CN116655769A - 一种重组人碱性成纤维细胞生长因子的生产工艺 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh‑bFGF)的生产工艺。本发明利用重组技术建立一条最优生产hbFGF路线，包括以下步骤：(1)大肠杆菌胞内表达载体pET‑28a/hbFGF的构建；(2)rh‑bFGF融合蛋白工程菌的制备、转化；(3)rh‑bFGF重组大肠杆菌的诱导表达和纯化。大肠杆菌表达重组人bFGF(rh‑bFGF)的重组蛋白生产工艺简单、成本低、产物均一，适合规模化生产。

Description

一种重组人碱性成纤维细胞生长因子的生产工艺

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组人碱性成纤维细胞生长因子的生产工艺。

背景技术

碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是一种含有155个氨基酸的阴离子多肽，分子量一般为18KD，等电点为9.6-9.8，其中包括9个配基，易被蛋白酶降解，对热和酸敏感，pH<4.0时失活，氨基酸序列中的半胱氨酸是构成三维空间结构的重要部分。目前，人、牛、鼠bFGF的cDNA序列分析已经完成，均为单拷贝基因，而bFGF在各种物种中的基因的核苷酸序列同源性非常高，人和牛之间同源性达94.9％，人和鼠之间达88.7％，牛和鼠之间达88.5％。

bFGF在体内分布广泛，在神经组织中，例如脑、垂体、下丘脑和眼；在骨骼组织中，例如软骨和骨；在生殖组织中，例如子宫、胎盘、黄体、睾丸、卵巢和前列腺；在肾上腺；在器官中，例如肾脏、肝脏和心脏；在毛细管中；在白细胞中，例如巨噬细胞；以及肿瘤，如软骨瘤。bFGF还在胚胎肾，小鸡肢芽和爪蟾卵母细胞的发育过程中表达。

bFGF因对组织生长和再生(包括伤口愈合)的多功能参与而闻名。它作用于伤口愈合的各种靶细胞，因此其对伤口愈合的影响已被广泛研究。在手术、创伤、糖尿病、烧伤或其他慢性伤口引起的皮肤损伤等疾病，使用bFGF药物治疗显著提高了伤口的恢复速度和皮肤再生的能力。bFGF是各种细胞类型的有丝分裂原，主要作用就是通过促进内皮细胞和血管平滑肌细胞的增殖，修复内皮细胞的生物活性，以此促进血管的生成。它由相邻的毛细血管组织释放，作为血管内皮细胞分裂的一种有效诱导物质，刺激血管内皮细胞的增殖，形成新的毛细血管。bFGF是一种生理相关的神经营养因子，在促进神经细胞生长和保护方面具有重要作用。能刺激神经元前体和神经胶质细胞的有丝分裂和分化，并在受损的中枢神经系统中介导神经营养和神经突生长效应。它在整个神经系统中表达，促进神经元的增殖和有丝分裂，改善血脊髓屏障的渗透性并调节脊髓损伤修复的微环境的稳定性。在脊髓损伤早期阶段，bFGF通过保护神经、调节神经胶质、抑制损伤病变中的细胞凋亡和促进神经纤维再生来治疗难以恢复的脊髓损伤。bFGF是软骨组织工程中常用于软骨细胞和骨髓间充质干细胞培养的生长因子，可促进软骨细胞和间充质细胞的增殖，以及骨髓间充质干细胞的软骨分化。

bFGF主要分布于垂体、脑和神经组织及视网膜、肾上腺、胎盘等，尤以垂体含量最高，能纯化大量的bFGF(0.5mg/kg)，其它组织含量很少，约为其1/10～1/50。bFGF不存在或以极低浓度存在于血清和体液中。动物和人体内正常组织中含量极少，而且bFGF在体外极容易失效，远不能满足实际需要。而基因工程可以允许细胞合成足够量的感兴趣的蛋白质，甚至是异源蛋白，这些蛋白质可以被用于关键研究领域、工业生产以及临床应用。随着基因组学、蛋白质组学和生物信息学的现代进步，使用重组技术生产的蛋白质数量呈指数增长，似乎保证了重组蛋白质的无限供应。大肠杆菌一直是公认的蛋白质生产的首选生物也是学术界和工业界生产重组蛋白的主力，并且是在各种表达平台之间进行比较的有用基准。大肠杆菌表达系统的优势有(1)快速生长；(2)容易达到高细胞密度；(3)廉价的复合培养基可用于快速生长；(4)遗传学、生物学和代谢学特征明确，导致大量克隆和表达载体和菌株的出现；(5)用于外源DNA转化可以简单快捷；(6)发酵周期短操作简单。这些使之成为重组蛋白生产的首选宿主。

研究表明真核DNA可以在大肠杆菌中繁殖，并且可以从细菌质粒中合成功能产物。在这些成功的案例之后，人们很快意识到这些技术的潜在应用几乎是无限的。bFGF能增强细胞有丝分裂具有广泛的生物学效应，能促进组织再生和伤口愈合，作为血管生成因子，参与神经再生和修复，增强软骨组织修复，对手术伤、体表慢性溃疡、烧伤创面等疾病具有积极治疗作用。而中国人口众多，对bFGF市场需求远大于天然存在的bFGF。然而，蛋白质生产仍然不是一件容易的事，很难为大型样品设置最佳培养条件。对一种基因产品有效的条件不一定对另一种基因产品有效。

因此需要建立一种方便快捷、成本低廉的生产bFGF的方法有助于解决bFGF在生产、制药、临床等方面的应用受限问题，对实现bFGF的高水平表达和大规模工业生产打下坚实基础。

发明内容

本发明目的在于克服天然bFGF含量极少且提取成本高的不足，利用重组DNA技术，在大肠杆菌中成功合成目的产物，大肠杆菌表达系统具有相对容易的基因操作、使用简单的生长培养基、快速的细胞生长、简单的发酵过程、无病毒和高质量产品，最重要的是，具有成本效益的栽培。具体为：通过构建重组质粒的方式在大肠杆菌中实现了hbFGF的异源表达，并对重组大肠杆菌进行发酵和提取纯化hbFGF。

为克服背景技术中的技术问题，本发明利用大肠杆菌表达rh-bFGF的重组蛋白，生产工艺简单、成本低、产物纯度高。

一种重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF)的生产工艺，具体包括以下步骤：

(1)大肠杆菌分泌表达载体pET-28a/hbFGF的构建，具体包括：人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)和载体质粒pET-28a获得；对hbFGF质粒和载体质粒pET-28a进行双酶切，然后使用连接酶进行连接，获得重组质粒pET-28a/hbFGF；

(2)hbFGF融合蛋白工程菌的制备、转化，具体包括：LB培养基的配制；将(1)获得的pET-28a/hbFGF转化至Rossetta感受态细胞中，通过培养基的培养获得重组菌株；

(3)重组菌株的诱导表达、菌液处理、纯化和保存，具体包括：将(2)获得的工程菌进行发酵、诱导表达，超声破碎得到粗成品，粗成品再经过镍离子(Ni²⁺)亲和层析柱纯化，即可获得本发明大肠杆菌表达的纯rh-bFGF蛋白，蛋白真空冷冻干燥保存。

进一步的，所述步骤(1)中，人碱性成纤维细胞生长因子质粒的获得，采用全基因合成，重组人bFGF基因序列如序列表1所示，重组人bFGF的氨基酸序列如序列表2所示。对hbFGF质粒和载体质粒pET-28a进行BamHI、XholI双酶切，然后使用T4DNA连接酶进行连接，获得重组质粒pET-28a/hbFGF；；

进一步的，所述步骤(2)中，大肠杆菌表达常用培养基的配制，具体方法为：

LB培养基：酵母粉5～10g，蛋白胨10～20g，氯化钠10～20g(制备固体培养基时另加15～30g琼脂粉)，定容到1～2L，121℃高压灭菌锅10～40min；

采用电转化法将pET-28a/hbFGF转化至大肠杆菌Rossetta感受态细胞：取一管100μl置于冰浴上融化的感受态细胞，向感受态细胞悬液中加入10μl DNA连接产物，用移液枪轻轻吹打混匀之后置于冰浴上30min。冰浴之后进行42℃热击45s，然后快速将离心管转移到冰浴上，冰上静置2-3min，此过程不要摇动离心管。然后在每个离心管中加入450μl无菌的不含有抗生素的LB培养基，混匀后进行37℃，100～200rpm震荡培养60min让菌体复苏。准备含有10～100μg/mL卡那霉素的LB固体琼脂培养板，加入适量已转化的感受态细胞，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于37℃培养箱直至液体被吸收，倒置培养12～16h，观察菌落生长情况。

进一步的，所述步骤(3)中，含有Rossetta/pET-28a/hbFGF工程菌的诱导表达，具体步骤为：

挑取单菌落接种于100mL LB培养基(含有10～100μg/mL Kana)，37℃、100～200rpm震荡培养过夜，测定其菌体生长OD₆₀₀至0.6～0.8之间加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.5～1.5mM，37℃震荡培养诱导2～8h，5000～10000rpm/min离心10～30min收集菌体，放入冰箱-20℃保存。

进一步的，所述步骤(3)中，含有Rossetta/pET-28a/hbFGF工程菌的诱导表达后的菌液处理，具体步骤为：离心收集的菌体解冻后加入0.5M NaCl+20mM磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.5)，冰上超声破碎，超声破碎条件：40～80％的功率、超声时间2～8s、停止时间4～10s、变幅杆6Φ。破碎时间20min～60min直至浑浊的液体变得透明、清澈，菌液从枪头滴下不粘连。破碎后4℃、10000～15000rpm离心20～40min收集上清液并使用0.45μm滤膜过滤得到粗成品。

进一步的，所述步骤(3)中，镍离子亲和层析的步骤为：

使用Ni Seplife FF(TED)亲和层析填料自行装柱，使用UV1001紫外-可见光检测器在线280nm波长吸收值，用为0.5mol/L NaCl+20mmol/L PBS(pH7.5)平衡柱子使检测结果稳定，此时将基线调零；加入过滤液；再用0.5mol/LNaCl+20mmol/L PBS(pH7.5)冲洗未与层析柱结合的杂蛋白，直到吸收峰归零；在用不同咪唑浓度梯度(50mM、100mM、200mM、300mM、500mM)的0.5mol/L NaCl+20mmol/L PBS(pH7.5)洗脱与层析柱结合的目的蛋白。收集不同洗脱液进行SDS-PAGE分析。

进一步的，所述步骤(3)中，蛋白保存具体步骤为：

纯化后得到的洗脱液经鉴定为所需目的蛋白及重组人bFGF蛋白原液，用0.22μm滤膜过滤除菌，分装于干净无菌的冻干瓶中进行冷冻真空干燥保存。

本发明的有益效果：

第一、本发明一种大肠杆菌表达重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF)的方法，通过对大肠杆菌进行载体构建，从而进行重组表达，对hbFGF的产量有了较大提升。

第二、本发明一种大肠杆菌表达重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF)的方法，使用了廉价易得的培养基成分，避免了生产成本高的问题。

第三、本发明一种大肠杆菌表达重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF)的方法，具有完整的工业生产工艺，技术路线方便简单，具有较好的环境效益，适合工业大规模生产。

附图说明

图1为rh-bFGF的测序峰图；

图2为诱导表达rh-bFGF的SDS-PAGE图；

图3为紫外检测器图和SDS-PAGE鉴定纯化后rh-bFGF图；

序列表说明：

序列表1本发明重组人bFGF的核苷酸序列

序列表2本发明重组人bFGF的核苷酸序列

具体实施方式

本发明提供了一种大肠杆菌表达rh-bFGF的方法，具体包括以下步骤：

(1)大肠杆菌分泌表达载体pET-28a/hbFGF的构建，具体包括：人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)和载体质粒pET-28a获得；对hbFGF质粒和载体质粒pET-28a进行双酶切，然后使用连接酶进行连接，获得重组质粒pET-28a/hbFGF；

(2)hbFGF融合蛋白工程菌的制备、转化，具体包括：LB培养基的配制；将(1)获得的pET-28a/hbFGF转化至Rossetta感受态细胞中，通过培养基的培养获得重组菌株；

(3)重组菌株的诱导表达、菌液处理、纯化和保存，具体包括：将(2)获得的工程菌进行发酵、诱导表达，超声破碎得到粗成品，粗成品再经过镍离子(Ni2+)亲和层析柱纯化，即可获得本发明大肠杆菌表达的纯rh-bFGF蛋白，蛋白真空冷冻干燥保存。

在本发明中将构建成功的重组质粒进行发酵，所述步骤(2)中LB培养基：酵母粉5～10g，蛋白胨10～20g，氯化钠10～20g(制备固体培养基时另加15～30g琼脂粉)，定容到1～2L，更优选为酵母粉8～10g，蛋白胨16～20g，氯化钠16～20g(制备固体培养基时另加34～30g琼脂粉)，定容到1.6～2L；最优选为酵母粉10g，蛋白胨20g，氯化钠20g(制备固体培养基时另加30g琼脂粉)，定容到2L；

在本发明中，所述步骤(2)中LB培养基121℃高压灭菌锅灭菌时间优选为10～40min，更优选为18～35min，最优选为20min。

在本发明中，所述步骤(2、3)中含有卡那霉素的LB固体琼脂培养板和LB液体培养基，其浓度优选为10～100μg/mL，更优选为20～80μg/mL，最优选为50μg/mL。

在本发明中，所述步骤(2、3)中LB固体琼脂培养板和LB液体培养基的震荡培养转速优选为100～200rpm，更优选为150～180rpm，最优选为170rpm。

在本发明中，所述步骤(3)中诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)终浓度优选为0.5～1.5mM，更优选为0.8～1.2mM，最优选为1.0mM。

在本发明中，所述步骤(3)中震荡培养诱导时间优选为2～8h，更优选为3～5h，最优选为4h。

在本发明中，所述步骤(3)中离心收集菌体转速优选为5000～10000rpm/min，更优选为6000～90000rpm/min，最优选为80000rpm/min。

在本发明中，所述步骤(3)中离心收集菌体离心收集时间优选为10～30min，更优选为15～25min，最优选为20min。

在本发明中，所述步骤(3)中超声破碎条件优选为40～80％的功率、超声时间2～8s、停止时间4～10s、变幅杆6Φ，破碎时间20min～60min，更优选为50～70％的功率、超声时间3～6s、停止时间6～8s、变幅杆6Φ，破碎时间25min～35min，最优选为60％的功率、超声时间4s、停止时间7s、变幅杆6Φ，破碎时间30min。

在本发明中，所述步骤(3)中超声破碎后离心转速优选为10000～15000rpm，更优选为11000～13000rpm，最优选为12000rpm。

在本发明中，所述步骤(3)中超声破碎后离心时间优选为20～40min，更优选为25～35min，最优选为30min。

在本发明中，所述步骤(3)中洗脱目的蛋白的咪唑浓度优选为50～500mM更优选为100～300mM，最优选为200mM。

为了进一步说明本发明，下面结合实例对本发明提供提供了一种大肠杆菌表达rh-bFGF的方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实例1

大肠杆菌表达载体Rossetta/pET-28a/hbFGF的构建：

通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)查询获得基因序列，在通过全基因合成的方式，获得目的基因hbFGF质粒，重组人bFGF基因序列如序列表1所示，重组人bFGF的氨基酸序列如序列表2所示。对载体质粒pET-28a进行相同的酶切，获得相同粘性末端的载体质粒，使用T4DNA连接酶连接两种质粒。连接体系为10μl，其中目的片段4μl，Solution I 5μl，载体1μl，16℃过夜连接。

实例2

rh-bFGF融合蛋白工程菌的制备和转化：

采用电转化法将pET-28a/hbFGF转化至大肠杆菌Rossetta感受态细胞。

取一管100μl置于冰浴上融化的感受态细胞，向感受态细胞悬液中加入10μl DNA连接产物，用移液枪轻轻吹打混匀之后置于冰浴上30min。

冰浴之后进行42℃热击45s，然后快速将离心管转移到冰浴上，冰上静置2-3min，此过程不要摇动离心管。

然后在每个离心管中加入450μl无菌的不含有抗生素的LB培养基，混匀后进行37℃，170rpm震荡培养60min让菌体复苏。

准备含有50μg/ml卡那霉素的LB固体琼脂培养板，加入适量已转化的感受态细胞，用用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于37℃培养箱直至液体被吸收，倒置培养12～16h，观察菌落生长情况。对生长单菌落菌株进行基因测序，结果如附图1。

实例3

工程菌的诱导表达、检测

挑取单菌落接种于提前灭菌好的LB培养基(含有50μg/ml卡那霉素)经37℃、170rpm震荡培养。测定其OD₆₀₀吸光值为0.6-0.8之间加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度1mM，37℃震荡培养诱导4h，8000rpm离心20min收集菌体，菌体加入0.5mol/L NaCl+20mM磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.5)，冰上超声破碎，破碎条件：60％的功率、超声时间4s、停止时间7s、变幅杆6Φ，破碎时间30min。至混悬液澄清透亮，4℃、12000rpm离心30min收集上清液并使用0.45μm滤膜过滤。

诱导表达得到的上清蛋白液经SDS-PAGE电泳可观察到21-22kD范围内有明显的特异性条带出现(图2重组大肠杆菌涂布平板图(a)；表达测试SDS-PAGE结果图(b)：泳道M：Marker；泳道1：诱导后样品；泳道2：诱导前样品泳道)。

实例4

rh-bFGF的镍离子(Ni²⁺)亲和层析纯化和保存

离心收集破碎菌体的上清，使用0.45μm滤膜过滤用以上样。使用Ni Seplife FF(TED)亲和层析填料自行装柱，使用UV1001紫外-可见光检测器在线280nm波长吸收值，用为0.5mol/L NaCl+20mmol/L PBS(pH7.5)平衡柱子使检测结果稳定，此时将基线调零；加入过滤液；再用0.5mol/L NaCl+20mmol/L PBS(pH7.5)冲洗未与层析柱结合的杂蛋白，直到吸收峰归零；在用不同咪唑浓度梯度(50mM、100mM、200mM、300mM、500mM)的0.5mol/L NaCl+20mmol/LPBS(pH7.5)洗脱与层析柱结合的目的蛋白。对收集液进行SDS-PAGE电泳可观察到本发明获得的大肠杆菌表达的目的蛋白被200mM咪唑洗脱纯化出来。洗脱下来的重组人bFGF蛋白原液用0.22滤膜过滤除菌，分装于冻干瓶中进行冷冻真空干燥。结果如附图3镍柱纯化层析图(a)：A：进样峰；B：50mM咪唑洗脱峰；C：100mM咪唑冲洗；D：200mM咪唑冲洗；E：300mM咪唑洗脱峰；F：500mM咪唑洗脱峰；镍柱纯化电泳图(b)：泳道M：Marker；泳道1：诱导前样品；泳道2：诱导后样品；泳道3：流穿液；泳道4-8：50mM、100mM、200mM、300mM、500mM咪唑洗脱样。

Claims (9)

1.一种重组人碱性成纤维细胞生长因子的生产工艺，其特征在于，包括以下步骤：

(1)大肠杆菌胞内表达载体pET-28a/hbFGF的构建，具体包括：获得质粒hbFGF和pET-28a，并对其进行双酶切，带有相同粘性的末端使用T4DNA连接酶进行连接，得到重组质粒pET-28a/hbFGF；

(2)rh-bFGF融合蛋白工程菌的制备、转化，具体包括：大肠杆菌表达系统常用溶液和LB基础培养基配置；将步骤(1)获得的重组质粒pET-28a/hbFGF电转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞，通过培养基的培养，获得具有抗性重组菌株rh-bFGF；

(3)rh-bFGF重组大肠杆菌的诱导表达、粗蛋白处理、纯化和保存，具体包括：将步骤(2)获得的重组菌株rh-bFGF通过诱导表达，超声破碎后得到粗蛋白再经过镍离子亲和层析纯化，即得到所需大肠杆菌表达重组人bFGF融合蛋白，蛋白冷冻干燥保存。

2.根据权利要求1所述一种重组人碱性成纤维细胞生长因子的生产工艺，其特征在于，所述步骤(1)中，人碱性成纤维细胞生成因子由全基因合成方法获得，重组人bFGF基因序列如序列表1所示，重组人bFGF的氨基酸序列如序列表2所示。

3.根据权利要求1所述一种重组人碱性成纤维细胞生长因子的生产工艺，其特征在于，所述步骤(1)中，对质粒hbFGF和质粒pET-28a分别进行BamHI限制性内切酶和XhoI限制性内切酶的双酶切，然后使用T4DNA连接酶进行连接得到重组质粒pET-28a/hbFGF。

4.根据权利要求1所述一种重组人碱性成纤维细胞生长因子的生产工艺，其特征在于，所述步骤(2)中，大肠杆菌表达体系常用溶液和培养基的配制，具体方法为：

LB培养基：酵母粉5～10g，蛋白胨10～20g，氯化钠10～20g(制备固体培养基时另加15～30g琼脂粉)，定容到1～2L，121℃高压灭菌锅10～40min。

5.根据权利要求1所述一种重组人碱性成纤维细胞生长因子的生产工艺，其特征在于，所述步骤(2)中，获得具有抗性重组菌株rh-bFGF的具体步骤为：

采用电转化法将重组质粒pET-28a/hbFGF转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞：取一管100μl置于冰浴上融化的感受态细胞，向感受态细胞悬液中加入10μl DNA连接产物，用移液枪轻轻吹打混匀之后置于冰浴上30min。冰浴之后进行42℃热击45s，然后快速将离心管转移到冰浴上，冰上静置2-3min，此过程不要摇动离心管。然后在每个离心管中加入450μl无菌的不含有抗生素的LB培养基，混匀后进行37℃，100～200rpm震荡培养60min让菌体复苏。准备含有10～100μg/mL卡那霉素的LB固体琼脂培养板，加入适量已转化的感受态细胞，用用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于37℃培养箱直至液体被吸收，倒置培养12～16h，观察菌落生长情况。

6.根据权利要求1所述一种重组人碱性成纤维细胞生长因子的生产工艺，其特征在于，所述步骤(3)中，重组菌株rh-bFGF的诱导表达，具体步骤为：挑取重组菌株rh-bFGF单菌落接种于100mL的LB培养基中，经37℃、100～200rpm震荡培养，测得其菌体生长密度OD₆₀₀吸光值达到0.6-0.8，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.5～1.5mM，37℃震荡培养诱导2～8h，5000～10000rpm/min离心10～30min收集菌体，冷冻保存。

7.根据权利要求1所述一种重组人碱性成纤维细胞生长因子的生产工艺，其特征在于，所述步骤(3)中，粗蛋白的超声破碎处理具体步骤为：保存的菌体加入0.5M NaCl+20mM磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.5)，冰上超声破碎，超声破碎条件为40～80％的功率、超声时间2～8s、停止时间4～10s、变幅杆6Φ，破碎时间20min～60min至混悬液澄清透亮，4℃、10000～15000rpm离心20～40min收集上清液并使用0.45μm滤膜过滤。

8.根据权利要求1所述一种重组人碱性成纤维细胞生长因子的生产工艺，其特征在于，所述步骤(3)中，镍离子亲和层析的步骤为：取离心并过0.45μm滤膜过滤后的过滤液，使用西安蓝晓科技新材料股份有限公司Ni Seplife FF(TED)亲和层析填料自行装柱，使用UV1001紫外-可见光检测器在线280nm波长吸收值，用为0.5mol/L NaCl+20mmol/L PBS(pH7.5)平衡柱子使检测结果稳定，此时将基线调零；加入过滤液；再加入0.5mol/L NaCl+20mmol/L PBS(pH7.5)冲洗未与层析柱结合的杂蛋白，直到吸收峰归零；在用含有50～500mM咪唑的0.5mol/L NaCl+20mmol/L PBS(pH7.5)洗脱与层析柱结合的目的蛋白，洗脱并收集洗脱峰对应的蛋白，即得到经过镍离子亲和层析后的重组人bFGF蛋白原液。

9.根据权利要求1所述一种重组人碱性成纤维细胞生长因子的生产工艺，其特征在于，所述步骤(3)中，重组人bFGF蛋白原液的保存具体步骤为：将重组人bFGF蛋白原液用0.22滤膜过滤除菌，分装于冻干瓶中进行冷冻真空干燥。