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CN117797278A - IL-17A mRNA、TLSV纳米粒/IL-17A mRNA复合物在制备预防或治疗肿瘤的药物中的用途 - Google Patents

IL-17A mRNA、TLSV纳米粒/IL-17A mRNA复合物在制备预防或治疗肿瘤的药物中的用途 Download PDF

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CN117797278A
CN117797278A CN202311597018.XA CN202311597018A CN117797278A CN 117797278 A CN117797278 A CN 117797278A CN 202311597018 A CN202311597018 A CN 202311597018A CN 117797278 A CN117797278 A CN 117797278A
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tumor
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West China Hospital of Sichuan University
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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种IL‑17A mRNA、TLSV纳米粒/IL‑17AmRNA复合物在制备预防或治疗肿瘤的药物中的用途。针对现有缺乏IL‑17A mRNA是否具有抗肿瘤效果、如何进行递送、如何抗肿瘤等研究的问题，本发明提供了一种IL‑17A mRNA及TLSV纳米粒/IL‑17A mRNA复合物在制备抗肿瘤药物中的用途。本发明首次发现IL‑17AmRNA在抗肿瘤中的效果，并通过DOTAP阳离子磷脂与两亲性双嵌段共聚物mPEG‑PCL包裹肿瘤细胞裂解物制得TLSV纳米粒，用其递送IL‑17A mRNA，获得具有抗肿瘤效果的TLSV纳米粒/IL‑17A mRNA复合物。本发明的IL‑17A mRNA和TLSV纳米粒/IL‑17A mRNA复合物均可有效的在体内抑制结直肠癌肿瘤组织的生长，为疾病治疗提供了一种新的策略。

Description

IL-17A mRNA、TLSV纳米粒/IL-17A mRNA复合物在制备预防或 治疗肿瘤的药物中的用途
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种IL-17A mRNA、TLSV纳米粒/IL-17A mRNA复合物在制备预防或治疗肿瘤的药物中的用途。
背景技术
恶性肿瘤是导致死亡的主要重大疾病之一，其中结直肠癌为最常见的恶性肿瘤之一。目前治疗癌症的手段主要有手术治疗、放疗、化疗及免疫治疗等，为进一步提高治疗的安全性及治疗效果，基因治疗被认为是一种有潜力的创新治疗手段。其中，基于mRNA的基因治疗是一种新兴的治疗策略。mRNA分子可在较短时间内在细胞中表达蛋白质，发挥补充、替代和编辑等作用进而抑制肿瘤生长。相较其他形式的核酸分子，mRNA因其生产效率较高，递送基因较灵活，能够避免基因组插入等优势，是肿瘤基因治疗的理想形式。肿瘤免疫基因疗法通过调控机体免疫应答而发挥抗肿瘤作用，mRNA由于其上述优点，在肿瘤免疫基因治疗策略中具有一定开发潜力。然而，如何提高mRNA分子的递送效率以及寻找合适的抗肿瘤免疫刺激策略是基于mRNA的肿瘤免疫基因治疗当前的重要研究方向。
白细胞介素17A(IL-17A)是IL-17细胞因子家族中的一员，它作为一种细胞外分泌因子可激活免疫细胞，上调免疫趋化因子CXCL9、肿瘤杀伤因子TNF-α的表达，招募DC细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)的抗肿瘤免疫作用，因此编码IL-17A的mRNA是一种潜在的免疫基因治疗靶点。
但目前的研究仅表明IL-17A蛋白质具有抗肿瘤作用，没有关于IL-17A mRNA递送到细胞进行肿瘤治疗的相关研究，因此，关于IL-17A的mRNA是否能应用于抗肿瘤领域，还需要进一步的研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题为：现有缺乏IL-17A mRNA是否具有抗肿瘤效果、如何进行递送、如何抗肿瘤等研究的问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供了一种IL-17A mRNA在制备预防或治疗肿瘤的药物中的用途。
其中，上述用途中，所述的IL-17A mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
SEQ ID NO:1IL-17AmRNA的核苷酸序列
ATGAGTCCAGGGAGAGCTTCATCTGTGTCTCTGATGCTGTTGCTGCTGCTGAGCCTGGCGGCTACAGTGAAGGCAGCAGCGATCATCCCTCAAAGCTCAGCGTGTCCAAACACTG AGGCCAAGGACTTCCTCCAGAATGTGAAGGTCAACCTCAAAGTCTTTAACTCCCTTGGCGCAAAAGTGAGCTCCAGAAGGCCCTCAGACTACCTCAACCGTTCCACGTCACCCTGGACTCTCCACCGCAATGAAGACCCTGATAGATATCCCTCTGTGATCTGGGAAGCTCAGTGCC
GCCACCAG
CGCTGTGTCAATGCGGAGGGAAAGCTGGACCACCACATGAATTCTGTTCTC
ATCCAGCAAGAGATCCTGGTCCTGAAGAGGGAGCCTGAGAGCTGCCCCTTCACTTTCAG
GGTCGAGAAGATGCTGGTGGGTGTGGGCTGCACCTGCGTGGCCTCGATTGTCCGCCAGGCAGCC。
其中，上述用途中，所述IL-17A mRNA的使用方法为与TLSV纳米粒结合，形成TLSV纳米粒/IL-17A mRNA复合物。
进一步的，所述的TLSV纳米粒由DOTAP阳离子磷脂与两亲性双嵌段共聚物mPEG-PCL包裹肿瘤细胞裂解物制备得到。所述的TLSV纳米粒的平均粒径为372.93±24.51nm，平均电位为+21.40±2.77mV。
更进一步的，所述的TLSV纳米粒的具体组成为：DOTAP重量份数为1～5份，两亲性mPEG-PCL双嵌段共聚物的重量份数为45～50份，肿瘤细胞裂解物的重量份数为12～15份。
优选的，所述的肿瘤细胞裂解物为CT26细胞或B16细胞的裂解物。其中，所述的CT26细胞裂解物为全细胞裂解物，主要成分包括：蛋白质、核酸、脂质糖类等有机成分及其他无机成分，蛋白质浓度≤1.2mg/mL。CT26细胞裂解物中蛋白质浓度不能过高，否则得到的TLSV纳米粒无法通过静电结合mRNA分子。
其中，上述用途中，所述的肿瘤为结直肠癌。
本发明还提供了一种TLSV纳米粒/IL-17AmRNA复合物，所述复合物是由DOTAP阳离子磷脂与两亲性双嵌段共聚物mPEG-PCL包裹肿瘤细胞裂解物制备的TLSV纳米粒，与IL-17AmRNA分子静电吸附获得。
优选的，所述的TLSV纳米粒的重量份数为30～40份，IL-17AmRNA为1～5份。
本发明还提供了一种上述TLSV纳米粒/IL-17AmRNA复合物制备方法，包括以下步骤：
a、将CT26细胞重悬，反复冻融并粉碎，离心收集上清液，获得细胞裂解物溶液；
b、称取原料，mPEG-PCL共聚物45～50份、DOTAP 1～5份；
c、将mPEG-PCL共聚物、DOTAP共同溶于有机相溶剂中，然后采用旋转蒸发仪，在55～60℃水浴条件下运行40～45min从而将溶剂蒸发，随后加12～15份细胞裂解物溶液水化直到完全溶解，得到TLSV纳米粒溶液；
d、30-40份TLSV纳米粒溶液和1～5份IL-17A mRNA在室温下孵育15～30分钟，得到TLSV纳米粒/IL-17AmRNA复合物。
其中，上述TLSV纳米粒/IL-17AmRNA复合物的制备方法中，步骤c所述的溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、四氯甲烷、乙醇、甲醇、乙酸乙酯或环己烷中的至少一种；所述的有机相溶剂为乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、四氯甲烷、甲醇中的至少一种。
本发明还提供了一种上述TLSV纳米粒/IL-17AmRNA复合物在制备预防或治疗肿瘤的药物中的用途。
进一步的，所述的肿瘤为结直肠癌。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明首次发现IL-17AmRNA可以用于制备预防或治疗肿瘤的药物，并首次对IL-17A mRNA的应用开发出了新的方式，即通过与TLSV纳米粒结合，形成TLSV纳米粒/IL-17AmRNA复合物的方式进行递送。本发明首次针对IL-17AmRNA开发出了递送效率高的TLSV纳米粒，两者形成的复合物可以有效地将目的基因导入细胞中，在基于IL-17AmRNA的基因功能研究、基因治疗研究及临床应用中有很好的应用前景。本发明的TLSV纳米粒/IL-17A mRNA复合物可介导淋巴细胞在体外有效抑制CT26细胞的生长；在体内TLSV纳米粒/IL-17A mRNA复合物亦可以有效抑制结肠癌肿瘤组织的生长，为结直肠癌的预防和治疗提供了一种新的选择。
附图说明
图1为本发明IL-17AmRNA在核酸凝胶中显示的条带大小。
图2为本发明TLSV与IL-17AmRNA的凝胶阻滞试验。
图3为本发明试验例1中介导的淋巴细胞上清杀伤效果图；a表示CT26细胞活力；b表示克隆形成实验中CT26被结晶紫染色形成的细胞集落；c表示对克隆数进行计数并做统计学分析。
图4为本发明试验例1中结直肠癌腹腔原位移植模型治疗效果图；a表示平均肿瘤重量，b表示平均肿瘤结节数。
图5为本发明试验例1中结直肠癌肺转移模型治疗效果图；a表示平均肿瘤重量，b表示平均肿瘤结节数。
图6为本发明试验例1中预防结直肠癌肺转移模型小鼠生存曲线。
图7为本发明试验例1中IL-17AmRNA的体外抗肿瘤机制效果图；a表示试验例2中各组脾淋巴细胞数量统计分析；b表示试验例2中各组脾淋巴细胞中DC细胞阳性比率；c表示试验例2中各组脾淋巴细胞中CD4+T细胞细胞阳性比率；d表示试验例2中各组脾淋巴细胞中CD8+T细胞细胞阳性比率；e表示试验例2中各组脾淋巴细胞中NK细胞细胞阳性比率；
图8为本发明试验例1中IL-17AmRNA的体内抗肿瘤机制效果图；a表示IL-17AmRNA在CT26结直肠癌腹腔原位移植肿瘤的治疗机制；b表示IL-17AmRNA在CT26结直肠癌肺转移瘤的治疗机制。
具体实施方式
本发明提供了一种IL-17A mRNA在制备预防或治疗肿瘤的药物中的用途。
常规情况下，IL-17A蛋白通过在肿瘤组织表达分泌，上调免疫趋化因子CXCL9、肿瘤杀伤因子TNF-α的表达，招募DC细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、抑制肿瘤微血管的形成协同达到抗肿瘤免疫作用。
目前的研究只是基于IL-17A 蛋白层面抗肿瘤，并没有IL-17AmRNA层面抗肿瘤的研究，主要是受到下述因素的影响：第一是载体因素，难以寻找到能够结合并高效递送mRNA到细胞发挥作用的载体。第二是由于mRNA分子的线性结构和低稳定性，mRNA比其他核酸更难递送。
本发明克服了上述问题，针对IL-17AmRNA，特别的筛选到了能够用于高效递送IL-17A mRNA的载体TLSV纳米粒，能够有效结合并且高效递送IL-17AmRNA到细胞中，得到的复合物在预防或治疗肿瘤中展示出了优异的效果。
本发明首次将IL-17AmRNA应用于肿瘤治疗中，由于mRNA分子量小，可以更好的被压缩，受空间结构影响较小；序列设计简单；绕过化学合成，利用自身细胞生产，简单高效。
本发明首次针对IL-17AmRNA，设计了一种能够高效递送IL-17A mRNA的TLSV纳米颗粒，通过将IL-17AmRNA与纳米颗粒形成复合物的方式，能够成功的将IL-17AmRNA进行递送并应用。
本发明开发的TLSV纳米粒由DOTAP阳离子磷脂与两亲性双嵌段共聚物mPEG-PCL包裹肿瘤细胞裂解物制备得到。所述的TLSV纳米粒的平均粒径为372.93±24.51nm，平均电位为+21.40±2.77mV。
本发明通过大量筛选，发现当DOTAP重量份数为1～5份，两亲性mPEG-PCL双嵌段共聚物的重量份数为45～50份，肿瘤细胞裂解物为12～15份时，得到的TLSV纳米粒递送IL-17AmRNA的效果更好。
特别的，本发明还提供了一种TLSV纳米粒/IL-17AmRNA复合物，所述复合物是由DOTAP阳离子磷脂与两亲性双嵌段共聚物mPEG-PCL包裹肿瘤细胞裂解物制备的TLSV纳米粒，与mRNA分子静电吸附获得。
优选的，所述的TLSV纳米粒的重量份数为30～40份，IL-17AmRNA为1～5份。
本发明所述的TLSV纳米粒/IL-17AmRNA复合物，是一种相对安全且高效的mRNA分子非病毒基因递送复合物，制备所得TLSV/IL-17A纳米基因复合物为结直肠癌治疗提供了一种新的策略。
本发明制备TLSV纳米粒的方法也是经过反复筛选而得到的特别的薄膜水化法，包括以下步骤：
a、将CT26细胞用DPBS重悬，加入次氯酸在孵箱中氧化1小时，每半小时搅拌一次。收集细胞，用DPBS洗涤细胞，用MilliQ重悬细胞，使细。在细胞在液氮与37℃水浴锅中反复冻融12次。细胞粉碎仪超声粉碎30分钟。离心并收集上清液。检测细胞裂解物的蛋白质浓度，用MilliQ稀释至蛋白质浓度为1.2mg/mL，获得的细胞裂解物溶液。
b、称取原料，mPEG-PCL共聚物45～50份、DOTAP 1～5份；
c、将mPEG-PCL共聚物、DOTAP共同溶于溶剂中，然后采用旋转蒸发仪，在55～60℃水浴条件下运行40～45min从而将溶剂蒸发，随后加12～15份细胞裂解物溶液水化直到完全溶解，得到TLSV纳米粒溶液。
本发明制备TLSV纳米粒/IL-17AmRNA复合物时，将30～40份TLSV纳米粒溶液及1～5份IL-17AmRNA在室温下孵育15～30分钟，得到TLSV纳米粒/IL-17A mRNA复合物。
本发明还提供了一种TLSV纳米粒/IL-17AmRNA复合物在制备预防或治疗肿瘤的药物中的用途。
进一步的，所述的肿瘤为结直肠癌。
下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。
实施例中所用的试剂和原料均为普通市售产品。
实施例1TLSV/IL-17A纳米基因复合物的制备
1、薄膜旋蒸法制备TLSV纳米粒
胰蛋白酶消化并获得CT26细胞，以DPBS为溶剂，将细胞重悬至1×106个/mL的浓度，在37℃，CO2浓度为4％的孵箱中，以终浓度为0.642μL/mL的次氯酸中氧化1小时，每半小时搅拌一次。收集细胞，用DPBS洗涤1次细胞，用MilliQ重悬细胞，使细胞浓度为1×107个/mL，将细胞分装于保种管中。在细胞在液氮与37℃水浴锅中反复冻融12次。细胞粉碎仪超声粉碎30分钟(950瓦，工作总时长30分钟，超声9.9秒，间隙5秒)。1500rpm的转速离心1分钟，收集上清液。检测细胞裂解物的蛋白质浓度，用MilliQ稀释至蛋白质浓度为1.2mg/mL，获得的细胞裂解物溶液于-80℃冰箱保存。
将阳离子脂质(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane，DOTAP)与甲基聚乙二醇-聚己内酯(mPEG-PCL)高分子聚合物(分子量为4000Da，PEG-PCL＝2000Da-2000Da)按1：9的质量比进行混合，并将混合物用二氯甲烷进行溶解，并置于旋转蒸发仪上以60℃旋蒸45min后成膜。所成的膜取出后溶解于CT26细胞裂解物溶液中，在60℃水浴条件下震荡5min，得到特定浓度的TLSV阳离子聚合物纳米粒溶液，置于4℃冰箱保存备用。
2、IL-17AmRNA溶液的制备
以pVAX1-IL-17A质粒为模板，通过PCR扩增得到IL-17A基因(ORF框序列的DNA片段(如SEQ ID NO:1所示)。经琼脂糖凝胶电泳后切下与目的基因大小一致的片段区域凝胶(如图1所示)，采用胶回收试剂盒回收该片段，得到纯化后的IL-17APCR产物。随后采用T7体外转录试剂盒，以0.5μg的IL-17A基因PCR产物为模板，在37℃恒温条件下进行过夜转录，然后在37℃恒温条件下进行5’端加帽和3’端加尾修饰，修饰后的IL-17AmRNA的核苷酸序列的5’端带有7-甲基鸟苷(m7G)帽结构，3’端带有poly(A)尾。修饰后的mRNA用转录纯化试剂盒进行纯化，最后用去离子水进行洗脱，得到IL-17AmRNA溶液。
3、制备TLSV/IL-17A纳米基因复合物
按TLSV阳离子纳米粒：IL-17AmRNA以35：1(w/w)(凝胶阻滞如图2所示)的比例将纳米粒溶液(分散于去离子水中，浓度为5mg/mL)加入到IL-17A mRNA溶液(分散于去离子水中，浓度为1mg/mL)中，之后立刻用移液枪吹打混匀，再在室温环境静置15分钟，即得TLSV/IL-17A纳米基因复合物。
实施例2本发明TLSV/IL-17A 纳米基因复合物体外介导淋巴细胞抗结直肠癌试验
为了研究TLSV/IL-17A纳米基因复合物在体外的抗肿瘤效应，将TLSV/IL-17A纳米基因复合物转染的CT26细胞：
A)空白对照组：0.9％的氯化钠溶液；
B)DMP对照组：DMP阳离子纳米粒置于MilliQ中；
C)TLSV治疗组：TLSV阳离子纳米粒置于MilliQ中；
D)IL-17A治疗组:TLSV/IL-17A纳米基因复合物置于MilliQ中。
TLSV/IL-17A纳米基因复合物按实施例3的方法制备，其配比如下：IL-17A mRNA：TLSV阳离子纳米粒＝1：35(W/W)，其中含IL-17A mRNA2μg，将TLSV/IL-17A纳米基因复合物稀释在MilliQ中。
DMP阳离子纳米粒由DOTAP阳离子磷脂与两亲性双嵌段共聚物mPEG-PCL混合制备得到，没有加入细胞裂解复合物。
将健康BalB/c小鼠(6-8周龄，雌性)的脾脏取出，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，将淋巴细胞接种于六孔板中(6×105个/孔)，随后分别加入各转染组CT26细胞上清500μL(每组3个平行)，72小时后，收集脾脏淋巴细胞上清并与CT26细胞共培养：通过MTT法(图3a)及克隆形成试验(图3b、c)研究被处理后CT26细胞的活性及生长情况。
从图3a可以看出，IL-17A治疗组CT26细胞的活力显著降低。与未处理组比较，IL-17A治疗组的细胞活力下降42.78％，显著高于DMP组(17.25％)和TLSV组(35.36％)。P<0.05被认为有统计学意义。
从图3b、c可以看出，IL-17A治疗组的C26的克隆数量明显减少。进而我们对各个组克隆数量进行计数统计，与空白对照组(284±25个)相比，IL-17A治疗组检测到的克隆数量(34±4个)明显少于DMP组(206±32个)及TLSV组(105±13个)，P<0.01被认为有统计学意义。
以上体外实验结果表明，TLSV/IL-17A纳米基因复合物具有显著的抗结直肠癌的作用。
实施例3本发明TLSV/IL-17A纳米基因复合物抗腹腔原位结直肠癌试验
为了研究TLSV/IL-17A纳米基因复合物在体内的抗肿瘤效应，在BalB/c小鼠(6-8周龄，雌性)皮下建立结直肠癌细胞腹腔原位移植瘤模型。将体外培养的CT26结直肠癌细胞用胰蛋白酶消化，并定容在无血清、无抗生素的DMEM培养基中，在每只小鼠的腹腔接种2×105个细胞，细胞接种2天后，开始按以下进行随机分组治疗(每组5只)：
A)空白对照组：0.9％的氯化钠溶液；
B)DMP对照组：DMP阳离子纳米粒置于MilliQ中；
C)TLSV治疗组：TLSV阳离子纳米粒置于MilliQ中；
D)IL-17A治疗组:TLSV/IL-17A纳米基因复合物置于MilliQ中。
采取腹腔注射方式进行治疗，TLSV/IL-17A纳米基因复合物按实施例1的方法制备，其配比如下：IL-17AmRNA：TLSV阳离子纳米粒＝1：35(W/W)，将TLSV/IL-17A纳米基因复合物稀释在MilliQ中。
DMP阳离子纳米粒由DOTAP阳离子磷脂与两亲性双嵌段共聚物mPEG-PCL混合制备得到，没有加入细胞裂解复合物。
每次每只小鼠的注射体积为70μL，其中含IL-17AmRNA10μg以及阳离子纳米粒TLSV350μg。每天给药1次，共治疗16次。第18天将动物处死并解剖，分离腹腔肿瘤组织进行肿瘤结节计数并称重。以上各组动物的肿瘤重量及结节数见图4，其中图4a表示肿瘤重量，图4b表示肿瘤结节数，P<0.05则认为有统计学意义。
从图4可以看出，TLSV/IL-17A纳米基因复合物治疗组肿瘤生长最慢，而对照组肿瘤生长较快，TLSV/IL-17A纳米基因复合物表现出较强的抑制肿瘤生长的作用，并且比DMP阳离子纳米粒效果更好。
以上实验结果表明，TLSV/IL-17A纳米基因复合物具有显著的抗结直肠癌的作用。
实施例4本发明TLSV/IL-17A 纳米基因复合物抗结直肠癌肺转移瘤试验
为了研究TLSV/IL-17A纳米基因复合物在结直肠癌肺转移的抗肿瘤效应，在BalB/c小鼠(6-8周龄，雌性)腹腔建立了结肠癌肺模型。将体外培养的C26结肠癌细胞用胰蛋白酶消化，并定容在无血清、无抗生素的DMEM培养基中，在每只小鼠的静脉接5×105个细胞，细胞接种3天后，开始按以下进行随机分组治疗(每组5只)：
A)空白对照组：0.9％的氯化钠溶液；
B)DMP对照组：DMP阳离子纳米粒置于MilliQ中；
C)TLSV治疗组：TLSV阳离子纳米粒置于MilliQ中；
D)IL-17A治疗组:TLSV/IL-17A纳米基因复合物置于MilliQ中。
采取静脉注射方式进行治疗，TLSV阳离子纳米粒/IL-17AmRNA基因复合物按实施例1的方法制备，其配比如下：mRNA：阳离子纳米粒＝1：35(W/W)，将阳离子纳米粒/mRNA复合物稀释在MilliQ中。每次每只小鼠的注射体积为100μL，其中含mRNA10μg以及阳离子纳米粒350μg。每天给药1次，共治疗12次。第15天将动物处死并解剖，分离肺组织并进行称重和肿瘤结节计数。肿瘤生长抑制用方差分析，P<0.05则认为有统计学意义。以上各组动物的肿瘤重量、肿瘤结节数见图5，其中图5a表示平均肿瘤重量，图5b表示平均肿瘤结节数。
从图5可以看出，TLSV/IL-17A纳米基因复合物治疗组肿瘤生长缓慢，而对照组肿瘤生长较快，TLSV阳离子纳米粒/IL-17AmRNA基因复合物表现出较强的抑制肿瘤生长的作用，与空白对照组相比抑瘤率达到54.71％。
以上实验结果表明，TLSV阳离子纳米粒/IL-17AmRNA基因复合物具有显著的抗结直肠癌的作用。
实施例5本发明TLSV/IL-17A纳米基因复合物预防结直肠癌肺转移试验
为了研究TLSV/IL-17A纳米基因复合物在体内的预防肿瘤转移效应，首先对BalB/c小鼠(6-8周龄，雌性)随机分组治疗(每组5只)：
A)空白对照组：0.9％的氯化钠溶液；
B)DMP对照组：DMP阳离子纳米粒置于MilliQ中；
C)TLSV治疗组：TLSV阳离子纳米粒置于MilliQ中；
D)IL-17A治疗组:TLSV/IL-17A纳米基因复合物置于MilliQ中。
每组采取静脉注射方式进行治疗，TLSV阳离子纳米粒/IL-17A mRNA基因复合物按实施例1的方法制备，其配比如下：IL-17AmRNA：阳离子纳米粒＝1：35(W/W)，将TLSV/IL-17A纳米基因复合物稀释在MilliQ中。每次每只小鼠的注射体积为100μL，其中含mRNA10μg以及阳离子纳米粒350μg。给药1次。
随后建立肺转移瘤模型。将体外培养的C26结肠癌细胞用胰蛋白酶消化，并定容在无血清、无抗生素的DMEM培养基中，在每只小鼠的静脉接种5×106个细胞。做小鼠的生存曲线(如图6所示)，计算每只小鼠的中位生存时间。其中，各组的平均中位生存期分别为：空白对照组，17天；DMP对照组，20.5天；TLSV对照组，22天；IL-17A治疗组，49天。
以上实验结果表明，TLSV/IL-17A纳米基因复合物具有显著的预防结直肠癌肺转移的效果。
实施例6本发明IL-17AmRNA的体外抗肿瘤机制研究及结果
按照实施例2的方法，将各组脾脏淋巴细胞收集做计数统计，如图7a所示，与未处理组(1.35×106个)相比，DMP处理组淋巴细胞为1.47×106个，TLSV处理组淋巴细胞为1.56×106个(P<0.05)，TLSV/IL-17A复合物处理组淋巴细胞数量达到1.60×106个(P<0.01)，TLSV/IL-17A复合物处理组淋巴细胞数量明显增加。
按照实施例2的方法，将各组淋巴细胞收集，通过对DC细胞，CD4+T细胞，CD8+T细胞及NK细胞表面标记物染色后做细胞流式分析(DC细胞表面标记物为CD11c分子，CD4+T细胞表面标记物为CD3及CD4分子，CD8+T细胞表面标记物为CD3及CD8a分子，NK细胞表面标记物为CD49b。如图7b所示，与DMP处理组(DC细胞阳性率为26.78％，P<0.05)及TLSV处理组(DC细胞阳性率为30.00％，P<0.05)相比，IL-17A治疗组(36.42％)的DC细胞增加明显。如图7c所示，IL-17A治疗组CD4+T细胞增加明显(43.53％)，而DMP处理组CD4+T细胞为22.23％(P<0.05),TLSV处理组CD4+T细胞为32.94％(P<0.05)。如图7d所示，TLSV/IL-17A复合物处理组CD8+T细胞增加明显(66.29％)，而DMP处理组CD8+T细胞为46.84％(P<0.001),TLSV处理组CD8+T细胞为56.17％(P<0.05)。如图7e所示，IL-17A治疗组NK细胞比率为11.04％，而DMP处理组NK细胞比率为1.65％(P<0.05),TLSV处理组NK细胞比率细胞为3.97％(P<0.05)。
上述结果表明，经过TLSV/IL-17A纳米基因复合物转染后，含有IL-17A的C26细胞上清能够诱导淋巴细胞增值，表现为IL-17A可促进DC细胞、T细胞、NK细胞等多种免疫细胞的增殖，所引发的免疫反应协同抑制CT26细胞的生长。
实施例7本发明IL-17AmRNA的体内抗肿瘤机制研究及结果
按照实施例3的方法，将各组肿瘤组织石蜡切片进行免疫组化分析来研究IL-17A在肿瘤组织的治疗机制。分别将免疫组化抗体用PBS稀释：IL-17A(1：500)、CXCL9(1：500)、TNF-α(1：500)和CD31(1:50)分别将抗体覆盖组织，孵育，洗涤，封片，然后观察各组阳性的差异。
如图8a所示，与其他组相比，IL-17A治疗组肿瘤组织中IL-17A阳性信号显著增强，该结果表明TLSV成功将IL-17AmRNA递送至肿瘤细胞，并分泌IL-17A到肿瘤组织中。并且IL-17A治疗组肿瘤组织切片的CXCL9和TNF-α细胞因子阳性信号增强，IL-17A治疗组肿瘤组织中免疫趋化因子CXCL9及炎症因子TNF-α分泌增加。IL-17A治疗组肿瘤组织的CD31阳性信号强度显著降低，IL-17A治疗组的肿瘤组织中微血管形成明显受到抑制。
以上结果表明，在CT26结直肠癌腹腔原位移植模型中，IL-17A通过促进炎症因子的表达，促进肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤组织微血管的形成协同完成治疗肿瘤的作用。
按照实施例4的方法，将各组肿瘤组织石蜡切片进行免疫组化分析来研究IL-17A在肿瘤组织的治疗机制。分别将免疫组化抗体用PBS稀释：IL-17A(1：500)、CXCL9(1：500)、TNF-α(1：500)和CD31(1:50)分别将抗体覆盖组织，孵育，洗涤，封片，然后观察各组阳性的差异。
如图8b所示，与其他组相比，IL-17A治疗组肿瘤组织中IL-17A阳性信号显著增强，该结果表明TLSV成功将IL-17A mRNA递送至肿瘤细胞，并分泌IL-17A到肿瘤组织中。并且IL-17A治疗组肿瘤组织切片的CXCL9和TNF-α细胞因子阳性信号增强，IL-17A治疗组肿瘤组织中免疫趋化因子CXCL9及炎症因子TNF-α分泌增加。IL-17A治疗组肿瘤组织的CD31阳性信号强度显著降低，IL-17A治疗组的肿瘤组织中微血管形成明显受到抑制。
以上结果表明，在CT26结直肠癌肺转移模型中，IL-17A通过促进炎症因子的表达，促进肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤组织微血管的形成协同完成治疗肿瘤的作用。

Claims (10)

1.IL-17A mRNA在制备预防或治疗肿瘤的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的IL-17A mRNA的核苷酸序列如SEQID:1所示。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述IL-17A mRNA的使用方法为与TLSV纳米粒结合，形成TLSV纳米粒/IL-17A mRNA复合物。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的TLSV纳米粒由DOTAP阳离子磷脂与两亲性双嵌段共聚物mPEG-PCL包裹肿瘤细胞裂解物制备得到。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的TLSV纳米粒的具体组成为：DOTAP重量份数为1～5份，两亲性mPEG-PCL双嵌段共聚物的重量份数为45～50份，肿瘤细胞裂解物的重量份数为12～15份。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的肿瘤为结直肠癌。
7.一种TLSV纳米粒/IL-17A mRNA复合物，其特征在于：由DOTAP阳离子磷脂与两亲性双嵌段共聚物mPEG-PCL包裹肿瘤细胞裂解物制备的TLSV纳米粒，与IL-17A mRNA分子静电吸附获得。
8.一种TLSV纳米粒/IL-17A mRNA复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、将CT26细胞重悬，反复冻融并粉碎，离心收集上清液，获得细胞裂解物溶液；
b、称取原料，mPEG-PCL共聚物45～50份、DOTAP 1～5份；
c、将mPEG-PCL共聚物、DOTAP共同溶于有机相溶剂中，然后采用旋转蒸发仪，在55～60℃水浴条件下运行40～45min从而将溶剂蒸发，随后加12～15份细胞裂解物溶液水化直到完全溶解，得到TLSV纳米粒溶液；
d、30～40份TLSV纳米粒溶液和1～5份IL-17A mRNA在室温下孵育15～30min，得到TLSV纳米粒/IL-17A mRNA复合物。
9.根据权利要求8所述的TLSV纳米粒/IL-17A mRNA复合物的制备方法，其特征在于：步骤c所述的溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、四氯甲烷、乙醇、甲醇、乙酸乙酯或环己烷中的至少一种；所述的有机相溶剂为乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、四氯甲烷、甲醇中的至少一种。
10.权利要求7所述的TLSV纳米粒/IL-17A mRNA复合物在制备预防或治疗肿瘤的药物中的用途。
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