RU2809355C1 - РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pET32a-TNF-Thy, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ ГИБРИДНОГО БЕЛКА α-ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ - ТИМОЗИН АЛЬФА 1, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI BL21 (DE3)/pET32A-TNF-Thy - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TNF-Thy, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TNF-Thy И ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО - Google Patents
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pET32a-TNF-Thy, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ ГИБРИДНОГО БЕЛКА α-ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ - ТИМОЗИН АЛЬФА 1, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI BL21 (DE3)/pET32A-TNF-Thy - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TNF-Thy, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TNF-Thy И ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО Download PDFInfo
- Publication number
- RU2809355C1 RU2809355C1 RU2022134302A RU2022134302A RU2809355C1 RU 2809355 C1 RU2809355 C1 RU 2809355C1 RU 2022134302 A RU2022134302 A RU 2022134302A RU 2022134302 A RU2022134302 A RU 2022134302A RU 2809355 C1 RU2809355 C1 RU 2809355C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- thy
- tnf
- protein
- hybrid protein
- pet32a
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 221
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 187
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 37
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 title claims abstract description 30
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 20
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims abstract description 17
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 229960004231 thymalfasin Drugs 0.000 title claims description 20
- 108010078233 Thymalfasin Proteins 0.000 title claims description 11
- 102400000800 Thymosin alpha-1 Human genes 0.000 title claims description 11
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 title abstract description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 41
- 206010054094 Tumour necrosis Diseases 0.000 title description 21
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 118
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 64
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims abstract description 60
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 49
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 30
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 claims abstract description 27
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims abstract description 21
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims abstract description 20
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 18
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 14
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 9
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims abstract description 9
- 241000702371 Enterobacteria phage f1 Species 0.000 claims abstract description 7
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 claims abstract description 7
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 127
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 72
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 72
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 63
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 26
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 12
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 12
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 claims description 12
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 12
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 12
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 7
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 claims description 7
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 7
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 claims description 7
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 claims description 7
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 21
- 238000011534 incubation Methods 0.000 abstract description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 238000007865 diluting Methods 0.000 abstract description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 abstract description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 68
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 60
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 38
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 38
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 35
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 25
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 22
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 21
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 19
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 19
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 19
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 19
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 17
- 230000008569 process Effects 0.000 description 17
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 17
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 15
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 11
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 11
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 11
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 11
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 11
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 10
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 10
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 9
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 9
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 9
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 8
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 8
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 8
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 7
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 7
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 7
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 7
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 5
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 5
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 5
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 5
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- XXXSILNSXNPGKG-ZHACJKMWSA-N Crotoxyphos Chemical compound COP(=O)(OC)O\C(C)=C\C(=O)OC(C)C1=CC=CC=C1 XXXSILNSXNPGKG-ZHACJKMWSA-N 0.000 description 4
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 4
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 4
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 4
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 4
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 4
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 4
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000005364 simax Substances 0.000 description 4
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 3
- NZVYCXVTEHPMHE-ZSUJOUNUSA-N thymalfasin Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O NZVYCXVTEHPMHE-ZSUJOUNUSA-N 0.000 description 3
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 2
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 230000007059 acute toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000403 acute toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 230000007665 chronic toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000160 chronic toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000011194 good manufacturing practice Methods 0.000 description 2
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 2
- 235000021184 main course Nutrition 0.000 description 2
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 2
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 2
- 231100001079 no serious adverse effect Toxicity 0.000 description 2
- 231100000957 no side effect Toxicity 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- -1 oligomers Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 2
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 2
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 description 1
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 description 1
- 208000006820 Arthralgia Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 101000987586 Homo sapiens Eosinophil peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 101000920686 Homo sapiens Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 101000959794 Homo sapiens Interferon alpha-2 Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O ammonium group Chemical group [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000001608 connective tissue cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010217 densitometric analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 210000001840 diploid cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 102000044890 human EPO Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012872 hydroxylapatite chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 230000007803 itching Effects 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 239000008297 liquid dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 239000012907 medicinal substance Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 235000011837 pasties Nutrition 0.000 description 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 208000011571 secondary malignant neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генной инженерии. Объектом изобретения является лекарственное средство, представляющее собой раствор для парентерального введения, содержащий регуляторы осмотического давления, буферную систему, поддерживающую рН 7,0-7,8, и высокоочищенный гибридный белок TNF-Thy с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1, причем гибридный белок TNF-Thy получен культивированием штамма-продуцента Escherichia coli, BL21(DE3)/pET32a-TNF-Thy, где после 3-5 часов культивирования проводят индукцию биосинтеза в клетках Escherichia coli BL21(DE3)/pET32a-TNF-Thy изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом и выдерживают 4-6 часов с получением биомассы клеток штамма-продуцента, продуцирующего белок TNF-Thy, выделение из полученной биомассы клеток штамма-продуцента белка TNF-Thy, последующую очистку выделенного гибридного белка TNF-Thy путем анионообменной и гель-проникающей хроматографии в денатурирующих условиях, ренатурацию гибридного белка TNF-Thy путем разбавления мочевинного раствора и очистку ренатурированного гибридного белка TNF-Thy анионообменной хроматографией с получением гибридного белка с чистотой не менее 97%, а штамм Escherichia coli BL 21(DE3)/pET32a-TNF-Thy - продуцент гибридного белка TNF-Thy - получен трансформацией родительского штамма Е. coli BL21(DE3) рекомбинантной плазмидой pET32a-TNF-Thy размером 5929 пар оснований (п.о.), обеспечивающей синтез белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1 размером 20,5кДа, и содержащей структурные элементы: промотор Т7 и оператор lacO, синтетическую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 2, кодирующую гибридный белок TNF-Thy, ген устойчивости к антибиотику ампициллину (AmpR) и бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину (AmpR промотор) для проведения отбора рекомбинантных клеток, ориджин репликации бактериофага f1 (f1 ori), ген лактозного репрессора LacI и бактериальный промотор гена лактозного репрессора (Laclpromoter) при следующем соотношении компонентов (масс.%): TNF-Thy с удельной активностью не менее 1,7×106 ЕД/мг и чистотой не менее 97% 0,0052-0,0064; регуляторы осмотического давления 1,8-2,9; буферная система, поддерживающая рН 7,0-7,8, 2,2-3,6; вода – остальное. Изобретение позволяет получить эффективное средство для парентерального введения, представляющее собой раствор, содержащий более чистый химически и биологически стабилизированный гибридный белок TNF-Thy, что повышает эффективность действия и уменьшает побочное действие гибридного белка за счет оптимально подобранного как состава компонентов, так и их количества, а также позволяет увеличить срок хранения лекарственного средства до 3-х лет при температуре от 2 до 8°С. 2 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 12 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генной инженерии, и касается нового штамма бактерий Escherichia coli BL 21/pET32a-TNF-Thy, который может быть использован для получения гибридного белка α -фактор некроза опухолей - тимозин альфа 1 (белок TNF-Thy), применяемого в медицинской промышленности для получения лекарственного препарата.
Терапевтически значимые белки, полученные на основе технологии рекомбинантных ДНК, в последние годы получили широкое распространение для лечения широкого круга заболеваний. К наиболее значимым и распространенным препаратам данного класса следует отнести препараты, созданные на основе рекомбинантных эритропоэтина, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и цитокинов человека. Общим для данного класса веществ является практическая невозможность и нецелесообразность выделения их из природных источников и, как следствие, получение их в искусственно созданных прокариотических (как правило, E.Coli) или эукариотических (обычно СНО) системах.
Поиск эффективных и безопасных препаратов для лечения заболеваний, характеризующихся высокой летальностью или приводящих к тяжелой инвалидизации пациентов, является одной из важнейших задач медицинской науки.
На сегодняшний день, в клинической практике, существует большое количество противоопухолевых препаратов, но эффективность большинства из них недостаточна и поэтому остается актуальным вопрос о разработке новых более активных препаратов, а также поиск веществ, эффективных при опухолях с первичной и приобретенной резистентностью к лекарственной терапии. В связи с этим решение о продвижении нового препарата с противоопухолевой активностью принимается на основании следующих критериев: механизм действия, высокая противоопухолевая активность, избирательная цитотоксичность в отношении определенных культур опухолевых клеток in vitro и ксенографтов опухолей человека, отсутствие перекрестной устойчивости с известными веществами.
Постоянно ведется поиск новых препаратов, которые могли бы повысить качество лечения пациентов с онкологической патологией.
В процессе приготовления лекарственных форм на основе белков данного класса необходимо решать проблемы связанные со стабильностью средства. Наиболее распространенным в настоящее время- подходом является введение в состав готового лекарственного средства в качестве стабилизатора сывороточного альбумина и/или сублимационная сушка. Однако, оба этих подхода не свободны от недостатков. Введение в качестве стабилизатора сывороточного альбумина человека повышает риск вирусных контаминаций препарата. Сублимационная сушка не только снижает активность препарата, но и вызывает частичную денатурацию, что в свою очередь иногда приводит к аллергическим реакциям у пациентов.
Другим подходом к решению проблемы стабильности рекомбинантных белков в готовых лекарственных формах является введение в композицию мочевины, комплекса амфотерных электролитов (аминокислот) и детергентов с последующей лиофильной сушкой, где удалось получить стабильную лекарственную форму рекомбинантного эритропоэтина человека. (RU, 2043118, C1, А61К 38/22, 1987) В то же время имеются существенные ограничения на срок хранения препарата после его растворения.
Известен лиофилизированный препарат с иммуномодулирующей и противовирусной активностью "Неоферон", включающий рекомбинантный интерферон альфа-2 человека, гибридный белок Т-ФНО-Т, стабилизирующую добавку, содержащую плазмозамещающий раствор полиглюкин, солевую буферную систему с рН 7,0-7,2 и воду апирогенную (RU, 2129878, C1, А61К 39/395, 1996). Препарат рекомендуется хранить при +4°С. Недостатком препарата является то, что стабилизирующий состав не обеспечивает длительное хранение препарата в жидком виде, а также необходимость хранения при достаточно низких температурах - не выше +4°С.
Также известны способы получения жидких лекарственных форм на основе рекомбинантных белков (RU, 2180233, C1, А61К 38/00, 2001).
Наиболее близким аналогом к заявляемому изобретению, в отношении плазмиды, является рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая синтез рекомбинантного гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α1 (RU, 2225443, С1, C12N 1/70, 25.07.2002). Рекомбинантная плазмидная ДНК pThy316 для экспрессии в клетках Escherichia coli гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α1, имеющая размер 3,77 т.п.н. и содержащая промоторы А2 и A3 фага Т7, обеспечивающие конститутивную экспрессию гена гибридного белка a-фактор некроза опухолей-тимозин-α1; расположенный после промотора A3 рибосомосвязывающий сайт; ген, кодирующий гибридный белок a-фактор некроза опухолей-тимозин-α1, заключенный между сайтами рестрикции XbaI и ClaI и включающий второй сайт рестрикции ClaI; следующую за геном гибридного белка и ограниченную двумя сайтами рестрикции XbaI терминаторную область; ген устойчивости к ампицилину; ген устойчивости к аминогликозидам (канамицину, неомицину и G-418), содержащий третий сайт рестрикции ClaI; а также уникальные сайты рестрикции: PstI в гене β-лактамазы; XhoI, HindIII и SmaI, находящиеся в гене аминогликозидфосфотрансферазы; Kpnl между промотором A3 и рибосомсвязывающим сайтом; EcoRI между промоторами A3 и А2.
Недостатком данного является применение в качестве основы для создания плазмидного вектора плазмиды pThy315. В качестве промотора в ней применяется тандем ранних промоторов А2 и A3 бактериофага Т7. Данный тандем является не эффективным для экспрессии рекомбинантных белков. Кроме того, с его помощью обеспечивается конститутивная экспрессия белка, что создает дополнительное метаболическое давление на клетки продуцента Escherichia coli. Это, в свою очередь, приводит к достижению ими более низких плотностей по сравнению с продуцентами с индуцибельными промоторами и снижает продуктивность. В итоге конечная продуктивность указанного способа получения гибридного белка TNF-Thy оказывается низкой, что делает эффективность производства на его основе довольно низкой, а трудоемкость - высокой.
Штамм на основе плазмид для продуцирования гибридного белка TNF-Thy из уровня техники не известен.
Из уровня техники известен способ получения гибридного белка TNF-Thy, который включает культивирование клеток трансформированного штамма Escherichia coli SG20050 введением плазмиды pThy315, кодирующей синтез указанного белка, в жидкой питательной среде с последующим выделением и очисткой белка (RU 2055896, C1, С12Р 21/00, 29.07.1992). При этом культивирование проводят при 36-38°С в среде, содержащей до 1,4% пептона или триптона, до 1,6% дрожжевого экстракта, до 1,15% NaCl и 50 мкг/мл ампициллина. При этом используют свежеполученные трансформанты или отобранные на начальной фазе экспоненциального роста и хранившиеся при температуре от минус 20 до минус 40°С в бульоне с 40% глицерина. После лизиса клеток осадок отмывают 1-3 М растворами мочевины и растворяют в 7 М растворе мочевины, полученный раствор наносят на анионообменный сорбент при рН 5,6-5,8 с элюцией тем же буфером с добавлением 150 мМ NaCl, после чего фракции с гибридным белком наносят на сорбент с иммобилизованным красителем (голубой), уравновешенный буфером с 7 М мочевины при рН 5,5-5,8 и элюируют белок буфером с градиентом рН 7,0-8,5 в присутствии 7 М мочевины и 1,0 М NaCl, с последующим диализом при рН 7,2-7,4 против раствора, содержащего 150 мМ NaCl и 10 мМ Na-фосфата.
Недостатком такого способа получения является использование при хроматографической очистке белка сорбента с иммобилизованным красителем (голубой). Этого типа сорбенты подвергаются в процессе использования частичной деградации, при этом краситель (голубой) отделяется от сорбента и самопроизвольно элюируется с колонки в виде связанного с белком комплекса. Такие примеси недопустимы для приготовления лекарственных препаратов.
Наиболее близким аналогом к заявляемому объекту изобретения, в отношении способа, является способ получения рекомбинантного гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α1, при котором культивирование штамма, трансформированого введением плазмиды pThy316, проводят при 37°С в среде, содержащей 1% пептона или триптона, 1% дрожжевого экстракта, 1% NaCl и 50 мкг/мл канамицина. (RU, 2225443, C1, C12N 1/70, 25.07.2002). После лизиса клеток лизат центрифугируют, осадок отмывают 1-2 М растворами мочевины и растворяют в 7 М растворе мочевины с 10 мМ Трис-HCl, полученный раствор наносят на анионообменный сорбент при рН 7,5 с элюцией тем же буфером в градиенте концентрации 0-1 М NaCl, после чего фракции с гибридным белком наносят на гидроксилапатит, уравновешенный 20 мМ натрий фосфатным буфером рН 6,8 с 7 М мочевины и элюируют белок градиентом концентрации 20-400 мМ натрий фосфатного буфера рН 6,8 с 7 М мочевиной. Полученный раствор наносят на сорбент Сефадекс G-50, уравновешенный 10 мМ натрий фосфатным буфером рН 7,2 с 150 мМ натрия хлористого, проводят хроматографию для удаления мочевины и ренатурации гибридного белка
Недостатком данного способа является отсутствие штамма-продуцента, а получение для ферментации трансформационной смеси, не позволяет проводить процесс в строго определенных условиях, что сказывается на качестве получаемого гибридного белка. Кроме того, проведение хроматогафии на колонке с гидроксилаппатитом не эфффективно, как и ренатурация в условиях хроматографии. Колоночная хроматография не позволяет получить высокий уровень ренатурации гибридного белка. Как показали проведенные исследования, способ описанный в ближайшем аналоге с учетом не отделения от олигомеров дает низкий выход ренатурированного гибридного белка за счет его агрегации (20-50%).
Аналогов в отношении лекарственного средства в виде раствора на основе гибридного белка α -фактора некроза опухолей-тимозин альфа 1 (TNF-Thy) из уровня техники не выявлено.
Задачей изобретения является разработка способа получения жидкого лекарственного средства на основе гибридного белка фактор некроза опухолей альфа-тимозин-альфа 1, обладающего высокой стабильной биологической активностью при хранении и не вызывающей побочных эффектов, в форме водного раствора для парентерального введения.
Также задачей настоящего изобретения является создание впервые штамма -продуцента гибридного белка TNF-Thy на основе сконструированной плазмиды, направляющей синтез гибридного белка TNF-Thy с целью повышения эффективности и снижения трудоемкости получения гибридного белка TNF-Thy, увеличении выхода и чистоты гибридного белка TNF-Thy, а так же получение более химически и биологически чистого и стабильного при хранении лекарственного средства в виде водного раствора для парентерального введения, имеющего хорошую переносимость, минимальный побочный эффект и обладающего высокой активностью при использовании в лечении различных заболеваний.
Поставленная задача достигается за счет создания рекомбинантной плазмиды pET32a-TNF-Thy - размером 5929 пар оснований (п.о.), обеспечивающей синтез белка имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1 размером 20,5кДа и содержащая структурные элементы: промотор Т7 и оператор lacO, синтетическую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 2, кодирующую гибридный белок TNF-Thy, ген устойчивости к антибиотику ампициллину (AmpR) и бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину (AmpR промотор) для проведения отбора рекомбинантных клеток, ори джин репликации бактериофага f1 (f1 ori), ген лактозного репрессора LacI и бактериальный промотор гена лактозного репрессора (Laclpromoter),
Так же заявляется штамм Escherichia coli BL 21/pET32a-TNF-Thy- продуцент гибридного белка TNF-Thy, полученного трансформацией рекомбинантной плазмидой pET32a-TNF-Thy.
Так же заявляется способ получения гибридного белка TNF-Thy, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1, включающий культивирование штамма-продуцента Escherichia coli BL21(DE3)/ pET32a-TNF-Thy, при этом после 3 -5 часов культивирования проводят индукцию биосинтеза рекомбинантного белка клетками Escherichia coli BL21 (DE3)/pET32a-TNF-Thy и выдерживают 4-6 часов, с получением биомассы клеток штамма-продуцента, продуцирующего гибридный белок TNF-Thy, выделение из полученной биомассы клеток штамма-продуцента гибридного белка TNF-Thy, последующую очистку выделенного гибридного белка TNF-Thy, путем анионо-обменной и гель-проникающей хроматографии в денатурирующих условиях, ренатурацию гибридного белка TNF-Thy путем разбавления мочевинного раствора и очистку ренатурированного гибридного белка TNF-Thy анионообменной хроматографией и с получением гибридного белка с чистотой не менее 97%
При этом культивирование клеток Escherichia coli BL21 (DE3)/ pET32a-TNF-Thy проводят в ростовой среде на протяжении по меньшей мере 7 часов, но не более 10 часов
А индукцию биосинтеза предпочтительно осуществлять изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом.
Выделение гибридного белка TNF-Thy можно осуществлять путем отделения клеток от культуральной жидкости, дезинтеграции клеток, выделения тел включений из полученного дезинтеграта и солюбилизацию тел включений.
Очистку гибридного белка TNF-Thy предпочтительно осуществлять с использованием анионообменной и гель-проникающей хроматографии при концентрации мочевины 7М-9М, рН 7,2-8,5
А разбавление мочевинного раствора предпочтительно осуществлять до концентрации мочевины не более 0,4 М
Еще одним объектом заявляемого изобретения является лекарственное средство, представляющее собой раствор для парентерального введения, содержащий регуляторы осмотического давления, буферную систему, поддерживающую рН 7,0-7,8, и высокоочищенный гибридный белок TNF-Thy с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1, причем гибридный белок TNF-Thy получен культивированием штамма-продуцента Escherichia coli, BL21(DE3)/ pET32a-TNF-Thy где после 3 -5 часов культивирования проводят индукцию биосинтеза в клетках Escherichia coli BL21(DE3)/ pET32a-TNF-Thy изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом и выдерживают 4-6 часов, с получением биомассы клеток штамма-продуцента, продуцирующего белок TNF-Thy, выделение из полученной биомассы клеток штамма-продуцента белка TNF-Thy, последующую очистку выделенного гибридного белка TNF-Thy, путем анионообменной и гель-проникающей хроматографии в денатурирующих условиях, ренатурацию гибридного белка TNF-Thy путем разбавления мочевинного раствора и очистку ренатурированного гибридного белка TNF-Thy анионообменной хроматографией с получением гибридного белка с чистотой не менее 97%, а штамм Escherichia coli BL 21(DE3)/pET32a-TNF-Thy- продуцент гибридного белка TNF-Thy, получен трансформацией родительского штамма Е. coli BL21(DE3) рекомбинантной плазмидой pET32a-TNF-Thy размером 5929 пар оснований (п.о.), обеспечивающей синтез белка имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1 размером 20,5кДа и содержащей структурные элементы: промотор Т7 и оператор lacO, синтетическую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 2, кодирующую гибридный белок TNF-Thy, ген устойчивости к антибиотику ампициллину (AmpR) и бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину (AmpR промотор) для проведения отбора рекомбинантных клеток, ориджин репликации бактериофага f1 (f1 ori), ген лактозного репрессора LacI и бактериальный промотор гена лактозного репрессора (Laclpromoter) при следующем соотношении компонентов (масс%):
| TNF-Thy с удельной активностью не менее | |
| 1,7х 106 ЕД/мг и чистотой не менее 97% | 0,0052-0,0064 |
| Регуляторы осмотического давления | 1,8-2,9 |
| Буферная система, поддерживающая рН 7,0-7,8 | 2,2-3,6 |
| Вода | остальное |
При этом в качестве регуляторов осмотического давления содержит маннит и натрий хлористый. А в качестве буферной системы поддерживающей рН 7,0 -7,8, содержит фосфатный буфер, состоящий из натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного и натрия фосфорнокислого однозамещенного 2-водного.
Таким образом, заявленная группа изобретений объединена единым изобретательским замыслом, направленным на создание впервые жидкого лекарственного средства, которое получено с использованием рекомбинантной плазмиды рЕТ32а- TNF-Thy, обеспечивающей синтез гибридного белка α -фактора некроза опухолей -тимозин альфа1 впервые созданным штаммом бактерий Escherichia coli BL21 (DE3)/ pET32a-TNF-Thy продуцентом гибридного белка, а так же способом получения гибридного белка TNF-Thy.
Способ получения белка TNF-Thy из впервые созданного штамма позволяет получить высокоочищенный белок, не оказывающий побочных эффектов, т.к. он свободен от примесей, присущих белку, полученному другими способами.
Более конкретно, заявляемое изобретение относится к составу, впервые содержащему белок TNF-Thy в жидком виде имеющий повышенную стабильность в растворах и высокую чистоту А также этот состав является эффективным с точки зрения простоты изготовления и максимальной концентрации, достижимой на единицу объема дозировки. Согласно этому изобретению рекомбинантный белок TNF-Thy, получен из впервые созданного штамма-продуцента Escherichia coli BL 21(DE3)/pET32a- TNF-Thy, в который встроена плазмида рЕТ32а- TNF-Thy, несущая рекомбинантный ген гибридного белка α -фактора некроза опухолей -тимозин альфа1. Белок TNF-Thy обладает чистотой не менее 97% и удельной биологической активностью не менее 1,7 х 106 ЕД на 1 мг белка.
Настоящее изобретение относится к гибридному белку TNF-Thy, имеющему аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1, содержащему α-фактор некроза опухолей и тимозин-α1. Рекомбинантный гибридный белок TNF-Thy, полученный из штамма Escherichia coli BL21 (DE3)/рЕТ32а-TNF-Thy, обладает следующими параметрами:
- Молекулярная масса мономера составляет 20,5±0,2кДа.
- Примеси белковой природы, олигомеры, агрегаты и мономеры - не более 3%;
- Содержание клеточной и векторной ДНК не более 100 пкг/106 ЕД
- Молекулярно- массовое распределение не менее 97% тримера (61±2)кДа
- Бактериальные эндотоксины не более 0,5 ЕЭ на 104 ЕД активности
- Удельная активность не менее 1,7×106 ЕД/ мг белка
Заявляемый штамм имеет преимущество в том, что впервые получен путем трансформации клеток штамма Escherichia coli BL 21(DE3) рекомбинантной плазмидной ДНК pET32a-TNF-Thy согласно настоящему изобретению. Необходимо отметить, что штамм - продуцент был получен впервые только за счет оригинального конструирования уникальной плазмиды pET32a-TNF-Thy, что обеспечивает эффективную экспрессию гена, позволяющую нарабатывать значительное количество биомассы, содержащей гибридный белок TNF-Thy.
Штамм Escherichia coli 21(DE3)/pET32a- TNF-Thy задепонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером В-10277.
Настоящее изобретение относится к гибридному белку TNF-Thy, имеющему аминокислотную последовательность SEQ ID NO1:
Ниже представлена нуклеотидная последовательность синтетического фрагмента, кодирующая гибридный белок TNF-Thy SEQ ID NO2
Изобретение иллюстрируется следующими графическими фигурами:
На Фиг. 1 изображена Карта плазмиды, содержащая:
fl ori - ориджин репликации бактериофага f1,
AmpR - ген резистентности к ампициллину (ген β-лактамазы),
ori- ориджин репликации colE1,
Т7 promoter - промотор бактериофага Т7,
TNF-Thy - ген гибридного белка TNF-Thy,
Т7 terminator - терминатор бактериофага Т7,
LacI - ген лактозного репрессора LacI.
На Фиг. 2 представлена фотография электрофоретического разделения тотального клеточного лизата:
1 - до начала индукции
2 - в момент индукции
3 - 2 часа после индукции
4 - 4 часа после индукции
5 - 5 часов после индукции
6 - стандарты молекулярных масс, Pierce Unstained Protein MW Marker, Thermo, cat # 26610
На Фиг 3. представлена хроматограмма гибридного белка α-фактор некроза опухолей - тимозин-α1, полученного по способу, описанному в ближайшем аналоге (RU 2225443).
На Фиг. 4 представлена хроматограмма заявляемого гибридного белка α-фактор некроза опухолей - тимозин-α1 (TNF-Thy), полученного из штамма Escherichia coli BL21 (DE3)/pET32a-TNF-Thy.
При этом представленные на Фиг. 3, Фиг. 4 результаты, получены методом высокоэффективной эксклюзионной хроматографии. Метод используется для определения качества белка по показателю «Чистота. Родственные соединения и посторонние примеси».
В заявляемом техническом решении поставленная задача решается посредством создания рекомбинантной плазмиды pET32a-TNF-Thy для экспрессии указанного гибридного белка, впервые полученным высокопродуктивным бактериальным штаммом-продуцентом Escherichia coli BL21(DE3)/pET32a-TNF-Thy, а также способа получения гибридного белка TNF-Thy, позволяющего получать гибридный белок TNF-Thy с высоким выходом и высокой степенью чистоты. Это позволяет использовать гибридный белок α-фактор некроза опухолей - тимозин-α1 в лекарственном средстве, обладающем длительным сроком хранения с сохранением биологической активности при отсутствии побочного действия на организм человека.
Предложенный впервые штамм и способ очистки имеют ряд существенных преимуществ по сравнению с известными из уровня техники, в т.ч. ранее указанными источниками.
Т.к. гибридный белок используется при производстве лекарственных средств, необходимо учитывать, что для обеспечения постоянства свойств лекарственного препарата, содержащего допустимые примеси в определенном диапазоне, должен соблюдаться целый ряд требований при ферментации, экспрессии белка и очистке.
Получение для ферментации трансформационной смеси, как в ближайшем аналоге, а не штамма, не позволяет проводить процесс в строго определенных условиях, описанных в стандартных операционных процедурах, что сказывается на качестве получаемого гибридного белка, соответственно это сказывается и на лекарственном препарате. Создание впервые штамма-продуцента Escherichia coli BL21(DE3)/pET32a-TNF-Thy позволяет получить эталонную культуру, заложить на хранение рабочую культуру клеток штамма и проводить процесс ферментации при стандартизованных условиях. В настоящее время это является одним из требований надлежащей производственной практики (GMP). В заявляемом изобретении выход биомассы с 1 л культуральной жидкости составляет от 50 до 80 г. А в вышеуказанном патенте получают биомассу 8 г/л. Соответственно, эффективность ферментации увеличилась в 6-10 раз.
Необходимо отметить, что проведение хроматогафии на колонне с сорбентом SepraPrep™Q более эффективно по сравнению с ДЕАЕ-целлюлозой, т.к. позволяет значительно сократить время проведения стадии.
Так же впервые заявлен способ хроматографии на Сефадексе G-100 в денатурирующих условиях. Растворенные и даже очищенные от посторонних примесей тельца включений дают гибридный белок TNF-Thy в различных олигомерных формах. Описанная в ближайшем аналоге хроматография на гидроксилапатите не позволяет разделить эти формы и не является способом, значительно увеличивающим чистоту гибридного белка. Заявляемый способ с использованием хроматографии в мочевине на Сефадексе G-100 позволил разделить олигомеры TNF-Thy и тримерную активную форму гибридного белка. Кроме того, во время проведения этой стадии происходит очистка от посторонних высокомолекулярных примесей. Выход активной тримерной формы составляет 25-30% от всего белка. Чистота на данном этапе составляет 90%, что позволяет проводить эффективно следующую важную стадию процесса - получение правильно свернутого гибридного белка TNF-Thy
Последующая хроматография описанная в ближайшем аналоге проводится на колонке Сефадексе G-50, уравновешенном 10 мМ натрий фосфатным буфером рН 7,2 с 150 мМ натрия хлористого, выполняется для удаления мочевины и ренатурации гибридного белка. При этом колоночная хроматография не позволяет получить высокий уровень ренатурации гибридного белка. Как показали проведенные исследования, способ, описанный в ближайшем аналоге с учетом не отделения от олигомеров дает низкий выход ренатурированного гибридного белка за счет его агрегации (20-50%). Заявляется более точный и упрощенный способ ренатурации гибридного белка, путем разбавления мочевинного раствора, без использования дорогих сорбентов, при сокращении времени процесса, что позволяет увеличить выход правильно свернутого гибридного белка до 90-100%, при этом чистота гибридного белка составляет 97%.
Таким образом, заявляется рекомбинантный гибридный белок TNF-Thy с чистотой не менее 97%.
Также заявленный гибридный белок TNF-Thy соответствует параметрам представленным выше и стабилен при рН от 7 до 8,5, при этом удельная активность составляет не менее 1,7 х 106 ЕД на 1 мг белка.
Впервые лекарственное средство на основе α-фактора некроза опухолей - тимозин-al полученно по данному изобретению в жидкой форме. Данное лекарственное средство нетоксично и апирогенно при испытаниях на острую и хроническую токсичность и пирогенность у мышей и кроликов, обладает контролируемой активностью при испытаниях на культурах клеток. Не оказывает побочных эффектов. Как показали проведенные исследования, это обусловлено отсутствием примесей белковой природы и эндотоксинов.
На Фиг. 3 показаны результаты анализа гибридного белка α-фактор некроза опухолей - тимозин-α1, полученного по ближайшему аналогу. Из представленной хроматограммы следует, что в растворе гибридного белка TNF-Thy присутствуют примеси белковой природы, количество которых составляет 6,6%. Таким образом, чистота целевого белка составляет 93,4%.
Результаты анализа гибридного белка α-фактор некроза опухолей - тимозин-α1, полученного из заявленного штамма Escherichia coli BL21(DE3)/pET32a-TNF-Thy показаны на Фиг. 4. Как видно из хроматограммы, примеси в данном образце практически отсутствуют и чистота составляет 100%.
Известно, что любое лекарственное вещество не поступает в организм в чистом виде. Поэтому основным требованием к лекарственным средствам так же является их химическая и биологическая чистота. Присутствие даже в незначительном количестве органических и/или неорганических примесей может вызвать нежелательные побочные действия у пациентов.
При создании лекарственного средства важным является не только чистота белка для снижения побочного действия, но и сохранение рекомбинантного гибридного белка α-фактор некроза опухолей - тимозин-α1 в активной форме в течение продолжительного периода времени.
Основной проблемой, связанной с любыми белковыми композициями, является преодоление физической неустойчивости белков. Физическая неустойчивость не вызывает изменений ковалентных связей в белках. Физическая неустойчивость скорее предполагает изменение структуры белков более высокого порядка, например, вторичной структуры. Такие изменения включают денатурацию, адсорбцию на поверхностях, агрегацию и осаждение.
В качестве буфера использовали буферные растворы, включающие фосфаты. Использование буферных растворов для создания определенного рН, как правило, имеющего существенное значение для стабилизации растворов, хорошо известно в фармации. Однако, применение их ограничено, так как многие из них реагируют с лекарственными веществами. Настоящим изобретением было обнаружено, что создание оптимальное значения рН раствора с помощью именно фосфатов значительно улучшает стабильность препаратов интерферона и не снижает активности препарата. Осуществление изобретения определяло, что буферный раствор следует применять в диапазоне рН между 7,0 и 7,8, предпочтительно 7,4
В качестве агентов - регуляторов осмотического давления, предпочтительно использовать хлорид натрия и маннит, в количестве, достаточном для получения изотонического раствора.
Необходимо отметить, что за счет получения высокоочищенного белка TNF-Thy и за счет экспериментально подобранных компонентов: маннита, натрия хлористого, натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного и натрия фосфорнокислого однозамещенного 2-водного, заявленное лекарственное средство не обладает побочным действием и является изотоничным, физиологичным. Данный факт подтверждается проведенными исследованиями, ни у одного из испытуемых не возникло никакого побочного действия (зуда, жжения, воспаления в месте инъекции, аллергических реакций и т.п.), что подтверждается ниже приведенными примерами.
Техническим результатом заявленного изобретения является создание впервые жидкого лекарственного средства для парентерального введения, представляющего собой раствор, содержащий более чистый химически и биологически стабилизированный гибридный белок TNF-Thy, что позволило повысить эффективность действия и уменьшить побочное действие гибридного белкае, за счет оптимально подобранного как состава компонентов, так и их количества, а так же позволило увеличить срок хранения лекарственного средства до 2-х лет при температуре от 2 до 8°С. Кроме этого, получают более дешевый и безопасное лекарственное средство, не содержащее токсичных компонентов.
Так же техническим результатом заявленного изобретения является повышение эффективности получения гибридного белка TNF-Thy, а именно, увеличение выхода белка из биомассы штамма с чистотой конечного продукта не менее 97%, за счет создания рекомбинантного штамма Escherichia coli - продуцента гибридного белка α-фактор некроза опухолей - тимозин-α1, полученного на основе сконструированной рекомбинантной плазмиды, что обеспечивает повышенный выход TNF-Thy, за счет увеличения количества получаемой в ходе культивирования биомассы в 6-10 раз, при сохранении содержания общего белка и доли гибридного белка TNF-Thy в общем белке клетки.
Указанный технический результат достигается за счет создания впервые штамма на основе сконструированной рекомбинантной плазмиды pET32a-TNF-Thy и способом получения белка с использованием такого штамма.
Так же указанный технический результат достигается созданием лекарственного средства на основе высокоочищенного гибридного белка TNF-Thy в жидком виде, при этом, гибридный белок TNF-Thy, полученный по данному изобретению практически не имеет в составе эндотоксинов, ковалентных олигомеров, мономеров и агрегатов, но и по заявленной совокупности объектов изобретения в процессе производства удалось не только получить гибридный белок TNF-Thy биологически и химически чистым, но и стабилизировать его, за счет оптимально подобранных компонентов.
Результаты исследования стабильности лекарственного средства полученного по Примеру №8 представлены в Таблице 1.
При реализации данного способа приготовления получают препарат, который обеспечивает его хранение при температуре от 2 до 8°С не менее 2 лет в герметичной упаковке.
Полученной лекарственное средство нетоксично и апирогенено при испытаниях на острую и хроническую токсичность и пирогенность у мышей и кроликов, обладает контролируемой антивирусной активностью при испытаниях на культурах клеток человека, что подтверждается представленой хроматограммой заявленного гибридного белка Кроме этого, заявленное лекарственное средство не оказывает побочных эффектов.
Технический результат так же достигается за счет создания рекомбинантной плазмиды pET32a-TNF-Thy для экспрессии гибридного белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1, имеющей длину 5929 пар оснований и состоящей из следующих ключевых генетических элементов:
- промотора Т7 и оператора lacO;
- синтетической нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO 2, кодирующую гибридный белок TNF-Thy;
- гена устойчивости к антибиотику ампициллину (AmpR) и бактериального промотора гена устойчивости к ампициллину (AmpRpromoter);
- гена лактозного репрессора LacI и бактериального промотора гена лактозного репрессора (Laclpromoter);
- ориджина репликации бактериофага f1 (f1 ori).
В качестве вектора экспрессии выбрана плазмида рЕТ32а. Для получения плазмиды по изобретению последовательность SEQ ID NO 2, полученную полным нуклеотидным синтезом, встраивают в плазмидный вектор рЕТ-32а по сайтам рестрикции XhoI и NdeI.
Указанная плазмида, далее обозначаемая как pET32a-TNF-Thy, состоит из следующих ключевых генетических элементов, расположенных в соответствии с Фиг. 1:
- гена устойчивости к антибиотику ампициллину (AmpR) и бактериального промотора гена устойчивости к ампициллину (AmpRpromoter);
- ориджина репликации бактериофага f1 (f1 ori);
- промотора Т7 и оператора lacO;
- гена лактозного репрессора LacI и бактериального промотора гена лактозного репрессора (Laclpromoter);
- синтетической нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO 2, кодирующей гибридный белок Tnf-Thy (SEQ ID NO 1), включающий в себя α-фактор некроза опухолей и тимозин-α1.
Структура указанной плазмидной ДНК (плазмиды), состоящей из указанных ключевых генетических элементов, представлена на Фиг. 1.
В вышеуказанной плазмиде ген AmpR предназначен для селекции стабильных клеток Escherichia coli. Бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину (AmpRpromoter) предназначен для его экспрессии.
Ориджин репликации бактериофага ƒ1 /AnalysisofGenesandGenomes, JohnWiley&Sons, 2004, S. 140/ широко используется для создания экспрессионных векторов.
Продуктом трансляции синтетической последовательности SEQ ID NO 2 является полипептид последовательности SEQ ID NO 1, включающий α-фактор некроза опухолей и тимозин-α1.
Также указанный технический результат достигается созданием штамма на основе сконструированной рекомбинантной плазмиды pET32a-TNF-Thy и способом получения белка с использованием такого штамма.
После клонирования синтезированной последовательности в составе вектора, полученной рекомбинантной плазмидой была проведена трансформация бактериальных клеток Escherichia coli BL 21(DE3).
Исходным материалом для создания штамма-продуцента по изобретению является известный из уровня техники штамм Е. coli BL21 (DE3) Генотип Е. colistx. В F- /HaeyoungJeong, ValérieBarbe, ChoongHoonLee, DavidVallenet, DongSuYu, Sang-HaengChoi, ArnaudCouloux, Seung-WonLee, SungHoYoon, LaurenceCattolico, Cheol-GooHur, Hong-SeogPark, BéatriceSegurens, SunChangKim, TaeKwangOh, RichardE. Lenski, F. WilliamStudier, PatrickDaegelen, JihyunF. Kim, Genome Sequences of Escherichia coli BstrainsREL606 and BL21(DE3), Journal of Molecular Biology, Volume 394, Issue 4, 2009, 644-652/.
Для лучшего понимания сущности заявленной группы изобретений ниже приведены примеры осуществления.
Пример 1. Конструирование экспрессионной плазмиды
Химический синтез олигонуклеотидов выполняют твердофазным фосфоамидитным методом на ДНК-синтезаторе ASM-102U (БИОССЕТ, Новосибирск) с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3'-конца к 5'-концу с помощью защищенных фосфамидитов - 5'-диметокситритил-N-ацил-2'-дезоксинуклеозид-3'-O-(β-цианэтил-диизопропиламино)-фосфитов, активированных тетразолом. Синтез проводят в масштабе 0,5-0,7 мкмоль, используя в качестве носителя пористое стекло (размер пор 500 Å), к которому через 3'-сукцинатную связь присоединяют первое нуклеозидное звено (нагрузка 20-30 мкмоль/г). Используют синтетический цикл стандартного фосфоамидитного метода. Для приготовления вектора ДНК плазмиды рЕТ32а (3 мкг, 1 пмоль) обрабатывают в 40 мкл буфера 20 мМ Трис-ацетата, 10 мМ ацетата магния, 50 мМ ацетатат калия, 100 мкг/мл БСА рестриктазой XhoI (10 ед. акт), а затем - в 40 мкл буфера 100 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgCl2, 100 мкг/мл БСА рестриктазой NdeI (10 ед.акт.) в течение 1 ч при 37°С. Векторный фрагмент после электрофореза в 15% агарозном геле вырезают из геля и переносят в 200 мкл буфера NT, растворяют при 50°С в течении 5-10 мин и наносят на колонку NucleoSpin ExtractII. Промывают буфером NT 3 и элюируют 50 мкл буфера NE.
Олигонуклеотидную последовательность SEQIDNO 2, кодирующую гибридный белок SEQ ID NO 1, получают полным нуклеотидным синтезом. Полученную синтетическую последовательность SEQ ID NO 2 обрабатывают в 40 мкл буфера 20 мМ Трис-ацетата, 10 мМ ацетата магния, 50 мМ ацетатат калия, 100 мкг/мл БСА рестриктазой XhoI (10 ед. акт.), а затем - в 40 мкл буфера 100мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgCl2, 100 мкг/мл БСА рестриктазой NdeI (10 ед.акт.) в течение 1 ч при 37°С. Синтетический фрагмент после электрофореза в 15% агарозном геле вырезают из геля и переносят в 200 мкл буфера NT, растворяют при 50°С в течении 5-10 мин и наносят на колонку NucleoSpinExtractII. Промывают буфером NT 3 и элюируют 50 мкл буфера NE.
Описанный выше полученный синтетический фрагмент в количестве 2 пмоль прибавляют к раствору 1 мкг, полученного из ДНК плазмиды рЕТ32а, описанного выше векторного фрагмента в 10 мкл буфера (20 мМ Трис-HCl, рН 7,56, 10 мМ MgCl2, 0,2 мМ rATP, 10 мМ дитиотреитол) и лигируют с помощью 10 ед.акт. Т4-ДНК-лигазы в течение 12 ч при 10°С.
Помещают на лед пробирки с компетентными клетками (XL1-Blue, Евроген) до полного размораживания содержимого из расчета одна пробирка на трансформацию. Аккуратно перемешивают суспензию клеток легким встряхиванием. Добавляют в каждую пробирку полученную после обработки Т4-ДНК-лигазой алкивоту реакционной смеси, аккуратно перемешивают содержимое легким встряхиванием. Инкубируют пробирки во льду в течение 20-30 мин. Переносят пробирки в водяную баню (плюс 42°С) на 30-45 сек. Быстро переносят пробирки из водяной бани в лед и инкубируют в течение 3-5 мин. Добавляют не менее 3-х объемов предварительно ме и инкубируют при 37°С в течение 40-60 мин в орбитальном шейкере-инкубаторе (Multitron, Infors) при скорости 225-250 об/мин. Высеивают содержимое пробирок на чашки Петри диаметром 60 мм.
Аликвоту полученной плазмидной ДНК используют для трансформации компетентных клеток E.coli BL21 (DE3). Трансформанты высевают на чашки с агаризованной средой LB, в которую добавляют ампициллин до конечной концентрации ампициллина 50 мкг/мл. Из клонов выделяют ДНК плазмиды pET32a-TNF-Thy. Скрининг рекомбинантов проводят с помощью секвенирования.
Пример 2. Получение штамма-продуцента E.coli BL21 (DE3)/ pET32a-TNF-Thy и характеристика его продуктивности
Штамм-продуцент E.coliBL21 (DE3)/pET32a-TNF-Thy получают трансформацией компетентных клеток E.coli BL21 (DE3) плазмидой, получение которой описано в Примере 1.
Предпочтительно (без ограничения), для введения указанной плазмиды в клетки штамма Е. coli BL21 (DE3) используют метод электропорации, известный из уровня техники /Татага Kleber-Janke, Wolf-Meinhard Becker, Use of Modified BL21(DE3) Escherichia coli Cells for High-Level Expression of Recombinant Peanut Allergens Affectedby Poor Codon Usage, Protein Expression and Purification, Volume 19, Issue 3,2000, 419-424/ и включенный в настоящее описание посредством ссылки.
Штамм-продуцент E.coli BL21 (DE3)/pET32a-TNF-Thy культивируют при 37°С в 100 мл жидкой питательной среды LB с добавкой ампициллина до конечной концентрации ампициллина 100 мкг/мл в течение 3 ч в колбах Ерленмейера (1 л, Corning) в орбитальном шейкере-инкубаторе со скоростью вращения 220 об/мин до достижения оптической плотности культуральной жидкости при длине волны 600 нм 0,7-0,8 ед. Затем осуществляют индукцию биосинтеза рекомбинантного белка прибавлением изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида до конечной концентрации изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида 0,5 мМ и инкубируют в течение 4 ч. Каждый час отбирают пробу по 2 мл, количество культуры, соответствующее 1 мл, центрифугируют в течение 10 мин при 6000 об/мин. Осажденные клетки переносят в 100 мкл лизирующего буфера с красителем бромфеноловым синим, с добавлением 2-меркаптоэтонола, инкубируют 5 мин при 98°С, аликвоты по 3 мкл используют для электрофореза в 14% SDS-ПААГ. Гель окрашивают добавлением 0,1% раствора Кумасси R-250 и сканируют с помощью денситометра Shimadzu CS-930. Результаты представлены на Фиг. 2.: 5 - клеточный лизат, 6 - стандарты молекулярных масс. Выход гибридного белка TNF-Thy по результатам денситометрического анализа составляет не менее 20% относительно суммарного белка клетки.
Предлагаемый штамм-продуцент Escherichia coli BL21(DE3)/pET32a-TNF-Thy характеризуется следующими признаками:
а) Морфологические признаки. Клетки палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.
б) Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаризованной среде «LB» (на 1 литр 10 г пептон, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl, 20 г агара) - колонии сероватые, слабовыпуклые, влажные, блестящие, пастообразной консистенции.
в) Физико-биологические признаки. Клетки растут при температуре от 4°С до 40°С при оптимальном значении рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения, включающие пептон, триптон, дрожжевой экстракт, аминокислоты и т.д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.
г) Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к пенициллиновым антибиотикам (до 500 мкг/мл).
Пример 3. Способ получения гибридного белка TNF-Thy
Культивирование штамма- продуцента
Используют ферментер объемом 20 л при условиях по Примеру 2. После окончания культивирования клетки продуцента рекомбинантного белка (биомассу) отделяют центрифугированием (5000 g, 20 мин, 4°С).
100 г биомассы суспендируют в 10 л 0,05 М фосфатного буфера рН 7,2 с 0,15 М натрия хлористого и охлаждают до плюс 8°С. Суспензию клеток пропускают два раза через фильеру дезинтегратора Ranie под давлением 300 и 600 bar. Суспензию разрушенных клеток центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при температуре от плюс 4 до 8°С.
К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА, 0,15М NaCl, 1% тритон Х-100, рН 7,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при температуре от плюс 4 до 8°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30. К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА, 0, 15М NaCl, 0,5% тритон Х-100, рН 8,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при 8°С. Затем суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при температуре от плюс 4 до 8°С.
К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА, 1М мочевина, рН 6,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.
К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 5 мМ ЭДТА, 2 М мочевина, рН 6,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.
Осадки растворяют добавлением буфера 20 мМ Трис, 5 мМ ЭДТА, 7 М мочевина, рН 7,0 и инкубируют 18 ч при (6±2)°С. Полученный раствор белка осветляют центрифугированием в роторе JA-14 при 13000 об/мин в течение 60 мин при плюс (6±2)°С. Далее проводят очистку на колонке объемом 2 л, упакованной сорбентом SepraPrep Q и уравновешенной буфером 20 мМ Трис⋅НCl, 7 М мочевина, рН 6,8. После нанесения белка колонку промывают тем же буфером и пропускают 4 л буфера 20 мМ Трис⋅HCl, 20 мМ NaCl, 7 М мочевина, рН 6,8, затем 20 мМ Трис⋅HCl, 50 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8 и 20 мМ Трис⋅HCl, 200 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8. Во фракции, полученной после элюции буфером 20 мМ Трис⋅HCl, 200 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8 увеличивают концентрацию мочевины с 7 М до 9 М выдерживают при плюс 16°С в течение 18 ч. Далее проводят процесс концентрирования раствора белка TNF-Thy на «полых волокнах» в аппарате АР-1-15ПС, уменьшая объем до 0,5 л концентрата белка.
Хроматографическая очистка белка TNF-Thy на Sephadex G-100
Наносят в колонну ПСК 200/1000 с 28,3 л Sephadex G-100 500 мл концентрата белка TNF-Thy и проводят элюцию с помощью буфера для гель-фильтрации 20 мМ Трис⋅HCl, 150 мМ NaCl, 9 М мочевина, рН 7,2 со скоростью 3,0 мл/мин. В собранных фракциях определяют спектрофотометрически А280, А260. Наличие TNF-Thy подтверждают с помощью электрофореза в 17,5% ПААГ с додецилсульфатом натрия (ДСН). Фракции, содержащие по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН более 90% TNF-Thy, объединяют. В объединенной фракции высокоочищенного препарата TNF-Thy определяют спектрофотометрически: А280, А254, белок. Чистоту препарата TNF-Thy определяют по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН, а также по данным ВЭЖХ в колонке с силикагелем C18.
Объединенную фракцию, содержащую TNF-Thy с чистотой больше 90%, передают на стадию ренатурации.
Ренатурация белка TNF-Thy
Для проведения ренатурации используют стеклянный реактор фирмы Simax с перемешивающим устройством и системой охлаждения. В очищенный реактор загружают 50 л фосфатного буфера с хлористым натрием с рН 7,3 и охлаждают до плюс (12±1) С. Через фильтр с порами 0,22 мкм внутрь реактора с охлажденным буфером подают со скоростью (50±5) мл/мин 2 л раствора очищенного белка TNF-Thy. После внесения всего раствора белка проводят инкубацию при работающей мешалке. В процессе ренатурации с помощью системы охлаждения поддерживают температуру раствора (12±1)°С. Длительность процесса (18±1) часов.
Хроматографическая очистка ренатурированного гибридного белка TNF-Thy на сорбенте DEAE Sepharose Fast Flow
Используют колонку с DEAESepharose FastFlow объемом 2 л. Уравновешивают 20 мМ фосфатным буфером, рН 7,3. Затем наносят раствор ренатурированного гибридного белка, в фосфатном буфере и промывают уравновешивающим буфером.
Через колонну с сорбентом последовательно пропускают 20 мМ фосфатный буфер, 80 мМ NaCl, рН 7,3 и 20 мМ фосфатный буфер, 300 мМ NaCl, рН 7,3. Все элюируемые белки собирают фракциями объемом по 0,4 л и анализируют с помощью электрофореза в 17,5% ПААГ-ДСН. Фракции, содержащие по данным электрофореза в 17,5%) ПААГ с ДСН не менее 95% TNF-Thy, объединяют. После объединения раствор TNF-Thy передают на стерилизующую фильтрации и контролируют параметры. Также отбирают пробу на определение биологической активности. Полученный раствор TNF-Thy хранят при минус (20±2)°С.
Определение активности
Для исследования противоопухолевой активности белка использовали штамм диплоидных клеток подкожной соединительной ткани мыши (NCTCclone 929 [Lcell, L-929, derivative of StrainL], ATCC® CCL-1™). Ампулу с клетками переносят из жидкого азота в водяную баню с температурой (40±0,1)°С. Клетки после оттаивания асептически переносят в пластиковый матрац, вместимостью 500 мл и в него с интервалом 1,5-2 мин добавляют ростовую среду (среда ДМЕМ - 90%, эмбриональная телячья сыворотка жидкая - 10%) в количестве 0,25; 0,25; 0,5; 0,5; 0,75; 1,0; 1,0; 2,0; 2,0; 10,0 мл. После подсчета количества клеток концентрацию клеток в суспензии доводят до посевной путем добавления ростовой среды с добавлением антибиотиков (канамицина 100 ЕД/мл, гентамицина 80-160 ЕД/мл). Клетки формируют монослой с типичной морфологией на 4-е сутки.
Для определения активности препарата контролируют количество пассажей культуры клеток, которых должно быть не более 30 пассажей.
Монослой клеток, полученный в матраце вместимостью 500 мл снимают со стекла 0,125% раствором трипсина и суспендируют в 40 мл ростовой среды и подсчитывают количество клеток в камере Горяева. Взвесь разводят ростовой средой из расчета, чтобы в 1,0 мл содержалось 200 тыс. клеток. В лунки микропланшетов вносят по 0,1 мл суспензии клеток. Приготовленный планшет инкубируют в течение 48-72 часов при температуре (37±1,0)°С и концентрации CO2 (5,0±0,5) %.
Для определения активности готовят сначала десятикратные разведения: 1:10, 1:100, 1:1000 и 1:10000, а затем последовательные двукратные разведения: 1:20000, 1:40000, 1:80000, 1:160000, 1:320000, 1:640000, 1:1280000, 1:2560000 исследуемого образца в ростовой среде. Из планшета с монослоем клеток удаляют среду в стакан для отходов и вносят в лунки по 100 мкл последовательных разведений образца и по 100 мкл поддерживающей среды с актиномицином Д в концентрации 2 мкг/мл. На каждое разведение используют не менее 4 лунок с культурой клеток. 4 лунки с культурой оставляют в качестве контрольных. В контрольные лунки дополнительно вносят по 100 мкл поддерживающей среды с актиномицином Д. Приготовленный планшет инкубируют в течение 48 часов при температуре (37±1,0)°С и концентрации CO2 (5,0±0,5) %.
Предварительную оценку состояния монослоя проводят через 24 часа. Дальнейший учет активности TNF-Thy проводят, если нет признаков дегенерации в контрольной культуре. Окончательный учет проводят через 48 часов. Для этого монослой отмывают от погибших клеток стерильным физиологическим раствором. Для этого из лунок сначала удаляют ростовую среду, вносят по 200 мкл физраствора, который также удаляют. Повторяют 2-3 раза. Затем содержимое лунок окрашивают 0,2% раствором кристаллического фиолетового. Для этого, после удаления ростовой среды, в лунки вносят по 100 мкл спирта этилового 96% и выдерживают в течение 10 минут. Спирт удаляют и промывают лунки водой очищенной, внося по 100 мкл в лунку и удаляя ее стряхиванием. Процедуру промывки повторяют три раза. Затем планшеты высушивают на воздухе в течение 30 минут. Затем в каждую лунку вносят по 200 мкл 0,2% раствора кристаллического фиолетового и выдерживают планшет в течение 20 минут при энергичном покачивании. Краситель удаляют стряхиванием и промывают планшеты водой очищенной. Для удаления связавшегося красителя в лунки вносят по 100 мкл кислоты уксусной 10%, которую затем удаляют стряхиванием. Учет результатов проводят визуально (с помощью инвертированного микроскопа) или автоматически, на планшетном спектрофотометре, при длине волны 540 нм.
За активность испытуемого образца принимают величину, обратную разведению, при котором имеет место 50±5% гибель клеток.
Расчет специфической активности проводят по формуле
где Р - разведение образца, при котором наблюдается 50% повреждение монослоя (снижение оптической плотности на 50% контрольной).
Расчет удельной активности:
где А - специфическая активность образца препарата, ЕД;
В - количество белка в образце препарата, мг
Получают гибридный белок с чистотой 97, 5% и удельной биологической активностью 1,9 х 106 ЕД на 1 мг белка.
Пример 4. Способ получения гибридного белка TNF-Thy
Культивирование штамма- продуцента
Используют ферментер объемом 20 л при условиях по Примеру 2, но после индукции биосинтеза рекомбинантного белка прибавлением изопропил-β-D-1-тиогалактоприанозида до конечной концентрации изопропил-β-D-1-тиогалактоприанозида 0,5 мМ, культуральную жидкость инкубируют в течение 6 часов. После окончания культивирования клетки продуцента рекомбинантного белка (биомассу) отделяют центрифугированием (5000 g, 20 мин, 4°С).
100 г биомассы суспендируют в 10 л 0,05 М фосфатного буфера рН 7,2 с 0,15 М натрия хлористого и охлаждают до плюс (6±2)°С. Суспензию клеток пропускают два раза через фильеру дезинтегратора Ranie под давлением 300 и 600 bar. Суспензию разрушенных клеток центрифугируют в роторе J А-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.
К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА- 0,15М NaCl, 1% тритон Х-100, рН 7,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С. К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА, 0, 15М NaCl, 0,5% тритон Х-100, рН 8,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Затем суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе J А-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.
К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА, 1М мочевина, рН 6,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.
К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 5 мМ ЭДТА, 2 М мочевина, рН 6,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.
Осадки растворяют добавлением буфера 20 мМ Трис, 5 мМ ЭДТА, 7 М мочевина, рН 7,0 и инкубируют 18 ч при (6±2)°С. Полученный раствор белка осветляют центрифугированием в роторе JA-14 при 13000 об/мин в течение 60 мин при плюс (6±2)°С. Далее проводят очистку на колонке объемом 2 л, упакованной сорбентом SepraPrep Q и уравновешенной буфером 20 мМ Трис-HCl, 7 М мочевина, рН 6,8. После нанесения белка колонку промывают тем же буфером и пропускают 4 л буфера 20 мМ Трис-HCl, 20 мМ NaCl, 7 М мочевина, рН 6,8, затем 20 мМ Трис-HCl, 50 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8 и 20 мМ Трис-HCl, 200 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8. Во фракции, полученной после элюции буфером 20 мМ Трис-HCl, 200 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8 увеличивают концентрацию мочевины с 7 М до 9 М выдерживают при плюс 16°С в течение 18 ч. Далее проводят процесс концентрирования раствора белка TNF-Thy на «полых волокнах» в аппарате АР-1-15ПС, уменьшая объем до 0,5 л концентрата белка.
Хроматографическая очистка белка TNF-Thy на Sephadex G-100
Наносят в колонну ПСК 200/1000 с 28,3 л SephadexG-100 500 мл концентрата белка TNF-Thy и проводят элюцию с помощью буфера для гель-фильтрации 20 мМ Трис-НСl, 150 мМ NaCl, 9 М мочевина, рН 7,2 со скоростью 3,0 мл/мин.
В собранных фракциях определяют спектрофотометрически А280, А260. Наличие TNF-Thy подтверждают с помощью электрофореза в 17,5% ПААГ с додецилсульфатом натрия (ДСН). Фракции, содержащие по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН более 90% TNF-Thy, объединяют.
В объединенной фракции высокоочищенного препарата TNF-Thy определяют спектрофотометрически: А280, А280, белок. Чистоту препарата TNF-Thy определяют по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН, а также по данным ВЭЖХ в колонке с силикагелем C18. Объединенную фракцию, содержащую TNF-Thy с чистотой больше 90%, передают на стадию ренатурации.
Ренатурация белка TNF-Thy
Для проведения ренатурации используют стеклянный реактор фирмы Simax с перемешивающим устройством и системой охлаждения. В очищенный реактор загружают 50 л фосфатного буфера с хлористым натрием с рН 7,3 и охлаждают до плюс (12±1)°С. Через фильтр с порами 0,22 мкм внутрь реактора с охлажденным буфером подают со скоростью (50±5) мл/мин 2 л раствора очищенного белка TNF-Thy. После внесения всего раствора белка проводят инкубацию при работающей мешалке. В процессе ренатурации с помощью системы охлаждения поддерживают температуру раствора (12±1)°С. Длительность процесса (18±1) часов.
Хроматографическая очистка ренатурированного гибридного белка TNF-Thy на сорбенте DEAE Sepharose Fast Flow
Используют колонку с DEAESepharose Fast Flow объемом 2 л. Уравновешивают 20 мМ фосфатным буфером, рН 7,3. Затем наносят раствор белка со стадии ренатурации в фосфатном буфере и промывают уравновешивающим буфером.
Через колонну с сорбентом последовательно пропускают 20 мМ фосфатный буфер, 80 мМ NaCl, рН 7,3 и 20 мМ фосфатный буфер, 300 мМ NaCl, рН 7,3. Все элюируемые белки собирают фракциями объемом по 0,4 л и анализируют с помощью электрофореза в 17,5% ПААГ-ДСН. Фракции, содержащие по данным электрофореза в 17,5%) ПААГ с ДСН не менее 95% TNF-Thy, объединяют. После объединения раствор TNF-Thy передают на стерилизующую фильтрации и контролируют параметры. Также отбирают пробу на определение биологической активности. Полученный раствор TNF-Thy хранят при минус (20±2)°С.
Определение активности проводят как описано в Примере 3.
Получают гибридный белок с чистотой 98% специфической активностью 1,25 х 106ЕД /мл и удельной биологической активностью 2,0 х 106 ЕД на 1 мг белка.
Пример 5. Способ получения гибридного белка TNF-Thy
Культивирование штамма- продуцента
Используют ферментер объемом 20 л при условиях по Примеру 2. После окончания культивирования клетки продуцента рекомбинантного белка (биомассу) отделяют центрифугированием (5000 g, 20 мин, 4°С).
100 г биомассы суспендируют в 10 л 0,05 М фосфатного буфера рН 7,2 с 0,15 М натрия хлористого и охлаждают до плюс (6±2)°С. Суспензию клеток пропускают два раза через фильеру дезинтегратора Ranie под давлением 300 и 600 bar. Суспензию разрушенных клеток центрифугируют в роторе J А-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.
К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА, 0,15М NaCl, 1% тритон Х-100, рН 7,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С. К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА, 0, 15М NaCl, 0,5% тритон Х-100, рН 8,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Затем суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе J А-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.
К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА, 1М мочевина, рН 6,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.
К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 5 мМ ЭДТА, 2 М мочевина, рН 6,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе J А-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.
Осадки растворяют добавлением буфера 20 мМ Трис, 5 мМ ЭДТА, 7 М мочевина, рН 7,0 и инкубируют 18 ч при (6±2)°С. Полученный раствор белка осветляют центрифугированием в роторе JA-14 при 13000 об/мин в течение 60 мин при плюс (6±2)°С. Далее проводят очистку на колонке объемом 2 л, упакованной сорбентом SepraPrep Q и уравновешенной буфером 20 мМ Трис⋅HCl, 7 М мочевина, рН 6,8. После нанесения белка колонку промывают тем же буфером и пропускают 4 л буфера 20 мМ Трис⋅HCl, 20 мМ NaCl, 7 М мочевина, рН 6,8, затем 20 мМ Трис⋅HCl, 50 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8 и 20 мМ Трис⋅HCl, 200 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8. Во фракции, полученной после элюции буфером 20 мМ Трис⋅HCl, 200 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8 увеличивают концентрацию мочевины с 7 М до 9 М выдерживают при плюс 16°С в течение 18 ч. Далее проводят процесс концентрирования раствора белка TNF-Thy на «полых волокнах» в аппарате АР-1-15ПС, уменьшая объем до 0,5 л концентрата белка.
Хроматографическая очистка белка TNF-Thy на Sephadex G-100
Наносят в колонну ПСК 200/1000 с 28,3 л Sephadex G-100 500 мл концентрата белка TNF-Thy и проводят элюцию с помощью буфера для гель-фильтрации 20 мМ Трис⋅НСl, 150 мМ NaCl, 7 М мочевина, рН 8,5 со скоростью 3,0 мл/мин.
В собранных фракциях определяют спектрофотометрически А280, А260. Наличие TNF-Thy подтверждают с помощью электрофореза в 17,5% ПААГ с додецилсульфатом натрия (ДСН). Фракции, содержащие по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН более 90% TNF-Thy, объединяют.
В объединенной фракции высокоочищенного препарата TNF-Thy определяют спектрофотометрически: А280, А260, белок. Чистоту препарата TNF-Thy определяют по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН, а также по данным ВЭЖХ в колонке с силикагелем С18. Объединенную фракцию, содержащую TNF-Thy с чистотой больше 90%, передают на стадию ренатурации.
Ренатурация белка TNF-Thy
Для проведения ренатурации используют стеклянный реактор фирмы Simax с перемешивающим устройством и системой охлаждения. В очищенный реактор загружают 50 л фосфатного буфера с хлористым натрием с рН 7,3 и охлаждают до плюс (12±1)°С. Через фильтр с порами 0,22 мкм внутрь реактора с охлажденным буфером подают со скоростью (50±5) мл/мин 2 л раствора очищенного белка TNF-Thy. После внесения всего раствора белка проводят инкубацию при работающей мешалке. В процессе ренатурации с помощью системы охлаждения поддерживают температуру раствора (12±1)°С. Длительность процесса (18±1) часов.
Хроматографическая очистка ренатурированного гибридного белка TNF-Thy на сорбенте DEAE Sepharose Fast Flow
Используют колонку с DEAESepharose Fast Flow объемом 2 л. Уравновешивают 20 мМ фосфатным буфером, рН 7,3. Затем наносят раствор белка, полученного на стадии ренатурации в фосфатном буфере и промывают уравновешивающим буфером. Через колонну с сорбентом последовательно пропускают 20 мМ фосфатный буфер, 80 мМ NaCl, рН 7,3 и 20 мМ фосфатный буфер, 300мМ NaCl, рН 7,3.
Все элюируемые белки собирают фракциями объемом по 0,4 л и анализируют с помощью электрофореза в 17,5% ПААГ-ДСН. Фракции, содержащие по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН не менее 95% TNF-Thy, объединяют. После объединения раствор TNF-Thy передают на стерилизующую фильтрации и контролируют параметры (белок, э/ф, ВЭЖХ). Также отбирают пробу на определение биологической активности. Полученный раствор TNF-Thy хранят при минус (20±2)°С.
Определение активности проводят как описано в Примере 3.
Получают гибридный белок с чистотой 98,5%,специфической активностью 1,3 х 106ЕД /мл и удельной биологической активностью 2,0 х 106ЕД на 1 мг белка.
Пример 6. Способ получения гибридного белка TNF-Thy
Культивирование штамма- продуцента
Используют ферментер объемом 20 л при условиях по Примеру 2. После окончания культивирования клетки продуцента рекомбинантного белка (биомассу) отделяют центрифугированием (5000 g, 20 мин, 4°С).
100 г биомассы суспендируют в 10 л 0,05 М фосфатного буфера рН 7,2 с 0,15 М натрия хлористого и охлаждают до плюс (6±2)°С. Суспензию клеток пропускают два раза через фильеру дезинтегратора Ranie под давлением 300 и 600 bar. Суспензию разрушенных клеток центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.
К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА, 0,15М NaCl, 1% тритон Х-100, рН 7,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С. К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА, 0, 15М NaCl, 0,5% тритон Х-100, рН 8,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Затем суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе J А-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.
К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА, 1М мочевина, рН 6,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.
К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 5 мМ ЭДТА, 2 М мочевина, рН 6,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.
Осадки растворяют добавлением буфера 20 мМ Трис, 5 мМ ЭДТА, 7 М мочевина, рН 7,0 и инкубируют 18 ч при (6±2)°С. Полученный раствор белка осветляют центрифугированием в роторе JA-14 при 13000 об/мин в течение 60 мин при плюс (6±2)°С. Далее проводят очистку на колонке объемом 2 л, упакованной сорбентом SepraPrep Q и уравновешенной буфером 20 мМ Трис⋅HCl, 7 М мочевина, рН 6,8. После нанесения белка колонку промывают тем же буфером и пропускают 4 л буфера 20 мМ Трис⋅HCl, 20 мМ NaCl, 7 М мочевина, рН 6,8, затем 20 мМ Трис⋅HCl, 50 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8 и 20 мМ Трис⋅HCl, 200 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8. Во фракции, полученной после элюции буфером 20 мМ Трис⋅HCl, 200 мМ NaCl,7 М мочевина рН 6,8 увеличивают концентрацию мочевины с 7 М до 9 М выдерживают при плюс 16°С в течение 18 ч. Далее проводят процесс концентрирования раствора белка TNF-Thy на «полых волокнах» в аппарате АР-1-15ПС, уменьшая объем до 0,5 л концентрата белка.
Хроматографическая очистка белка TNF-Thy на Sephadex G-100
Наносят в колонну ПСК 200/1000 с 28,3 л Sephadex G-100 500 мл концентрата белка TNF-Thy и проводят элюцию с помощью буфера для гель-фильтрации 20 мМ Трис⋅HCl, 150 мМ NaCl, 9 М мочевина, рН 7,2 со скоростью 3,0 мл/мин.
В собранных фракциях определяют спектрофотометрически А280, А260. Наличие TNF-Thy подтверждают с помощью электрофореза в 17,5% ПААГ с додецилсульфатом натрия (ДСН).
Фракции, содержащие по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН более 90% TNF-Thy, объединяют.
В объединенной фракции высокоочищенного препарата TNF-Thy определяют спектрофотометрически: А280, А260, белок. Чистоту препарата TNF-Thy определяют по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН, а также по данным ВЭЖХ в колонке с силикагелем С18. Объединенную фракцию, содержащую TNF-Thy с чистотой больше 90%, передают на стадию ренатурации.
Ренатурация белка TNF-Thy
Для проведения ренатурации используют стеклянный реактор фирмы Simax с перемешивающим устройством и системой охлаждения. В очищенный реактор загружают 90 л фосфатного буфера с хлористым натрием с рН (7,3±0,1) и охлаждают до плюс (12±1)°С. Через фильтр с порами 0,22 мкм внутрь реактора с охлажденным буфером подают со скоростью (50±5) мл/мин 2 л раствора очищенного белка TNF-Thy. После внесения всего раствора белка проводят инкубацию при работающей мешалке. В процессе ренатурации с помощью системы охлаждения поддерживают температуру раствора (12±1)°С. Длительность процесса (18±1) часов.
Хроматографическая очистка ренатурированного гибридного белка TNF-Thy на сорбенте DEAE Sepharose Fast Flow
Используют колонку с DEAESepharose Fast Flow объемом 2 л. Уравновешивают 20 мМ фосфатным буфером, рН 7,3. Затем наносятраствор белка, полученного на стадии ренатурациив фосфатном буфере и промывают уравновешивающим буфером.
Через колонну с сорбентом последовательно пропускают 20 мМ фосфатный буфер, 80 мМ NaCl, рН 7,3 и 20 мМ фосфатный буфер, 300 мМ NaCl, рН 7,3.
Все элюируемые белки собирают фракциями объемом по 0,4 л и анализируют с помощью электрофореза в 17,5% ПААГ-ДСН. Фракции, содержащие по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН не менее 95% TNF-Thy, объединяют. После объединения раствор TNF-Thy передают на стерилизующую фильтрацию и контролируют параметры. Также отбирают пробу на определение биологической активности. Полученный раствор TNF-Thy хранят при минус (20±2)°С.
Определение активности проводят как описано в Примере 3.
Получают гибридный белок с чистотой 97%, специфической активностью 1,2 х 106ЕД /мл и удельной биологической активностью 1,85 х 106 ЕД на 1 мг белка
Пример 7. Получение лекарственного средства с активностью 90 000 ЕД/флакон
Состав: гибридный белок, полученный из штамма Escherichia coli BL21 (DE3)/pET32a-TNF-Thy, по примеру 4- 7,2 мл, маннит -1,5 г, натрий хлористый -0,88 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный12-водный-2,9 г, натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный -0,3 г, вода для инъекции до 100 мл.
Все компоненты, за исключением, TNF-Thy, взвешивали и растворяли в воде для инъекций. рН раствора проверяли и при необходимости доводили до значения 7,4. Затем был добавлен размороженный раствор TNF-Thy, полученный по примеру 4
Раствор фильтровали в стерильных условиях. Флаконы асептически заполняли по 1 мл полученным составом и завальцовывали. Продукт хранили при температуре от 2 до 8°С.
Определяли активность лекарственного средства
Препарат должен оказывать цитотоксическое действие в культуре клеток L-929.
Штамм диплоидных клеток подкожной соединительной ткани мыши (NCTCclone 929 [Lcell, L-929, derivativeofStrainL], ATCC® CCL-1™) хранят в виде замороженной суспензии. Одну криопробирку с клетками тест-культуры из сосуда Дьюара с жидким азотом помещают в водяную баню до полного оттаивания суспензии (не более чем на 2 минуты) при температуре (37±2)°С В ламинарном боксе в асептических условиях содержимое пробирки переносят в одноразовую стерильную центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую 6 мл поддерживающей среды (см. примечание 3). После центрифугирования при 2000 об/мин 10 мин, надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 10 мл ростовой среды (см. примечание 2), осадок ресуспендируют и переносят суспензию во флакон площадью 25 см для культивирования. Флакон помещают в СО2-инкубатор для культивирования в стандартных условиях (при температуре (37±2)°С, и (5,0±0,5) % углекислого газа) на 48-72 часа до образования монослоя.
После формирования монослоя на поверхности дна культурального флакона, проводят процедуру пассирования клеток, т.е. переноса части клеток монослоя во второй культуральный флакон со средой роста. Перенос клеток необходимо производить, не допуская образования плотного слоя для того, чтобы клетки находились в логарифмической фазе роста.
Из флакона со сформированным клеточным монослоем удаляют культуральную среду и трижды промывают его 5-6 мл 0,25% раствора Трипсин-ЭДТА, прогретым до температуры (37±2)°С. Последнюю внесенную во флакон порцию раствора удаляют не полностью, а оставляют около 1 мл и равномерно распределяют по всей поверхности монослоя. Флакон с клетками помещают в СО2-инкубатор до тех пор, пока клетки полностью не отслоятся от дна культурального флакона. Вносят 2 мл ростовой среды, суспендируют клетки пипетированием, переносят в чашку Петри и отбирают пробу для подсчета количества клеток в камере Горяева. Переносят 1-1,5 мл клеточной суспензии в новый флакон и добавляют ростовую среду 5-6 мл до посевной концентрации клеток 100 тыс.клеток/мл. После переноса отслоившихся клеток в новый флакон с ростовой средой, их оба помещают в стандартные условия культивирования на 24-48 часов. При образовании на дне флаконов монослоя, один флакон используют для повторного переноса клеток и определения специфической активности, а с другим повторяют процедуру снятия клеток для закладки в рабочий банк клеток.
Перед каждой процедурой работы с клетками при помощи инвертированного микроскопа оценивают морфологию клеток и чистоту культуры в культуральном флаконе. При отсутствии посторонней микрофлоры и нормальной морфологии клеток определяют культуру, как пригодную к использованию.
Далее готовят исследуемый образец. Готовят три десятикратных разведения. Для этого в пробирки типа Эппендорф вносят по 900 мкл поддерживающей среды с актиномицином Д. В пробирку №1 вносят 100 мкл раствора исследуемого препарата, тщательно перемешивают. В пробирку №2 переносят 100 мкл раствора из пробирки №1, тщательно перемешивают. В пробирку №3 переносят 100 мкл раствора из пробирки №2, тщательно перемешивают.
Из пробирки №3 готовят двукратные рабочие разведения испытуемого образца. Для этого в 8 пробирок типа Эппендорф вносят по 500 мкл поддерживающей среды с актиномицином Д. Из пробирки №3 с раствором испытуемого препарата переносят 500 мкл в пробирку №4, тщательно перемешивают. Из пробирки №4 переносят 500 мкл раствора в пробирку №5, тщательно перемешивают. Повторяют процедуру для пробирок №6-11. Получают следующие разведения: 1:2×103, 1:4×103, 1:8×103, 1:16×103, 1:32×103, 1:64×103, 1:128×103, 1:256×103. Разведения в пробирках №4-11 приготовлены для внесения в планшет.
Для определения пригодности ранее полученного клеточного монослоя по окончании инкубации визуально оценивают его состояние с помощью микроскопа. Клетки должны иметь типичную морфологию, должна отсутствовать посторонняя микрофлора.
Из полученного монослоя клеток удаляют культуральную среду. Для этого переворачивают планшет над емкостью с рабочим раствором перекиси водорода.
По окончании инкубации визуально с помощью микроскопа оценивают состояние клеточного монослоя.
Учет активности стандартного и испытуемого образцов осуществляют при отсутствии признаков дегенерации в лунках с контрольными клетками (Кк), не подвергавшимися воздействию препаратов.
Оценку результата осуществляют с помощью инвертированного микроскопа.
За активность стандартного и испытуемого образца принимают величину, обратную разведению, которое вызывает повреждение 50% клеток аденокарциномы мыши L-929.
Расчет активности (X) стандартного и испытуемого образца проводят по формуле:
где Р - разведение образца препарата, при котором произошло 50% повреждение клеток.
Полученное лекарственное средство имеет специфическую активность при титровании в культуре клеток L-929 90000 ЕД во флаконе
Пример 8. Получение лекарственного средства с активностью 100 000 ЕД/флакон
Состав: гибридный белок, полученный из штамма Escherichia coli BL21 (DE3)/pET32a-TNF-Thy, по примеру 5- 7,7 мл, маннит -1,0 г, натрий хлористый -0,87 г, натрий фосфорнокислыйдвузамещенный 12-водный-2,1 г, натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный - 0,6 г, вода для инъекции до 100 мл.
Все компоненты, за исключением, TNF-Thy, взвешивали и растворяли в воде для инъекций. рН раствора проверяли и при необходимости доводили до значения 7,0. Затем был добавлен размороженный раствор TNF-Thy, полученный по примеру 5.
Раствор фильтровали в стерильных условиях. Флаконы асептически заполняли по 1 мл полученным составом и завальцовывали. Продукт хранили при температуре от 2 до 8°С. Определяли активность лекарственного средства как описано в примере 7. Полученное лекарственное средство имеет специфическую активность при титровании в культуре клеток L-929 100000 ЕД во флаконе
Пример 9. Получение лекарственного средства с активностью 110 000 ЕД/флакон Состав: гибридный белок, полученный из штамма Escherichia coli BL21 (DE3)/pET32a-TNF-Thy, с активностью 1,2 х 106 ЕД/мл - 9,1 мл, маннит -2 г, натрий хлористый -0,89 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный12-водный-3,3г, натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный - 0,1 г, вода для инъекции до 100 мл.
Все компоненты, за исключением, TNF-Thy, взвешивали и растворяли в воде для инъекций. рН раствора проверяли и при необходимости доводили до значения 7,8. Затем был добавлен размороженный раствор TNF-Thy, полученный по примеру 6.
Раствор фильтровали в стерильных условиях. Флаконы асептически заполняли по 1 мл полученным составом и завальцовывали. Продукт хранили при температуре от 2 до 8°С.
Определяли активность лекарственного средства. Полученное лекарственное средство имеет специфическую активность при титровании в культуре клеток L-929 110000 ЕД во флаконе
Пример 10. Сравнительные результаты клинического применения лекарственного средства, полученного по примеру 8 и препарата «РЕФНОТ».
В связи с тем, что впервые заявляется лекарственное средство рекомбинантного гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α1 в жидком виде, для сравнения был взят препарат «Рефнот» в лиофилизированном виде, который пред применением растворяли в 1 мл воды для инъекций
Лекарственное средство, полученное по примеру 8 и препарат «РЕФНОТ», применялись в группах по 200 пациентов в возрасте 20-80 лет с онкологическими заболеваниями различной локализации, различных стадий (I-IV), с метастазами различной локализации или без метастазов.
Лекарственное средство, полученное по примеру 8 и препарат «РЕФНОТ» назначались на фоне базовой химиотерапии 1 раз в сутки в дозировке от 100 000 ЕД до 400 000 ЕД по различным схемам, согласно инструкции по медицинскому применению препарата рекомбинантного гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α1.
Все пациенты наблюдались около двух месяцев. Терапия лиофилизированным лекарственным средством, полученным по примеру 8 и препаратом рекомбинантного гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α1, полученным по ближайшему аналогу, показала сопоставимую эффективность: была отмечена положительная клиническая динамика, стабилизация динамики по RECIST, стабилизация динамики метастазов.
У пациентов, для лечения которых применялся препарат «РЕФНОТ» наиболее часто (у 12% пациентов) встречалось нежелательное явление «повышение температуры». При применении лекарственного средства, полученного по примеру 8, повышение температуры наблюдалось у 1% пациентов.
Пример 11. Клиническое исследование лекарственного средства, полученного по примеру 9.
В связи с тем, что впервые заявляется лекарственное средство рекомбинантного гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α1 в жидком виде, для сравнения был взят препарат «Рефнот» в лиофилизированном виде, который пред применением растворяли в 1 мл воды для инъекций
Заявленное в примере 9, лекарственное средство применяли в клиническом исследовании, в котором участвовало 80 пациенток с клиническим диагнозом: рак молочной железы. Больных разделили на две группы лечения.
Для группы I: Подкожно вводили 1 мл лекарственного средства, полученное по примеру 9: 10 инъекций по 100 000 ЕД ежедневно. Терапия начиналась за 2 дня до химиотерапии, дни химиотерапии пропускались. Среднее число курсов составило 2 (от 1 до 8). Для группы II: Подкожно вводили растворенный в 1 мл воды для инъекций препарат «РЕФНОТ»: 10 инъекций по 100 000 ЕД ежедневно. Терапия начиналась за 2 дня до химиотерапии, дни химиотерапии пропускались. Среднее число курсов составило 2 (от 1 до 8).
Частота объективных ответов в I группе составила 47%. Контроль опухолевого роста зарегистрирован в 25% случаев. У одного пациента полный регресс опухоли в ответ на терапию. Медиана выживаемости без прогрессирования составила 107 месяцев (95% ДИ 25-189 месяцев). Медиана общей выживаемости составила 115 месяцев (95% ДИ 47-183 месяцев).
Частота объективных ответов во II группе составила 43%». Контроль опухолевого роста зарегистрирован в 13% случаев. Медиана выживаемости без прогрессирования составила 80 месяцев (95% ДИ 38-128 месяцев). Медиана общей выживаемости составила 67 месяцев (95% ДИ 32-102 месяцев).
В группе I отмечена тенденция к увеличению безрецидивной и общей выживаемости пациентов (приблизительно в 1,5 раза). При дальнейшем наблюдении обнаружено, что в группе I общее число пациентов с метастазами по итогам лечения несколько меньше, при этом чаще наблюдается поражение 1 или 2 органов, в то время как во II группе преобладают пациенты с метастазами в 2 и более органах.
Число нежелательных явлений в группе I было ниже, чем в группе II. В обеих группах не было отмечено серьезных нежелательных явлений. Все возникшие нежелательные явления не требовали отмены терапии.
Пример12. Клиническое исследование лекарственного средства, полученного по примеру 7. В связи с тем, что впервые заявляется лекарственное средство рекомбинантного гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α1 в жидком виде, для сравнения был взят препарат «Рефнот» в лиофилизированном виде, который пред применением растворяли в 1 мл воды для инъекций
Заявленное в примере 7 лекарственное средство применяли в клиническом исследовании, в котором участвовало 200 пациентов с различными формами злокачественных новообразований преимущественно с местно-распространенными формами заболевания (стадии 2А-3В), закончившие основной курс противоопухолевого лечения. Больных разделили на две группы лечения.
Для группы I: Подкожно вводили 1 мл лекарственного средства, полученное по примеру 7: 100 000 ЕД в сутки подкожно через день, с 1 по 19 день. Затем перерыв 10 дней. Всего на 1 курс 10 введений. Всего 6 курсов терапии.
Для группы II: Подкожно вводили растворенный в 1 мл воды для инъекций препарат «РЕФНОТ»: 100 000 ЕД в сутки подкожно через день, с 1 по 19 день. Затем перерыв 10 дней. Всего на 1 курс 10 введений. Всего 6 курсов терапии.
Безрецидивная выживаемость оказалась статистически значимо выше (р<0.05) среди пациентов, закончивших основной курс противоопухолевого лечения и получавших затем лиофилизированное лекарственное средство, полученное по примеру 7 в течение 6 месяцев. Вторичные злокачественные новообразования возникли у 2 и 5 пациентов в группах I и II соответственно. Выживаемость без прогрессирования была значимо выше у больных, получавших лекарственное средство, полученное по примеру 7.
Ни в одной из групп не было зарегистрировано ни одного серьезного нежелательного явления. Общее количество пациентов, отметивших нежелательные явления, в группе II было незначительно выше. Больные жаловались на повышение температуры на фоне терапии, слабость и артралгию. Все нежелательные явления характеризовались легкой степенью выраженности и купировались, не требуя отмены терапии.
Claims (4)
1. Лекарственное средство, обладающее активностью гибридного белка альфа-фактор некроза опухолей - тимозин альфа 1 (TNF-Thy), представляющее собой раствор для парентерального введения, содержащий регуляторы осмотического давления, буферную систему, поддерживающую рН 7,0-7,8, и высокоочищенный гибридный белок TNF-Thy с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1, причем гибридный белок TNF-Thy получен культивированием штамма-продуцента Escherichia coli, BL21(DE3)/pET32a-TNF-Thy, где после 3-5 часов культивирования проводят индукцию биосинтеза в клетках Escherichia coli BL21(DE3)/pET32a-TNF-Thy изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом и выдерживают 4-6 часов с получением биомассы клеток штамма-продуцента, продуцирующего белок TNF-Thy, выделение из полученной биомассы клеток штамма-продуцента белка TNF-Thy, последующую очистку выделенного гибридного белка TNF-Thy путем анионообменной и гель-проникающей хроматографии в денатурирующих условиях, ренатурацию гибридного белка TNF-Thy путем разбавления мочевинного раствора и очистку ренатурированного гибридного белка TNF-Thy анионообменной хроматографией с получением гибридного белка с чистотой не менее 97%, а штамм Escherichia coli BL 21 (DE3)/pET32a-TNF-Thy- продуцент гибридного белка TNF-Thy - получен трансформацией родительского штамма Е. coli BL21(DE3) рекомбинантной плазмидой pET32a-TNF-Thy размером 5929 пар оснований (п.о.), обеспечивающей синтез белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1 размером 20,5 кДа, и содержащей структурные элементы: промотор Т7 и оператор lacO, синтетическую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 2, кодирующую гибридный белок TNF-Thy, ген устойчивости к антибиотику ампициллину (AmpR) и бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину (AmpR промотор) для проведения отбора рекомбинантных клеток, ориджин репликации бактериофага f1 (f1 ori), ген лактозного репрессора LacI и бактериальный промотор гена лактозного репрессора (LacIpromoter) при следующем соотношении компонентов (масс.%):
2. Лекарственное средство по п. 1, отличающееся тем, что в качестве регуляторов осмотического давления содержит маннит и натрий хлористый.
3. Лекарственное средство по п. 1, отличающееся тем, что в качестве буферной системы поддерживающей рН 7,0-7,8, содержит фосфатный буфер, состоящий из натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного и натрия фосфорнокислого однозамещенного 2-водного.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2809355C1 true RU2809355C1 (ru) | 2023-12-11 |
Family
ID=
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2129878C1 (ru) * | 1996-04-24 | 1999-05-10 | Зинченко Елена Вениаминовна | Иммуномодулирующий препарат с противовирусной активностью "неоферон" |
| RU2180233C1 (ru) * | 2001-06-26 | 2002-03-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Протеиновый контур" | Способ получения жидких лекарственных форм рекомбинантных белков |
| RU2225443C1 (ru) * | 2002-07-25 | 2004-03-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственное предприятие "Фармаклон" | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК, КОДИРУЮЩАЯ СИНТЕЗ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРЕПАРАТ РЕКОМБИНАНТНОГО ГИБРИДНОГО БЕЛКА α-ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ-ТИМОЗИН-α1 |
| US8652468B2 (en) * | 1999-01-21 | 2014-02-18 | Genentech, Inc. | Methods of binding TNF-α using anti-TNF-α antibody fragment-polymer conjugates |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2129878C1 (ru) * | 1996-04-24 | 1999-05-10 | Зинченко Елена Вениаминовна | Иммуномодулирующий препарат с противовирусной активностью "неоферон" |
| US8652468B2 (en) * | 1999-01-21 | 2014-02-18 | Genentech, Inc. | Methods of binding TNF-α using anti-TNF-α antibody fragment-polymer conjugates |
| RU2180233C1 (ru) * | 2001-06-26 | 2002-03-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Протеиновый контур" | Способ получения жидких лекарственных форм рекомбинантных белков |
| RU2225443C1 (ru) * | 2002-07-25 | 2004-03-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственное предприятие "Фармаклон" | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК, КОДИРУЮЩАЯ СИНТЕЗ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРЕПАРАТ РЕКОМБИНАНТНОГО ГИБРИДНОГО БЕЛКА α-ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ-ТИМОЗИН-α1 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4664684B2 (ja) | 原核生物宿主におけるｉｌ−２１の生産 | |
| JPS61501307A (ja) | 高収量の組換え産物の産生宿主及び産生方法 | |
| ES2371219T3 (es) | Producción de fgf18 en huéspedes procariotas. | |
| JP2525023B2 (ja) | 組み換えインタ―ロイキン―１の精製 | |
| RU2809355C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pET32a-TNF-Thy, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ ГИБРИДНОГО БЕЛКА α-ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ - ТИМОЗИН АЛЬФА 1, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI BL21 (DE3)/pET32A-TNF-Thy - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TNF-Thy, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TNF-Thy И ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО | |
| DE69230879T2 (de) | Verwendung von Hepatocyten-Wachstumsfaktoren zur Herstellung eines Vermehrungssystems für Hematopoietische Stammzellen | |
| EP3173420A1 (en) | Polypeptide and polypeptide complex for suppressing tumor metastasis and treating leukemia as well as preparation method therefor and application thereof | |
| Taylor et al. | Studies on a serum substitute for mammalian cells in culture I. Biological efficacy of whole and fractionated peptone dialysate | |
| RU2809357C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pET32a-TNF-Thy, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ ГИБРИДНОГО БЕЛКА α-ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ - ТИМОЗИН АЛЬФА 1, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI BL21(DE3)/pET32A-TNF-Thy - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TNF-Thy, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TNF-Thy И ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО | |
| US5151349A (en) | Method for expressing polypeptide having anti-tumor activity | |
| RU2787531C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА PET32a-TNF-Thy, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ ГИБРИДНОГО БЕЛКА α-ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ - ТИМОЗИН АЛЬФА 1, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI BL21(DE3)/PET32A-THF-Thy - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TNF-Thy И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TNF-Thy | |
| JPH03297388A (ja) | 新規なｔｎｆ変異体、その製造法及びそれを有効成分とする抗腫瘍剤 | |
| RU2809360C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pET32a-IFG144, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ ИНТЕРФЕРОНА ГАММА, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI JM109/pET32a-IFG144 - ПРОДУЦЕНТ БЕЛКА ИНТЕРФЕРОН ГАММА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНТЕРФЕРОНА ГАММА И ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО | |
| RU2809358C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pET32a-IFG144, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ ИНТЕРФЕРОНА ГАММА, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI JM109/pET32a-IFG144 - ПРОДУЦЕНТ БЕЛКА ИНТЕРФЕРОН ГАММА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНТЕРФЕРОНА ГАММА И ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО | |
| RU2787131C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pET32a-IFG144, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ ИНТЕРФЕРОНА ГАММА, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI JM109/pET32a-IFG144 ПРОДУЦЕНТ БЕЛКА ИНТЕРФЕРОН ГАММА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНТЕРФЕРОНА ГАММА | |
| HUT64593A (en) | Method for producing human fgf muteine | |
| RU2321424C1 (ru) | ПРЕПАРАТ, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pSX70, КОДИРУЮЩАЯ СИНТЕЗ РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ГРАНУЛОЦИТ-КОЛОНИЙСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА (Г-КСФ), ШТАММ Escherichia coli SX70-ПРОМЫШЛЕННЫЙ ШТАММ ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО Г-КСФ И СПОСОБ ПРОМЫШЛЕННОГО ПОЛУЧЕНИЯ Г-КСФ | |
| RU2225443C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК, КОДИРУЮЩАЯ СИНТЕЗ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРЕПАРАТ РЕКОМБИНАНТНОГО ГИБРИДНОГО БЕЛКА α-ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ-ТИМОЗИН-α1 | |
| RU2816486C2 (ru) | Химерный фермент МГЛ-S3 - метионин-гамма-лиаза, слитая с S3 доменом белка VGF из Vaccinia virus, способ получения МГЛ-S3 и противоопухолевый препарат на основе этого фермента | |
| RU2214832C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая синтез, способ получения и препарат рекомбинантного интерферона гамма человека | |
| JPH02138224A (ja) | 血小板減少症治療剤 | |
| RU2708556C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная ДНК p280_2GM, кодирующая полипептид со свойствами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека, штамм E.COLI SG 20050/ p280_2GM - продуцент полипептида со свойствами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека и способ получения указанного полипептида | |
| SU1703693A1 (ru) | Рекомбинантна плазмидна ДНК @ - @ 2-19, кодирующа синтез интерлейкина-2 человека, способ ее конструировани @ штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент интерлейкина-2 человека | |
| JPS62246522A (ja) | インタ−ロイキン１を有効成分とする感染症予防・治療剤 | |
| RU2294372C1 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2b И ИНТЕРФЕРОНСОДЕРЖАЩИЙ ПРЕПАРАТ (ВАРИАНТЫ) |