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CN116515841B - 一种真菌来源的启动子元件及其应用 - Google Patents

一种真菌来源的启动子元件及其应用 Download PDF

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CN116515841B CN202310741142.2A CN202310741142A CN116515841B CN 116515841 B CN116515841 B CN 116515841B CN 202310741142 A CN202310741142 A CN 202310741142A CN 116515841 B CN116515841 B CN 116515841B
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Abstract

本发明涉及生物技术与基因工程技术领域，公开了一种真菌来源的启动子元件及其应用，具体涉及一种真菌来源的具有启动子活性的多核苷酸及其在生产有机酸与酶制剂中的用途。利用本发明具有启动子活性的多核苷酸可以用于增强目标基因的表达，进而可以提高菌株的有机酸、相关酶的产量，具有较广泛的应用前景。

Description

一种真菌来源的启动子元件及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术、生物工程和基因工程技术领域，涉及具有启动子活性的多核苷酸，以及利用启动子活性的多核苷酸增强目标基因表达的方法、提高菌株有机酸或酶制剂产量的方法。
背景技术
真菌是生物产业领域极为重要的工业菌株，广泛用于有机酸、酶制剂等工业生产。以黑曲霉为例，黑曲霉是有机酸与酶制剂产业极为重要的工业菌株。目标基因的高效表达是实现真菌高产有机酸和酶制剂的关键，而启动子元件是影响基因高效表达的最重要的调控元件，不仅可以调控目标基因的表达，控制代谢流向目标产品，提高目标产品的产量与生产效率；还可以通过强启动子来直接提高酶制剂等目标蛋白的产量。
目前，已有文献报道了真菌中的强启动子，如构巢曲霉三磷酸甘油醛脱氢酶P gpdA 启动子，泡盛曲霉谷氨酸脱氢酶P gdhA 启动子等（雷达，许杨等，曲霉属蛋白表达中高效启动子的应用研究[J]，食品工业科技，2013，34(13)：342－345），其中，来源于构巢曲霉的P gpdA 启动子是目前已报道的商业化较好且普遍认为是真菌中的强启动子。Xu等(Xu Y， Zhou Y，Cao W， Liu H.Improved Production of Malic Acid in Aspergillus nigerbyAbolishing Citric Acid Accumulation and Enhancing Glycolytic Flux.ACS SynthBiol. 2020. 9(6):1418-1425)利用该启动子来强化糖酵解途径后，使苹果酸/葡萄糖的转化率从1.27 mol/mol提高至1.64 mol/mol，从而提高了苹果酸的产量。然而，目前还需要丰富适用于各种不同用途的启动子活性的核酸分子。比如，开发活性更高的启动子或与目标基因适配性更好的启动子，将有利于增强有机酸合成相关基因的表达，增强酶制剂的表达，从而更具工业应用潜力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种来源于真菌的具有强启动子活性的多核苷酸序列，该具有强启动子活性的多核苷酸能够提高有机酸相关基因、酶制剂编码基因的表达强度，从而提高有机酸、酶制剂的产量，具有工业应用潜能。在此基础上，完成了本发明。
一方面，本发明提供了一种真菌来源的启动子元件，为具有强启动子活性的多核苷酸，其中，所述多核苷酸选自如下（a）-（d）中组成的组中的任一项：
（a）包括如SEQ ID NO：1-2任一序列所示的核苷酸序列；
（b）包含如SEQ ID NO：1-2任一序列所示的核苷酸序列的反向互补序列；
（c）在高严格性杂交条件下，能够与（a）或（b）或（c）所示的核苷酸序列杂交的序列，并仍具有启动子活性；
（d）与（a）或（b）或（c）所示的核苷酸序列具有至少90%，可选至少95%，优选至少97%，更优选至少98%，最优选至少99%的序列同一性，且仍具有启动子活性的序列。
优选地，具有启动子活性的多核苷酸是核苷酸序列如SEQ ID NO：1-2任一序列所示的多核苷酸。
第二方面，本发明提供了一种转录表达盒，其中所述转录表达盒包括第一方面的启动子，可选地，所述转录表达盒还含有蛋白编码基因，所述蛋白编码基因与所述具有启动子活性的多核苷酸可操作地连接。
第三方面，本发明提供了一种重组表达载体，其中所述重组表达载体包括第一方面所述的核苷酸序列或第二方面所述的转录表达盒。
第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，其中，所述宿主细胞中含有第二方面的转录表达盒，或第三方面的重组表达载体；其中，所述宿主细胞是真菌。可选地，所述宿主细胞为黑曲霉（Aspergillusniger），构巢曲霉（Aspergillus nidulans），米曲霉（Aspergillus oryzae），产黄青霉（Penicillium chrysogenum），里氏木霉（Trichoderma reesei），玉蜀黍黑粉菌（Ustilago maydis），嗜热毁丝霉（Myceliophthorathermophila）；最优选黑曲霉（Aspergillusniger），构巢曲霉（Aspergillus nidulans）。
第五方面，本发明提供了第一方面所述的多核苷酸，第二方面的转录表达盒，第三方面的重组表达载体，第四方面的宿主细胞在如下至少一种中的用途：
（a）用于增强基因的转录水平，或制备用于增强基因的转录水平的试剂或试剂盒；
（b）用于制备蛋白，或制备用于制备蛋白的试剂或试剂盒；
（c）生产有机酸，或制备用于生产有机酸的试剂或试剂盒。
可选地，所述有机酸是葡萄糖酸、柠檬酸中的任一种；所述酶制剂是葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶与植酸酶中的任一种。
第六方面，本发明提供了一种调控目标基因转录的方法，其中所述方法包括将第一方面的具有启动子活性的多核苷酸与目标基因可操作地连接，例如通过将所述启动子活性的多核苷酸与目标基因可操作地连接的载体导入重组宿主细胞，增强所述重组宿主细胞中的目标基因的转录。
第七方面，本发明提供了一种制备蛋白的方法，其中所述方法包括利用含有目标基因的第二方面的表达盒，或含有目标基因的第三方面的重组表达载体，导入重组宿主细胞以表达目标基因，或培养第四方面的宿主细胞以表达蛋白。
第八方面，本发明提供了一种有机酸或酶制剂的生产方法，其中所述方法包括利用第二方面的表达盒，或第三方面的重组表达载体，导入宿主细胞，培养所述宿主细胞，收集产生的有机酸或酶，其中所述表达盒或重组表达载体中含有与第一方面所述的核苷酸可操作连接的编码与有机酸或酶制剂合成相关蛋白的基因；进一步地，还包括将有机酸或酶制剂从发酵液中分离出来的步骤；
在一个具体实施方式中，所述宿主细胞是真菌，可选地，所述宿主细胞为黑曲霉（Aspergillusniger），构巢曲霉（Aspergillus nidulans），米曲霉（Aspergillus oryzae），产黄青霉（Penicillium chrysogenum），里氏木霉（Trichoderma reesei），玉蜀黍黑粉菌（Ustilago maydis），嗜热毁丝霉（Myceliophthorathermophila），最优选黑曲霉（Aspergillusniger），构巢曲霉（Aspergillus nidulans）。
在另一个具体实施方式中，所述有机酸是葡萄糖酸、柠檬酸中的任一种；所述酶制剂是葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶与植酸酶中的任一种。
本发明通过研究从黑曲霉中分离鉴定得到具有强启动子活性的多核苷酸序列，利用本发明具有启动子活性的多核苷酸可以用于增强目标基因的表达，进而可以提高菌株的有机酸、相关酶的产量，具有较广泛的应用前景和应用潜力。
附图说明
图1、显示启动子元件的荧光蛋白报告菌株的荧光检测。
具体实施方式
当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”联用时，词语“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
本发明的术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
本发明所用的术语“启动子”是指一种核酸分子，通常位于目标基因编码序列的上游，为RNA聚合酶提供识别位点，并位于mRNA转录起始位点的5’方向的上游。它是不被翻译的核酸序列，RNA聚合酶与这一核酸序列结合后启动目标基因的转录。在核糖核酸（RNA）的合成中，启动子可以和调控基因转录的转录因子产生相互作用，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度，包含核心启动子区域和调控区域，就像“开关”，决定基因的活动，继而控制细胞开始生产哪一种蛋白质。本发明的启动子的多核苷酸序列如SEQ ID：1-2所示，本发明还包括上述核酸分子的一些具有相同功能的变异体，与SEQ ID NO：1-2任一项所示的多核苷酸序列有至少90％以上，优选至少95％以上，优选至少96％以上，优选至少97％以上，优选至少98％以上，或优选至少99％以上的同一性，且具有启动子活性的多核苷酸。
优选的是，所述变异体的突变发生在启动子的调控区域，例如可通过插入或删除调控区域，或对调控区域进行随机或定点突变等来获得。换言之，本发明也包括在SEQ IDNO：1-2所示的多核苷酸序列的基础上进行一个、数个或数十个（例如100个以内，或者80个以内，或60个以内，或50个以内，或40个以内，或30个以内，或20个以内，或15个以内，或10个以内，或5个以内）的碱基删除或突变而获得的保留了启动子指导目的基因表达的功能的SEQ ID NO：1-2的变异体。本发明也包括在SEQ ID NO：1-2所示多核苷酸的两端添加例如15～50个碱基的片段，更优选长15～30个碱基且具有启动子活性的多核苷酸。
本发明的术语“多核苷酸”指由核苷酸组成的聚合物。多核苷酸可以是单独片段的形式，也可以是更大的核苷酸序列结构的一个组成部分，其是从至少在数量或浓度上分离一次的核苷酸序列衍生而来的，能够通过标准分子生物学方法（例如，使用克隆载体）识别、操纵以及恢复序列及其组分核苷酸序列。当一个核苷酸序列通过一个DNA序列（即A、T、G、C）表示时，这也包括一个RNA序列（即A、U、G、C），其中“U”取代“T”。换句话说，“多核苷酸”指从其他核苷酸（单独的片段或整个片段）中去除的核苷酸聚合物，或者可以是一个较大核苷酸结构的组成部分或成分，如表达载体或多顺反子序列。多核苷酸包括DNA、RNA和cDNA序列。
本发明的术语“表达”包括涉及RNA产生及蛋白产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
本发明的术语“转录表达盒”指的包含转录调控元件与目标基因，利用转录调控元件对目标基因的表达进行调控的一类表达元件。在本公开中，转录调控元件包含启动子，在此基础上，还可以包含增强子、沉默子、绝缘子等元件。在本公开中，目标基因具体为蛋白编码基因。目标基因与多核苷酸“可操作地连接”，是指将具有启动子活性的多核苷酸与目标基因功能性连接，以启动和介导目标基因的转录，所述可操作地连接的方式可以采用本领域技术人员所述的任何方式。
本发明的术语“目标基因”涉及与本发明中具有启动子活性的多核苷酸连接，以对其转录水平进行调控的任一种的基因。在一些实施方案中，目标基因是指编码微生物中目标蛋白质的基因。示例性的，目标基因是编码与目标化合物的生物合成相关的酶的基因、编码与还原力相关的酶的基因，编码与糖酵解或TCA循环相关的酶的基因，或编码与目标化合物的释放相关的酶的基因等等。
本发明的术语“目标化合物”可以选自有机酸、酶制剂，也可以选自本领域中可能通过生物合成得到的其他种类的化合物。在一些实施方式中，目标化合物为有机酸。有机酸可以是具有酸性的有机化合物，例如，其中包括羧基和磺酸基的那些化合物。示例性的，有机酸包括葡萄糖酸、乳酸、醋酸、琥珀酸、丁酸、棕榈酸、草酸、酒石酸、柠檬酸、丙酸、己烯酸、癸酸、辛酸、戊酸、苹果酸中的一种或两种以上的组合，或者是本领域中其他种类的有机酸。在一些实施方式中，目标化合物为酶制剂，示例性的，酶制剂包括葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶与植酸酶中的一种或两种以上的组合。
本发明的术语“表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、病毒或其他载体。质粒可以是线性或闭合的环形质粒。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。载体的选择一般取决于载体与其中被导入该载体的宿主细胞的相容性。
表达载体一般包括(从5’到3’方向)：引导目的基因转录的启动子和目的基因。如果需要，所述的重组载体还可以包括：在所述启动子的下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点，翻译起始用的核糖体结合位点，3’-转录终止子，3’-多聚核苷酸化信号，其它非翻译核酸序列，转运和靶向核酸序列，抗性选择标记，增强子或操作子。目的基因连接入所述适合的多克隆位点或酶切位点内，从而将目的基因与启动子可操作地连接。
本领域常用的各种翻译起始用的核糖体结合位点、3’-多聚核苷酸化信号，其它非翻译核酸序列，转运和靶向核酸序列，抗性选择标记，增强子或操作子都可用于本发明。
载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在，其复制不依赖于染色体复制的载体，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可包含用于保证自我复制的任何方式。备选地，载体可以是当被导入宿主细胞时，整合到基因组中并且与其已经被整合进入的染色体一起复制的载体。此外，可使用一起包含将被导入宿主细胞基因组的总DNA的单个载体或质粒或两个或多个载体或质粒，或转座子。
本发明的载体优选包含一个或多个容许容易选择转化、转染、转导等细胞的可选择标记。可选择的标记是基因，其产物提供对抗生素或病毒的抗性、对重金属的抗性、原养型至营养缺陷型等。
本发明的载体优选包含容许该载体整合进入宿主细胞基因组或该载体在细胞中独立于基因组自主个复制的元件。表达载体可含有一个以上拷贝的感兴趣的目的基因，以增加该基因产物的产量。目的基因拷贝数的增加可通过将至少一个附加拷贝的序列整合进入宿主细胞基因组或通过包括可扩增的选择标记基因和该目的基因来获得，其中包含扩增拷贝的选择标记基因并且由此包含附加拷贝目的基因的细胞可通过在存在适当的选择剂时培养该细胞来筛选。
用于制备重组表达载体的方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。
本发明的术语“序列同一性”和“同一性百分比”指两个或更多个多核苷酸或多肽之间相同（即同一）的核苷酸或氨基酸的百分比。两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列同一性可通过以下方法测定：将多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列对准且对经对准的多核苷酸或多肽中含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行评分，且将其与经对准的多核苷酸或多肽中含有不同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行比较。多核苷酸可例如通过含有不同核苷酸（即取代或突变）或缺失核苷酸（即一个或两个多核苷酸中的核苷酸插入或核苷酸缺失）而在一个位置处不同。多肽可例如通过含有不同氨基酸（即取代或突变）或缺失氨基酸（即一个或两个多肽中的氨基酸插入或氨基酸缺失）而在一个位置处不同。序列同一性可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中氨基酸残基的总数来计算。举例而言，可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中核苷酸或氨基酸残基的总数且乘以100来计算同一性百分比。
本发明的术语“互补的”是指在核苷酸或核苷酸之间的杂交或碱基配对，例如双链DNA分子的两条链之间或者寡核苷酸引物与被测序或扩增的单链核苷酸上的引物结合位点之间等。
本发明的术语“高严格条件”是指，对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃处在5X SSPE（saline sodium phosphate EDTA）、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃处使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
本发明所述“宿主细胞”具有本领域普通技术人员通常理解的含义，即，能够导入本发明启动子介导的表达盒的细胞，导入之后称为重组宿主细胞。换言之，本发明可以利用任何宿主细胞，只要其细胞中含有本发明的启动子序列。本发明的宿主细胞可以是真核细胞，包括但不限于黑曲霉（Aspergillusniger），构巢曲霉（Aspergillus nidulans），米曲霉（Aspergillus oryzae），产黄青霉（Penicillium chrysogenum），里氏木霉（Trichoderma reesei），玉蜀黍黑粉菌（Ustilago maydis），嗜热毁丝霉（Myceliophthorathermophila）等菌株中的任一种，优选黑曲霉、构巢曲霉、米曲霉、里氏木霉，最优选黑曲霉，以及由上述菌株制备的产生酶制剂与有机酸的突变体或菌株。
重组宿主细胞具体例如通过转化来实现。此处“转化”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即将外源性的DNA导入宿主的过程。所述转化的方法包括任何将核酸导入细胞的方法，这些方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙沉淀法、氯化钙(CaCl2)沉淀法、微注射法、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法以及乙酸锂-DMSO法。
在本发明中，所述宿主细胞的培养可以根据本领域的常规方法进行，包括但不限于孔板培养、摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等，并可以根据实际情况适当地调整各种培养条件如温度、时间和培养基的pH值等。
本发明的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例（虽然表示本发明的具体实施方式）仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本发明的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法，例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。
实施例1 具有启动子活性的DNA片段的鉴定
通过黑曲霉菌株AB4.1（参见中国专利ZL201710380366.X）的基因组与转录组分析，挖掘到一个具有高表达水平的基因，推测该基因上游的基因间区DNA片段（SEQ ID NO：1）为其启动子元件，命名为Pro1。为鉴定上游基因间区DNA片段是否具有启动子活性，本发明设计了以绿色荧光蛋白为报告基因，构建潜在启动子元件的荧光报告菌株。采用位于该DNA片段的上下游引物（表1），以黑曲霉AB4.1基因组为模板进行PCR扩增，获得该DNA片段，然后利用同源重组构建该潜在启动子的荧光报告质粒。同时，设计引物PCR扩增获得了三磷酸甘油醛脱氢酶的启动子（P gpdA ）序列作为对照，该启动子是目前商业上普遍应用并认可的真菌的强启动子。采用gfp基因的上下游引物，以含有gfp基因的质粒pMF272（GenBank:AY598428.1）为模板，进行PCR扩增绿色荧光蛋白基因片段。具体引物序列如表1所示。
表1不同启动子介导表达载体构建的引物
PCR反应体系为5×FastPfu 缓冲液10μL，10 mM dNTPs1μL，上游/下游引物各2.5μL，DNA模板0.5 μL，FastPfu (TransGene)1.5μL，超纯水32μL。
PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸2min，35个循环；最后72℃延伸10min。
PCR产物进行纯化后，以第一轮PCR产物为模板，利用重叠PCR将启动子的DNA片段与绿色荧光基因融合在一起。第二轮PCR产物经PCR产物纯化后，与由限制性内切酶SpeI与XholI酶切处理的质粒pSilent-1 (GenBank: LT827033.1)，采用诺唯赞非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒（货号：C112-01）进行重组反应，然后转化至大肠杆菌Trans-T1。提取相应的重组质粒后，采用酶切与测序验证，获得潜在启动子Pro1与对照启动子P gpdA 介导的绿色荧光蛋白报告质粒pPro1-GFP与pP gpdA -GFP。
黑曲霉AB4.1原生质体悬液的制备与转化参照专利ZL201710380366.X。在冰上向预先冷却的15 mL离心管中加入100 μL原生质体悬液，然后分别加入5 μg各DNA片段介导的绿色荧光蛋白报告载体pPro1-GFP与pP gpdA -GFP，向其加入1 mL溶液C（Tris-HCl 10 mM，CaCl2 5.54 g/L，PEG6000 50% (w/v)，pH 7.5，过滤除菌）冰浴10 min，2 mL溶液B并混匀。与预热的含有潮霉素的上层培养基MMSH（0.95 M Sucrose,1% Glucose, 70 mM NaNO3, 7 mMKH2PO4, 7 mM KCl,2mM MgSO4）混匀后，再平铺至下层培养基MMSH平板上。将平板在30℃培养箱中培养3-5天，获得各DNA片段介导的荧光蛋白报告菌株，分别命名为AnPro1-GFP与AnP gpdA -GFP。
将获得的上述菌株的新鲜孢子悬浮于在50 ml CMA液体培养基中，在30℃、200 r/min的条件培养24 h。在480 nm下利用荧光共聚焦显微镜来观察各菌株培养物的荧光蛋白表达情况。结果如图1所示，与对照启动子P gpdA 相比，SEQ ID NO：1所示DNA片段的荧光蛋白报告菌株检测到了更强的荧光，这表明Pro1可启始下游基因的转录，具有启动子活性，且比已知的强启动子P gpdA 具有更强的活性。
实施例2 启动子Pro1在葡萄糖氧化酶表达中的应用效果
首先，采用葡萄糖氧化酶编码基因goxC的上游引物与下游引物，以黑曲霉AB4.1菌株的基因组为模板，进行PCR扩增葡萄糖氧化酶基因片段。具体引物序列如表2所示。
表2黑曲霉葡萄糖氧化酶表达载体构建的引物
PCR反应体系和反应条件同实施例1。
PCR产物进行纯化后，分别和由限制性内切酶HindIII与BglII酶切处理的质粒片段pPro1-GFP与pP gpdA -GFP，采用诺唯赞非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒（货号：C112-01）进行重组反应，然后转化至大肠杆菌Trans-T1。提取相应的重组质粒后，采用酶切与测序验证，获得各不同启动子介导下的葡萄糖氧化酶表达载体pPro1-GoxC与pP gpdA -GoxC，其中pP gpdA -GoxC作为对照。
然后，按照实施例1的方法将葡萄糖氧化酶表达载体pPro1-GoxC与pP gpdA -GoxC转化至黑曲霉菌株AB4.1，获得各启动子介导的葡萄糖氧化酶表达强化的黑曲霉菌株，分别命名为AnPro1-GoxC与AnP gpdA -GoxC。将黑曲霉葡萄糖氧化酶表达强化菌株AnPro1-GoxC与AnP gpdA -GoxC分别接种于马铃薯琼脂培养基PDA培养基（参见中国专利ZL201710380366.X）上30℃培养5天，然后用0.9%生理盐水收集孢子，并采用血球计数板进行孢子计数。以106/mL的接种量接种于黑曲霉蛋白发酵培养基（2％葡萄糖，2％麦芽糖，1.5％硫酸铵，4％胰蛋白酶消化的大豆培养液，0.1％磷酸二氢钠，0.1％硫酸镁），34℃，250 r/min培养96 h，然后采用抽滤方式分离获得发酵上清，即为粗酶液。
将粗酶液直接用缓冲液稀释至合适浓度测定葡萄糖氧化酶酶活。取4支试管，加入2mL缓冲液、0.3mL葡萄糖、0.4mL苯酚、0.1mL4-氨基安替吡啉、0.1mL辣根过氧化物酶，30℃预热5min。向其中一管加入0.1mL蒸馏水，作为空白调零。向样品管中加入0.1mL样品溶液，此时开始计时，涡旋混匀后立即在500nm波长处用1cm比色杯比色。读取0.5 min时吸光度值为A0，再反应1min后，读取吸光度值A1，得出ΔA500=A1-A0。酶活计算公式为ΔA500×酶液稀释倍数×反应液体积×1000/（887×反应时间×样品体积×比色皿的厚度）=33.82×ΔA500×酶液稀释倍数。其中，反应体积为3mL，1000为消光系数单位转换系数；887为消光系数(L·mol-1·cm-1）；反应时间为1 min；样品体积为0.1 mL；比色皿的厚度为1 cm。酶活单位定义在pH6.0，30℃条件下，每分钟能把1µmol的β-D-葡萄糖氧化为D-葡萄糖酸和过氧化氢所需要的酶量，定义为1个酶活力单位（U）。结果表明，SEQ ID NO：1所示的DNA片段不仅具有启动子活性，与目前商业应用中普遍认为的强启动子P gpdA 相比，该启动子介导下的葡萄糖氧化酶的酶活力达到3543 U/mL显著提升，比P gpdA 启动子介导下的葡萄糖氧化酶酶活提高了20-30%，这说明Pro1启动子具有强启动活性，是黑曲霉的强启动子，具有较好的应用效果。
实施例3 启动子Pro1在葡萄糖酸钠生产中的应用效果
将黑曲霉葡萄糖氧化酶表达强化菌株AnPro1-GoxC与AnP gpdA -GoxC分别接种于PDA培养基上30℃培养5天，然后用0.9%生理盐水收集孢子，并采用血球计数板进行孢子计数。以106/mL的接种量接种于葡萄糖酸钠发酵培养基（葡萄糖20%，玉米浆0.1%，磷酸二氢钾0.05%，硫酸镁0.025%），37℃，250 r/min培养48h。通过快速抽滤收集发酵上清，稀释10倍后，加热煮沸10 min，用滤膜过滤后用HPLC检测葡萄糖酸钠含量。具体检测条件为采用色谱柱C18-H(250mmX4.6mm，No. 366-1101, Sepax Technologies, Co.)，岛津UFLC高效液相色谱仪（配有岛津LC-20AD输液泵、SPD-20A UV检测器、CTO-20A/AC柱温箱、SIL-20ACHT UFLC规格自动进样器，岛津LCsution工作站），流动相3 M甲醇与0.25 M磷酸，流速为1 mL/min，进样量为20 uL，柱温28℃，紫外检测波长为210 nm。与强启动子P gpdA 介导的对照菌株相比，SEQ ID NO:1所示的启动子Pro1介导下的葡萄糖氧化酶过表达菌株的葡萄糖酸钠发酵水平达到196.13g/L，较对照菌株提升了30-50%，效果显著。
实施例4 Pro1启动子截短后的应用效果
为验证启动子截短后是否仍然具有启动子活性，以pPro1-GoxC为模板，以截短的启动子片段的上游引物与载体的下游引物进行反向扩增，来构建启动子截短后的葡萄糖氧化酶表达载体。Pro1启动子截短后为690bp，序列如SEQ ID NO: 2 所示。具体引物序列如表3所示。
表3柠檬酸外排蛋白黑曲霉表达载体构建的引物
PCR反应体系和PCR反应条件同实施例1。PCR产物进行纯化后，采用诺唯赞非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒（货号：C112-01）利用引物上的同源臂进行重组反应，然后转化至大肠杆菌Trans-T1。提取相应的重组质粒后，采用测序验证，获得启动子截短后的葡萄糖氧化酶表达载体pPro1-m-GoxC。
按照实施例1的方法将葡萄糖氧化酶表达载体pPro1-m-GoxC转化至黑曲霉菌株，获得Pro1启动子截短突变体介导的葡萄糖氧化酶表达强化的黑曲霉菌株，命名为AnPro1-m-GoxC，同时以AnPro1-GoxC菌株作为对照。按照实施例2与实施例3的葡萄糖氧化酶与葡萄糖酸钠的发酵方法与检测方法，对AnPro1-m-GoxC的葡萄糖氧化酶酶活与葡萄糖酸钠的生产水平进行检测。结果显示，与全长启动子相比，本实施例中截短后的启动子仍可起始葡萄糖氧化酶的表达，其酶活水平在3500 U/mL左右，其葡萄糖酸钠的生产水平与全长启动子相当。本实施例说明截短后的核酸序列仍然具有较强的启动子活性，也就是说只要含有截短后的核酸序列就可以完全具备启动子的功能。

Claims (13)

1.一种真菌来源的启动子元件，其特征在于，所述启动子元件选自如SEQ ID NO：1或2任一序列所示的核苷酸序列的多核苷酸。
2.一种转录表达盒，其特征在于，所述转录表达盒包括如权利要求1所述的启动子元件，以及与所述启动子元件可操作地连接的蛋白编码基因。
3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括如权利要求2所述的转录表达盒。
4.一种重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞中含有如权利要求2所述的转录表达盒，或如权利要求3所述的重组表达载体。
5.如权利要求4所述的重组宿主细胞，其特征在于，其是真菌。
6.如权利要求5所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述真菌为黑曲霉（Aspergillus niger），构巢曲霉（Aspergillus nidulans），米曲霉（Aspergillus oryzae），产黄青霉（Penicillium chrysogenum），里氏木霉（Trichoderma reesei），玉蜀黍黑粉菌（Ustilago maydis），嗜热毁丝霉（Myceliophthorathermophila）。
7.如权利要求1所述的启动子元件，或如权利要求2所述的转录表达盒，或如权利要求3所述的重组表达载体，或如权利要求4至6任一项所述重组宿主细胞在如下至少一个方面中的用途：
（a）用于增强基因的转录水平，或制备用于增强基因的转录水平的试剂或试剂盒；
（b）用于制备蛋白酶，或制备用于制备蛋白酶的试剂或试剂盒；
（c）用于生产有机酸，或制备用于生产有机酸的试剂或试剂盒。
8.如权利要求7所述用途，其特征在于，所述有机酸是葡萄糖酸、柠檬酸中的任一种；所述蛋白酶是葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶与植酸酶中的任一种。
9.一种调控目标基因转录的方法，其特征在于，通过将如权利要求1所述的启动子元件与目标基因可操作地连接的载体导入重组宿主细胞，增强所述重组宿主细胞中的目标基因的转录。
10.一种制备蛋白的方法，其特征在于，所述方法通过将如权利要求1所述的启动子元件与目标蛋白基因可操作地连接的载体导入重组宿主细胞，以表达所述目标蛋白。
11.一种有机酸或酶制剂的生产方法，其特征在于，所述方法包括培养如权利要求4至6任一项所述的重组宿主细胞以产生有机酸或酶，并收集产生的有机酸或酶的步骤，其中所述蛋白编码基因是与有机酸或酶合成相关蛋白的基因。
12.如权利要求11所述的生产方法，其特征在于，所述有机酸是葡萄糖酸、柠檬酸中的任一种；所述酶制剂中的酶是葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶与植酸酶中的任一种。
13.如权利要求11所述的生产方法，其特征在于，还包括将有机酸或酶制剂从培养后的发酵液中分离出来的步骤。
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