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CN112870373B - 用于mRNA递送的多肽聚合物复合纳米颗粒及其制备方法和用途 - Google Patents

用于mRNA递送的多肽聚合物复合纳米颗粒及其制备方法和用途 Download PDF

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CN112870373B CN202110362080.5A CN202110362080A CN112870373B CN 112870373 B CN112870373 B CN 112870373B CN 202110362080 A CN202110362080 A CN 202110362080A CN 112870373 B CN112870373 B CN 112870373B
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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于mRNA递送的多肽聚合物复合纳米颗粒及其制备方法和用途。针对目前缺乏细胞穿膜肽与聚合物纳米粒DMP进行复合制备纳米复合物以及对其用途的相关研究，本发明提供了一种由多肽和聚合物纳米粒组成的mRNA递送载体，本发明用于mRNA递送的多肽聚合物复合纳米颗粒，为细胞穿膜肽cRGD‑R9修饰DMP‑Mal纳米粒制备得到。该纳米颗粒能通过静电相互作用结合mRNA，可以有效地将目的基因导入细胞中，其本身具有细胞毒性低、转染率高等特征，在基于mRNA的基因功能研究、基因治疗研究及临床应用中有很好的应用前景。

Description

用于mRNA递送的多肽聚合物复合纳米颗粒及其制备方法和 用途
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于mRNA递送的多肽聚合物复合纳米颗粒及其制备方法和用途。
背景技术
近几年来，基因治疗领域的快速发展为癌症患者带来了许多创新的治疗方法，其中重点在于有效的将核酸药物传递到患者靶细胞中并治疗性的表达以干预或者治疗癌症。因此，需要能够有效且安全地递送核酸药物到患者体内的基因载体。基因载体通常分为：病毒和非病毒两大类，相比于大多数病毒载体而言，非病毒载体基因递送具有更强的装载能力、较低的免疫原性以及较小的副作用等优点。在基因治疗中，良好的基因载体应具备靶向性、有效性、安全性和易于制备等优点，从而使核酸药物发挥抗肿瘤作用。因此，我们致力于开发一种安全有效的非病毒基因载体递送mRNA，使其稳定的在体内表达，挥发抑制肿瘤细胞的增殖和以期达到基因治疗的目的。
甲氧基聚乙二醇-聚己内酯(monomethoxyl poly(ethylene glycol)-b-poly(ε-caprolactone)，简称mPEG-PCL，是一种两嵌段共聚物，一端是亲水链段甲氧基聚乙二醇，一端是亲油链段聚ε-己内酯，具有良好的生物相容性和安全性。mPEG和PCL均是美国食品药品监督管理局(FDA)认可用于体内的聚合物，在药物、基因导入系统中有很好的应用前景。DOTAP是一种两亲性的阳离子磷脂，作为阳电荷的供体，同样也被广泛应用于基因递送载体的制备。二者可共同通过自组装，在水溶液中形成阳离子纳米粒DMP，成为核酸递送的潜在载体。但是，由于mRNA分子的特殊性质，DMP纳米载体对mRNA分子的递送能力有限，需要进一步提升其递送能力从而服务于基于mRNA的基因治疗研究和药物开发。
细胞穿膜肽(CPPs)是一类能够穿过细胞膜或组织屏障的短肽。CPPs可通过内吞和直接穿透等机制，运载所携带的蛋白质、核酸及纳米颗粒等生物大分子进入细胞内发挥其效应功能，因此成为提高药物递送效率的重要技术工具，并在生物医学研究领域具有良好的应用前景。CPPs可通过与纳米载体之间的共价偶联，实现对纳米粒对细胞递送能力的提升。
目前，还没有将细胞穿膜肽与聚合物纳米粒DMP进行复合制备纳米复合物的报道，更没有对得到的纳米复合物是否具有递送mRNA的相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题为：开发一种由多肽和聚合物纳米粒组成的mRNA递送载体，以实现mRNA分子在体内的高效传输。
本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种用于mRNA递送的多肽聚合物复合纳米颗粒。所述的用于mRNA递送的多肽聚合物复合纳米颗粒，为细胞穿膜肽cRGD-R9修饰DMP-Mal纳米粒制备得到。
其中，上述用于mRNA递送的多肽聚合物复合纳米颗粒中，所述多肽聚合物复合纳米颗粒的平均粒径为250nm，平均电位为+20mv。
其中，上述用于mRNA递送的多肽聚合物复合纳米颗粒中，所述的细胞穿膜肽cRGD-R9与DMP-Mal纳米粒的质量比为：1～5：20～60。
其中，上述用于mRNA递送的多肽聚合物复合纳米颗粒中，所述的DMP-Mal纳米粒由阳离子磷脂DOTAP、mPEG-PCL聚合物和Mal-PEG-PCl聚合物共同制备得到，所述的DOTAP、mPEG-PCL聚合物与Mal-PEG-PCL聚合物的质量比为：5：45：1。
本发明还提供了一种上述用于mRNA递送的多肽聚合物复合纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
称取mPEG-PCL聚合物45份，DOTAP 5份，Mal-PEG-PCL聚合物1份，分别溶于溶剂中，然后利用旋转蒸发仪将溶剂蒸发挥干成膜，旋转蒸发仪上以60℃旋蒸30min，加适量水化溶液水化直到膜完全溶解，得到DMP-Mal纳米粒溶液，以适量的DMP-Mal纳米粒与cRGD-R9多肽混合孵育，反应溶液透析后，得到用于mRNA递送的多肽聚合物复合纳米颗粒。
其中，上述用于mRNA递送的多肽聚合物复合纳米颗粒的制备方法中，所述的溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、四氯甲烷、乙醇、甲醇、乙醚、戊烷、乙酸乙酯或环己烷中的至少一种。
其中，上述用于mRNA递送的多肽聚合物复合纳米颗粒的制备方法中，所述的水化溶液为双蒸水、去离子水、纯水或生理盐水中的至少一种。
本发明还提供了上述用于mRNA递送的多肽聚合物复合纳米颗粒在递送mRNA分子中的用途。
其中，上述用途中，所述的mRNA分子为Bim的mRNA、IL-22BP的mRNA或IL-15的mRNA。
本发明还提供了一种上述用于mRNA递送的多肽聚合物复合纳米颗粒负载mRNA分子得到的复合物。
进一步的，本发明还提供了一种上述复合物在制备预防或治疗肿瘤疾病的药物中的用途。
进一步的，上述用途中，所述的肿瘤为结肠癌、肺癌或乳腺癌。
本发明的有益效果为：
本发明提供了一种用于mRNA递送的多肽聚合物复合纳米颗粒DMP-039，该纳米颗粒能通过静电相互作用结合mRNA，可以有效地将目的基因导入细胞中，其本身具有细胞毒性低、转染率高等特征，在基于mRNA的基因功能研究、基因治疗研究及临床应用中有很好的应用前景。DMP-039纳米颗粒可介导不同基因发挥疗效，如DMP-039纳米粒递送的IL-22BP、Bim或IL-15等基因的mRNA分子可以在体内有效抑制肿瘤组织的生长。DM-039P纳米粒是一种相对安全且高效的mRNA分子非病毒基因递送载体，制备所得mRNA/DMP-039复合物为疾病治疗提供了一种新的策略。
附图说明
图1所示为DOTAP化学结构式；
图2所示为mPEG-PCL化学结构式；
图3所示为Mal-PEG-PCL化学结构式；
图4所示为cRGD-R9多肽结构式；
图5所示为试验例1中结肠癌动物模型治疗效果图；a表示平均肿瘤重量，b表示平均肿瘤结节数；
图6所示为试验例2中乳腺癌动物模型治疗效果图；a表示肿瘤生长曲线，b表示平均肿瘤重量；
图7所示为试验例3中结肠癌肺转移动物模型治疗效果图；a表示肺重，b表示平均肺肿瘤结节数。
具体实施方式
本发明提供了一种穿膜肽修饰的功能性阳离子聚合物载体，发明人首先采用阳离子磷脂DOTAP、两亲性共聚物mPEG-PCL和Mal-PEG-PCL自组装为DMP-Mal阳离子纳米粒，再通过加成反应与cRGD-R9穿膜肽共价偶联制备得到穿膜肽修饰的mRNA递送载体，即DMP-039纳米粒。本发明的DMP-039纳米粒具有mRNA递送效率高、细胞毒性低等优点。
本发明中所采用的阳离子磷脂DOTAP，化学命名为(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵，简称DOTAP，化学结构式见图1。本发明采用DOTAP制备纳米粒，一方面，DOTAP磷脂也是两亲性，能够与同为两亲性的mPEG-PCL聚合物一起自组装为纳米颗粒；另一方面，DOTAP磷脂带正点，可与带负电的mRNA分子产生静电吸附，实现对mRNA的递送；此外，由于细胞膜也由脂质组成，DOTAP的存在能够促进纳米颗粒的跨膜摄取。
本发明中所采用的两亲性共聚物之一为甲氧基聚乙二醇-聚己内酯，简称mPEG-PCL，化学结构式见图2。mPEG-PCL具有生物可降解性、生物相容性和两亲性，且能够在水溶液中自助装为纳米颗粒，是理想的纳米药物载体骨架材料。
本发明中所采用的两亲性共聚物之一为马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯，简称Mal-PEG-PCL，化学结构式见图3。Mal-PEG-PCL不仅具有生物可降解性、生物相容性和两亲性，且能够在水溶液中自助装为纳米颗粒，还能够通过马来酰亚胺基团与多肽进行共价偶联，是理想的纳米药物功能化载体骨架材料。
本发明中所采用的细胞穿膜肽cRGD-R9，化学结构式见图4，是一种具有细胞穿透功能的短肽，具有促进细胞跨膜摄取的功能。
本发明通过筛选试验确定了DMP-039纳米粒中mPEG-PCL与DOTAP的重量比，先采用mPEG-PCL与DOTAP的重量比为：1:1～20:1制备DMP-039纳米粒，对这些纳米粒进行细胞转染实验，试验发现当mPEG-PCL聚合物为6～12份、DOTAP 1份时有较好的转染效率，优选mPEG-PCL共聚物9份，DOTAP 1份。
本发明通过筛选试验确定了DMP-039纳米粒中Mal-PEG-PCL与mPEG-PCL的重量比，先采用Mal-PEG-PCL与mPEG-PCL的重量比为：1：100～1：20制备DMP-039纳米粒，对这些纳米粒进行细胞转染实验，试验发现当Mal-PEG-PCL聚合物为1份、mPEG-PCL聚合物为30-50份时有较好的转染效率，优选Mal-PEG-PCL聚合物1份，mPEG-PCL共聚物45份。
在前期纳米基因药物的制备过程中，将mRNA/DMP复合物中mRNA与DMP纳米的质量比范围定为1:1～1:50。通过进行凝胶阻滞分析和细胞转染实验发现，在这个比例范围内DMP-039纳米粒能够有效结合mRNA分子并有较好的转染效率。在此的基础上，进一步将该比例缩小至1：10～1：30，再次进行凝胶阻滞分析和细胞转染实验发现，在这个比例范围内DMP-039对mRNA分子的递送效果最优。
本发明制备DMP-039纳米粒所需的mPEG-PCL共聚物中，mPEG和PCL的分子量比例为1:1，mPEG-PCL的总分子量范围为4000Da～8000Da。
本发明制备DMP-039纳米粒所需的Mal-PEG-PCL共聚物中，PEG和PCL的分子量比例为1:1，Mal-PEG-PCL的总分子量范围为4000Da～8000Da。
本发明制备DMP-039纳米粒所需的穿膜肽中，DMP纳米粒和穿膜肽的摩尔比例为30:1。
本发明得到的DMP-039纳米粒的平均粒径为250nm，平均电位为+20mv，具备良好的mRNA结合能力，能保护mRNA不被RNase酶降解，与未用穿膜肽修饰的载体材料DMP以及金标转染材料PEI25K相比，本发明DMP-039纳米粒具有更高的mRNA转染能力和较低的细胞毒性。
本发明制备得到的DMP-039纳米粒属于生物可降解阳离子纳米粒，是一种新型基因导入系统非病毒载体。该纳米粒能通过静电相互作用结合mRNA，可以有效地将mRNA形式的目的基因导入肿瘤细胞中，其本身具有细胞毒性低、转染率高等特征。
下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。
实施例中所用的各种试剂均为普通市售产品。
实施例1DMP-039阳离子纳米粒的制备
1、制备DMP-Mal纳米粒
将阳离子脂质DOTAP、mPEG-PCL聚合物(分子量为4000Da，PEG-PCL＝2000Da-2000Da)和Mal-PEG-PCL聚合物(分子量为4000Da，PEG-PCL＝2000Da-2000Da)按5：45：1的质量比进行混合，并将混合物用二氯甲烷进行溶解，并置于旋转蒸发仪上以60℃旋蒸45min后成膜。所成的膜取出后溶解于去离子水中，然后在60℃水浴条件下震荡5min，得到特定浓度的DMP-Mal阳离子聚合物纳米粒溶液，置于4℃冰箱保存备用。
2、制备DMP-039纳米粒
将制备好的DMP-Mal纳米粒水溶液，浓度为10mg/mL，按照DMP-Mal纳米水溶液与cRGD-R9多肽的质量比为30:1的比例溶解于Hepes缓冲液中，混匀后于4℃环境下过夜反应。反应结束后将上述混合溶液放入2000Da分子量大小的透析袋中，透析液为蒸馏水，于4℃环境下过夜透析。透析后所得溶液即为DMP-039纳米粒水溶液，置于4℃冰箱保存备用。
实施例2制备IL-22BP mRNA/DMP-039纳米粒基因复合物
1、制备IL-22BP mRNA溶液
以pVAX1-IL-22BP质粒为模板，通过PCR扩增得到IL-22BP基因的DNA片段。经琼脂糖凝胶电泳后切下与目的基因大小一致的片段区域凝胶，采用胶回收试剂盒回收该片段，得到纯化后的IL-22BP PCR产物。随后采用T7体外转录试剂盒，以0.5μg的IL-22BP基因PCR产物为模板，在37℃恒温条件下进行过夜转录，然后在37℃恒温条件下进行5’端加帽和3’端加尾修饰。修饰后的mRNA用转录纯化试剂盒进行纯化，最后用去离子水进行洗脱，得到IL-22BP mRNA溶液。
2、制备IL-22BP mRNA/DMP-039复合物
按DMP-039阳离子纳米粒：IL-22BP mRNA以25：1(w/w)的比例将纳米粒溶液(分散于去离子水中，浓度为5mg/mL)加入到mRNA溶液(分散于去离子水中，浓度为1mg/mL)中，之后立刻用移液枪吹打混匀，再在室温环境静置15分钟，即得DMP-039阳离子纳米粒质粒IL-22BP mRNA复合物。
实施例3制备Bim mRNA/DMP-039纳米粒基因复合物
1、制备Bim mRNA溶液
以pVAX1-Bim质粒为模板，通过PCR扩增得到Bim基因的DNA片段。经琼脂糖凝胶电泳后切下与目的基因大小一致的片段区域凝胶，采用胶回收试剂盒回收该片段，得到纯化后的Bim PCR产物。随后采用T7体外转录试剂盒，以0.5μg的Bim基因PCR产物为模板，在37℃恒温条件下进行过夜转录，然后在37℃恒温条件下进行5’端加帽和3’端加尾修饰。修饰后的mRNA用转录纯化试剂盒进行纯化，最后用去离子水进行洗脱，得到Bim mRNA溶液。
2、制备Bim mRNA/DMP-039复合物
按DMP-039阳离子纳米粒：Bim mRNA以25：1(w/w)的比例将纳米粒溶液(分散于去离子水中，浓度为5mg/mL)加入到mRNA溶液(分散于去离子水中，浓度为1mg/mL)中，之后立刻用移液枪吹打混匀，再在室温环境静置15分钟，即得DMP-039阳离子纳米粒质粒Bim mRNA复合物。
实施例4制备IL-15mRNA/DMP-039纳米粒基因复合物
1、制备IL-15mRNA溶液
以pVAX1-IL-15质粒为模板，通过PCR扩增得到IL-15基因的DNA片段。经琼脂糖凝胶电泳后切下与目的基因大小一致的片段区域凝胶，采用胶回收试剂盒回收该片段，得到纯化后的IL-15PCR产物。随后采用T7体外转录试剂盒，以0.5μg的IL-15基因PCR产物为模板，在37℃恒温条件下进行过夜转录，然后在37℃恒温条件下进行5’端加帽和3’端加尾修饰。修饰后的mRNA用转录纯化试剂盒进行纯化，最后用去离子水进行洗脱，得到IL-15mRNA溶液。
2、制备IL-15mRNA/DMP-039复合物
按DMP-039阳离子纳米粒：IL-15mRNA以25：1(w/w)的比例将纳米粒溶液(分散于去离子水中，浓度为5mg/mL)加入到mRNA溶液(分散于去离子水中，浓度为1mg/mL)中，之后立刻用移液枪吹打混匀，再在室温环境静置15分钟，即得DMP-039阳离子纳米粒质粒IL-15mRNA复合物。
试验例1本发明DMP-039阳离子纳米粒/IL-22BP mRNA基因复合物抗结肠癌试验
为了研究DMP-039阳离子纳米粒/IL-22BP mRNA基因复合物在体内的抗肿瘤效应，在BalB/c小鼠(6-8周龄，雌性)腹腔建立了结肠癌腹腔转移瘤模型。将体外培养的C26结肠癌细胞用胰蛋白酶消化，并定容在无血清、无抗生素的DMEM培养基中，在每只小鼠的腹腔接种2×105个细胞，细胞接种3天后，开始按以下进行随机分组治疗(每组5只)：
A)空白对照组：5％的葡萄糖溶液；
B)空白载体对照组：DMP-039阳离子纳米粒置于5％的葡萄糖溶液中；
C)IL-22BP治疗组：DMP-039阳离子纳米粒/IL-22BP mRNA基因复合物置于5％的葡萄糖溶液中。
采取腹腔注射方式进行治疗，DMP-039阳离子纳米粒/IL-22BP mRNA基因复合物按实施例3的方法制备，其配比如下：mRNA：阳离子纳米粒＝1：25(W/W)，将阳离子纳米粒/mRNA复合物稀释在葡萄糖溶液中，并调整使得葡萄糖终浓度为5％。每次每只小鼠的注射体积为100μL，其中含mRNA 10μg以及阳离子纳米粒250μg。每天给药1次，共治疗16次。治疗结束后,隔天将动物处死并解剖，分离腹腔肿瘤组织并进行称重和肿瘤结节计数。肿瘤生长抑制用方差分析，P<0.05则认为有统计学意义。以上各组动物的肿瘤重量、肿瘤结节数见图5，其中图5a表示平均肿瘤重量，图5b表示平均肿瘤结节数。
从图5可以看出，DMP-039阳离子纳米粒/IL-22BP mRNA基因复合物治疗组肿瘤生长缓慢，而对照组肿瘤生长较快，DMP-039阳离子纳米粒/IL-22BP mRNA基因复合物表现出极强的抑制肿瘤生长的作用，与空白对照组相比抑瘤率达到77.5％。
试验例2本发明DMP-039阳离子纳米粒/Bim mRNA基因复合物抗乳腺癌试验
为了研究DMP-039阳离子纳米粒/Bim mRNA基因复合物在体内的抗肿瘤效应，在BalB/c小鼠(6-8周龄，雌性)皮下建立了乳腺癌异位移植瘤模型。将体外培养的4T1乳腺癌细胞用胰蛋白酶消化，并定容在无血清、无抗生素的DMEM培养基中，在每只小鼠的皮下接种1.5×106个细胞，细胞接种5天后，开始按以下进行随机分组治疗(每组5只)：
A)空白对照组：5％的葡萄糖溶液；
B)空白载体对照组：DMP-039阳离子纳米粒置于5％的葡萄糖溶液中；
C)Bim治疗组：DMP-039阳离子纳米粒/Bim mRNA基因复合物置于5％的葡萄糖溶液中。
采取瘤内注射方式进行治疗，DMP-039阳离子纳米粒/Bim mRNA基因复合物按实施例3的方法制备，其配比如下：mRNA：阳离子纳米粒＝1：25(W/W)，将阳离子纳米粒/mRNA复合物稀释在葡萄糖溶液中，并调整使得葡萄糖终浓度为5％。每次每只小鼠的注射体积为100μL，其中含mRNA 10μg以及阳离子纳米粒250μg。每天给药1次，共治疗15次。治疗开始后每天测量肿瘤体积大小。治疗结束后，隔天将动物处死并解剖，分离皮下肿瘤组织并进行称重。肿瘤生长抑制用方差分析，P<0.05则认为有统计学意义。以上各组动物的肿瘤重量、肿瘤生长曲线见图6，其中图6a表示肿瘤生长曲线，图6b表示平均肿瘤重量。
从图6可以看出，DMP-039阳离子纳米粒/Bim mRNA基因复合物治疗组肿瘤生长缓慢，而对照组肿瘤生长较快，DMP-039阳离子纳米粒/Bim mRNA基因复合物表现出极强的抑制肿瘤生长的作用，与空白对照组相比抑瘤率达到69.9％。
试验例3本发明DMP-039阳离子纳米粒/IL-15mRNA基因复合物抗结肠癌肺转移瘤试验
为了研究DMP-039阳离子纳米粒IL-15mRNA基因复合物在体内的抗肿瘤效应，在BalB/c小鼠(6-8周龄，雌性)肺部建立了肺转移瘤模型。将体外培养的C26结肠癌细胞用胰蛋白酶消化，并定容在无血清、无抗生素的DMEM培养基中，在每只小鼠的静脉接种3×105个细胞，细胞接种1天后，开始按以下进行随机分组治疗(每组5只)：
A)空白对照组：5％的葡萄糖溶液；
B)空白载体对照组：DMP-039阳离子纳米粒置于5％的葡萄糖溶液中；
C)IL-15治疗组：DMP-039阳离子纳米粒/IL-15mRNA基因复合物置于5％的葡萄糖溶液中。
采取尾静脉注射方式进行治疗，DMP-039阳离子纳米粒/IL-15mRNA基因复合物按实施例3的方法制备，其配比如下：mRNA：阳离子纳米粒＝1：25(W/W)，将阳离子纳米粒/mRNA复合物稀释在葡萄糖溶液中，并调整使得葡萄糖终浓度为5％。每次每只小鼠的注射体积为100μL，其中含mRNA 10μg以及阳离子纳米粒250μg。每天给药1次，共治疗13次。治疗结束后第3天将动物处死并解剖，分离肺组织并进行称重。肿瘤生长抑制用方差分析，P<0.05则认为有统计学意义。以上各组动物的肺重量、肺结节数见图7，其中图7a表示肺重，图7b表示平均肺肿瘤结节数。
从图7可以看出，DMP-039阳离子纳米粒/IL-15mRNA基因复合物治疗组肿瘤生长缓慢，而对照组肿瘤生长较快，DMP-039阳离子纳米粒/IL-15mRNA基因复合物表现出极强的抑制肿瘤生长的作用，与空白对照组相比抑瘤率达到67.1％。
以上实验结果表明，DMP-039阳离子纳米粒/IL-15mRNA基因复合物具有显著的抗结肠癌肺转移肿瘤的作用。

Claims (9)

1.用于mRNA递送的多肽聚合物复合纳米颗粒，其特征在于：为细胞穿膜肽cRGD-R9修饰DMP-Mal纳米粒制备得到；所述的DMP-Mal纳米粒由阳离子磷脂DOTAP、mPEG-PCL聚合物和Mal-PEG-PCl聚合物共同制备得到，所述的DOTAP、mPEG-PCL聚合物与Mal-PEG-PCL聚合物的质量比为：5：45：1。
2.根据权利要求1所述的用于mRNA递送的多肽聚合物复合纳米颗粒，其特征在于：所述多肽聚合物复合纳米颗粒的平均粒径为250nm，平均电位为+20mv。
3.根据权利要求1所述的用于mRNA递送的多肽聚合物复合纳米颗粒，其特征在于：所述的细胞穿膜肽cRGD-R9与DMP-Mal纳米粒的质量比为： 1~5：20~60。
4.权利要求1-3任一项所述的用于mRNA递送的多肽聚合物复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
称取mPEG-PCL聚合物45份，DOTAP 5份，Mal-PEG-PCL聚合物1份，分别溶于溶剂中，然后利用旋转蒸发仪将溶剂蒸发挥干成膜，旋转蒸发仪上以60℃旋蒸30min，加适量水化溶液水化直到膜完全溶解，得到DMP-Mal纳米粒溶液，以适量的DMP-Mal纳米粒与cRGD-R9多肽混合孵育，反应溶液透析后，得到用于mRNA递送的多肽聚合物复合纳米颗粒。
5.权利要求1-3任一项所述的用于mRNA递送的多肽聚合物复合纳米颗粒在制备递送mRNA分子药物中的用途。
6.根据权利要求5所述的用于mRNA递送的多肽聚合物复合纳米颗粒在制备递送mRNA分子药物中的用途中，其特征在于：所述的mRNA分子为Bim的 mRNA、IL-22BP的 mRNA或IL-15的mRNA。
7.权利要求1-3任一项所述的用于mRNA递送的多肽聚合物复合纳米颗粒负载mRNA分子得到的复合物。
8.权利要求7所述的复合物在制备预防或治疗肿瘤疾病的药物中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述的肿瘤为结肠癌、肺癌或乳腺癌。
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