脱糖基化的抗体)相比，按照实施例1而制造的89Zr标记脱糖基化抗体在任意时间点，在作为造血系统组织的肝脏和脾脏中的聚集量均低(图3)。另外，关于滞留在血液中的抗体量，在任意时间点，89Zr标记脱糖基化抗体均多于89Zr标记糖链未处理抗体，呈现89Zr标记脱糖基化抗体的肿瘤聚集性更高的结果。
[实施例2]使用225Ac标记DOTAGA-DBCO来制造脱糖基化抗体-RI偶联物
(1.脱糖基化抗体制备工序)(工序1)
使用实施例1中记载的脱糖基化抗体和抗体修饰接头，利用抗体修饰接头来进行抗体的修饰，进而，将实施例1中记载的通过一价抗体的分离纯化法而得到的包含第一抗体组合物的溶液供于后述标记工序。
(2.络合物形成工序)(工序2)
使DOTAGA-DBCO分散于作为溶剂的0.156mol/L乙酸钠缓冲液(pH5.5)，制成包含螯合剂0.3mmol/L的分散液。使将该分散液0.080mL、0.2mol/L盐酸水溶液0.034mL和含有225Ac离子作为放射性金属源的溶液(0.2mol/L盐酸水溶液、放射能量浓度为157MBq/mL、由ROSATOM公司制进行制备，液量为0.006mL)0.94MBq混合而得到的反应液在加热条件下发生反应，得到225Ac络合物溶液。此时的螯合剂与放射性金属离子的摩尔比率为螯合剂:225Ac离子＝约12304:1，反应液的加热条件设为70℃，加热时间设为30分钟。
与实施例1同样地测定所得225Ac络合物的放射化学纯度。其结果，225Ac络合物的标记率为81％。将所得225Ac络合物溶液中的0.04mL(300kBq、配体为8nmοl量)用于标记工序。
(3.标记工序)(工序3)
向历经上述工序2而得到的未纯化状态的225Ac络合物的溶液中添加工序1中得到的包含肽修饰抗体(一价抗体)的溶液0.117mL，在37℃下使其进行1.5小时的点击反应，得到225Ac络合物标记抗体。反应时的DBCO与叠氮的摩尔比为约1:1.5。未纯化时的225Ac络合物标记抗体的反应率为77.6％。
进而，针对所得225Ac络合物标记抗体的溶液，使用超滤过滤器(Merck公司制、型号：UFC505096)进行纯化。纯化后的225Ac络合物标记抗体的RCP为99.4％、RCY为62.0％。利用与实施例1相同的方法来进行225Ac络合物标记抗体的RCP和RCY的测定。
(4.制剂化工序)(工序4)
将通过上述工序3而制造的225Ac络合物标记脱糖基化抗体与实施例1同样地用保存缓冲液进行稀释。
[比较例2]使用225Ac标记DOTAGA-DBCO来制造其与抗体(未经脱糖基化)的复合物
(1.抗体制备工序)(工序1)
使用比较例1中记载的未经脱糖基化的抗体和抗体修饰接头，利用抗体修饰接头来进行抗体的修饰，进而，将实施例1中记载的通过一价抗体的分离纯化法而得到的包含第一抗体组合物的溶液供于后述标记工序。
(2.络合物形成工序)(工序2)
使DOTAGA-DBCO分散于作为溶剂的0.156mol/L乙酸钠缓冲液(pH5.5)，制成包含螯合剂0.3mmol/L的分散液。使将该分散液0.080mL、0.2mol/L盐酸水溶液0.034mL和含有225Ac离子作为放射性金属源的溶液(0.2mol-/L盐酸水溶液、放射能量浓度为157MBq/mL、由ROSATOM公司制进行制备、液量为0.006mL)0.94MBq混合而得到的反应液在加热条件下发生反应，得到225Ac络合物溶液。此时的螯合剂与放射性金属离子的摩尔比率为螯合剂:225Ac离子＝约12304:1，反应液的加热条件设为70℃，加热时间设为30分钟。
与实施例1同样地测定所得225Ac络合物的RCP。其结果，225Ac络合物的RCP为81％。将所得225Ac络合物溶液中的0.04mL(307kBq、配体为8nmοl量)用于标记工序。
(3.标记工序)(工序3)
向历经上述工序2而得到的未纯化状态的225Ac络合物的溶液中添加通过工序1而得到的包含肽修饰抗体(一价抗体)的溶液0.137mL，在37℃下使其进行1小时的点击反应，由此得到225Ac络合物标记抗体。反应时的DBCO与叠氮的摩尔比为约1:1.7。未纯化时的225Ac络合物标记抗体的反应率为79.8％。
进而，针对在37℃下使其反应2小时而得到的225Ac络合物标记抗体的溶液，使用超滤过滤器(Merck公司制、型号：UFC505096)进行纯化。纯化后的225Ac络合物标记抗体的RCP为99.7％、RCY为60.9％。与实施例1同样地进行225Ac络合物标记抗体的RCP和RCY的测定。
(4.制剂化工序)(工序4)
将上述工序3中制造的225Ac络合物标记抗体与比较例1同样地用保存缓冲液进行稀释。
[评价4]聚集体的评价
利用动态光散射法(DLS)来确认225Ac络合物标记抗体中是否包含聚集体。作为DLS测定装置，使用WYATT公司制的DynaPro NanoStar(制造编号：693-DPN)，利用下述条件进行分析。关于制造结束后的平均粒径，225Ac络合物标记脱糖基化抗体为10.6nm，225Ac络合物标记糖链未处理抗体为9.2nm。均在抗体的平均粒径即9～12nm的范围内，因此，未启示出聚集等的进行。
〔DLS测定条件〕
测定时间：5秒
测定间隔：1秒
测定次数：10次×3次
测定温度：25℃
激光波长：658nm
激光输出：10～100mW(可变)
[评价5]对于抗原的结合性
与评价2中记载的方法同样地制作SKOV3肿瘤和MDA-MB-231肿瘤的冷冻切片。向含有1％牛血清白蛋白的PBS中分别以成为1kBq/mL的方式添加实施例2和比较例2中得到的放射性复合物，对SKOV3肿瘤切片和MDA-MB-231肿瘤切片进行浸渍。将与评价2中记载的方法同样地结合于切片的放射能量的评价结果示于图4。
按照实施例2和比较例2的记载而制造的放射性复合物更强烈地结合于HER2为阳性的SKOV3肿瘤切片，不结合于HER2为阴性的MDA-MB-231肿瘤切片，显示出HER2选择性结合。另一方面，糖链发生断裂的抗体和糖链未发生断裂的抗体对于HER2的结合能力没有差异。
[评价6]使用225Ac络合物标记抗体进行的药效评价
使用小鼠来制作SKOV3的皮下荷瘤模型，确认按照实施例2和比较例2的记载而制造的放射性复合物的抗肿瘤效果。
将SKOV3细胞悬浮于包含50％基质胶的McCoy’s 5A培养基(gibco公司制)中，向5周龄的雌性NSG小鼠(ジャクソンラボラトリージャパン公司制)的右肩皮下给药5×106cells，制作荷瘤小鼠。使肿瘤体积生长至约为50～200mm3为止，由形状适合于肿瘤直径测定的个体随机实施分组。将此时的各小鼠的肿瘤体积和体重示于表2。肿瘤体积按照下式来计算。
肿瘤体积(mm3)＝(肿瘤长径×(肿瘤短径)2)×1/2
[表2]
225Ac络合物标记抗体均以10kBq或5kBq/只(以曲妥珠单抗计分别为约100μg/只和约50μg/只)的用量进行尾静脉内给药。另外，作为对照组，设定给药了保存缓冲液的溶剂对照组。各组设为6只，至给药后30天为止，经时性地进行一般状态的观察，并测量体重和肿瘤体积。体重低于给药日的体重的80％且运动量、摄食行动观察到异常的个体应用人道终点而进行安乐死。将经时性肿瘤体积的变化示于图5，将经时性体重变化示于图6，将观察期间内的存活个体数示于图7。图5的图表的纵轴表示肿瘤体积，横轴表示自给药各药剂起经过的天数。图表用各组的肿瘤体积的平均值±标准偏差来表示。图6的图表的纵轴表示小鼠的体重，横轴表示自给药各药剂起经过的天数。图7的图表的纵轴表示存活个体数，横轴表示自给药各药剂起经过的天数。图中的“*”表示通过应用人道终点而将个体安乐死的时间点。
给药有225Ac络合物标记抗体的组在给药后第30天与溶剂对照组相比在抗肿瘤效果上观察到差异。另外，在10kBq给药组、5kBq给药组中，给药有实施例2中制造的抗体的组的平均肿瘤体积均小于比较例2中制造的抗体，因此，启示出脱糖基化的抗体显示出更强的抗肿瘤效果。
另外，关于因体重、运动量减少而应用了人道终点的个体，给药有实施例2中制造的抗体的组中合计为1只，与此相对，给药有比较例2中制造的抗体的组中合计为5只。根据该结果而启示出：通过对抗体进行脱糖基化，从而能够降低体重、运动量减少之类的副作用。
[实施例3]使用89Zr标记DOTAGA-DBCO来制造脱糖基化抗体-RI偶联物-2
(1.抗体制备工序)(工序1)
抗体使用脱糖基化的西妥昔单抗。抗体修饰接头使用与实施例1中记载的接头相同的接头，一价抗体的分离纯化也与实施例1同样地实施。
(2.络合物形成工序)(工序2)
将形成络合物时的放射能量设为87.7MBq，除此之外，与实施例1同样地实施。
与实施例1同样地测定所得89Zr络合物的RCP。其结果，89Zr络合物的RCP为97.8％。将所得89Zr络合物溶液中的0.03mL(25.9MBq、配体为3nmοl量)用于标记工序。
(3.标记工序)(工序3)
作为抗体，使用脱糖基化的西妥昔单抗，将反应时的DBCO与叠氮的摩尔比设为约1:1.2，除此之外，与实施例1同样地实施。未纯化时的89Zr络合物标记抗体的反应率为56.1％。
进而，针对所得89Zr络合物标记抗体的溶液，使用超滤过滤器(Merck公司制、型号：UFC505096)进行纯化。纯化后的89Zr络合物标记抗体的RCP为93.9％、RCY为46.6％。与实施例1同样地进行89Zr络合物标记抗体的RCP和RCY的测定。
(4.制剂化工序)(工序4)
选取一部分上述工序3的89Zr络合物标记脱糖基化抗体，置于5mL微量离心管(LoBind、Eppendorf公司制)，用保存缓冲液(含有100mg/LPS20的5844mg/L氯化钠、7507mg/L甘氨酸、2101mg/L柠檬酸水合物水溶液))进行稀释。
[比较例3]使用89Zr标记DOTAGA-DBCO来制造其与抗体(未经脱糖基化)的复合物-2
(1.抗体制备工序)(工序1)
抗体使用未经脱糖基化的西妥昔单抗。抗体修饰接头使用与实施例1中记载的接头相同的接头，一价抗体的分离纯化也与实施例1同样地实施。
(2.络合物形成工序)(工序2)
与实施例3同样地实施。
与实施例1同样地测定所得89Zr络合物的RCP。其结果，89Zr络合物的RCP为97.8％。将所得89Zr络合物溶液中的0.03mL(28.7MBq、配体为3nmοl量)用于标记工序。
(3.标记工序)(工序3)
作为抗体，使用未经脱糖基化的西妥昔单抗，将反应时的DBCO与叠氮的摩尔比设为约1:1.2，除此之外，与实施例1同样地实施。未纯化时的89Zr络合物标记抗体的反应率为51.4％。
进而，针对所得89Zr络合物标记抗体的溶液，使用超滤过滤器(Merck公司制、型号：UFC505096)进行纯化。纯化后的89Zr络合物标记抗体的RCP为93.8％、RCY为50.7％。与实施例1同样地进行89Zr络合物标记抗体的RCP和RCY的测定。
(4.制剂化工序)(工序4)
选取一部分上述工序3的89Zr络合物标记抗体(未经脱糖基化)，置于5mL微量离心管(LoBind、Eppendorf公司制)中，用保存缓冲液(含有100mg/L PS20的5844mg/L氯化钠、7507mg/L甘氨酸、2101mg/L柠檬酸水合物水溶液)进行稀释。
[评价7]聚集体的比例
与评价1同样地通过SEC来分析实施例3、比较例3中制造的89Zr络合物标记抗体中包含的聚集体的比例。与评价1同样地设定HPLC条件。将制造结束后的各成分的比例示于表3。
[表3]
[评价8]对于抗原的结合性
与评价2中记载的方法同样地制作肿瘤的冷冻切片。其中，阳性切片使用由NSG小鼠制作的A431切片，作为阴性切片的替代，使用由SCID Beige小鼠制作的低表达切片即SNU-16切片。将结果示于图8。
按照实施例3和比较例3的记载而制造的任意放射性复合物均确认到对于EGFR的结合活性。89Zr络合物标记抗体更强烈地结合于EGFR为阳性的A431肿瘤切片，对于EGFR为低表达的SNU-16肿瘤切片显示出更低的结合性，显示出EGFR选择性结合。另一方面，脱糖基化抗体和糖链未处理抗体对于EGFR的结合能力均没有差异。
[评价9]体内分布评价
与评价3同样地使用小鼠来制作A431肿瘤的皮下移植模型，确认按照实施例3和比较例3的记载而制造的放射性复合物在生物体内的各组织中的分布。将A431细胞悬浮于DMEM培养基(gibco公司制)，向5周龄的雌性NSG小鼠(ジャクソンラボラトリージャパン公司制)的右肩皮下移植5×106cells，制作荷瘤小鼠。饲育荷瘤小鼠直至肿瘤体积约达到50～200mm3为止，分别以0.5～0.6MBq/只(各组n＝4)的用量向尾静脉内给药89Zr络合物标记抗体。在给药各放射性复合物24、48和120小时后，在异氟烷麻醉下从心脏进行采血，采取心脏、肺、脾脏、胰脏、胃、小肠、大肠、大腿肌肉、大腿骨、皮肤、肿瘤、肾脏、肝脏，回收除此之外的组织作为剩余全身。在代谢笼中饲育给药各放射性复合物后的小鼠直至解剖时间点为止，采取粪便和尿。测定所采取的各组织、血液的重量，利用γ射线闪烁测定装置(JDC-1712、日立制作所)来测定各组织、血液、粪便和尿的计数率。根据所得组织重量和计数率来计算每单位重量的聚集率(％ID/g)。将结果示于图9。图表的纵轴表示各组织的每单位重量的聚集率。
与按照比较例3的记载而制造的89Zr标记糖链未处理抗体相比，按照实施例3而制造的89Zr标记脱糖基化抗体在作为造血系统组织的肝脏和脾脏中的聚集量低(图10)。另外，关于滞留在血液中的抗体量，在任意时间点，89Zr标记脱糖基化抗体均多于89Zr标记糖链未处理抗体，呈现89Zr标记脱糖基化抗体的肿瘤聚集性更高的结果。
本申请基于在日本申请的特愿2021-141625(申请日：2021年8月31日)，并将它们的内容全部援引至本说明书中。

Claims (16)

1.复合物，其是螯合有放射性核素的螯合剂与脱糖基化的抗体的复合物，
该螯合剂经由接头位点特异性地修饰所述抗体的Fc区域。
2.根据权利要求1所述的复合物，其中，该接头包含抗体修饰肽，所述抗体修饰肽用下述式(i)表示，且由13个以上且17个以下的氨基酸残基组成，
(Xa)-Xaa1-(Xb)-Xaa2-(Xc)-Xaa3-(Xd)…(i)
式(i)中，Xa、Xb、Xc和Xd分别表示连续的a个X、连续的b个X、连续的c个X和连续的d个X；
X为在侧链上不具有硫醇基和卤代乙酰基的氨基酸残基；
a、b、c和d各自独立地为1以上且5以下的整数，并且满足a+b+c+d≤14；
Xaa1和Xaa3各自独立地表示来自在侧链上具有硫醇基的氨基酸的氨基酸残基，且经由二硫键结合或者硫醚基经由接头结合，或者，
Xaa1和Xaa3中的一者表示来自在侧链上具有硫醇基的氨基酸的氨基酸残基，另一者表示来自在侧链上具有卤代乙酰基的氨基酸的氨基酸残基，且经由硫醚键结合；
Xaa2为赖氨酸残基、精氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸。
3.根据权利要求2所述的复合物，其中，在所述式(i)中，该抗体修饰肽的Xaa2为赖氨酸残基。
4.根据权利要求2所述的复合物，其中，该抗体修饰肽包含由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的抗体修饰肽，所述SEQ ID NO:2中，Xaa2为赖氨酸残基。
5.根据权利要求1或2所述的复合物，其中，该螯合剂具有来自下述式(A)所示的化合物或其盐的结构，
[化1]
(A@
式(A)中，R11、R13和R14各自独立地为包含-(CH2)pCOOH、-(CH2)pC5H5N、-(CH2)pPO3H2、-(CH2)pCONH2或-(CHCOOH)(CH2)pCOOH的基团，R12或R15中的一者为氢原子、羧基、或者碳原子数2或3的羧基烷基，另一者为用于与所述抗体复合化的取代基，p为0以上且3以下的整数，R12为用于与所述抗体复合化的取代基时，R15为氢原子，R12不是用于与所述抗体复合化的取代基时，R15为用于与所述抗体复合化的取代基。
6.根据权利要求1或2所述的复合物，其中，该接头具有通过点击反应而形成的结合基团。
7.根据权利要求1或2所述的复合物，其中，该放射性核素为Ac-225、Y-90、Lu-177或Zr-89。
8.复合物，其是螯合有放射性核素的螯合剂与脱糖基化的抗体的复合物，
该放射性核素为锕-225(Ac-225)。
9.根据权利要求1或8所述的复合物，其中，该脱糖基化的抗体为人IgG抗体。
10.根据权利要求1或8所述的复合物，其中，脱糖基化基于N型糖链的断裂。
11.放射性药物，其含有权利要求1或8所述的复合物作为有效成分。
12.根据权利要求11所述的放射性药物，其用于癌症的RI内服疗法。
13.根据权利要求11所述的放射性药物，其用于癌症的诊断。
14.根据权利要求1或8所述的复合物的制造方法，其包括：
将螯合有放射性核素的螯合剂与脱糖基化的抗体进行复合化，生成该螯合剂与该抗体的复合物的复合化工序。
15.根据权利要求14所述的制造方法，其中，该复合化工序通过实行点击反应来实施。
16.根据权利要求15所述的制造方法，其中，该复合化工序通过使该抗体与下述式所示的DOTAGA-DBCO的放射性金属络合物进行点击反应来实施，
[化2]
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