KR20180037237A

KR20180037237A - 프로모터 변이체

Info

Publication number: KR20180037237A
Application number: KR1020187006217A
Authority: KR
Inventors: 디트하드 마타노비치; 브리지트 개서; 롤랜드 프리엘호퍼
Original assignee: 론자 리미티드
Priority date: 2015-08-05
Filing date: 2016-08-05
Publication date: 2018-04-11
Also published as: US20200347391A1; JP6833812B2; DK3332005T3; CN108350447B; IL257000A; IL257000B; KR102253479B1; AU2016303026B2; EP3332005A1; CA2992170C; US10752907B2; JP2018522565A; BR112018002395A2; ES2902044T3; CN108350447A; AU2016303026A1; WO2017021541A1; TW201718859A; US20180223293A1; CA2992170A1

Abstract

서열번호 1에 의해 확인되는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)의 탄소원 조절가능한 pG1 프로모터의 기능성 변이체인 단리된 및/또는 인공 pG1-x 프로모터로서, 상기 pG1-x 프로모터는 하기 프로모터 영역: a) 뉴클레오티드 서열 서열번호 2 및 서열번호 3을 포함하는 적어도 하나의 코어 조절 영역; 및 b) pG1-x 프로모터 서열 내의, 코어 조절 영역 이외의 다른 임의 영역인 비-코어 조절 영역을 특징으로 하는, 길이가 적어도 293 bp인, 서열번호 1의 적어도 일부로 이루어지거나, 또는 그를 포함하고; 여기서, pG1-x 프로모터는 프로모터 영역 중 임의의 것에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 서열번호 2 및 서열번호 3에서 적어도 80%의 서열 동일성, 및 서열번호 2 또는 서열번호 3 이외의 다른 임의 영역에서 적어도 50%의 서열 동일성을 포함하고; 추가로 여기서, pG1-x 프로모터는 pG1 프로모터와 비교하여 동일하거나, 또는 증가된 프로모터 강도 및 유도비를 특징으로 하고, 여기서, - 프로모터 강도는 pG1 프로모터와 비교하여 유도된 상태에서 적어도 1.1배 증가되어 있고/거나, - 유도비는 pG1 프로모터와 비교하여 적어도 1.1배 증가되어 있는 것인, 단리된 및/또는 인공 pG1-x 프로모터.

Description

프로모터 변이체

본 발명은 본원에서 pG1-x로서 지칭되며, 특정 프로모터 요소 및 특성을 특징으로 하는 것인, 서열번호 1에 의해 확인되는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)의 탄소원 조절가능한 pG1 프로모터의 기능성 변이체 또는 유도체인 단리된 인공 프로모터와 관련이 있다.

메틸영양성 효모 피치아 파스토리스 (동의어: 코마가타엘라 종(Komagataella sp.))는 잘 확립된 단백질 생산 숙주이다. P. 파스토리스(P. pastoris)에 대한 수많은 균주 조작 접근법이 각종의 생성물을 위한 생산성을 개선시켰고, 이는 또한 생산 목적으로 프로모터에 헌신적 노력을 기울여 왔다 (문헌 [Prielhofer, R., M. Maurer, J. Klein, J. Wenger, C. Kiziak, B. Gasser & D. Mattanovich, (2013) Induction without methanol: novel regulated promoters enable high-level expression in Pichia pastoris. Microb Cell Fact 12: 5]). 유전자 프로모터는 관심 유전자 (GOI)의 발현을 위해 중요한 특징이며; 하류 (3') GOI의 RNA의 전사는 상류 (5') 프로모터 서열에 의해 구동된다. RNA 폴리머라제 II (RNAPII)는 진핵생물에서 mRNA의 전사를 담당한다. RNAPII 프로모터는 코어 프로모터 및 수개의 시스-작용 DNA 요소: 인접 프로모터, 인핸서, 사일렌서 및 경계/인슐레이터 요소로 이루어진다. 효모 코어 프로모터는 전형적으로 주요 전사 개시 부위에 가깝게 위치하고 (-75/+50 bp), 이는 빈번하게는 부적절한 TATA 박스를 함유하며 (TATA 컨센서스 서열과 비교하여 최대 2개의 염기가 차이가 남), 다른 유기체에서는 전형적으로 발견되는 프로모터 요소가 없다. 전사 조절은 상이한 조건에 대해 반응하고, 시스-작용 요소 및 상응하는 조절 단백질 (전사 인자 (TF))을 통해서 수행된다.

생명 공학적 적용을 위해, 구성적 또는 조절식/유도식 유전자 발현을 허용하는 프로모터가 사용된다. P. 파스토리스를 이용하는 제조 프로세스는 탄소원 의존성 프로모터, 예컨대, 메탄올 유도성 P_AOX를 사용한다. 이로써, 성장 단계는, 잠재적으로는 부담이 되는 단백질 제조 단계로부터 분리될 수 있다. 프로모터 세트는 또한 탄소원에 의해 제어되지만, 유도를 위해서는 메탄올에 의존하지 않고: 상기 프로모터는 과도한 글리세롤에 의한 억제, 및 글루코스 제한에 의한 유도라는 특성을 공유한다고 최근 보고되었다 (문헌 [Prielhofer et al., 2013]). 상기 프로모터들 중 가장 강력한 것인 pG1 (서열번호 1)은 0.05 g/L 글루코스 미만에서 완전히 유도되고; 이는 천연적으로 fa 고친화성 글루코스 수송체 유전자 GTH1의 발현을 제어한다. 글루코스 흡수 특징은 고친화성 및 저친화성 글루코스 수송체의 존재에 의존한다. S. 세레비지아에(S. cerevisiae)에서의 17개의 헥소스 수송 (HXT) 유전자 (HXT1 - 17)는 글루코스 농도에 의존하여 발현되지만, P. 파스토리스에서는 단 2개의 HXT 상동체만이 발견된다 (PAS_chr1-4_0570 및 PAS_chr2-1_0054, PpHxt1 및 PpHxt2로 명명됨). PpHxt1은 P. 파스토리스에서의 주요 저친화성 수송체인 것으로 확인된 반면, 고친화성 글루코스 수송은 다른 두 유전자, 즉, PAS_chr3_0023 및 PAS_chr1-3_0011 (GTH1, pG1에 의해 제어되는 유전자)에 의해 촉진된다 (문헌 [Prielhofer et al., 2013]).

S. 세레비지아에는 글루코스 흡수 및 (발효) 글루코스 대사 능력이 크다는 것을 특징으로 하지만, P. 파스토리스는 글루코스 흡수율 및 글루코스의 호흡 대사가 더 낮다. 추가로, P. 파스토리스는 S. 세레비지아에보다 훨씬 더 낮은 세포외 농도의 글루코스를 흡수할 수 있다 (고친화성 수송체의 K_M은 S. 세레비지아에의 경우, mM 범위인데 비해 P. 파스토리스의 경우, μM 범위). 글루코스 흡수 거동에서의 근본적 차이는 관련된 유전자의 전사 제어에서도 또한 나타나며, 이는 또한 전사 조절인자, 예컨대, PpAft1 및 PpMxr1 (ScAdr1의 상동체)의 진화된 기능에서도 또한 관찰될 수 있다.

P_AOX1 및 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제의 프로모터인 P_GAP의 P. 파스토리스 프로모터 연구 및 무작위 돌연변이유발법을 통해 야생형 프로모터와 비교하였을 때, 상이한 활성을 가지고, 유도 거동이 변경된 프로모터 변이체를 포함하는 라이브러리를 생성하였고, P_AOX1의 수개의 중요한 전사 인자 결합 부위 (TFBS)를 확인할 수 있었다 (WO2006/089329 A2).

pG1 프로모터 및 그의 단편이 WO2013/050551 A1에 추가로 기술되어 있다.

WO2014067926A1에는 특정 리더 서열을 사용하는 관심 단백질의 발현이 개시되어 있다. 리더는 다양한 프로모터와 함께 사용되었다. 예시적인 프로모터로서, pG1 프로모터가 사용된다.

슈트룰 K.(Struhl K.) (문헌 [Proceedings of the National Academy of Sciences of the United 상태s of America 1982, 78(7):4461-4465])는 효모 his3 프로모터 영역의 결실 맵핑을 기술하였다. 그는 대부분의 진핵생물 유전자의 앞쪽에 있는 서열인 T-A-T-A 박스는 야생형 프로모터 기능을 위해서는 충분하지 않다는 결론을 얻었고, 효모 프로모터가 RNA 폴리머라제와 DNA 사이의 단순한 상호작용 부위보다 더 복잡합 것으로 보인다고 제안하였다.

콴트(Quandt) 등 (문헌 [핵산s Research 1995, 23(23)4878-4884])은 서열 데이터 분석에 기초하여 조절 모티프를 확인하기 위하여 뉴클레오티드 서열 데이터 중의 컨센서스 매치를 검출하기 위한 도구를 기술하였다. 소프트웨어 도구 (매트인스펙터(MatInspector))를 사용하여 컨센서스 패턴 라이브러리를 생성하고, 잠재적인 서열 매치를 검출하였다.

본 발명의 목적은 탄소원 조절 및 프로모터 강도와 관련하여 개선된 조절가능한 프로모터를 제공하고자 하는 것이다. POI 제조 증진 및/또는 단축된 기간 내의 POI 제조를 위해 상기와 같은 프로모터를 제공하는 것이 추가 목적이다.

본 목적은 청구하는 바와 같은 본 주제에 의해 해결된다.

본 발명에 따라, 서열번호 1에 의해 확인되는 피치아 파스토리스의 탄소원 조절가능한 pG1 프로모터의 기능성 변이체인 단리된 및/또는 인공 pG1-x 프로모터로서, 상기 pG1-x 프로모터는 하기 프로모터 영역:

a) 뉴클레오티드 서열 서열번호 2 및 서열번호 3을 포함하는 적어도 하나의 코어 조절 영역; 및

b) pG1-x 프로모터 서열 내의, 코어 조절 영역 이외의 다른 임의 영역인 비-코어 조절 영역을 특징으로 하는, 길이가 적어도 293 bp인, 서열번호 1의 적어도 일부로 이루어지거나, 또는 그를 포함하고;

여기서, pG1-x 프로모터는 프로모터 영역 중 임의의 것에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 서열번호 2 및 서열번호 3에서 적어도 80%의 서열 동일성, 및 서열번호 2 또는 서열번호 3 이외의 다른 임의 영역에서 적어도 50%의 서열 동일성을 포함하고; 추가로

여기서, pG1-x 프로모터는 pG1 프로모터와 비교하여 동일하거나, 또는 증가된 프로모터 강도 및 유도비를 특징으로 하고, 여기서,

- 프로모터 강도는 pG1 프로모터와 비교하여 유도된 상태에서 적어도 1.1배 증가되어 있고/거나,

- 유도비는 pG1 프로모터와 비교하여 적어도 1.1배 증가되어 있는 것인, 단리된 및/또는 인공 pG1-x 프로모터를 제공한다.

구체적으로, 서열번호 1에 의해 확인되는 피치아 파스토리스의 pG1 프로모터는 실시예에서 참조로서 본원에서 사용되는 바와 같이, 서열번호 7, 8, 또는 9 중 임의의 것, 더욱 구체적으로, 서열번호 9이다.

구체적으로, pG1-x 프로모터는 pG1 (서열번호 264)로 명명되는 선행 기술의 프로모터 중 임의의 것, 또는 WO2013050551 A1에 기술된 바와 같은, pG1a (서열번호 265), pG1b (서열번호 266), pG1c (서열번호 267), pG1d (서열번호 268), pG1e (서열번호 269), 또는 pG1f (서열번호 270) 중 임의의 것이 아니다.

구체적인 실시양태에 따라, 본 발명에 따른 pG1-x 프로모터는

- pG1 프로모터와 비교하여 유도된 상태에서 적어도 1.1배, 또는 적어도 1.2배, 또는 적어도 1.3배, 또는 적어도 1.4배, 또는 적어도 1.5배, 또는 적어도 1.6배, 또는 적어도 1.7배, 또는 적어도 1.8배, 또는 적어도 1.9배, 또는 적어도 2배, 또는 적어도 2.1배, 또는 적어도 2.2배, 또는 적어도 2.3배, 또는 적어도 2.4배, 또는 적어도 2.5배, 또는 적어도 2.6배, 또는 적어도 2.7배, 또는 적어도 2.8배 증가된, 또는 적어도 2.9배, 또는 적어도 3배, 또는 적어도 3.3배, 또는 적어도 3.5배, 또는 적어도 3.8배, 또는 적어도 4배, 또는 적어도 4.5배, 또는 적어도 5배, 또는 적어도 5.5배, 또는 적어도 6배 증가된 프로모터 강도, 및

- pG1 프로모터로 달성되는 유도비와 비교하여 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 유도비에 의해 측정되는 바와 같이, 탄소원에 의해 조절될 수 있는 능력을 특징으로 하는, 탄소원 조절가능한 프로모터이다.

구체적인 추가의 실시양태에 따라, 본 발명에 따른 pG1-x 프로모터는

- pG1 프로모터와 비교하여 유도된 상태에서 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 프로모터 강도, 및

- pG1 프로모터로 달성되는 유도비와 비교하여 적어도 1.1배, 또는 적어도 1.2배, 또는 적어도 1.3배, 또는 적어도 1.4배, 또는 적어도 1.5배, 또는 적어도 1.6배, 또는 적어도 1.7배, 또는 적어도 1.8배, 또는 적어도 1.9배, 또는 적어도 2배, 또는 적어도 2.1배, 또는 적어도 2.2배, 또는 적어도 2.3배, 또는 적어도 2.4배, 또는 적어도 2.5배, 또는 적어도 2.6배, 또는 적어도 2.7배, 또는 적어도 2.8배 증가된, 또는 적어도 2.9배, 또는 적어도 3배, 또는 적어도 3.3배, 또는 적어도 3.5배, 또는 적어도 3.8배, 또는 적어도 4배, 또는 적어도 4.5배, 또는 적어도 5배, 또는 적어도 5.5배, 또는 적어도 6배 증가된 유도비에 의해 측정되는 바와 같이, 탄소원에 의해 조절될 수 있는 능력을 특징으로 하는, 탄소원 조절가능한 프로모터이다.

구체적으로, 프로모터 강도는 pG1 프로모터와의 비교로 관심 단백질 (POI), 예컨대, 모델 단백질 (예컨대, 녹색 형광 단백질, GFP (예컨대, 증강된 GFP, eGFP 포함), 진 뱅크 수탁 번호 U57607)의 발현 수준 및/또는 전사율에 의해 측정된다. pG1-x의 프로모터 강도는 구체적으로, 예를 들어, pG1 프로모터와 비교하여 적어도 1.2배, 또는 적어도 1.3배, 또는 적어도 1.4배, 또는 1.5배, 또는 적어도 1.6배, 또는 적어도 1.7배, 또는 적어도 1.8배, 또는 적어도 1.9배, 또는 적어도 2배, 또는 적어도 2.1배, 또는 적어도 2.2배, 또는 적어도 2.3배, 또는 적어도 2.4배, 또는 적어도 2.5배, 또는 적어도 2.6배, 또는 적어도 2.7배, 또는 적어도 2.8배 증가된, 또는 적어도 2.9배, 또는 적어도 3배, 또는 적어도 3.5배, 또는 적어도 4배, 또는 적어도 4.5배, 또는 적어도 5배, 또는 적어도 5.5배, 또는 적어도 6배, 또는 적어도 6.5배, 또는 적어도 7배, 또는 적어도 7.5배, 또는 적어도 8배, 또는 적어도 8.5배, 또는 적어도 9배, 또는 적어도 9.5배, 또는 적어도 10배 증가되어 있다.

본원에서, pG1 프로모터는 개선된 프로모터 기능을 측정하기 위한 참조 또는 대조군으로서의 역할을 할 수 있다. 상기 대조군 pG1 프로모터는 동일한 숙주 세포 및 발현 시스템을 사용하는 평행 대조군 실험에서, 또는 동일한 숙주 세포 배양물 내의 내부 대조군으로서 사용될 수 있다. pG1 프로모터와 비교하여 프로모터 기능을 정량화하는 상기 대조군 실험은 바람직하게, P. 파스토리스 숙주 세포 배양물에서, 특히, 모델 단백질, 예컨대, GFP 또는 eGFP를 발현하는 재조합 P. 파스토리스에서 수행된다.

pG1-x 프로모터 유도는 구체적으로 상기 POI의 전사의 유도, 구체적으로 상기 POI의 추가 번역 및 임의적 발현을 포함하는 전사의 유도를 지칭한다.

상기 전사율은 프로모터 강도의 척도로서 측정되고, 이는 구체적으로 상기 프로모터를 완전히 유도하였을 때 수득되는 전사체의 양을 지칭한다.

상기 전사율은 예컨대, 글루코스 제한된 케모스타트 배양 조건하에서 수득되고, pG1 프로모터의 전사율 대비 상대적인 값으로 표시되는, 완전한 유도된 상태에서의 전사 강도에 의해 측정될 수 있다.

바람직하게, 전사 분석은 바람직하게, qRT-PCR, DNA 마이크로어레이, RNA 서열분석 및 트랜스크립톰 분석을 사용하는, 정량적 또는 반-정량적 분석이다.

하기 표준 검정법에 의해 pG1 프로모터 강도 대비 프로모터 강도를 측정할 수 있다: 시험하고자 하는 프로모터의 제어하에 eGFP를 발현하는 P. 파스토리스 균주를 웰당 2 mL 배양물을 이용하여 280 rpm으로 진탕시키면서, 25℃에서 24 딥 웰 플레이트 중에서 스크리닝한다. 글루코스 공급 비드 (6 mm, 쿠너(Kuhner: 스위스))를 사용하여 글루코스 제한 성장 조건을 생성한다. 유도된 상태에서 (YP + 1 공급 비드, 20-28시간 동안) eGFP 발현에 대해 세포를 분석한다.

배양 조건이 예컨대, 0.4 g/L 미만, 바람직하게, 0.04 g/L 미만, 구체적으로, 0.02 g/L 미만인 글루코스 농도에서 대략 최대로 유도한다면, 상기 프로모터는 탈억제되고, 완전히 유도된 것으로 간주된다. 완전히 유도된 프로모터는 천연 pGAP 프로모터와 비교하여 바람직하게, 적어도 20%, 더욱 바람직하게, 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 및 적어도 100%의 전사율, 또는 적어도 150% 또는 적어도 200%인 더욱 더 높은 전사율을 나타낸다. 전사율은 예를 들어, 액체 배양물 중에서 클론을 배양할 때, 예컨대, 하기 실시예 섹션에 기술되어 있는 바와 같이, 리포터 유전자, 예컨대, eGFP의 전사체의 양에 의해 측정될 수 있다. 대안적으로, 전사율은 마이크로어레이 상에서의 전사 강도에 의해 측정될 수 있으며, 여기서, 마이크로어레이 데이터는 억제된 상태와 탈억제된 상태 사이의 발현 수준 차이, 및 대조군과 비교하여 완전히 유도된 상태에서 높은 신호 강도를 나타낸다.

상기 천연 pGAP 프로모터는 구체적으로 POI의 발현을 측정하기 위해 숙주 세포로서 사용될 수 있는 진핵 세포에 내인성이거나, 또는 그와 상동성인 프로모터이고, 이는 비교 목적의 표준 또는 참조 프로모터로서의 역할을 한다.

예를 들어, P. 파스토리스의 천연 pGAP 프로모터는 예컨대, 도 7에 제시된 서열: P. 파스토리스 (GS115)의 천연 pGAP 프로모터 서열 (서열번호 260)을 가지는, P. 파스토리스에서 GAPDH의 발현을 제어하기 위해 사용되는, P. 파스토리스에서의 비변형된, 내인성 프로모터 서열이다. P. 파스토리스가 본 발명에 따라 POI를 제조하기 위한 숙주로서 사용된다면, 본 발명에 따른 pG1-x 프로모터의 전사 강도 또는 전사율은 P. 파스토리스의 상기 천연 pGAP 프로모터와 비교되고/거나, 천연 pG1 프로모터와 비교된다.

또 다른 예로서, S. 세레비지아에의 천연 pGAP 프로모터는 S. 세레비지아에에서 GAPDH의 발현을 제어하기 위해 사용되는, S. 세레비지아에에서의 비변형된, 내인성 프로모터 서열이다. S. 세레비지아에가 POI를 제조하기 위한 숙주로서 사용된다면, pG1-x 프로모터의 전사 강도 또는 전사율은 S. 세레비지아에의 상기 천연 pGAP 프로모터와 비교된다.

그러므로, 본 발명에 따른 프로모터의 상대적인 전사 강도 또는 전사율은 보통 POI를 제조하기 위한 숙주로서 사용되는 동일한 종 또는 균주의 세포의 천연 pGAP 프로모터와 비교된다.

유도비는 본 pG1-x 프로모터의 조절을 측정하는 데 중요한 파라미터이고, 억제된 상태에서의 프로모터 활성 또는 강도에 대한 유도된 상태에서의 프로모터 활성 또는 강도로 설정된다. 예를 들어, 억제된 상태에서의 모델 단백질 (예컨대, GFP 또는 eGFP)의 발현 수준 및/또는 전사율은 과도한 글리세롤에 의한 억제시에 측정되고, 유도된 상태에서의 모델 단백질의 발현 수준 및/또는 전사율은 글루코스 공급을 제한함으로써 유도시에 측정된다.

구체적으로, 유도비는 억제된 상태 대비 유도된 상태에서의 발현 수준 (예컨대, GFP 또는 eGFP)의 비로 측정된다. pG1-x 프로모터의 유도비는 구체적으로 pG1 프로모터와 비교하여 동일하거나, 또는 그보다 더 높다. 구체적인 경우에, 유도비는 pG1 프로모터와 비교하여 적어도 2배, 또는 적어도 3배, 또는 적어도 4배, 적어도 5배, 또는 적어도 6배, 또는 적어도 7배, 적어도 8배, 또는 적어도 9배, 또는 적어도 10배 증가되어 있다.

pG1 프로모터 강도와 비교되는 유도비는 하기 표준 검정법에 의해 측정될 수 있다: 시험하고자 하는 프로모터의 제어하에 eGFP를 발현하는 P. 파스토리스 균주를 웰당 2 mL 배양물을 이용하여 280 rpm으로 진탕시키면서, 25℃에서 24 딥 웰 플레이트 중에서 스크리닝한다. 글루코스 공급 비드 (6 mm, 쿠너: 스위스)를 사용하여 글루코스 제한 성장 조건을 생성한다. 억제 (YP + 1% 글리세롤, 지수 증식기) 및 유도 (YP + 1 공급 비드, 20-28시간 동안) 동안 eGFP 발현에 대해 세포를 분석한다.

구체적으로, pG1-x 프로모터는 탈억제된 (유도된) 상태에서 억제된 상태에서의 것보다 적어도 2.5배, 또는 적어도 3배, 또는 적어도 4배, 적어도 5배, 또는 적어도 6배, 또는 적어도 7배, 적어도 8배, 또는 적어도 9배, 또는 적어도 10배 더 높은 프로모터 활성 또는 강도 (예컨대, 전사 활성 또는 전사 강도)를 가진다.

구체적으로, 코어 조절 영역은 뉴클레오티드 서열 서열번호 2 및 서열번호 3을 도입하는데, 이는 서열 서열번호 2 및 3이 pG1-x 프로모터 서열에 임의 순서로, 바람직하게, 서로 매우 근접하게, 예컨대, 서열 서열번호 2 및 3 사이는 최대 10, 20, 50 또는 100 bp가 되게 포함되어 있다는 것을 의미한다.

구체적으로, 서열번호 2 및/또는 서열번호 3은 하나 이상의 전사 인자 결합 부위 (TFBS)를 함유한다.

구체적으로, 서열번호 2 및 서열번호 3 뉴클레오티드 서열은 그들 각각이 또는 그 둘 모두가 함께 TFBS, 또는 각 전사 인자에 의해 인식되며, 기능성인 것으로 간주되는 그의 적어도 일부를 나타낸다. 상기 서열번호 2 또는 서열번호 3 뉴클레오티드 서열 (또는 그의 기능성 변이체)은 필수적인 것으로 간주되며, 이는 pG1-x 프로모터에 비변형된 형태로, 또는 적어도 80%의 서열 동일성, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 최대 100%의 서열 동일성을 가지는 그의 기능성 변이체로서 도입된다.

구체적으로, pG1-x 프로모터는 pG1 프로모터 중의 상응하는 영역과 적어도 50%의 서열 동일성, 구체적으로, 코어 조절 영역 중 또는 비-코어 조절 영역 중에 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 가지는, 서열번호 2 및 서열번호 3 이외의 다른 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 구체적으로, 서열번호 2 및 서열번호 3 이외의 다른 임의의 것인, 코어 조절 영역 내의 뉴클레오티드 서열은 pG1 프로모터 중의 상응하는 영역과 적어도 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 98%의 서열 동일성을 가진다. 구체적으로, 비-코어 조절 영역 중의 뉴클레오티드 서열은 pG1 프로모터 중의 상응하는 영역과 90% 미만, 또는 80% 미만, 또는 70% 미만, 또는 60% 미만의 서열 동일성을 가질 수 있다.

구체적으로, 코어 조절 영역은 뉴클레오티드 서열 서열번호 4, 또는 TFBS를 포함하는 그의 기능성 변이체, 바람직하게, 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 98%의 서열 동일성을 가지는 기능성 변이체를 포함하거나, 또는 그로 이루어진다.

구체적으로, 코어 조절 영역은 서열번호 5로 제시되는 주요 조절 영역, 또는 TFBS를 포함하는 그의 기능성 변이체, 바람직하게, 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 98%의 서열 동일성을 가지는 기능성 변이체 내로 도입된다.

구체적으로, 하나 이상의 TFBS는 Rgt1, Cat8-1 및 Cat8-2로 이루어진 군으로부터 선택되는 전사 인자 중 임의의 것에 대한 TFBS이다.

구체적으로, TFBS는 전사 인자 Rgt1 및/또는 Cat8-1 및/또는 Cat8-2에 의해 인식된다. TFBS는, 동일 인자에 대해서도 달라질 수 있는 특정 컨센서스 서열을 특징으로 한다. 구체적인 전사 인자는 하기와 같이 확인된다:

Rgt1은 글루코스-반응성 전사 활성인자 및 억제인자이고, 수개의 글루코스 수송체 (HXT) 유전자의 발현을 조절한다. P. 파스토리스의 Rgt1은 아미노산 서열 서열번호 261 (도 7)을 특징으로 한다.

Cat8-1 및 Cat8-2는 비-발효 성장 조건하에서의 다양한 유전자의 탈억제에 필요한, 탄소원 반응 요소에 결합하는 아연 클러스터 전사 활성인자이다. P. 파스토리스의 Cat8-1 및 Cat8-2는 각각 아미노산 서열 서열번호 262 및 263 (도 7)을 특징으로 한다.

구체적으로, 코어 조절 영역은 뉴클레오티드 서열 서열번호 2 및 서열번호 3 사이에 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 결실은 하나 이상의 점 돌연변이일 수 있고, 서열번호 2 및 서열번호 3 사이에 위치하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개, 또는 9개의 모든 뉴클레오티드를 지칭한다.

구체적으로, 코어 조절 영역은 뉴클레오티드 서열 서열번호 2 및 서열번호 3 사이에 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입을 포함한다. 삽입은 하나 이상의 점 돌연변이일 수 있고, 서열번호 2 및 서열번호 3 사이에 위치하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개, 또는 10개의 모든 뉴클레오티드를 지칭한다.

구체적으로, 코어 조절 영역은 뉴클레오티드 서열 서열번호 2 및 서열번호 3 사이에 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환을 포함한다. 치환은 하나 이상의 점 돌연변이일 수 있고, 서열번호 2 및 서열번호 3 사이에 위치하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개, 또는 9개의 모든 뉴클레오티드를 지칭한다.

특정 결실, 삽입, 또는 치환 중 임의의 것을 조합하여 pG1-x 프로모터를 수득할 수 있다.

한 구체적인 측면에 따라, pG1-x 프로모터는, 원래의 코어 조절 영역 또는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 기능성 변이체인, 코어 조절 영역 또는 주요 조절 영역의 카피를 적어도 2개 포함한다. 구체적으로, pG1-x 프로모터는 코어 조절 영역의 카피를 적어도 2, 3, 또는 4개 및/또는 주요 조절 영역의 카피를 적어도 2, 3, 또는 4개 포함할 수 있다.

또 다른 구체적인 측면에 따라, pG1-x 프로모터는 Rgt1, Cat8-1 및 Cat8-2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 TFBS의 카피를 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 포함한다.

구체적으로, pG1-x 프로모터는 바람직하게는 pG1 서열의 3' 영역의 적어도 280개의 뉴클레오티드 또는 3' 영역의 기능성 변이체는 그대로 남겨 두면서, pG1 서열의 5' 단부에 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실을 포함하는, pG1 프로모터의 개선된 기능성 변이체이다.

구체적인 실시양태에 따라, pG1-x 프로모터는 서열번호 12-29 중 임의의 것에 의해 확인되는 적어도 하나의 또는 적어도 2개의 T 모티프를 포함한다. T 모티프는 구체적으로

a) 본원에서 T_n 또는 (T)_n으로 지칭되고, 바람직하게, 여기서, n=13-20인, 인접 T (티민)로 이루어진 서열; 바람직하게, 여기서, T 모티프는 T14, T15, 또는 T16인 것;

b) 본원에서 ATn 또는 A(T)_n으로 지칭되고, 바람직하게, 여기서, n=13-20, 일부 경우에서, 바람직하게, 여기서, n=13-22인, 제1 위치에 A (아데닌), 이어서, 인접 T (티민)로 이루어진 서열을 특징으로 하는 것인 서열;

c) 본원에서 TATn 또는 TA(T)_n으로 지칭되고, 바람직하게, 여기서, n=13-20인, 제1 위치에 T (티민), 및 제2 위치에 (아데닌), 이어서, 인접 T (티민)로 이루어진 서열을 특징으로 하는 것인 서열;

d) 본원에서 TnA 또는 (T)_nA으로 지칭되고, 바람직하게, 여기서, n=13-20인, 인접 T (티민)로 이루어진 서열 및 마지막 위치에 A (아데닌)를 특징으로 하는 것인 서열;

e) 본원에서 TnAT 또는 (T)_nAT로 지칭되고, 바람직하게, 여기서, n=13-20인, 인접 T (티민)로 이루어진 서열, 이어서, 마지막에서 두 번째 위치에 A (아데닌), 및 마지막 위치에 T (티민)를 특징으로 하는 것인 서열; 또는

d) 본원에서 TTTn 또는 TnTT 또는 T(A/T)Tn 또는 T(A/T)(T)_n, 또는 Tn(A/T)T 또는 (T)_n(A/T)T로 지칭되고, 바람직하게, 여기서, n=13-20인, A (아데닌)이 T (티민)으로 치환된, 이로써, 예컨대, n=15-22인 (T)_n으로 이루어진 서열로 이루어진 T 모티프가 생성되는 것인, c) 또는 e)의 서열 중 임의의 것으로 이루어진다.

상기 a) 내지 d) 하에 언급된 T 모티프 중 임의의 것은 한 프로모터 서열로 조합될 수 있고, 이로써, 예컨대, 프로모터 서열은 n=13-20인 TA(T)_n 모티프인 한 T 모티프, 및 n=13-22인 (T)_n 모티프인 또 다른 T 모티프를 포함한다.

T 모티프는 임의적으로 연장부를 포함하고, 이로써, 이는 T 모티프의 3' 단부에서 및/또는 5' 단부에서 하나 이상의 "A" (예컨대, 1, 2, 또는 3개의 아데닌)에 의해 연장되고, 임의적으로 "T" (예컨대, 1, 2, 또는 3개의 티민)에 의해 추가로 연장되고, 상기 연장부는 또한 본원에서 연장된 T 모티프로 지칭된다.

본원에서 "T 모티프"라는 용어는 항상 연장되거나, 또는 연장되지 않은 T 모티프를 포함하여야 하고, 따라서, 상기 용어는 구체적으로 연장부를 포함하지 않는 T 모티프, 또는 연장된 T 모티프, 이 둘 모두를 포함한다.

구체적으로, T 모티프는 서열번호 12-29 중 임의의 것인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 그로 이루어진다. T 모티프 중 임의의 1개, 2개 또는 그 초과의 것은 모티프 연장부와 함께 또는 그를 포함하지 않고, pG1-x 프로모터 내로 도입될 수 있다.

한 구체적인 측면에 따라, T 모티프 연장부는 그의 5' 단부에의 "TA" 서열 신장부이며, 이로써, "TAT" 5' 단부를 수득할 수 있다.

또 다른 구체적인 측면에 따라, T 모티프 연장부는 그의 5' 단부에의 "TAA" 서열 신장부이며, 이로써, "TAAT" 5' 단부를 수득할 수 있다.

또 다른 구체적인 측면에 따라, T 모티프 연장부는 그의 3' 단부에의 "AT" 서열 신장부이며, 이로써, "TAT" 3' 단부를 수득할 수 있다.

또 다른 구체적인 측면에 따라, T 모티프 연장부는 그의 3' 단부에의 "AAT" 서열 신장부이며, 이로써, "TAAT" 3' 단부를 수득할 수 있다.

한 구체적인 측면에 따라, T 모티프는 코어 조절 영역 상류 및 임의로 주요 조절 영역 상류에 위치한다.

또 다른 구체적인 측면에 따라, T 모티프는 코어 조절 영역 하류 및 임의로 주요 조절 영역 하류에 위치한다.

구체적으로, pG1-x 프로모터는 번역 개시 부위의 적어도 일부를 도입한, 3'-말단 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 번역 개시 부위는 구체적으로 진핵생물에서 코작(Kozak) 컨센서스 서열로서, 및 유전자 발현을 지원하는 적합한 서열로서 공지되어 있다.

구체적으로, 번역 개시 부위는

a) pG1 프로모터로부터 기원하고, 뉴클레오티드 서열 서열번호 6, 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 가지는 그의 기능성 변이체로 이루어지거나, 또는 그를 포함하거나; 또는

b) 피치아 파스토리스의 임의의 다른 프로모터, 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 가지는 그의 기능성 변이체로부터 기원한다.

pG1 프로모터의 3'-말단 영역 대신, 또는 뉴클레오티드 서열 서열번호 6 대신 사용될 수 있는 예시적인 대안적 3'-말단 프로모터 영역은 예컨대, 하기 프로모터: pAOX1, pAOX2, pDAS1, pDAS2, pFLD, pGAP, 또는 pTEF2 중 임의의 것으로부터 유래된 것이다.

구체적인 실시양태에 따라, 프로모터 길이는 최대 2,000 bp이다. 특정 pG1-x 프로모터 길이는 pG1 프로모터보다 짧고, 예컨대, 길이는 적어도 293 bp 또는 300 bp, 또는 적어도 328 bp, 또는 적어도 350 bp 또는 적어도 400 bp, 또는 적어도 500 bp이다.

구체적으로, pG1-x 프로모터는 pG1 프로모터의 단편으로부터 기원하는 서열을 포함할 수 있다. 한 구체적인 측면에 따라, pG1-x 프로모터는 pG1 서열의 적어도 50%, 또는 60%, 또는 70%, 또는 80%, 또는 적어도 90%까지 연장된, 적어도 서열번호 1의 3'-영역을 포함하는, pG1의 모체 단편의 변이체 또는 유도체이다.

구체적으로, pG1-x 뉴클레오티드 서열은 3' 단부에서부터 다양한 5' 단부까지 길이가 예컨대, 적어도 293 bp 또는 300 bp, 또는 적어도 328 bp, 또는 적어도 350 bp, 또는 적어도 400 bp, 또는 적어도 500 bp의 뉴클레오티드 서열 길이, 최대 적어도 1, 또는 적어도 10, 또는 적어도 100 bp의 결실을 포함하는 pG1 프로모터 단편 길이인 범위의 특정 길이를 수득하기 위해, 5' 말단 영역의 결실, 또는 5' 말단 영역에 결실, 예컨대, 5' 단부에서의 뉴클레오티드 서열의 컷-오프를 포함하는, pG1 프로모터 뉴클레오티드 서열로부터 유래된 것이다.

그러나, 프로모터 길이는 또한 예컨대, pG1 프로모터의 길이보다 더 긴 길이, 구체적으로 최대 1,500 bp, 또는 최대 2,000 bp인 길이를 수득하기 위해 증가될 수 있다. 구체적으로, 길이는 293 bp - 1,500 bp, 293 bp - 2,000 bp, 328 bp - 1,500 bp, 또는 328 - 2,000 bp 범위 중 임의의 것 내에 있을 수 있다.

한 구체적인 측면에 따라, 본 발명은

a) 서열번호 37-44, 바람직하게, 서열번호 45-76 중 임의의 것;

b) 서열번호 77-80, 바람직하게, 서열번호 81-112 중 임의의 것;

c) 서열번호 113-114, 바람직하게, 서열번호 115-130 중 임의의 것;

d) 서열번호 131-132, 바람직하게, 서열번호 133-148 중 임의의 것;

e) 서열번호 149-150, 바람직하게, 서열번호 151-166 중 임의의 것;

f) 서열번호 167-168, 바람직하게, 서열번호 169-184 중 임의의 것;

g) 서열번호 185-186, 바람직하게, 서열번호 187-202 중 임의의 것;

h) 서열번호 203-204, 바람직하게, 서열번호 205-220 중 임의의 것;

i) 서열번호 221-222, 바람직하게, 서열번호 223-238 중 임의의 것;

j) 서열번호 239-240, 바람직하게, 서열번호 241-256 중 임의의 것; 및

k) 서열번호 32-36 또는 서열번호 257-259;

또는

l) 상기 a) - k) 중 임의의 것의 기능성 변이체 중 임의의 것으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 그로 이루어진, 단리된 및/또는 인공 pG1-x 프로모터로서, 바람직하게, 여기서, pG1-x 프로모터는 pG1 프로모터와 비교하여 동일하거나, 또는 증가된 프로모터 강도 및 유도비를 특징으로 하고, 여기서,

상기 a) - k)의 상기와 같은 pG1-x 프로모터의 기능성 변이체는 바람직하게, 본원에 기술된 pG1 프로모터의 기능성 변이체에 대하여 기술된 바와 같은 특정 특성 중 임의의 것을 특징으로 한다.

구체적으로, 상기 a) - k)의 pG1-x 프로모터 중 임의의 것의 기능성 변이체, 바람직하게, 서열번호 45-76 중 임의의 것의 기능성 변이체는 하기 특성

a) 서열이 바람직하게, 프로모터 서열의 3' 영역의 적어도 280개의 뉴클레오티드 또는 3' 영역의 기능성 변이체는 그대로 남겨 두면서, 프로모터 서열의 5' 단부에 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실을 포함하는, 바람직하게, 50, 100, 150, 200, 250, 또는 300개의 뉴클레오티드로 이루어지되, 그러나, 최대 주요 조절 영역의 임의의 서열 하류 또는 3'과 함께 상기 주요 조절 영역을 포함하지는 않는 프로모터 서열의 5' 결실을 포함하고, 1개 초과의 주요 조절 영역의 경우, 프로모터 서열의 5' 단부 결실은 최대 제1 또는 가장 5'인 주요 조절 영역은 포함하지 않는 것인, 상기 a) - k)의 pG1-x 프로모터 중 임의의 것의 프로모터 서열의 기능성 변이체인 것인 특성;

b) 서열이 하나 이상의 TFBS를 포함하고, 바람직하게, 하나 이상의 TFBS는 Rgt1, Cat8-1, 및 Cat8-2로 이루어진 군으로부터 선택되는 전사 인자 중 임의의 것에 대한 것인 특성;

c) 코어 조절 영역이 뉴클레오티드 서열 서열번호 4, 또는 하나 이상의 TFBS를 포함하는 그의 기능성 변이체, 바람직하게, 적어도 80%의 서열 동일성을 가지는 기능성 변이체를 포함하는 특성;

d) 코어 조절 영역이 서열번호 5로 제시되는 주요 조절 영역, 또는 TFBS를 포함하는 그의 기능성 변이체, 바람직하게, 적어도 80%의 서열 동일성을 가지는 기능성 변이체 내로 도입되는 특성;

e) 코어 조절 영역이 뉴클레오티드 서열 서열번호 2 및 서열번호 3 사이에 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 특성;

f) 서열이 코어 조절 영역 카피 또는 주요 조절 영역 카피를 적어도 2개 포함하는 특성;

g) 서열이 서열번호 12-29 중 임의의 것으로 확인되는 적어도 하나의 또는 적어도 2개의 T 모티프를 추가로 포함하고; 바람직하게, 여기서, T 모티프는 코어 조절 영역의 상류 또는 하류 및 임의로 주요 조절 영역의 상류 또는 하류에 위치하는 특성;

h) 서열이 번역 개시 부위의 적어도 일부를 포함하는 3'-말단 뉴클레오티드 서열을 포함하는 특성;

i) 서열이 최대 2,000 bp 길이까지 신장된 특징 중 하나 이상의 것을 특징으로 한다.

본 발명은 단리된 형태의 pG1-x 프로모터를 추가로 제공한다.

구체적으로, 본원에 기술된 pG1-x 프로모터를 포함하는 단리된 pG1-x 프로모터 핵산, 또는 상보적인 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 구체적으로, 상보적인 서열은 엄격한 조건하에서 pG1-x 프로모터에 하이브리드화하는 서열이다.

구체적으로, 핵산은 관심 단백질 (POI)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결되는데, 상기 핵산은 천연적으로는 POI를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 회합되어 있지 않는 것이다. POI는 구체적으로 이종성 폴리펩티드 또는 단백질이다.

구체적으로, 뉴클레오티드 서열은 POI의 분비를 가능하게 하는 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 바람직하게, 여기서, 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 POI를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5' 단부에 인접하게 위치하는 것인 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.

구체적으로, 신호 펩티드는 S. 세레비지아에 알파-메이팅 인자 프리프로 펩티드로부터의 신호 서열, P. 파스토리스 산성 포스파타제 유전자 (PHO1) 및 세포외 단백질 X (EPX1) (문헌 [Heiss, S., V. Puxbaum, C. Gruber, F. Altmann, D. Mattanovich & B. Gasser, (2015) Multistep processing of the secretion leader of the extracellular protein Epx1 in Pichia pastoris and implications on protein localization. Microbiology])로부터의 신호 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다.

구체적으로, POI는 진핵성 단백질, 바람직하게, 포유동물 단백질이다.

특정 경우에, a POI는 다량체 단백질, 구체적으로, 이량체 또는 삼량체이다.

구체적인 실시양태에 따라, POI는 바람직하게, 항체 또는 그의 단편, 효소 및 펩티드를 포함하는 치료학적 단백질, 단백질 항생제, 독소 융합 단백질, 탄수화물 - 단백질 접합체, 구조 단백질, 조절 단백질, 백신 및 백신 유사 단백질 또는 입자, 프로세스 효소, 성장 인자, 호르몬 및 시토카인, 또는 구체적으로, 본 발명의 프로모터의 전사 제어하에서 관심 유전자를 발현하는 재조합 세포 배양물의 세포 대사산물을 포함하는 POI의 대사산물로부터 선택되는 이종성 단백질이다.

특정 POI는 항원 결합 분자, 예컨대, 항체, 또는 그의 단편이다. 특정 POI 중에는 항체, 예컨대, 모노클로날 항체 (mAb), 면역글로불린 (Ig) 또는 면역글로불린 부류 G (IgG), 중쇄 항체 (HcAb's), 또는 그의 단편, 예컨대, 단편-항원 결합 (Fab), Fd, 단일 쇄 가변 단편 (scFv), 또는 그의 조작된 변이체, 예컨대, 예를 들어, Fv 이량체 (디아바디), Fv 삼량체 (트리아바디), Fv 사량체, 또는 미니바디 및 단일 도메인 항체, 예컨대, VH 또는 VHH 또는 V-NAR이다. 추가의 항원 결합 분자는 (대안적) 스캐폴드 단백질, 예컨대, 예컨대, 조작된 쿠니츠(Kunitz) 도메인, 애드넥틴(Adnectin), 어피바디(Affibody), 안티칼린(Anticalin), 및 DARPin으로부터 선택될 수 있다. "스캐폴드"라는 용어는 항원 결합 분자 생성을 위한 출발점으로서의 역할을 하는 - 크기, 구조 및 기원이 상이한 - 조밀하고, 안정적으로 폴딩된 단백질들로 이루어진 다면체로 된 기를 기술한다. 항체 (면역글로불린)의 구조-기능 관계에서 영감을 받은 상기와 같은 대안적 단백질 스캐폴드는 주어진 (생체)분자의 엄격하고(tight), 특이적인 인식을 위해 재성형될 수 있는 상호작용 부위를 지원하는 강건한, 보존되는 구조적 프레임워크를 제공한다.

구체적인 실시양태에 따라, POI, 그의 대사산물 또는 유도체를 사용하여 발효 생성물이 제조된다.

본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 핵산을 포함하는 발현 구축물, 바람직하게, 자가 복제 벡터 또는 플라스미드, 또는 숙주 세포의 염색체 DNA 내로 통합되는 벡터 또는 플라스미드를 추가로 제공한다.

구체적으로, 발현 구축물은 pG1-x 프로모터의 전사 제어하에 POI를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 pG1-x 프로모터로서, 상기 프로모터는 천연적으로는 POI의 코딩 서열과 회합되어 있지 않는 것인 pG1-x 프로모터를 포함한다. 구체적으로, 발현 구축물은 벡터이다.

본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 발현 구축물을 포함하는 재조합 숙주 세포, 바람직하게, 진핵 세포, 예컨대, 포유동물, 곤충, 효모, 사상성 진균 또는 식물 세포, 바람직하게, 효모 또는 사상성 진균 세포, 더욱 바람직하게, 사카로마이세스(Saccharomyces) 또는 피치아 속의 효모 세포를 제공한다.

구체적으로, 효모는 피치아, 칸디다(Candida), 토룰로프시스(Torulopsis), 아르슐라(Arxula), 한세눌라(Hansenula), 야로위아(Yarrowia), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 사카로마이세스, 코마가타엘라, 바람직하게, 메틸영양성 효모로 이루어진 군으로부터 선택된다.

구체적으로 바람직한 효모는 피치아 파스토리스, 코마가타엘라 파스토리스(Komagataella pastoris), K. 파피이(K. phaffii), 또는 K. 슈도파스토리스(K. pseudopastoris), 예컨대, 예컨대, P. 파스토리스 균주 CBS 704, CBS 2612, CBS 7435, CBS 9173-9189, DSMZ 70877, X-33, GS115, KM71 및 SMD1168 중 임의의 것이다.

한 구체적인 측면에 따라, 재조합 숙주 세포는 핵산 서열의 다중 카피, 및/또는 발현 구축물의 다중 카피를 포함한다. 예를 들어, 재조합 세포는 2, 3, 4개, 또는 그 초과의 카피 (유전자 카피수, GCN)를 포함한다.

본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 재조합 숙주 세포의 안정적인 배양물을 추가로 제공한다.

구체적인 실시양태에 따라, 탄소원이 제한된 조건 대비 과잉량의 탄소원의 존재하에서 더 높은 비성장률을 가지는 세포를 사용한다.

본 발명은

a) POI를 발현시키는 조건하에서 세포주를 배양하는 단계, 및

b) POI를 회수하는 단계를 포함하는, 본원에 기술된 바와 같은 재조합 숙주 세포주를 배양함으로써 POI를 제조하는 방법을 추가로 제공한다.

구체적으로, 상기 방법은 탄소원 조절가능한 pG1-x 프로모터의 전사 제어하에 수행되며, 여기서, 상기 pG1-x 프로모터는 pG1 프로모터와 비교하여 개선된 프로모터 강도 및 조절가능한 특성 중 적어도 하나를 가진다.

구체적인 실시양태에 따라, 세포주를 회분식, 유가식 또는 연속 배양 조건하에서 및/또는 제한된 탄소 기질을 함유하는 배지 중에서 배양한다.

구체적으로, 배양은 생물반응기에서 제1 단계로서 회분식 상(phase)으로 출발한 후, 이어서, 제2 단계로서, 유가식 상 또는 연속 배양 상으로 수행된다.

구체적으로, 숙주 세포는 높은 성장률 (예컨대, 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 최대 성장률까지) 단계 동안 탄소원이 풍부한 배지 중에서 성장되고, 낮은 성장률 (예컨대, 최대 성장률의 90% 미만, 바람직하게, 80% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 또는 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만, 0.4% 미만, 0.3% 미만, 또는 0.2% 미만) 단계 동안, 예컨대, 탄소원을 제한하면서, 바람직하게, 한정 최소 배지를 공급함으로써 POI를 제조한다.

구체적으로, POI를 성장 제한 조건하에, 예컨대, 세포주를 최대 성장률보다 낮은 성장률로, 전형적으로 세포의 최대 성장률의 90% 미만, 바람직하게, 80% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만, 0.4% 미만, 0.3% 미만, 또는 0.2% 미만인 성장률로 배양함으로써 발현시킨다. 전형적으로, 최대 성장률은 특정 숙주 세포에 대하여 개별적으로 측정된다.

구체적으로, 배양 방법은

a) 기초 탄소원을 사용하여 pG1-x 프로모터를 억제시키는 제1 단계, 이어서,

b) 보충 탄소원을 사용하지 않거나, 또는 제한된 양을 사용하여 pG1-x 프로모터를 탈억제시키거나, 또는 유도함으로써 POI의 제조를 유도하는 제2 단계를 포함한다.

구체적으로, 회분식 상은 초기에 세포 배양물에 첨가된 기초 탄소원이 세포주에 의해 소비될 때까지 수행된다. 용존 산소량 (DO) 스파이크 방법을 사용하여 회분식 상 동안의 기초 탄소원 소비량을 측정할 수 있다.

구체적인 실시양태에 따라, 회분식 상은 산소 분압 (pO2) 신호의 연속적인 감소를 특징으로 하고, 여기서, 회분식 상 종료시, 이는 pO2의 증가를 특징으로 한다. 전형적으로, 회분식 상에 전형적인 것으로서 회분식 상 동안 기초 탄소원은 소비하면서, 추가의 탄소원은 첨가하지 않는 동안, 산소 분압 (pO2) 신호는 연속하여, 예를 들어, 65% 미만, 예컨대, 예를 들어, 30% 미만까지 감소될 것이다. 기초 탄소원 소비시, pO2는 예컨대, 30% 초과, 예컨대, 예를 들어, 65% 초과, 또는 탄소원이 제한된 조건하에서 추가의 탄소원을 첨가하기 위해 공급 배지를 사용하여 유가식 시스템으로 전환시키는 시점을 명시하는 그 초과의 값까지 증가하게 될 것이다.

구체적으로, pO2는 회분식 상 동안 65% 미만 또는 그 미만의 포화도까지 감소한 후, 이어서, 회분식 종료시 65% 초과 또는 그 초과의 포화도까지 증가한다. 구체적으로, 회분식 상은 산소 분압 (pO2) 신호가 65% 초과의 포화도, 구체적으로, 70%, 75%, 80%, 또는 85% 중 임의의 값을 초과하는 포화도로 증가할 때까지 수행된다.

구체적으로, 회분식 상은 약 20 내지 36h 동안 수행된다.

배양 시간과 관련하여 "약"이라는 용어는 +/-5% 또는 +/-10%를 의미하여야 한다.

예를 들어, 약 20 내지 36h인 구체적인 회분식 수행 시간은 18 내지 39.6h, 구체적으로, 19 내지 37.8h인 지속 시간을 의미한다.

구체적인 실시양태에 따라, 회분식 상은 회분식 배지 중 기초 탄소원으로서 40 내지 50 g/L 글리세롤, 구체적으로, 45 g/L 글리세롤을 사용하여 수행되고, 배양은 25℃에서 약 27 내지 30h 동안, 또는 30℃에서 약 23 내지 36h 동안, 또는 25℃ 내지 30℃ 사이의 임의의 온도에서 23 내지 36h의 배양 시간 동안 수행된다. 회분식 배지 중 글리세롤의 농도를 저하시키면, 회분식 상의 지속 기간은 단축될 것이며, 반면, 회분식 배지 중 글리세롤을 증가시키면, 회분식 상은 연장되기까지 할 것이다. 글리세롤에 대한 대안으로서, 글루코스가 예컨대, 상기와 거의 동일한 양으로 사용될 수 있다.

회분식 상 다음으로 유가식 상이 이어지는, 세포 배양 및 POI 발현의 전형적인 시스템에서, 구체적으로, 유가식 상에서의 배양은 약 15 내지 80h, 약 15 내지 70h, 약 15 내지 60h, 약 15 내지 50h, 약 15 내지 45h, 약 15 내지 40h, 약 15 내지 35h, 약 15 내지 30h, 약 15 내지 35h, 약 15 내지 25h, 또는 약 15 내지 20h; 바람직하게, 약 20 내지 40h 중 임의의 시간 동안 수행된다. 구체적으로, 유가식 상에서의 배양은 약 80h, 약 70h, 약 60h, 약 55h, 약 50h, 약 45h, 약 40h, 약 35h, 약 33h, 약 30h, 약 25h, 약 20h, 또는 약 15h 중 임의의 시간 동안 수행된다.

120h 미만, 또는 100h 미만 또는 최대 80h 동안 진행되고, 이로써, 성공적으로 POI가 제조되며, 이를 통해 높은 수율을 얻게 되는 임의의 상기와 같은 유가식 배양은 본원에서 "고속 발효"로 지칭된다. 구체적으로, 부피 비(specific) 생성물 형성률 (rP)은 단위 부피 (L) 및 단위 시간 (h)당 형성되는 생성물의 양 (mg) (mg (L h)^- ¹)이다. 부피 비 생성물 형성률은 또한 공간 시간 수율 (STY) 또는 부피 생산성으로도 명명된다.

구체적으로, 유가식 배양은 공간 시간 수율이 약 30 mg (L h)^-1 (30 mg (L h)^-1 +/-5% 또는 +/-10%를 의미)이 되도록 수행된다. 구체적으로, 약 30 mg (L h)^-1인 공간 시간 수율은 약 30h 이내에 유가식으로 달성되고, 구체적으로, 33h, 32h, 31h, 30h, 29h, 28h, 27h, 26h, 또는 25h 유가식 시간 중 임의의 시간 미만인 시간 이내에 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33 mg (L h)^-1 중 적어도 임의의 것이 달성될 수 있다.

구체적으로, 회분식 상은 제1 단계 a)로서 수행되고, 유가식 상은 제2 단계 b)로서 수행된다.

구체적으로, 제2 단계 b)는 비성장률을 0.04 h^-1 내지 0.2 h^-1 범위 이내로, 바람직하게, 0.2, 0.15, 0.1 h^-1 또는 0.15 h^-1 중 임의의 값 미만으로 유지시킬 수 있도록 하는 성장 제한량으로 보충 탄소원을 제공하는 공급 배지를 유가식 상에서 사용한다.

구체적으로, 회분식 및 유가식 배양 방법은 효모 숙주 세포, 예컨대, 사카로마이세스 속 또는 피치아 속 또는 코마가타엘라 속 중 임의의 것의 효소, 또는 피치아 속 이외의 다른 속으로부터의 효모, 예컨대, K. 락티스(K. lactis), Z. 로욱시이(Z. rouxii), P. 스티피티스(P. stipitis), H. 폴리모르파(H. polymorpha), 또는 Y. 리폴리티카(Y. lipolytica), 바람직하게, 피치아 파스토리스 또는 코마가타엘라 파스토리스로부터의 것을 사용한다. 구체적으로, 효모는 고속 발효에서 사용된다.

구체적으로, 회분식 및 유가식 배양 방법은 서열번호 37-44 중 임의의 것, 바람직하게, 서열번호 45-76 중 임의의 것인 pG1-x 프로모터를 사용한다. 특히, pG1-x 프로모터는 서열번호 39, 바람직하게, 서열번호 49인 것을 특징으로 한다.

구체적으로, POI는 세포의 천연 pGAP 프로모터와 비교하여 적어도 15%의 전사율로 제조된다.

구체적인 실시양태에 따라, 기초 탄소원은 보충 탄소원과 상이하며, 예컨대, 정량적으로 및/또는 정성적으로 상이한다. 정량적 차이가 프로모터 활성을 억제 또는 탈억제시킬 수 있는 상이한 조건을 제공할 수 있다.

추가의 구체적인 실시양태에 따라, 기초 및 보충 탄소원은 동일한 유형의 분자 또는 탄수화물을 바람직하게는 상이한 농도로 포함한다. 추가의 구체적인 실시양태에 따라, 탄소원은 2개 이상의 상이한 탄소원의 혼합물이다.

진핵 세포 배양용으로 적합한 임의 유형의 유기 탄소가 사용될 수 있다. 구체적인 실시양태에 따라, 탄소원은 헥소스, 예컨대, 글루코스, 프럭토스, 갈락토스 또는 만노스, 이당류, 예컨대, 사카로스, 알콜, 예컨대, 글리세롤 또는 에탄올, 또는 그의 혼합물이다.

구체적으로 바람직한 실시양태에 따라, 기초 탄소원은 글루코스, 글리세롤, 에탄올, 또는 그의 혼합물, 및 복합 영양 물질로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에 따라, 기초 탄소원은 글리세롤이다.

추가의 구체적인 실시양태에 따라, 보충 탄소원은 헥소스, 예컨대, 글루코스, 프럭토스, 갈락토스 및 만노스, 이당류, 예컨대, 사카로스, 알콜, 예컨대, 글리세롤 또는 에탄올, 또는 그의 혼합물이다. 바람직한 실시양태에 따라, 보충 탄소원은 글루코스이다.

구체적으로,

a) 기초 탄소원은 글루코스, 글리세롤, 에탄올, 그의 혼합물, 및 복합 영양 물질로 이루어진 군으로부터 선택되고;

b) 보충 탄소원은 헥소스, 예컨대, 글루코스, 프럭토스, 갈락토스 또는 만노스, 이당류, 예컨대, 사카로스, 알콜, 예컨대, 글리세롤 또는 에탄올, 또는 상기 중 임의의 것의 혼합물이다.

상기 배양 단계는 구체적으로 상기 탄소원의 존재하에서, 따라서, 상기 탄소원을 포함하는 배양 배지 중에서, 또는 단계 b)에서는 또한 보충 탄소원의 부재하에서도 세포주를 배양하는 것을 포함한다.

탈억제 (또는 유도) 조건은 적합하게는 특정 수단에 의해 달성될 수 있다. 제2 단계 b)는 임의적으로 보충 탄소원을 제공하지 않거나, 또는 그를 제한된 양으로 제공하는 공급 배지를 사용한다.

구체적으로, 공급 배지는 화학적으로 규명되고, 메탄올을 함유하지 않는 것이다.

공급 배지는 액체 형태로, 또는 아니면 대안적 형태로, 예컨대, 고체, 예컨대, 정제 또는 다른 지속 방출 수단으로서, 또는 예컨대, 이산화탄소와 같은 기체로서 배양 배지에 첨가될 수 있다. 그러나, 바람직한 실시양태에 따라, 세포 배양 배지에 첨가되는 보충 탄소원의 제한된 양은 심지어 0일 수 있다. 바람직하게, 제한된 탄소 기질 조건하에서 배양 배지 중 보충 탄소원의 농도는 0-1 g/L, 바람직하게, 0.6 g/L 미만, 더욱 바람직하게, 0.3 g/L 미만, 더욱 바람직하게, 0.1 g/L 미만, 바람직하게, 1-50 mg/L, 더욱 바람직하게, 1-10 mg/L, 구체적으로 바람직하게, 1 mg/L 또는 심지어는 그 미만, 예컨대, 적합한 표준 검정법으로 측정된 바와 같은 검출 한계 미만, 예컨대, 성장 세포 배양물에 의한 소비시 배양 배지 중의 잔류 농도로서 측정되는 바와 같은 검출 한계 미만이다.

바람직한 방법에서, 보충 공급원의 제한된 양은, 제조 단계 종료시, 또는 발효 프로세스 산출시, 바람직하게, 발효 생성물 수확시 발효 브로쓰 중에서 측정되는 바와 같은 검출 한계 미만인 세포 배양물 중의 잔류량을 제공한다.

구체적으로, 제2 단계 b)는 비성장률을 0.001 h^-1 내지 0.2 h^-1, 바람직하게, 0.005 h^-1 내지 0.15 h^-1 범위 이내로 유지시킬 수 있도록 하는 성장 제한량으로 보충 탄소원을 제공하는 공급 배지를 사용한다.

도면
도 1: 매트인스팩터를 이용한 탄소원 관련 TFBS에 관한 pG1 서열 분석. (P_GTH1로도 또한 지칭되는) pG1을 먼저 증폭시키고, 위치 -965부터 -1 (길이 965 bp, 서열은 도 6에 제공되어 있다 (서열번호 1, 특히, 서열번호 9가 사용되고 있다). 번호는 (표 2에 열거된) 결실을 위해 선택된 TFBS를 나타낸다)까지를 클로닝하였다. 연관된 매트릭스 패밀리는 F$CSRE (탄소원 반응 요소, 줄무늬로 표시된 박스), F$ADR (효모 대사 조절인자, 점으로 표시된 박스), F$MGCM (단량체 Gal4 부류 모티프, 필링형 박스) 및 F$YMIG (효모 GC 박스 단백질, 흰색 박스)이다. 다른 TFBS도 결실에 의해 영향을 받을 수 있다 (매트릭스 매치에 관한 상세한 정보는 표 1에 제시되어 있다). 검은색 대시 기호로 표시된 박스는 단축형 pG1 변이체의 스크리닝에 의해 확인된 pG1의 주요 조절 영역을 나타낸다. 별표 표시는 이 또한 결실을 위해, 및 돌연변이를 위해 선택된 중요한 TAT (위치 -390 내지 -374) 모티프의 위치를 나타낸다. 단축형 pG1 프로모터 변이체의 대안적 5'-출발부는 화살표 표시 및 상응하는 변이체의 길이로 표지되어 있다.
도 2: 단축형 pG1 프로모터 변이체의 스크리닝 데이터
성장을 억제 및 유도하는 조건하에 pG1의 제어하에서 eGFP를 발현하는 클론 (클론 #8, GCN이 1인 것으로 확인), 또는 단축형 pG1 변이체의 제어하에서 eGFP를 발현하는 클론 (삼중으로 배양된 각 2개씩의 클론, 사전 스크리닝에서 선택)에 대한 집단의 비 eGFP 형광 (세포 부피와 관련된 형광)의 기하 평균이 제시되어 있다. 비발현 야생형 P. 파스토리스 세포를 음성 대조군으로서 사용하였다. 억제성 사전 배양 동안 및 공급 비드를 이용한 24 및 48시간 유도 이후 샘플을 채취하였다.
도 3: TFBS결실 및 -TAT 돌연변이 변이체의 스크리닝 데이터
성장을 억제 및 유도하는 조건하에 pG1의 제어하에서 eGFP를 발현하는 클론 (클론 #8, GCN이 1인 것으로 확인), 또는 pG1 변이체의 제어하에서 eGFP를 발현하는 클론 (최대 9개의 클론을 3개의 웰에서 풀 배양하였다)에 대한 집단의 비 eGFP 형광 (세포 부피와 관련된 형광)의 기하 평균이 제시되어 있다. 야생형 P. 파스토리스 세포를 음성 대조군으로서 사용하였다.
도 4: pG1 중복 변이체의 스크리닝 데이터
성장을 억제 및 유도하는 조건하에 pG1의 제어하에서 eGFP를 발현하는 클론 (클론 #8, GCN이 1인 것으로 확인), 또는 pG1 변이체의 제어하에서 eGFP를 발현하는 클론 (최대 9개의 클론을 3개의 웰에서 풀 배양하고, 사전 스크리닝에서 선택하였다)에 대한 집단의 비 eGFP 형광 (세포 부피와 관련된 형광)의 기하 평균이 제시되어 있다. 야생형 P. 파스토리스 세포를 음성 대조군으로서 사용하였다.
도 5: eGFP를 발현하는 pG1 및 pG1 변이체의 유가식 배양
회분식 (a) 및 유가식 배양 (b)에서 플레이트 판독기를 사용하여 (유사한 바이오매스 밀도로 희석된) 생물반응기 샘플로부터 상대 eGFP 형광을 측정하였고, 이는 공급 시간 경과에 따라 제시되어 있다 (회분 종점을 0으로 설정). pG1의 제어하에서 eGFP를 발현하는 클론 (#8)을 pG1 결실 변이체 (pG1-Δ2, 서열번호 211), TAT 돌연변이 (pG1-T16, 서열번호 257, 및 중복 (pG1-D1240) 변이체 (서열번호 49)의 제어하에서 발현하는 클론들과 비교하였다.
도 6: pG1 및 pG1 -x 프로모터 서열
도 6a: 참조 서열
도 6b: pG1 -x 프로모터의 서열
개별 서열 요소:
위치 8 (서열번호 2): ATAAATGGA (예컨대, 서열번호 8에서 위치 -293 내지 -285):
위치 9 (서열번호 3): CATATTTTTCCGGTT (예컨대, 서열번호 8에서 위치 -275 내지 -261)
코어 영역: (서열번호 4): ATAAATGGA CGCCTGCTC CATATTTTTCCGGTT (예컨대, 서열번호 8에서 위치 -293 내지 -261)
주요 조절 영역: (서열번호 5): (예컨대, 서열번호 8에서 위치 -328 내지 -211):

3'-말단 뉴클레오티드 서열 (서열번호 6):

서열 표시:
· 주요 조절 영역: 굵은체 표시.
· 코어 조절 영역: 굵은체 , 이탤릭체 및 밑줄체 표시 , 서열번호 2 및 3 이중 밑줄체 표시.
· T 모티프: 이탤릭체 및 밑줄체 표시 , 이는 임의적으로 (T 모티프의 5'-말단 단부에서) 선행 TA 서열에 의해, 또는 (T 모티프의 3'-말단 단부에서) 후속 AT 서열에 의해 연장될 수 있다.
· 3'-말단 영역:

.
· 참조 pG1 (P_GTH1) 서열에서 프로모터 활성과 관련이 더 적은 영역:

: 범위가 5'-말단 단부부터 -328까지인 영역 (도 6a에서 대시-점선 밑줄체로 표시된 영역) 내의 하나 이상의 뉴클레오티드에서부터 최대로는 모든 뉴클레오티드가 치환, 또는 결실될 수 있거나, 또는 추가의 뉴클레오티드가 상기 영역 내에 삽입될 수 있지만, 바람직한 실시양태는 여전히 선행 A 또는 TA 뉴클레오티드와 함께 또는 그의 부재하에; 또는 후속 A 또는 AT 뉴클레오티드와 함께 또는 그의 부재하에 (T)n (n=13-20)인 적어도 하나의 T 모티프를 포함한다. 부분적으로 또는 전체적으로 결실될 수 있는 상기의 관련이 더 적은 영역은 서열번호 37 내지 서열번호 202 중 어느 하나에서 범위가 5'-말단 단부에서부터 제1 또는 5' 주요 조절 영역 (굵은체 표시)까지인 영역이고; 바람직하게, 서열번호 37 내지 서열번호 202 중 어느 하나의 5'-말단 단부의 최대 50, 100, 150, 200, 250, 300, 320, 또는 325개 뉴클레오티드가 결실될 수 있다.
· 결실: del (밑줄체 표시).
(T) _n (n=13-20) 모티프: 이는 임의적으로 그의 5' 단부에서, 예컨대, "A" 또는 "TA"에 의해; 또는 그의 3' 단부에서, 예컨대, "A" 또는 "AT"에 의해 연장될 수 있다.
o (T)₁₃: 서열번호 12: TTTTTTTTTTTTT
o (T)₁₄: 서열번호 13: TTTTTTTTTTTTTT
o (T)₁₅: 서열번호 14: TTTTTTTTTTTTTTT
o (T)₁₆: 서열번호 15: TTTTTTTTTTTTTTTT
o (T)₁₇: 서열번호 16: TTTTTTTTTTTTTTTTT
o (T)₁₈: 서열번호 17: TTTTTTTTTTTTTTTTTT
o (T)₁₉: 서열번호 18: TTTTTTTTTTTTTTTTTTT
o (T)₂₀: 서열번호 19: TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT .
TA(T) _n (n=13-20) 모티프는 임의적으로 돌연변이화되어 2번 위치의 "A"가 "T"로 치환될 수 있다 (A/T).
o TA(T)₁₃: 서열번호 20: TATTTTTTTTTTTTT
o TA(T)₁₃ (A/T 치환),
서열번호 14 ((T)₁₅ 참조): TTTTTTTTTTTTTTT
o TA(T)₁₄: 서열번호 21: TATTTTTTTTTTTTTT
o TA(T)₁₄ (A/T 치환),
서열번호 15 ((T)₁₆ 참조): TTTTTTTTTTTTTTTT
o TA(T)₁₅: 서열번호 22: TATTTTTTTTTTTTTTT
o TA(T)₁₅ (A/T 치환),
서열번호 16 ((T)₁₇ 참조): TTTTTTTTTTTTTTTTT
o TA(T)₁₆: 서열번호 23: TATTTTTTTTTTTTTTTT
o TA(T)₁₆ (A/T 치환),
서열번호 17 ((T)₁₈ 참조): TTTTTTTTTTTTTTTTTT
o TA(T)₁₇: 서열번호 24: TATTTTTTTTTTTTTTTTT
o TA(T)₁₇ (A/T 치환),
서열번호 18 ((T)₁₉ 참조): TTTTTTTTTTTTTTTTTTT
o TA(T)₁₈: 서열번호 25: TATTTTTTTTTTTTTTTTTT
o TA(T)₁₈ (A/T 치환),
서열번호 19 ((T)₂₀ 참조): TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
o TA(T)₁₉: 서열번호 26: TATTTTTTTTTTTTTTTTTTT
o TA(T)₁₉ (A/T 치환),
서열번호 28 (즉, (T)₂₁): TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
o TA(T)₂₀: 서열번호 27: TATTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
o TA(T)₂₀ (A/T 치환),
o 서열번호 29 (즉, (T)₂₂): TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT .
도 7: P. 파스토리스 (GS115)의 천연 pGAP 프로모터 서열 (서열번호 260)

도 7 계속: 전사 인자 서열
Rgt1 (PAS_chr1-3_0233) (서열번호 261)
Cat8-2(PAS_chr4_0540) (서열번호 262)
Cat8-1(PAS_chr2-1_0757) (서열번호 263).
도 8 : 선행 기술 서열
WO2013050551 A1에 기술된 바와 같은, pG1 (서열번호 264), pG1a (서열번호 265), pG1b (서열번호 266), pG1c (서열번호 267), pG1d (서열번호 268), pG1e (서열번호 269), 또는 pG1f (서열번호 270).
도 9: (a) 표준 유가식 프로토콜, 마우러(Maurer) 등 (문헌 [Microbial Cell Factories, 2006, 5:37])으로부터 개조된 (b) 공간 시간 수율 최적화된 유가식 프로토콜 ("고속 발효")을 사용하여 모델 단백질로서 대안적 스캐폴드 단백질을 발현하는 서열번호 39의 선택된 pG1-3 실시양태 (pG1-D1240 (서열번호 49))의 유가식 배양.

본 명세서 전역에 걸쳐 사용되는 특정 용어는 하기 의미를 가진다.

본원에서 사용되는 바, "탄소 기질"로서도 지칭되는 "탄소원"이라는 용어는 미생물을 위한 에너지원으로서 적합한 발효가능한 탄소 기질, 전형적으로, 공급원 탄수화물, 예컨대, 숙주 유기체 또는 생산 세포주에 의해 대사될 수 있는 것, 특히, 정제된 형태로, 최소 배지에 또는 원료 물질로 제공되는, 예컨대, 복합 영양 물질과 같은, 단당류, 올리고당류, 다당류, 글리세롤을 포함한 알콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 공급원을 의미하여야 한다. 탄소원은 본 발명에 따라, 단일 탄소원으로서, 또는 상이한 탄소원의 혼합물로서 사용될 수 있다.

예컨대, 본 발명에 따라 사용되는 "기초 탄소원"은 전형적으로 세포 성장에 적합한 탄소원, 예컨대, 진핵 세포를 위한 영양원이다. 기초 탄소원은 배지, 예컨대, 기초 배지 또는 복합 배지에, 그뿐만 아니라, 정제된 탄소원을 함유하는 화학적으로 규명된 배지에 제공될 수 있다. 기초 탄소원은 전형적으로는 특히, 배양 프로세스 중 성장 단계 동안 세포를 성장시킬 수 있는, 예를 들어, 예컨대, 표준 계대배양 단계 동안 90% 초과, 바람직하게, 95% 초과의 생존능을 나타내면서, 적어도 5 g/L 세포 건조 질량, 바람직하게, 적어도 10 g/L 세포 건조 질량, 또는 적어도 15 g/L 세포 건조 질량의 세포 밀도를 수득할 수 있도록 하는 양으로 제공된다.

본 발명에 따라, 기초 탄소원은 전형적으로 예컨대, 비성장률이 높은 세포주 배양 동안, 예컨대, 회분식 또는 유가식 배양 프로세스에서 세포주의 성장 단계 동안 바이오매스를 증가시키기 위해 에너지를 제공하는 데 있어 과도한 것으로서 이해되는 과량 또는 과잉량으로 사용된다. 상기 과잉량은 발효 브로쓰 중 측정가능하며, 제한된 양의 보충 탄소원을 제공하는 동안보다 전형적으로 적어도 10배 더 높은, 바람직하게, 적어도 50배 또는 적어도 100배 더 높은 잔류 농도를 달성하는 (성장 제한 조건하에서 사용되는 것과 같은) 제한된 양의 보충 탄소원을 초과하는 양이다.

예컨대, 본 발명에 따라 사용되는 "보충 탄소원"은 전형적으로 특히, 배양 프로세스의 제조 단계에서 생산 세포주에 의한 발효 생성물의 생산을 촉진시키는 보충 기질이다. 예컨대, 회분식, 유가식 및 연속 배양 프로세스에서 제조 단계 다음으로는 구체적으로 성장 단계가 이어진다. 보충 탄소원은 구체적으로 유가식 프로세스의 공급물 중에 함유되어 있을 수 있다. 보충 탄소원은 전형적으로 탄소 기질 제한 조건하에서, 즉, 제한된 양의 탄소원을 사용하여 세포 배양에서 사용된다.

본원에서 "제한된 양"의 탄소원 또는 "제한된 탄소원"이란, 구체적으로, 특히, 배양 프로세스에서 최대 성장률 미만의 제어된 성장률로 생산 세포주에 의한 발효 생성물의 생산을 촉진시키는 탄소 기질의 유형 및 양을 지칭하는 것으로 이해된다. 예컨대, 회분식, 유가식 및 연속 배양 프로세스에서 제조 단계 다음으로는 구체적으로 성장 단계가 이어진다. 세포 배양 프로세스는 회분식 배양, 연속 배양, 및 유가식 배양을 사용할 수 있다. 회분식 배양은 소량의 시드 배양액을 배지에 첨가하고, 배양하는 동안 추가 배지를 첨가하거나, 또는 배양물을 배출하지 않으면서, 세포를 성장시키는 배양 프로세스이다. 연속 배양은 배양하는 동안 배지를 연속하여 첨가하고, 배출하는 배양 프로세스이다. 연속 배양은 또한 관류 배양도 포함한다. 회분식 배양과 연속 배양 사이의 중간이며, 이는 또한 반회분식 배양으로도 지칭되는 유가식 배양은 배양하는 동안 배지를 연속하여 또는 순차적으로 첨가하지만, 연속 배양과 달리, 배양액은 연속하여 배출하지 않는 배양 프로세스이다.

성장 제한 영양 기질을 배양물에 공급하는 것에 기초한 유가식 프로세스가 특히 바람직하다. 바이오산업 프로세스에서는 전형적으로 생물반응기에서 높은 세포 밀도에 도달하기 위해서 단회 유가식 또는 반복된 유가식 발효를 포함한, 유가식 전략법이 사용된다. 탄소 기질을 제어된 방식으로 첨가하는 것이 배양물의 성장률에 직접적으로 영향을 주고, 과잉 물질대사 또는 원치않는 대사 부산물 형성을 회피하는 데 도움을 준다. 탄소원이 제한된 조건하에서, 탄소원은 구체적으로 유가식 프로세스의 공급물 중에 함유되어 있을 수 있다. 이로써, 탄소 기질은 제한된 양으로 제공된다.

또한 본원에 기술된 바와 같은 케모스타트 또는 연속 배양에서, 성장률은 엄격하게 제어될 수 있다.

본원에서 특히 탄소원의 제한된 양이란, 생산 세포주를 성장 제한 조건하에서, 예컨대, 제조 단계 또는 제조 모드에서 유지시키는 데 필요한 탄소원 양인 것으로 이해된다. 상기 제한된 양은, 탄소원이 공급 배지에 함유되어 있고, 바이오매스를 낮은 비성장률로 유지시키면서, 예컨대, POI를 제조하기 위하여 지속적인 에너지 전달을 위해 배양물에 낮은 공급률로 공급되는 유가식 프로세스에서 사용될 수 있다. 공급 배지는 전형적으로 세포 배양물의 제조 단계 동안 발효 브로쓰에 첨가된다.

탄소원의 제한된 양은 선정된 임계값 미만, 또는 심지어는 표준 (탄수화물) 검정법에서 측정된 바와 같은 검출 한계 미만인 세포 배양 브로쓰 중의 탄소원의 잔류량에 의해 측정될 수 있다. 잔류량은 전형적으로 발효 생성물 수확시 발효 브로쓰 중에서 측정될 것이다.

탄소원의 제한된 양은 또한 시간당 산출되는 평균량을 측정하기 위해 예컨대, 배양 시간당 전체 배양 프로세스, 예컨대, 유가식 상 동안에 걸쳐 첨가된 양에 의해 측정되는 바와 같이, 발효기에 대한 탄소원의 평균 공급률을 정의함으로써 측정될 수 있다. 이러한 평균 공급률은 세포 배양물에 의해 보충 탄소원이 확실히 완전하게 사용될 수 있도록 낮게, 예컨대, 0.6 g L^-1 h^-1 (초기 발효 부피 (L) 및 시간 (h)당 탄소원 (g)) 내지 25 g L^-1 h^-1, 바람직하게, 1.6 g L^-1 h^-1 내지 20 g L^-1 h^-1로 유지된다.

탄소원의 제한된 양은 또한 비성장률을 측정함으로써 측정될 수 있으며, 비성장률은 제조 단계 동안 낮게, 예컨대, 최대 비성장률보다 낮게, 예컨대, 선정된 범위 내로, 예컨대, 0.001 h^-1 내지 0.20 h^-1, 또는 0.005 h^-1 내지 0.20 h^-1, 바람직하게, 0.01 h^-1 내지 0.15 h^-1 범위로 유지된다.

구체적으로, 화학적으로 규명되고, 메탄올을 함유하지 않는 공급 배지가 사용된다.

유가식 프로세스에서 세포 배양 배지, 예컨대, 최소 배지 또는 공급 배지와 관련하여 "화학적으로 규명된"이라는 용어는 화학 성분 및 (폴리)펩티드 모두가 공지되어 있는 것인, 생산 세포주의 시험관내 세포 배양에 적합한 배양 배지를 의미하여야 한다. 전형적으로, 화학적으로 규명된 배지는 전적으로 동물 유래 성분을 함유하지 않으며, 이는 순수하고, 일관된 세포 배양 환경을 나타낸다.

본원에서 사용되는 바, "세포주"라는 용어는 장기간 동안에 걸쳐 증식할 수 있는 능력을 획득한 특정 세포 유형의 확립된 클론을 지칭한다. "숙주 세포주"라는 용어는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드에 의해 매개되는 세포 대사산물을 제조하는 대사 경로의 내인성 또는 재조합 유전자 또는 생성물을 발현하는 데 사용되는 세포주를 지칭한다. "생산 숙주 세포주" 또는 "생산 세포주"란 보편적으로 생산 프로세스의 생성물, 예컨대, POI를 수득하기 위해 생물반응기에서의 배양을 위해 즉석에서 사용이 가능한 세포주인 것으로 이해된다. "진핵성 숙주" 또는 "진핵 세포주"라는 용어는 POI 또는 숙주 세포 대사산물 생산을 위해 배양될 수 있는 임의의 진핵 세포 또는 유기체를 의미하여야 한다. 본 용어는 인간은 포함하지 않는 것으로 널리 이해되고 있다.

숙주 세포주와 관련하여, "발효"라고도 또한 명명되는 "세포 배양" 또는 "배양"이라는 용어는 구체적으로, 산업계에 공지된 방법에 따라 제어식 생물반응기에서 세포의 성장, 분화 또는 연속 생존능에 바람직한 조건하에 인공, 예컨대, 시험관내 환경에서 세포를 활성 상태 또는 휴지 상태로 유지시키는 것을 의미한다.

본 발명의 배양 배지를 사용하여 세포 배양물을 배양할 때, 세포 배양물의 배양을 지원하는 데 적합한 조건하에서 세포 배양물을 배양 베쓸 중 배지와, 또는 기질과 접촉시킨다. 특정 실시양태에서, 당업계에 널리 공지된 표준 세포 배양 기술에 따라 세포를 배양하는 데 본원에 기술된 바와 같은 배양 배지가 사용된다. 본 발명의 다양한 측면에서, 진핵 세포, 구체적으로, 효모 또는 사상성 진균의 성장을 위해 사용될 수 있는 배양 배지를 제공한다.

세포 배양 배지는 제어식, 인공 및 시험관내 환경에서 세포를 유지 및 성장시키는 데 필요한 영양분을 제공한다. 세포 배양 배지의 특징 및 조성은 특정 세포 요건에 따라 달라진다. 중요한 파라미터로는 오스몰농도, pH, 및 영양분 제제를 포함한다. 영양분 공급은 당업계에 공지된 방법에 따라 연속 또는 불연속 모드로 수행될 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 배양 배지는 재조합 단백질을 제조하는 데 특히 유용하다.

회분식 프로세스는, 발효 동안 추가 영양분의 추가 공급 없이, 세포 배양에 필요한 모든 영양분이 초기 배양 배지에 함유되어 있는 것인 배양 모드인 것인데 반해, 유가식 프로세스에서, 회분식 상 이후, 하나 이상의 영양분이 공급에 의해 배양물에 공급되는 공급 단계가 이루어진다. 영양분을 공급하는 목적은 재조합 단백질의 양도 증가시키기 위하여 바이오매스의 양을 증가시키고자 하는 것이다. 비록 대부분의 배양 프로세스에서 공급 모드가 중대하고, 중요하기는 하지만, 본 발명의 프로모터를 사용하는 본 발명은 특정 배양 모드와 관련하여 제한되지 않는다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은 유가식 프로세스이다. 구체적으로, 원하는 재조합 POI를 제조하기 위해, 원하는 재조합 POI를 코딩하는 핵산 구축물로 형질전환된 숙주 세포를 성장 단계 배지에서 배양하고, 제조 단계 배지로 전이시킨다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 숙주 세포를 연속 모드로, 예컨대, 케모스타트에서 배양한다. 연속 발효 프로세스는 신선한 배양 배지의 생물반응기 내로의 정의된, 일정하고, 연속적인 공급률을 특징으로 하며, 이로써, 배양 브로쓰는 동시에 같은 정의된, 일정하고, 연속적인 제거율로 생물반응기로부터 제거된다. 배양 배지 공급률 및 제거율을 같은 일정한 수준으로 유지시킴으로써 생물반응기 중의 배양 파라미터 및 조건은 일정하게 그대로 유지된다.

본원에 기술된 바와 같은 안정적인 세포 배양이란, 유전적 특성을 유지시키는, 구체적으로 심지어 약 20세대 배양, 바람직하게, 적어도 30 세대, 더욱 바람직하게, 적어도 40 세대, 가장 바람직하게, 적어도 50 세대 배양 후에도 POI 제조 수준을 높게, 예컨대, 적어도 ㎍ 수준으로 유지시키는 세포 배양을 지칭하는 것으로 이해된다. 구체적으로, 산업 규모의 제조를 위해 사용될 때 매우 이로운 것으로 간주되는 안정적인 재조합 숙주 세포주를 제공한다.

본 발명의 세포 배양은 영양분 공급에 기초한 배양 모드, 특히, 유가식 또는 회분식 프로세스, 또는 연속 또는 반-연속 프로세스 (예컨대, 케모스타트)와 함께 조합하여, 예컨대, 부피 및 기술 시스템, 이 둘 모두와 관련하여 산업 제조 규모의 방법에 특히 이롭다.

"발현" 또는 "발현 시스템" 또는 "발현 카세트"라는 용어는, 작동가능하게 연결된 원하는 코딩 서열 및 제어 서열을 함유하는 핵산 분자로서, 이로써, 상기 서열로 형질전환 또는 형질감염된 숙주는 코딩된 단백질 또는 숙주 세포 대사산물을 생산할 수 있는 것인 핵산 분자를 지칭한다. 형질전환을 수행하기 위해, 발현 시스템이 벡터에 포함될 수 있지만; 관련 DNA 또한 숙주 염색체 내로 통합될 수 있다. 발현은 폴리펩티드 또는 대사산물을 포함한, 분비 또는 비-분비 발현 생성물을 지칭할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "발현 구축물" 또는 "벡터" 또는 "플라스미드"란, 적합한 숙주 유기체에서의 클로닝된 재조합 뉴클레오티드 서열, 즉, 재조합 유전자의 전사, 및 그의 mRNA의 번역을 위해 요구되는 DNA 서열로서 정의된다. 발현 벡터 또는 플라스미드는 일반적으로, 성분들이 함께 작동가능하게 연결되어 있는, 숙주 세포에서의 자가 복제를 위한 기점, 선별가능한 마커 (예컨대, 아미노산 합성 유전자, 또는 항생제, 예컨대, 제오신, 카나마이신, G418 또는 히그로마이신에 대한 내성을 부여하는 유전자), 다수의 제한 효소 절단 부위, 적합한 프로모터 서열 및 전사 종결인자를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "플라스미드" 및 "벡터"라는 용어는 자가 복제 뉴클레오티드 서열 뿐만 아니라, 게놈 통합 뉴클레오티드 서열도 포함한다.

본 발명의 발현 구축물은 구체적으로 프로모터의 전사 제어하에 POI를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 본 발명의 프로모터로서, 상기 프로모터는 천연적으로는 POI의 코딩 서열과 회합되어 있지 않는 것인 프로모터를 포함한다.

본원에서 사용되는 바, 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 또는 단백질과 관련하여 "이종성"이라는 용어는 주어진 숙주 세포에 대하여 외래, 즉, "외인성," 예컨대, 자연상에서 발견되지 않는 것이거나; 또는 예컨대, 그러나, 이종성 핵산을 사용하는 이종성 구축물과 관련해서는 천연적으로 주어진 숙주 세포에서 발견되는, 예컨대, "내인성"인 것인 화합물을 지칭한다. 내인성으로 발견되는 이종성 뉴클레오티드 서열은 또한 세포에서 비천연적인 양으로, 예컨대, 예상보다 더 큰 양으로 또는 천연적으로 발견되는 양보다 더 큰 양으로 제조될 수 있다. 이종성 뉴클레오티드 서열, 또는 이종성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 가능하게는 내인성 뉴클레오티드 서열과 다른 서열을 가지지만, 이는 내인성으로 발견되는 것과 동일한 단백질을 코딩한다. 구체적으로, 이종성 뉴클레오티드 서열은 자연상의 숙주 세포와 동일한 관계에 있는 것에서는 발견되지 않는 것이다. 임의의 재조합 또는 인공 뉴클레오티드 서열은 이종성인 것으로 이해된다. 이종성 폴리뉴클레오티드의 한 예로는 본원에 기술된 바와 같이, 예컨대, 하이브리드 프로모터를 수득하기 위한, 또는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 본 발명에 따른 프로모터와 천연적으로는 회합되어 있지 않은 뉴클레오티드 서열이 있다. 그 결과, 하이브리드 또는 키메라 폴리뉴클레오티드가 수득될 수 있다. 이종성 화합물의 추가 예로는, 보통은 내인성, 자연적으로 발생된 POI 코딩 서열이 작동가능하게 연결되어 있지 않는 것인, 전사 제어 요소, 예컨대, 본 발명의 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 POI 코딩 폴리뉴클레오티드가 있다.

본원에서 사용되는 바, 본 발명과 관련하여 "변이체"라는 용어는 유사한 모체 서열과 특정 서열 동일성 또는 상동성을 가지는 임의 서열을 지칭하여야 한다. 변이체는 구체적으로 예컨대, 크기 변이, 예컨대, 크기 변이, 예컨대, (말단 또는 비-말단, 예컨대, "사이," 즉, 뉴클레오티드 서열 내의 결실 또는 삽입을 포함하는 것) 신장, 또는 단편화, 돌연변이, 하이브리드화 (서열 조합 포함)에 의해 모체 서열로부터 유래된 임의 서열이다.

본원에 기술된 바와 같은 pG1-x 프로모터는 구체적으로 천연 (야생형) pG1 프로모터의 인공 변이체이다. 비록 천연 구조와 특정 정도의 서열 동일성이 존재하기는 하지만, 본 발명의 물질, 방법 및 용도, 예컨대, 구체적으로 단리된 핵산 서열, 아미노산 서열, 발현 구축물, 형질전환된 숙주 세포 및 재조합 단백질을 지칭하는 것은 "인공" 또는 합성이고, 그러므로, 이는 "자연 법칙"의 결과로 간주되지 않는다는 것이 널리 이해되고 있다.

본원에서 "pG1-x 프로모터"로 지칭되는 프로모터는 pG1 프로모터의 변이체이고, 그의 뉴클레오티드 서열은 변이체를 제조하기 위해 "모체" 서열로서 사용되는 pG1 프로모터의 돌연변이유발에 의해 생성될 수 있다. pG1-x 프로모터는 2, 3, 4개 또는 그 초과의 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 카피를 포함하는 프로모터를 포함한다.

pG1-x 프로모터 시리즈는 예컨대, 도 6b에 예시된 서열 중 임의의 것, 특히, 하기 서열:

a) 서열번호 37-44, 바람직하게, 서열번호 45-76 중 임의의 것;

b) 서열번호 77-80, 바람직하게, 서열번호 81-112 중 임의의 것;

k) 서열번호 32-36 또는 서열번호 257-259 중 임의의 것을 포함하거나, 또는 그로 이루어진 프로모터에 의해 예시된다.

pG1-x 프로모터는 또한 5'-말단 단부 일부 또는 그 모두에서부터 최대 제1 또는 5' 주요 조절 영역까지 결실되어 있는; 바람직하게, 서열번호 37 내지 서열번호 202 중 어느 하나의 5'-말단 단부의 최대 50, 100, 150, 200, 250, 300, 320, 또는 325개의 뉴클레오티드가 결실되어 있는, 서열번호 37 내지 서열번호 202 중 어느 하나의 3' 단편을 포함한다.

pG1-x 프로모터는

- 프로모터 강도가 pG1 프로모터와 비교하여 유도된 상태에서 적어도 1.1배 증가되어 있고/거나,

- 유도비가 pG1 프로모터와 비교하여 적어도 1.1배 증가되어 있는 것인, pG1 프로모터와 비교하여 동일하거나, 또는 증가된 프로모터 강도 및 유도비를 가지는 것을 특징으로 한다.

"모체" 서열로서 예컨대, 예시된 도 6b의 pG1-x 프로모터, 또는 크기 변이체, 특히, 신장된 변이체 또는 그의 단편을 사용하여 특정 영역의 돌연변이유발에 의해 변이체를 제조함으로써, 특히, 프로모터의 필수 요소 및 기능은 유지되거나, 또는 심지어는 개선되도록 함으로써 추가의 pG1-x 변이체도 실현가능하다. pG1-x 프로모터 변이체는 예컨대, 재조합 세포주에서 프로모터로서 사용하기에 적합한 서열을 제조하는 돌연변이유발에 의해 예시된 pG1-x 프로모터 서열 중 임의의 것으로부터 유래될 수 있다. 상기 변이체 프로모터는 돌연변이체 서열로 이루어진 라이브러리로부터 선정된 특성을 가진 상기 라이브러리 구성원을 선별함으로써 수득될 수 있다. 변이체 프로모터는 동일하거나, 또는 심지어 개선된 특성, 예컨대, 프로모터 강도, POI 제조 유도가 개선된, 억제 및 탈억제 조건하에서의 차별적 효과 (특히, 유도비)가 증가된 특성을 가질 수 있다. 변이체 프로모터는 또한 유사한 서열로부터, 예컨대, 피치아 파스토리스 이외의 다른 진핵성 종으로부터 또는 피치아 이외의 다른 속으로부터, 예컨대, K. 락티스, Z. 로욱시이, P. 스티피티스, H. 폴리모르파로부터의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 예컨대, 프로모터 변이체, 본원에 기술된 바와 같은 pG1-x 프로모터 또는 pG1-x 프로모터의 변이체, 또는 pG1 프로모터의 변이체와 관련하여 "기능적으로 활성"이라는 용어는 서열 내에서 또는 서열의 양측 말단부 중 어느 하나 또는 그 둘 모두에서 돌연변이유발에 의해, 구체적으로, 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 모체 서열의 변형으로부터 생성된 변이체 서열로서, 상기 변형은 상기 서열의 활성에 영향을 주지 않는다 (특히, 그를 손상시키지 않는다)라는 것을 의미한다. 본원에 기술된 바와 같은 pG1-x 프로모터와 관련하여, 기능 및 활성은 구체적으로 프로모터 활성 및 강도 뿐만 아니라, 유도비를 특징으로 한다.

본원에 기술된 바와 같은 기능적으로 활성인 프로모터 변이체는 구체적으로 pG1 프로모터와 실질적으로 동일하거나 (+/-10%, 또는 +/- 5%), 또는 그보다 훨씬 더 높은 프로모터 활성을 보이는 것을 특징으로 한다.

본원에 기술된 바와 같은 기능적으로 활성인 프로모터 변이체는 구체적으로 pG1 프로모터와 실질적으로 동일한 (+/- 10%, 또는 +/- 5%), 예컨대, 유도비에 의해 측정되는 조절가능한 특성, 또는 그보다 훨씬 더 높은 유도비를 보이는 것을 특징으로 한다.

본원에서 사용되는 바, "프로모터"라는 용어는 코딩 서열 또는 기능성 RNA의 발현을 제어할 수 있는 DNA 서열을 지칭한다. 프로모터 활성은 그의 전사 효율에 의해 사정될 수 있다. 이는 예컨대, 노던 블롯팅에 의해 프로모터로부터의 mRNA 전사량을 측정함으로써 직접적으로, 또는 프로모터로부터 발현된 유전자 생성물의 양을 측정함으로써 간접적으로 측정될 수 있다.

본원에 기술된 바와 같은 pG1-x 프로모터는 구체적으로 코딩 DNA의 발현을 개시하거나, 조절하거나, 또는 다르게는 그를 매개하거나, 제어한다. 프로모터 DNA 및 코딩 DNA는 동일 유전자로부터 또는 상이한 유전자로부터의 것일 수 있고, 이는 동일하거나, 또는 상이한 유기체로부터의 것일 수 있다.

본원에 기술된 바와 같은 pG1-x 프로모터는 구체적으로 억제된 상태 및 유도된 상태에서 프로모터 강도가 상이한, 조절가능한 프로모터, 특히, 탄소원 조절가능한 프로모터인 것으로서 이해된다.

본 발명의 프로모터의 강도는 구체적으로, 상기 프로모터에서 높은 빈도로 또는 낮은 빈도로 발생하는 전사 개시율로 제시되는 그의 전사 강도를 지칭한다. 전사 강도가 높을수록, 상기 프로모터에서 더욱 빈번하게 전사가 발생할 것이다. 주어진 mRNA 서열이 얼마나 자주 전사되는지를 측정함으로써 다른 것보다 일부 유전자에 대하여 더 높은 전사 우선권을 효과적으로 제공하여 더 높은 고농도로 전사체를 생성하는 바, 이에 프로모터 강도가 중요하다. 다량으로 요구되는 단백질을 코딩하는 유전자는 예를 들어, 전형적으로 비교적 강력한 프로모터를 가진다. RNA 폴리머라제는 전사 과업을 한번에 단 1회만을 수행할 수 있는 바, 이에 그의 작업이 효율적으로 이루어질 수 있도록 우선 순위화하여야 한다. 프로모터 강도 차이는 상기 우선 순위화가 이루어질 수 있도록 선택된다.

본 발명에 따라, 조절가능한 프로모터는, 전형적으로는 거의 최대 활성인 상태인 것으로 이해되는 완전히 유도된 상태에서 비교적 강력하다.

상대적 강도는 보편적으로는 유사한 프로모터, 예컨대, pG1 프로모터, 또는 표준 프로모터, 예컨대, 숙주 세포로서 사용되는 세포의 각각의 pGAP 프로모터 대비로 측정된다. 전사 빈도는 보편적으로 예컨대, 적합한 검정법, 예컨대, RT-PCR 또는 노던 블롯팅에서 전사체의 양으로 측정되는, 전사율로서 이해된다. 예를 들어, 본 발명에 따른 프로모터의 전사 강도는 P. 파스토리스인 숙주 세포에서 측정되고, P. 파스토리스의 천연 pGAP 프로모터와 비교된다.

관심 유전자를 발현하는 프로모터의 강도는 보편적으로 발현 강도 또는 높은 발현 수준/발현율을 지지할 수 있는 능력으로서 이해된다. 예를 들어, 본 발명의 프로모터의 발현 및/또는 전사 강도는 P. 파스토리스인 숙주 세포에서 측정되고, P. 파스토리스의 천연 pGAP 프로모터와 비교된다.

참조 (표준)로서 pGAP 프로모터를 사용하는 비교 전사 강도는 표준 수단에 의해, 예컨대, 마이크로어레이를 사용하여 예컨대, 전사체의 양을 측정함으로써, 아니면, 세포 배양물에서, 예컨대, 재조합 세포 중 각각의 유전자 발현 생성물의 양을 측정함으로써 측정될 수 있다. 예시적인 시험은 실시예 섹션에 예시되어 있다.

특히, 전사율은 마이크로어레이 상에서, 또는 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)을 이용하여 전사 강도에 의해 측정될 수 있고, 여기서, 마이크로어레이 또는 qRT-PCR 데이터가 성장률이 높은 조건과 성장률이 낮은 조건 사이, 또는 상이한 배지 조성을 사용하는 조건 사이의 발현 수준의 차이, 및 천연 pGAP 프로모터 대비의 높은 신호 강도를 보여준다.

발현율은 예를 들어, 리포터 유전자, 예컨대, eGFP의 발현량에 의해 측정될 수 있다.

본원에 기술된 바와 같은 pG1-x 프로모터는, 종종 "상동성 pGAP 프로모터"로 명명되는, 숙주 세포에서의 천연 pGAP 프로모터와 비교하여 적어도 15%인 전사율 또는 전사 강도로 반영되는, 비교적 높은 전사 강도를 발휘한다. 바람직하게, 전사율 또는 강도는 예컨대, POI 제조를 위한 숙주 세포로서 선택된 진핵 세포에서 측정된 바, 천연 pGAP 프로모터와 비교하여 적어도 20%, 특히 바람직한 경우에, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 및 적어도 100% 또는 그보다 훨씬 더 높은, 예컨대, 적어도 150% 또는 적어도 200%이다.

천연 pGAP 프로모터는 전형적으로 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 (GAPDH)를 코딩하는 gap 유전자의 발현을 개시하는 것으로서, 이는 대부분의 살아있는 유기체에 존재하는 구성적 프로모터이다. 해당작용 및 글루코스 신생 합성의 중요한 효소인 GAPDH (EC 1＼2＼1＼12)는 이화작용 및 동화작용 탄수화물 물질대사에서 중요한 역할을 한다.

천연 pGAP 프로모터는 구체적으로 비변형된 (비-재조합) 또는 재조합 진핵 세포를 포함한, 동일한 종 또는 균주의 천연 진핵 세포에서와 같은 방식으로 재조합 진핵 세포에서 활성을 띤다. 상기와 같은 천연 pGAP 프로모터는 보편적으로 내인성 프로모터, 따라서, 진핵 세포와 상동성인 것으로 이해되고, 이는 비교 목적으로 표준 또는 참조 프로모터로서의 역할을 한다.

예를 들어, P. 파스토리스의 천연 pGAP 프로모터는 예컨대, 도 13에 제시된 서열을 가지는, P. 파스토리스에서 GAPDH의 발현을 제어하는 데 사용되는 것으로서, P. 파스토리스 중의 비변형된, 내인성 프로모터 서열: P. 파스토리스 (GS115)의 천연 pGAP 프로모터 서열 (서열번호 260)이다. P. 파스토리스가 본 발명에 따른 POI 제조를 위한 숙주로서 사용될 경우, 본 발명에 따른 프로모터의 전사 강도 또는 전사율은 상기 P. 파스토리스의 천연 pGAP 프로모터와 비교된다.

또 다른 예로서, S. 세레비지아에의 천연 pGAP 프로모터는 S. 세레비지아에에서 GAPDH의 발현을 제어하는 데 사용되는 것으로서, S. 세레비지아에 중의 비변형된, 내인성 프로모터 서열이다. S. 세레비지아에가 본 발명에 따른 POI 제조를 위한 숙주로서 사용될 경우, 본 발명에 따른 프로모터의 전사 강도 또는 전사율은 상기 S. 세레비지아에의 천연 pGAP 프로모터와 비교된다.

그러므로, 본 발명에 따른 프로모터의 상대적인 발현 또는 전사 강도는 일반적으로 POI 제조를 위한 숙주로서 사용되는 동일한 종 또는 균주의 세포의 천연 pGAP 프로모터와 비교된다.

본원에서 사용되는 바, pG1-x 프로모터 또는 pG1 프로모터와 관련하여 "조절가능한"이라는 용어는 프로모터가 진핵 세포에서 회분식 배양의 성장 단계에서 과도한 양의 탄소원 (영양 기질 또는 기초 기질)의 존재하에서는 억제되고, 예컨대, 탄소량 감소시, 예컨대, 유가식 전략법에 따라 성장 제한 탄소원 (영양 기질 또는 보충 기질)을 배양물에 공급하였을 때, 탈억제되어 생산 세포주의 제조 단계에서 강력한 프로모터 활성을 발휘한다는 것을 지칭하여야 한다. 이와 관련하여, "조절가능한"이라는 용어는, 세포에 의해 용이하게 소비되도록 탄소 소비, 감소, 부족 또는 고갈에 의한 또는 탄소원의 제한된 첨가에 의한 프로모터의 탈억제를 지칭하는, "탄소원 제한 조절가능한" 또는 "글루코스 제한 조절가능한" 것으로 이해된다.

본원에 기술된 바와 같은 기능적으로 활성인 pG1-x 프로모터는 세포 성장 조건 (성장 단계)하에서는 침묵화 또는 억제되고, 생산 조건 (제조 단계)하에서는 활성화 또는 탈억제되며, 따라서, 탄소원을 제한함으로써 생산 세포주에서 POI 제조를 유도하는 데 적합한 것인, 비교적 강력한 조절가능한 프로모터이다.

구체적으로, 본원에 기술된 바와 같은 프로모터는 글루코스 및 글루코스 제한 존재하에서 그의 강도를 비교하는 시험에서 측정되는 바와 같이, 차별적인 프로모터 강도로 탄소원 조절가능한 것이며, 이는 비교적 높은 글루코스 농도, 바람직하게, 적어도 10 g/L, 바람직하게, 적어도 20 g/L인 농도에서도 여전히 억제된다는 것을 보여주는 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 프로모터는 제한된 글루코스 농도 및 프로모터를 완전히 유도하는 글루코스 임계값 농도에서 완전히 유도되고, 여기서, 임계값은 20 g/L 미만, 바람직하게, 10 g/L 미만, 1 g/L 미만, 심지어 0.1 g/L 미만 또는 50 mg/L 미만이고, 바람직하게, 40 mg/L 미만인 글루코스 농도에서 천연, 상동성 pGAP 프로모터의 예컨대, 적어도 50%의 완전 전사 강도를 가진다.

바람직하게, 유도비는 선정된 탄소원 임계값 미만인 유도 조건으로의 전환시 POI 제조 개시에 의해 측정되고, 억제된 상태에서의 강도와 비교되는 차별적인 프로모터 강도로서 이해된다. 전사 강도는 보편적으로 완전히 유도된 상태에서의 강도, 즉, 탈억제 조건하에서 거의 최대인 활성을 보여주는 강도로서 이해된다. 차별적인 프로모터 강도는 예컨대, 억제 조건 대비 탈억제 조건하에서 재조합 숙주 세포주에서의 POI 제조 효율 또는 POI 제조 수율에 따라, 아니면, 전사체 양에 의해 측정된다. 본 발명에 따른 조절가능한 프로모터는 유도 배수로서도 이해되는 바와 같이, 억제된 상태 대비 탈억제된 상태에서 적어도 2배, 더욱 바람직하게, 적어도 5배, 더욱더 바람직하게, 적어도 10배, 더욱 바람직하게, 적어도 20배, 더욱 바람직하게, 적어도 30, 40, 50, 또는 100배인 바람직한 차별적인 프로모터 강도를 가진다.

모체 서열 대비 변이체의 "서열 동일성"이라는 용어는 2개 이상의 뉴클레오티드 서열이 특정 정도로, 최대 100%에 가까운 정도까지 상응하는 위치에서 동일한 또는 보존되는 염기쌍을 가지는 동일성 (또는 상동성) 정도를 나타낸다. 상동성 서열은 전형적으로 적어도 약 50%의 뉴클레오티드 서열 동일성, 바람직하게, 적어도 약 60%의 동일성, 더욱 바람직하게, 적어도 약 70%의 동일성, 더욱 바람직하게, 적어도 약 80%의 동일성, 더욱 바람직하게, 적어도 약 90%의 동일성, 더욱 바람직하게, 적어도 약 95%의 동일성을 가진다.

뉴클레오티드 서열, 예컨대, 프로모터 또는 유전자의 뉴클레오티드 서열과 관련하여 "동일성(%)"은 서열을 정렬하고, 필요할 경우, 최대 서열 동일성(%)을 달성하기 위해 갭을 도입한 후, 및 임의의 보존적 치환은 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않으면서, DNA 서열 중 뉴클레오티드와 동일한 후보 DNA 서열 중 뉴클레오티드의 백분율인 것으로 정의된다. 뉴클레오티드 서열 동일성(%)을 측정하기 위한 목적으로 수행되는 정렬은 당업계에 포함되어 있는 다양한 방식으로, 예를 들어, 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용함으로써 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 전장의 서열에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요하는 임의의 알고리즘을 포함하는, 정렬 측정에 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 두 뉴클레오티드 서열 사이의 서열 동일성은 하기 예시적인 파라미터로 설정된 blastn과 함께 NCBI BLAST 프로그램 버전 2.2.29 (2014년 1월 6일)을 사용하여 측정된다: 워드 크기: 11; 기대값: 10; 갭 비용: 존재 = 5, 연장 = 2; 필터 = 활성화된 낮은 복잡도; 매치/미스매치 점수: 2,-3; 필터 스트링: L; m.

본 발명과 관련하여 사용되는 바, "돌연변이유발"이라는 용어는 비-코딩 또는 코딩 영역에 적어도 하나의 변이를 가지는 뉴클레오티드 서열의 변이체를 수득하기 위해 예컨대, 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실 및/또는 치환을 통해 뉴클레오티드 서열의 변이체를 제공하는 방법을 지칭하여야 한다. 돌연변이유발은 무작위, 반-무작위 또는 부위 지정 돌연변이를 통해 이루어질 수 있다. 특정 pG1-x 프로모터 변이체는 모체 서열로서 pG1 뉴클레오티드 서열을 사용하여 돌연변이유발 방법을 사용함으로써 pG1 프로모터 서열로부터 유래된다. 상기 돌연변이유발 방법은 핵산을 조작하는 방법 또는 주형으로서 pG1 프로모터 서열 정보를 사용하여 뉴클레오티드 서열을 새로 합성하는 방법을 포함한다. 특이적 돌연변이유발 방법은 합립적인 프로모터 조작에 적용된다.

pG1-x 프로모터는 pG1 프로모터의 돌연변이유발에 의해 제조될 수 있고, 기능적으로 활성인 변이체를 포함하는, 본원에 기술된 바와 같은 pG1-x 프로모터의 변이체는 표준 기술을 사용하여 추가로 제조될 수 있다. 예컨대, 프로모터를 변형시켜 발현 수준 및 조절 특성이 변경된 프로모터 변이체를 생성할 수 있다. 예를 들어, 예컨대, 진핵 세포에서 유전자 발현을 미세 조정하기 위해 상이한 발효 전략하에 변이체를 그의 발현에 대하여 분석하고, 적합한 변이체를 선택함으로써 모체 분자로서 사용될 수 있는 선택된 프로모터 서열의 돌연변이유발에 의해 프로모터 라이브러리를 제조할 수 있다. 변이체의 합성 라이브러리를 사용하여 예컨대, 선택된 POI를 제조하기 위한 요건에 부합하는 프로모터를 선택할 수 있다. 상기 변이체는 진핵성 숙주 세포에서 증가된 발현율 및 탄소원이 풍부한 조건 및 탄소원이 제한된 조건하에서 차별적인 발현을 가질 수 있다. 전형적으로, 거대 무작위화된 유전자 라이브러리는 고도의 유전자 다양성으로 제조되고, 이는 구체적으로 원하는 유전자형 또는 표현형에 따라 선택될 수 있다.

본원에 기술된 바와 같은 바람직한 pG1-x 프로모터 중 일부는 pG1 프로모터의 크기 변이체이고, 이는 프로모터의 특정 요소 또는 영역의 1개 초과의 카피를 포함하거나, 또는 pG1 프로모터의 하나 이상의 (동일하거나, 또는 상이한) 단편을 포함한다.

특이적 돌연변이유발 방법은 예컨대, 프로모터의 뉴클레오티드 서열 내의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 심지어는 그 초과의 연속된 뉴클레오티드를 변이시키는 서열 중 하나 이상의 뉴클레오티드의 점 돌연변이, 특히, 탠덤 점 돌연변이를 제공한다. 상기 돌연변이는 전형적으로 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 삽입, 및/또는 치환 중 적어도 하나이다. 프로모터 서열은 뉴클레오티드 서열의 최대 50%에 이르기까지 말단부, 특히, 5'-영역 내에서 돌연변이화될 수 있으며, 이는 프로모터 활성은 실질적으로는 손실하지 않으면서, 고도로 가변적일 수 있다. 프로모터 서열은 구체적으로 주요 조절 영역 내에서 돌연변이화될 수 있지만, pG1 모체 주요 조절 영역과의, 및 특히, 모체 코어 조절 영역과의 서열 동일성이 높은, 예컨대, 예로서, 적어도 80%인 것이 바람직하다. 주요 조절 영역 내부에 있되, 코어 조절 영역 외부에 있는 서열의 가변성은 80% 미만의 서열 동일성을 얻기 위해서 더 높을 수도 있다.

코어 조절 영역은 구체적으로 서열번호 2 및 서열번호 3을 도입하고, 이는 전사 인자 결합 부위 (TFBS), 및 서열번호 2와 서열번호 3 사이의 사이 영역을 나타낸다.

서열번호 2로서 확인되는 뉴클레오티드 서열은 Rgt1, Cat8-1 및 Cat8-2에 의해 인식되는 TFBS의 적어도 일부를 포함한다.

서열번호 3으로서 확인되는 뉴클레오티드 서열은 Rgt1, Cat8-1 및 Cat8-2에 의해 인식되는 TFBS의 적어도 일부를 포함한다.

구체적으로, 서열번호 2와 서열번호 3 사이의 뉴클레오티드 서열 (사이 서열)은 (예컨대, 50% 미만의 서열 동일성으로) 비-상동성 서열로 돌연변이화되거나, 또는 심지어는 결실될 수 있다.

서열번호 2 및 서열번호 3 내의 임의의 돌연변이는 구체적으로 보존적인 것, 즉, 예컨대, 각 전사 인자에 의한 인식을 유지시키는 (또는 개선시키는) 것이다. 상기와 같은 보존적 돌연변이체를 조작할 때, 서열번호 2 및/또는 서열번호 3 뉴클레오티드 서열 내의 서열 동일성은 적어도 90%, 바람직하게, 적어도 95%이다.

주요 조절 영역은 서열번호 5에 의해 확인되는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 그로 이루어진다. 상기 영역은 코어 조절 영역 및 추가의 비-코어 조절 영역을 포함하며, 이는 pG1 프로모터의 필수 요소를 포함하고, 본원에 기술된 바와 같은 pG1-x 프로모터를 제조할 수 있는 특정 정도로 돌연변이화될 수 있다.

부위 지정 돌연변이유발의 특정 영역은 예컨대, pG1 또는 pG1-x 프로모터의 비-코어 조절 영역 (주요 조절 영역 내부 또는 외부)이다. 그러나, 특정 돌연변이체는 또한 프로모터 기능을 유지시킬 수 있도록 서열 동일성을 특정 정도로 유지시키면서, 프로모터의 코어 조절 영역으로 지정되는 돌연변이유발 방법에 의해 제조될 수 있다. 추가의 특정 영역은 주요 조절 영역 외부 또는 그 내부에 존재한다. 구체적으로, 프로모터는 예컨대, pG1 프로모터의 코어 조절 영역 및 하나 이상의 영역 또는 대안적 (천연 또는 인공) 프로모터를 포함하는 하이브리드 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 예컨대, pG1 프로모터 이외의 다른 임의의 것인 프로모터의 3'-영역의 번역 개시 부위 (구체적으로, 적어도 10개의 말단 뉴클레오티드, 또는 적어도 15개의 말단 뉴클레오티드를 포함하는 3' 단부)는 pG1 프로모터의 번역 개시 부위를 치환시키는 데 사용될 수 있다.

특이적 돌연변이란, pG1 프로모터의 선택된 영역 (또는 모티프), 예컨대, T 모티프 또는 연장된 T 모티프의 중복을 지칭한다. 상기 선택된 모티프는 모티프의 어느 한쪽 말단부 또는 양쪽 말단부 모두에서 또는 모티프 내에서 추가의 뉴클레오티드에 의해 신장될 수 있거나, 또는 단출될 수 있다. 천연 pG1 서열은 뉴클레오티드 "T"에 이어서, "A", 이어서, T15로 이루어진 TAT 모티프 (서열번호 14)를 포함한다. 상기 TAT 모티프 5'-TATTTTTTTTTTTTTTT-3' (서열번호 22)는, 심지어는 TAT 모티프를 중복시킴으로써, 또는 TAT 모티프이거나, 또는 대안적 T 모티프, 적어도 T13 모티프 (서열번호 12)를 포함하는 연장된 T 모티프 (예컨대, TAT 모티프)를 사용하는 적어도 2, 또는 3, 또는 4개의 TAT 모티프 카피를 삽입함으로써 증가될 수 있는 프로모터 강도에 대하여 긍정적인 영향을 미치는 것으로 판명되었다.

본 발명은 엄격한 조건하에서 pG1-x 프로모터에 하이브리드화하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.

본 발명에서 사용되는 바, "하이브리드화" 또는 "하이브리드화하는"이라는 용어는 두 핵산 서열이 적절한 조건하에서 이중 가닥을 형성하도록 안정적이고, 특이적인 수소 결합으로 서로 어닐링하는 프로세스를 의미하는 것으로 한다. 두 상보적인 서열, 또는 충분히 상보적인 서열 사이의 하이브리드화는 사용되는 작동 조건, 및 특히 엄격도에 의존한다. 엄격도는 상동성 정도를 나타내는 것으로 이해될 수 있으며; 엄격도가 높을수록, 두 서열 사이의 상동성(%)은 더 높다. 엄격도는 특히 두 핵 서열의 염기 조성에 의해 및/또는 상기 두 핵 서열 사이의 미스매칭 정도에 의해 정의될 수 있다. 조건, 예컨대, 염 농도 및 온도를 달리함으로써, 주어진 핵산 서열이 오직 그의 정확한 보체와만 (고도의 엄격도), 또는 임의의 다소 관련이 있는 서열과만 (낮은 엄격도) 하이브리드화할 수 있도록 허용할 수 있다. 온도를 승온시키거나, 또는 염 농도를 감소시키는 것이 하이브리드화 반응의 선택성을 증기시키는 경향이 있을 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "엄격한 조건하에서 하이브리드화하는"이라는 어구는 바람직하게 특정의 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 것을 지칭하는 것으로 이해된다. 바람직한 실시양태에서, "엄격한 하이브리드화 조건"은 두 핵산 서열의 상동성이 적어도 70%, 바람직하게, 적어도 80%, 바람직하게, 적어도 90%인 조건, 즉, 하이브리드화는, 상기 하이브리드화 동안 수득된 이중 가닥이 바람직하게, 적어도 70%, 바람직하게, 적어도 80%, 바람직하게, 적어도 90%의 A-T 결합 및 C-G 결합을 포함하는 경우에만 오직 가능한 것인 조건이다.

엄격도는 반응 파라미터, 예컨대, 하이브리드화 용액 중에 존재하는 이온성 종의 농도 및 유형, 변성화제의 성질 및 농도 및/또는 하이브리드화 온도에 의존할 수 있다. 적절한 조건은 예컨대, 샘브룩(Sambrook) 등에 의해 기술된 바와 같이 (문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989]), 당업자에 의해 결정될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 핵산, POI 또는 다른 화합물과 관련하여 "단리된" 또는 "단리"라는 용어는 상기 화합물이 "실질적으로 순수한" 형태로 존재하도록 하기 위해, 자연적으로 그와 회합되어 있던 환경으로부터 충분히 분리되어 있다는 것을 지칭하여야 한다. "단리된"이라는 것이 반드시, 다른 화합물 또는 물질과의 인공 또는 합성 혼합물, 또는 근본적인 활성을 간섭하지 않고, 예를 들어, 불완전한 정제에 기인하여 존재할 수 있는 불순물의 존재를 배제하는 것을 의미하는 것은 아니다. 특히, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 또한 본원에서 "인공"인 것으로 지칭되는, "화학적으로 합성된 것," 및 특히, "P. 파스토리스 또는 임의의 다른 유기체에서 자연적으로 발생되지 않는 것"을 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 핵산과 관련하여, "단리된 핵산" 또는 "단리된 핵산 서열"이라는 용어가 종종 사용된다. 상기 용어가 DNA에 적용될 때, 이는 그의 유래 기점이 되는 유기체의 자연적으로 발생된 게놈 중에서 그와 함께 바로 인접해 있는 서열로부터 분리된 DNA 분자를 지칭한다. 예를 들어, "단리된 핵산"은 벡터, 예컨대, 플라스미드 또는 바이러스 벡터 내로 삽입된, 또는 원핵 또는 진핵 세포 또는 숙주 유기체의 게놈 DNA 내로 통합된 DNA를 포함할 수 있다. "단리된 핵산" (DNA 또는 RNA)은 생물학적 또는 합성 수단에 의해 직접 제조되고, 그의 제조 동안에 존재하는 다른 성분으로부터 분리된 분자를 추가로 나타낼 수 있다.

본원에 사용되는 바, "~에 작동가능하게 연결된"이라는 용어는, 하나 이상의 뉴클레오티드 서열의 기능이 단일 핵산 분자 상에 존재하는 적어도 하나의 다른 뉴클레오티드 서열에 의해 영향을 받도록 하는 방식으로 상기 핵산 분자, 예컨대, 벡터 상에 뉴클레오티드 서열이 회합되어 있다는 것을 지칭한다. 예를 들어, 프로모터가 재조합 유전자의 코딩 서열의 발현에 영향을 줄 수 있다면, 이는 상기 코딩 서열과 작동가능하게 연결되어 있는 것이다. 추가의 예로서, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산이 단백질을 분비된 형태로, 예컨대, 성숙한 단백질의 프리폼으로 또는 성숙한 단백질로 발현시킬 수 있다면, 이는 POI를 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 것이다. 구체적으로, 서로 작동가능하게 연결된 상기 핵산들은 바로, 즉, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산과 POI를 코딩하는 핵산 사이에 추가 요소 또는 핵산 서열 없이 연결될 수 있다.

프로모터가 코딩 서열의 전사를 제어한다면, 프로모터 서열은 전형적으로는 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 것으로 이해된다. 프로모터 서열이 천연적으로 코딩 서열과 회합되어 있지 않다면, 그의 전사는 천연 (야생형) 세포에서 프로모터에 의해 제어되지 않거나, 또는 서열은 상이한 인접 서열과 재조합된다.

본원에서 사용되는 바, "관심 단백질 (POI)"이라는 용어는 숙주 세포에서 F합 기술에 의해 제조된 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다. 더욱 구체적으로, 단백질은 숙주 세포에서 자연적으로 발생되지 않는 폴리펩티드, 즉, 이종성 단백질일 수 있거나, 아니면, 숙주 세포에 천연인 것, 즉, 숙주 세포에 대해 동정성인 단백질일 수 있지만, POI를 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 자가 복제 벡터로의 형질전환에 의해, 또는 재조합 기술에 의한 POI를 코딩하는 핵산 서열의 하나 이상의 카피의 숙주 세포의 게놈 내로의 통합시에, 또는 POI를 코딩하는 유전자의 발현을 제어하는 하나 이상의 조절 서열, 예컨대, 프로모터 서열의 재조합 변형에 의해 제조된다. 일부 경우에서, 본원에서 사용되는 바, POI라는 용어는 또한 재조합적으로 발현된 단백질에 의해 매개되는 숙주 세포에 의한 임의의 대사산물 생성물을 지칭한다.

POI는 구체적으로 정제된 형태로, 예컨대, 실질적으로 순수한 형태로 세포 배양물로부터 회수될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "실질적으로 순수한" 또는 "정제된"이라는 용어는 시료가 적어도 50% (w/w), 바람직하게, 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 화합물, 예컨대, 핵산 분자 또는 POI를 포함한다는 것을 지칭하여야 한다. 순도는 화합물에 적합한 방법 (예컨대, 크로마토그래피 방법, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, HPLC 분석 등)에 의해 측정된다.

본원에서 사용되는 바, "재조합"이라는 용어는 "유전 공학에 의해 제조된 것 또는 유전 공학의 결과"인 것을 의미하여야 한다. 따라서, "재조합 미생물"은 적어도 하나의 "재조합 핵산"을 포함한다. 재조합 미생물은 구체적으로 발현 벡터 또는 클로닝 벡터를 포함하거나, 또는 재조합 핵산 서열을 함유하도록 유전적으로 조작된 것이다. "재조합 단백질"은 숙주에서 각 재조합 핵산을 발현시킴으로써 제조된다. "재조합 프로모터"는 본원에 기술된 기능적으로 활성인 프로모터로서의 그의 용도에 적합한, 유전적으로 조작된 비-코딩 뉴클레오티드 서열이다.

일반적으로, 본원에서 지칭되는 재조합 핵산 또는 유기체는 당업자에게 널리 공지된 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다. 본 발명에 따라, 종래 분자 생물학, 미생물학 및 당업계 내의 재조합 DNA 기술이 사용될 수 있다. 상기 기술은 문헌에 완전하게 설명되어 있다. 예컨대, 문헌 [Maniatis, Fritsch & Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1982)]를 참조한다.

본 발명의 바람직한 실시양태에 따라, 프로모터 및 관련 유전자를 벡터 또는 발현 구축물로 라이게이션시킴으로써 재조합 구축물을 수득한다. 상기 벡터 또는 발현 구축물을 사용하여 숙주 세포를 형질전환시킴으로써 상기 유전자를 숙주 세포 게놈 내로 안정하게 통합시킬 수 있다.

발현 벡터로는 클로닝 벡터, 변형된 클로닝 벡터, 및 특수 디자인된 플라스미드를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 사용되는 바람직한 발현 벡터는 숙주 세포에서의 재조합 유전자의 발현에 적합한 임의의 발현 벡터일 수 있고, 이는 숙주 유기체에 의존하여 선택된다. 재조합 발현 벡터는 숙주 벡터로도 또한 명명되는, 숙주 유기체에서 복제가 가능하거나, 또는 숙주 유기체의 게놈 내로의 통합이 가능한 임의의 벡터일 수 있다.

적절한 발현 벡터는 전형적으로 진핵성 숙주 세포에서 POI를 코딩하는 DNA를 발현하는 데 적합한 추가의 조절 서열을 포함한다. 조절 서열의 예로는 오퍼레이터, 인핸서, 리보솜 결합 부위, 및 전사 및 번역 개시 및 종결을 제어하는 서열을 포함한다. 조절 서열은 발현시키고자 하는 DNA 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.

숙주 세포에서 재조합 뉴클레오티드 서열이 발현될 수 있도록 하기 위해, 발현 벡터는 코딩 서열의 5' 단부에 인접한 위치에, 예컨대, 관심 유전자 (GOI) 또는 POI의 분비를 가능하게 하는 신호 펩티드 유전자로부터 상류에 본 발명에 따른 프로모터를 제공할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "신호 펩티드"란 구체적으로 천연 신호 펩티드, 이종성 신호 펩티드 또는 천연 및 이종성 신호 펩티드의 하이브리드를 지칭하여야 하고, 이는 구체적으로는 POI를 생산하는 숙주 유기체에 대해 이종성 또는 동종성일 수 있다. 신호 펩티드의 기능은 POI가 분비되어 소포체 내로 유입될 수 있도록 허용하는 것이다. 이는 일반적으로 단백질의 원형질 막 밖으로의 수송을 지시하는 짧은 (3-60개의 아미노산 길이) 펩티드 쇄로써, 이를 통해 이종성 단백질의 분리 및 정제가 용이해질 수 있다. 일부 신호 펩티드는 단백질이 수송된 이후에 신호 펩티다아제에 의해 단백질로부터 절단된다.

예시적인 신호 펩티드는 S. 세레비지아에 알파-메이팅 인자 프리프로 펩티드로부터의 신호 서열 및 P. 파스토리스 산성 포스파타제 유전자 (PHO1) 및 세포외 단백질 X (EPX1)로부터의 신호 펩티드이다 (문헌 [Heiss et al., 2015]; WO2014067926A1).

POI의 발현을 구동시키도록 조절 요소 (예컨대, pG1-x 프로모터 및 임의적으로 신호 서열) 중 하나 이상의 것을 포함하는 발현 벡터를 구축할 수 있고, 발현된 수율을 종래 조절 요소를 포함하는 구축물과 비교하여, 예컨대, 관련 서열의 기능을 입증한다. 확인된 뉴클레오티드 서열을 특이적인 뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시키고, 발현 벡터로 클로닝하고, 각종의 상이한 POI를 높은 수준으로 제조하기 위해 예컨대, 효모 벡터 및 P. 파스토리스 균주를 사용하여 진핵 세포주로 형질전환시킬 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 pG1-x 프로모터가 상기와 같이 제조되는 재조합 POI의 양에 미치는 효과를 추정하기 위해, 각 세포에서의 종래 pG1 프로모터 또는 pGAP 프로모터를 포함하는 균주 비교로 진핵 세포주를 진탕 플라스크 실험 및 유가식 또는 케모스타트 발효로 배양할 수 있다. 특히, 프로모터 선택이 재조합 단백질 제조에 큰 영향을 미친다.

재조합 숙주 세포주를 사용하여 형질전환체를 배양하고, 이로써, 적절한 배지 중에서 수득하고, 발현된 생성물 또는 대사산물을 배양물로부터 단리시키고, 임의적으로, 적합한 방법에 의해 그를 정제함으로써 POI를 제조할 수 있다.

상기 벡터 DNA, 예컨대, 플라스미드 DNA를 숙주 내로 도입하고, 고수율로 POI 또는 숙주 세포 대사산물을 발현하는 형질전환체를 선택함으로써 본 발명에 따른 형질전환체를 수득할 수 있다. 진핵 세포 형질전환을 위해 통상 사용되는 방법, 예컨대, 전기 펄스 방법, 원형질체 방법, 아세트산 리튬 방법, 및 그의 변형된 방법을 사용하여 숙주 세포가 외부 DNA를 도입할 수 있도록 숙주 세포를 처리한다. P. 파스토리스는 바람직하게는 전기천공에 의해 형질전환된다. 미생물에 의해 재조합 DNA 단편을 흡수시키는 데 바람직한 형질전환 방법으로는 화학적 형질전환, 전기천공 또는 원형질체화에 의해 형질전환을 포함한다. 본 발명에 따른 형질전환체는 상기 벡터 DNA, 예컨대, 플라스미드 DNA를 숙주 내로 도입하고, 관련 단백질 또는 숙주 세포 대사산물을 고수율로 발현시키는 형질전환체를 선택함으로써 수득할 수 있다.

본 발명의 방법에 따른 POI 제조를 위한 수개의 상이한 접근법 바람직하다. 물질은, 관련 단백질 및 상기 기술된 바와 같은 조절 요소 중의 적어도 하나를 코딩하는 재조합 DNA를 보유하는 발현 벡터로 진핵성 숙주 세포를 형질전환시키고, 형질전환된 세포의 배양물을 제조하고, 배양물을 성장시키고, 전사 및 POI 생산을 유도하고, 발효 프로세스의 생성물을 회수함으로써 발현되고, 프로세싱되고, 임의적으로 분비될 수 있다.

본 발명에 따른 숙주 세포는 바람직하게는 하기 시험: ELISA, 활성 검정법, HPLC, 또는 다른 적합한 시험에 의해 그의 발현 능력 또는 수율에 대하여 시험된다.

본 발명은 구체적으로 발효 프로세스가 파일럿 규모 또는 산업 규모로 이루어질 수 있도록 허용한다. 산업 프로세스 규모는 바람직하게는 적어도 10 L, 구체적으로, 적어도 50 L, 바람직하게, 적어도 1 ㎥, 바람직하게, 적어도 10 ㎥, 가장 바람직하게, 적어도 100 ㎥의 용적을 사용할 것이다.

예컨대, 수일의 전형적인 프로세스 시간을 사용하는, 100 L 내지 10 ㎥ 이상의 반응기 부피의 유가식 배양, 또는 대략 0.02 - 0.15 h^-1의 희석률로 대략 50 - 1,000 L 이상의 발효기 부피의 연속 프로세스를 지칭하는 산업 규모의 제조 조건이 바람직하다.

적합한 배양 기술은 생물반응기에서 회분식 상으로 출발하여, 이어서, 높은 비성장률의 짧은 지수 유가식 상, 이어서, 추가로 낮은 비성장률의 유가식 상으로 진행되는 배양을 포함할 수 있다. 또 다른 적합한 배양 기술은 회분식 상, 이어서, 낮은 희석률의 연속 배양 성을 포함할 수 있다.

바람직한 실시양태는 바이오매스를 제공하기 위해 회분식 배양, 이어서, 높은 수율로 POI를 제조하기 위해 유가식 배양을 포함한다.

본원에 기술된 바와 같은 숙주 세포를 생물반응기에서 적어도 1 g/L 세포 건조 중량, 더욱 바람직하게, 적어도 10 g/L 세포 건조 중량, 바람직하게, 적어도 20 g/L 세포 건조 중량의 세포 밀도를 수득할 수 있도록 하는 성장 조건하에서 배양하는 것이 바람직하다. 파일럿 또는 산업 규모로 상기와 같은 바이오매스 생산 수율을 제공하는 것이 이롭다.

바이오매스 축적을 허용하는 성장 배지, 구체적으로, 기초 성장 배지는 전형적으로 탄소원, 질소원, 황 공급원 및 포스페이트 공급원을 포함한다. 전형적으로, 상기 배지는 추가로 미량 원소 및 비타민을 포함하고, 아미노산, 펩톤 또는 효모 추출물을 추가로 포함할 수 있다.

바람직한 질소 공급원으로는 NH₄H₂PO₄, 또는NH₃또는 (NH₄)₂SO₄를 포함하고;

바람직한 황 공급원으로는 MgSO₄, 또는 (NH₄)₂SO₄ 또는 K₂SO₄를 포함하고;

바람직한 포스페이트 공급원으로는 NH₄H₂PO₄ _,또는 H₃PO₄ 또는 NaH₂PO₄, KH₂PO₄, Na₂HPO₄ 또는 K₂HPO₄를 포함하고;

추가의 전형적인 배지 성분으로는 KCl, CaCl₂, 및 미량 원소, 예컨대: Fe, Co, Cu, Ni, Zn, Mo, Mn, I, B를 포함하고;

바람직하게, 배지는 비타민 B₇로 보충되고;

P. 파스토리스용으로 전형적인 성장 배지는 글리세롤, 소르비톨 또는 글루코스, NH₄H₂PO₄, MgSO₄, KCl, CaCl₂, 비오틴, 및 미량 원소를 포함한다.

제조 단계에서, 제조 배지는 구체적으로 오직 제한된 양의 보충 탄소원을 포함하는 것이 사용된다.

바람직하게, 숙주 세포주를 적합한 탄소원을 포함하는 무기 배지 중에서 배양하고, 이로써, 단리 프로세스를 크게 추가로 간소화시킬 수 있다. 바람직한 무기 배지의 예로는 예컨대, 영양요구성을 보완하기 위해, 사용가능한 탄소원 (예컨대, 글루코스, 글리세롤, 소르비톨 또는 메탄올), 대량 원소 (칼륨, 마그네슘, 칼슘, 암모늄, 클로라이드, 술페이트, 포스페이트) 및 미량 원소 (구리, 아이오다이드, 망간, 몰리브데이트, 코발트, 아연 및 철 염, 붕산)를 함유하는 염 및 임의적으로 비타민 또는 아미노산을 함유하는 것이 있다.

구체적으로, 원하느 POI를 발현시키는 데 적합한 조건하에서 세포를 배양하고, POI는 발현 시스템 및 발현된 단백질의 성질에 따라, 예컨대, 단백질이 신호 펩티드에 융합되어 있는지 여부 및 단백질이 가용성인지 또는 막에 결합되어 있는지 여부에 의존하여, 세포 또는 배양 배지로부터 정제될 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 배양 조건은 숙주 세포의 유형 및 사용되는 특정 발현 벡터를 포함하는 인자에 따라 달라질 것이다.

전형적인 제조 배지는 보충 탄소원, 및 추가로 NH₄H₂PO₄, MgSO₄, KCl, CaCl₂, 비오틴, 및 미량 원소를 포함한다.

예를 들어, 발효에 첨가되는 보충 탄소원의 공급물은 최대 50 wt%의 사용가능한 당을 포함하는 탄소원을 포함할 수 있다. 보충 배지의 낮은 공급률이 생성물 또는 부산물 억제가 세포 성장에 미치는 효과를 제한할 것이며, 이로써, 기질 제공에 기초한 높은 생성물 수율이 가능해질 것이다.

발효는 바람직하게는 pH 3 내지 7.5 범위에서 수행된다.

20℃ 내지 35℃, 바람직하게, 22-30℃ 범위의 온도에서 전형적인 발효 시간은 약 24 내지 120시간이다.

POI는 바람직하게는 적어도 1 mg/L, 바람직하게, 적어도 10 mg/L, 바람직하게, 적어도 100 mg/L, 가장 바람직하게, 적어도 1 g/L의 수율을 생성할 수 있도록 하는 조건을 사용하여 발현된다.

본원에 개시된 방법은 POI가 바람직하게는 분비된 형태로, 아니면 세포내 생성물로서 발현될 수 있도록 허용하는 조건하에서 상기 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 이어서, 재조합적으로 제조된 POI 또는 숙주 세포 대사산물을 당업자에게 널리 공지된 기술에 의해 세포 배양 배지로부터 단리시킬 수 있고, 추가로 정제시킬 수 있다.

본 발명에 따라 제조된 POI는 전형적으로, 원하는 POI의 농도는 증가시키고/거나, 적어도 하나의 불순물의 농도는 감소시키는 것을 포함하는, 최신식 기술을 사용함으로써 단리되고, 정제될 수 있다.

POI가 세포로부터 분비된다면, 이는 최신식 기술을 사용함으로써 배양 배지로부터 단리되고, 정제될 수 있다. 생성물이, 효모 세포가 파쇄되어 세포내 단백질이 방출될 때 생성되는 단백질의 복합 혼합물이 아닌 배양물 상청액으로부터 회수되기 때문에 정제 프로세스를 촉진시킨다는 것을 포함하는 이유에서 일반적으로는 숙주 세포로부터의 재조합 발현 생성물의 분비가 이롭다.

배양된 형질전환체 세포 또한 초음파 처리에 의해 또는 기계적으로, 효소적으로 또는 화학적으로 파쇄시켜 원하는 POI를 함유하는 세포 추출물을 수득할 수 있고, 이로부터 POI를 분리하고, 정제한다.

재조합 폴리펩티드 또는 단백질 생성물을 수득하기 위한 단리 및 정제 방법으로서, 방법, 예컨대, 용해도 차이를 이용하는 방법, 예컨대, 염석 및 용매 침전, 분자량 차이를 이용하는 방법, 예컨대, 한외여과 및 겔 전기영동, 전하 차이를 이용하는 방법, 예컨대, 이온 교환 크로마토그래피, 특이적 친화성을 이용하는 방법, 예컨대, 친화성 크로마토그래피, 소수성 차이를 이용하는 방법, 예컨대, 역상 고성능 액체 크로마토그래피, 및 등전점 차이를 이용하는 방법, 예컨대, 등전점 전기영동이 사용될 수 있다.

고도로 정제된 생성물에는 본질적으로 오염 단백질이 없고, 바람직하게, 적어도 90%, 더욱 바람직하게, 적어도 95%, 또는 심지어 적어도 98%, 최대 100%의 순도를 가진다. 정제된 생성물은 세포 배양 상청액의 정제에 의해, 아니면, 세포 파편으로부터 정제에 의해 수득될 수 있다.

단리 및 정제 방법으로서 하기 표준 방법이 바람직하다: 세포 파쇄 (POI가 세포내에서 수득되는 경우), 세포 (파편) 분리 및 미세여과 또는 접선 유동 필터 (TFF)에 의한 세척 또는 원심분리, 침전 또는 열 처리에 의한 POI 정제, 효소적 소화에 의한 POI 활성화, 크로마토그래피, 예컨대, 이온 교환 (IEX), 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC), 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 (SEC) 또는 HPLC 크로마토그래피에 의한 POI 정제, 농축의 POI 침전 및 한외여과 단계에 의한 세척.

단리 및 정제된 POI를 종래 방법, 예컨대, 웨스턴 블롯, HPLC, 활성 검정법, 또는 ELISA에 의해 확인할 수 있다.

POI는 임의의 진핵성, 원핵성 또는 합성 폴리펩티드일 수 있다. 이는 분비된 단백질 또는 세포내 단백질일 수 있다. 본 발명은 또한 자연적으로 발생된 단백질의 기능적 상동체, 기능적 등가 변이체, 유도체 및 생물학적으로 활성인 단편의 재조합적 제조를 제공한다. 기능적 상동체는 바람직하게는 서열과 동일하거나, 그에 상응하고, 그의 기능적 특성을 가진다.

본원에서 지칭되는 POI는 바람직하게는 치료학적, 예방학적, 진단적, 분석적 또는 산업적 사용을 위해 진핵성 숙주 세포와 동종성이거나, 또는 이종성인 생성물일 수 있다.

POI는 바람직하게는 진핵 세포, 바람직하게, 효모 세포에서 바람직하게, 분비된 단백질로서 제조된 이종성 재조합 폴리펩티드 또는 단백질이다. 바람직하게 제조된 단백질의 예로는 면역글로불린, 면역글로불린 단편, 아프로티닌, 조직 인자 경로 억제제 또는 다른 프로테아제 억제제, 및 인슐린 또는 인슐린 전구체, 인슐린 유사체, 성장 호르몬, 인터류킨, 조직 플라스미노겐 활성인자, 형질전환 성장 인자 a 또는 b, 글루카곤, 글루카곤-유사 펩티드 1 (GLP-1), 글루카곤-유사 펩티드 2 (GLP-2), GRPP, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 XIII, 혈소판 유래 성장 인자 1, 혈청 알부민, 효소, 예컨대, 리파제 또는 프로테아제, 또는 천연 단백질과 유사한 기능을 가지는 기능적 상동체, 기능적 등가 변이체, 유도체 및 생물학적으로 활성인 단편이 있다. POI는 천연 단백질과 구조적으로 유사할 수 있고, 천연 단백질의 C- 및 N-말단 단부 중 어느 하나 또는 그 둘 모두, 또는 측쇄에의 하나 이상의 아미노산의 부가, 천연 아미노산 서열 중 하나 또는 수개의 상이한 부위에서의 하나 이상의 아미노산 치환, 천연 단백질의 어느 한 단부, 또는 양쪽 단부 모두에서 또는 아미노산 서열 중 하나 또는 수개 부위에서의 하나 이상의 아미노산 결실, 또는 천연 아미노산 서열 중 하나 이상의 부위에서의 하나 이상의 아미노산 삽입에 의해 천연 단백질로부터 유래될 수 있다. 상기와 같은 변형은 상기 언급한 수개의 단백질에 대해 널리 공지되어 있다.

POI는 또한 상기 생화학적 반응 또는 일련의 수개의 반응의 생성물을 수득하기 위한, 예컨대, 숙주 세포의 생성물을 수득하기 위한 목적으로 숙주 세포에서 생화학적 반응을 제공하는 기질, 효소, 억제제 또는 보조인자로부터 선택될 수 있다. 예시적인 생성물은 비타민, 예컨대, 리보플라빈, 유기산 및 알콜일 수 있고, 이는 본 발명에 따른 재조합 단백질 또는 POI의 발현 후에 증가된 수율로 수득될 수 있다.

일반적으로, 재조합 생성물을 발현하는 숙주 세포는 POI의 재조합 발현에 적합한 임의의 진핵 세포일 수 있다.

바람직한 포유동물의 예로는 BHK, CHO (CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX, CHO-K1, CHOK1SV, CHO-S), HeLa, HEK293, MDCK, NIH3T3, NS0, PER.C6, SP2/0 및 VERO 세포가 있다.

본 발명에 따른 숙주 세포로서 사용되는 바람직한 효모 세포의 예로는 사카로마이세스 속 (예컨대, 사카로마이세스 세레비지아에), 피치아 속 (예컨대, P. 파스토리스, 또는 P. 메타놀리카(P. methanolica)), 마가타엘라 속 (K. 파스토리스(K. pastoris), K. 슈도파스토리스 또는 K. 파피이), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 쉐페르소마이세스 스티피티스(Scheffersomyces stipitis) 또는 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)가 있다.

더욱 최근의 문헌에서는 피치아 파스토리스가 코마가타엘라 파스토리스, 코마가타엘라 파피이(Komagataella phaffii) 및 코마가타엘라 슈도파스토리스로 분류되고, 명칭이 변경되어 있다. 본원에서 피치아 파스토리스는 모든 코마가타엘라 파스토리스, 코마가타엘라 파피이 및 코마가타엘라 슈도파스토리스에 대하여 동의어로 사용된다.

바람직한 효모 숙주 세포는 메틸영양성 효모로부터, 예컨대, 피치아 또는 코마가타엘라, 예컨대, 피치아 파스토리스, 또는 코마가타엘라 파스토리스, 또는 K. 파피이, 또는 K. 슈도파스토리스로부터 유래된 것이다. 숙주의 예로는 효모, 예컨대, P. 파스토리스를 포함한다. P. 파스토리스 균주의 예로는 CBS 704 (=NRRL Y-1603 = DSMZ 70382), CBS 2612 (=NRRL Y-7556), CBS 7435 (=NRRL Y-11430), CBS 9173-9189 (CBS 균주: CBS-KNAW 진균 다양상 센터(CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre), 왕립 미생물 자원 센터(Centraalbureau voor Schimmel-cultures: 네덜란드 위트레흐트)), 및 DSMZ 70877 (독일 미생물 및 세포 배양물 컬렉션(German Collection of Micro-organisms and Cell Cultures)) 뿐만 아니라, 인비트로겐(Invitrogen)으로부터의 균주, 예컨대, X-33, GS115, KM71 및 SMD1168을 포함한다. S. 세레비지아에 균주의 예로는 W303, CEN.PK 및 BY-시리즈 (EUROSCARF 컬렉션)를 포함한다. 상기 기술된 균주들 모두 형질전환체를 제조하고, 이종성 유전자를 발현하는 데 성공적으로 사용되어 왔다.

본 발명에 따른 바람직한 효모 숙주 세포, 예컨대, P. 파스토리스 또는 S. 세레비지아에 숙주 세포는, P. 파스토리스 또는 S. 세레비지아에 균주로부터 유래된 것일 수 있고, 생산 숙주와는 다른 이종성 또는 재조합 프로모터 서열을 함유한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 본 발명에 따른 숙주 세포는 숙주 세포와 동일한 속, 종, 또는 균주로부터 기원된 프로모터를 포함하는, 본 발명에 따른 재조합 발현 구축물을 포함한다.

본 발명에 따라, POI를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 본원에 기술된 바와 같은 pG1-x 프로모터 서열을 포함하는 P. 파스토리스 숙주 세포주를 제공하는 것이 바람직하다.

POI가 숙주 세포와 상동성인 단백질, 즉, 숙주 세포에서 자연적으로 발생되는 단백질이라면, 숙주 세포에서의 POI의 발현은 그의 천연 프로모터 서열을 본 발명에 따른 프로모터 서열로 교체함으로써 조정될 수 있다.

본 목적은 예컨대, 부위 특이 재조합을 허용하는 표적 유전자의 상동성 서열, 프로모터 서열 및 숙주 세포에 적합한 선별가능한 마커를 포함하는 재조합 DNA 분자로 숙주 세포를 형질전환시킴으로써 달성될 수 있다. POI를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 프로모터 서열을 작동가능하게 연결시키기 위해서는 부위 특이 재조합이 이루어져야 한다. 이로써, 천연 프로모터 서열 대신 본 발명에 따른 프로모터 서열로부터 POI가 발현된다.

POI의 천연 프로모터 서열과 비교하여 pG1-x 프로모터가 증가된 프로모터 활성을 가지는 것이 구체적으로 바람직하다.

구체적인 실시양태에 따라, POI 제조 방법은 숙주 세포의 게놈 내로의 통합에 적합한 플라스미드 상에서 세포당 단일 카피로 또는 다중 카피로 제공되는, POI를 코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열을 사용한다. POI를 코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열은 또한 자가 복제 플라스미드 상에서 세포당 단일 카피로 또는 다중 카피로 제공될 수 있다.

본원에 기술된 바와 같은 바람직한 방법은 진핵성 발현 벡터, 바람직하게, 효모 발현 벡터인 플라스미드를 사용한다. 발현 벡터는 클로닝 벡터, 변형된 클로닝 벡터 및 특수 디자인된 플라스미드를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 사용되는 바람직한 발현 벡터는 숙주 세포에서의 재조합 유전자의 발현에 적합한 임의의 발현 벡터일 수 있고, 이는 숙주 유기체에 의존하여 선택된다. 재조합 발현 벡터는 본 발명에 따른 DNA 구축물을 보유하며, 숙주 벡터, 예컨대, 효모 벡터로도 또한 명명되는, 숙주 유기체에서 복제가 가능하거나, 또는 숙주 유기체의 게놈 내로의 통합이 가능한 임의의 벡터일 수 있다. 바람직한 효모 발현 벡터는 한세눌라 속, 피치아 속, 칸디다 속 및 토룰로프시스 속으로 대표되는 메틸영양성 효모로 이루어진 군으로부터 선택되는 효모에서의 발현을 위한 것이다.

본 발명에서, 벡터로서 pPICZ, pGAPZ, pPIC9, pPICZalfa, pGAPZalfa, pPIC9K, pGAPHis 또는 pPUZZLE로부터 유로된 플라스미드를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 실시양태에, 재조합 구축물은 관련 유전자를 벡터로 라이게이션시킴으로써 수득된다. 상기 벡터를 사용하여 숙주 세포를 형질전환시킴으로써 이들 유전자들을 숙주 세포 게놈 내로 안정적으로 통합시킬 수 있다. 재조합 숙주 세포주를 사용하여 이와 같이 수득된 형질전환체를 적절한 배지 중에서 배양하고, 발현된 POI를 배양물로부터 단리시키고, 발현된 생성물에 적절한 방법에 의해 POI를 정제하여, 특히, 오염 단백질로부터 POI를 분리시킴으로써 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드를 제조할 수 있다.

발현 벡터는 하나 이상의 표현형 선별가능한 마커, 예컨대, 항생제 내성을 부여하거나, 또는 독립 영양 요건을 공급하는 단백질을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 효모 벡터는 보편적으로 효모 플라스미드로부터 복제 기점, 자가 복제 서열 (ARS), 또는 대안적으로, 숙주 게놈 내로의 통합을 위해 사용되는 서열, 프로모터 영역, 폴리아데닐화를 위한 서열, 전사 종결을 위한 서열, 및 선별가능한 마커를 함유한다.

DNA 서열 및 조절 요소, 예컨대, pG1-x 프로모터 및 POI를 코딩하는 유전자(들), 프로모터 및 종결인자를 각각 라이게이션시키고, 이들을, 통합 또는 숙주 복제에 필요한 정보를 함유하는 적합한 벡터 내로 삽입하는 데 사용되는 방법은 예컨대, 샘브룩 등에 의해 기술된 바와 같이 (문헌 [A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989]), 당업자에게 널리 공지되어 있다.

본 발명에 따른 조절 요소, 및/또는 통합 표적으로서 POI를 사용하는 벡터는, 먼저 조절 요소 및/또는 POI를 코딩하는 전체 DNA 서열을 함유하는 DNA 구축물을 제조한 후, 이어서, 상기 단편을 적합한 발현 벡터 내로 삽입함으로써, 또는 개별 요소에 대한 유전 정보를 함유하는 DNA 단편을 순차적으로 삽입한 후, 이어서, 라이게이션시킴으로써 구축될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

다중클로닝 부위를 가지는 벡터인 다중클로닝 벡터 또한 본 발명에 따라 사용될 수 있으며, 여기서, 원하는 이종성 유전자는 다중클로닝 부위로 도입되어 발현 벡터를 제공할 수 있다. 발현 벡터에서, 프로모터는 POI 유전자의 상류에 위치하고, 유전자의 발현을 조절한다. 다중클로닝 벡터인 경우, POI 유전자가 다중클로닝 부위에 도입되어 있기 때문에, 프로모터는 다중클로닝 부위의 상류에 위치한다.

본 발명에 따른 재조합 숙주 세포를 수득하기 위해 제공되는 DNA 구축물은 확립된 표준 방법, 예컨대, 포스포르아미다이트 방법에 의해 합성적으로 제조될 수 있다. DNA 구축물은 또한 예를 들어, 게놈 또는 cDNA 라이브러리를 제조하고, 본 발명에 따른 폴리펩티드 모두 또는 그 일부를 코딩하는 DNA 서열을, 표준 기술에 따라 합성 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 하이브리드화에 의해 스크리닝함으로써 수득된, 게놈 또는 cDNA 기원의 것일 수 있다 (문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989]). 마지막으로, DNA 구축물은 표준 기술에 따라, 전체 DNA 구축물의 다양한 일부분인 것에 상응하는 단편인 것인, 합성, 게놈 또는 cDNA 기원의 단편을 적절하게 어닐링함으로써 제조된 혼합된 합성 및 게놈, 혼합된 합성 및 cDNA 또는 혼합된 게놈 및 cDNA 기원의 것일 수 있다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 효모 발현 벡터는 예컨대, 상동성 재조합에 의해 효모 게놈에 안정적으로 통합될 수 있다.

바람직하게는, 숙주 세포를 본 발명에 따른 조절 요소, 및/또는 POI 유전자로 형질전환시킴으로써 수득된, 본 발명에 따른 형질전환체 숙주 세포를 먼저 다수의 세포 개수로 효율적으로 성장하는 조건하에서 배양할 수 있다. POI 발현을 위해 세포주를 제조하는 경우, 발현 생성물을 제조하는 배양 기술이 선택된다.

상기 기술내용은 하기 실시예를 참조함으로써 더욱 충분하게 이해될 것이다. 그러나, 그러한 실시예는 단지 본 발명의 하나 이상의 실시양태를 실시하는 방법을 나타내는 것이며, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 이해되지 않아야 한다.

실시예

실시예 1: pG1의 5'-단축을 통해 pG1의 주요 조절 영역을 밝힌다.

천연 (야생형) pG1 프로모터를 P. 파스토리스 (코마가타엘라 파피이) 균주 CBS2612 (CBS 균주: CBS-KNAW 진균 다양상 센터, 왕립 미생물 자원 센터: 네덜란드 위트레흐트)로부터 단리시켰다. 생어(Sanger) 서열분석 및 후속된 BLAST 분석에 의해 측정된 바, CBS2612의 pG1 프로모터 서열은 균주 GS115 (인비트로겐) (PAS_chr1-3_0011의 상류) 및 CBS7435 (P7435_Chr1-0007의 상류) 또는 K. 파스토리스 DSMZ 70382 (DSMZ 균주: 독일 미생물 및 세포 배양물 컬렉션) (PIPA00372의 상류)에서 각 영역과 95% 초과의 서열 동일성을 가졌다. pG1의 게놈 영역을 분석하는 동안, 균주 CBS7435 (P7435_Chr1-0007) 및 DSMZ 70382 (PIPA00372)에서의 그의 유전자 GTH1은 GS115 (PAS_chr1-3_0011)에서의 것과 상이한 출발 주석을 가진다는 것을 파악하게 되었다. GS115 및 CBS2612와 대조적으로, 다른 두 균주의 게놈 서열에서 코딩 서열은 추가로 36 bp 하류에서 출발하는 주석을 가지고 있다.

pG1의 관련된 조절 영역을 확인하기 위해, 대안적 5'번 위치 -858, -663, -492, -371, -328, -283, -211 및 -66에서부터 출발하여 -1번 위치까지 CBS2612로부터 8개의 단축형 pG1 변이체를 클로닝하였다 (도 1 참조, GTH1 유전자 유전자좌 PAS_chr1-3_0011의 출발점을 기준으로 넘버링). 상기 단축형 프로모터 변이체를, pG1의 원래의 965 bp 버전과의 비교하여 억제 특성 (글리세롤) 및 유도 특성 (글루코스 공급 비드)에 대하여 시험하는 실시예 8에 기술된 바와 같이 딥 웰 플레이트에서 eGFP 발현에 대하여 스크리닝하였다 (도 2). 억제 조건하에서는 모든 길이 변이체의 경우 eGFP 신호에 있어서는 어던 차이도 발견되지 않았고, 이는 프로모터 억제가 단축형 변이체 중 어느 것에서도 제한되지 않았다는 것을 보여주는 것이다. 유도 48시간 후, 길이가 328 bp까지 단축된 프로모터 변이체의 경우, 발현 능력은 완전히 기능성을 띠는 것으로 그대로 유지되었다. 283 bp 변이체는 원래의 pG1 프로모터와 비교하였을 때, 단지 약 ⅔ 정도로만 강력하였다. 가장 짧은 길이의 두 변이체 (211 및 66 bp)는 거의 비기능성인 것으로 보였다. 본 결과는 위치 -400 내지 -200 사이의 영역이 중요한 조절 특성을 함유한다는 것이다.

실시예 2: 고밀도의 예측된 탄소원 관련 TFBS가 pG1 프로모터의 주요 조절 영역을 마킹한다.

게노매틱스(Genomatix)로부터의 매트인스팩터를 사용하여 매트릭스 군 '진균' 및 '일반 코어 프로모터 요소'에 속하는 매트릭스 패밀리에 대해 pG1 프로모터 서열 (유전자 PAS_chr1-3_0011의 상류쪽 1000 bp)을 검색하였다. 46개의 상이한 매트릭스 패밀리에 속하는 111개의 추정 TFBS가 발견되었다 (표 1). 분석된 서열 중 가장 흔한 매트릭스 패밀리는 단량체 Gal4 부류 모티프 (F$MGCM, 12개의 결합 부위), 호메오도메인 함유 전사 조절인자 (F$HOMD, 6개의 결합 부위), 진균 기초 류신 지퍼 패밀리 (F$BZIP, 5개의 결합 부위) 및 효모 GC 박스 단백질 (F$YMIG, 5개의 결합 부위)이었다. 위치 -400 내지 -200 사이에서 매우 높은 TFBS 결합 부위 밀도가 감지되었고, 여기서, 언급된 TFBS (가장 흔한 매트릭스 패밀리) 중 약 ⅔가 그 위치에 존재하였다 (28개 중 18개). 일반 코어 프로모터 요소와 관련하여 매트인스팩터에 의해서는 어떤 효모 또는 진균 관련 모티프도 확인되지 않았고, -26번 위치에서 출발하는 TATA 박스를 발견할 수 있었다.

예컨대, 위치 -390 내지 -375에서 중요한 모티프를 확인하게 되었으며, 이는 그의 서열 5'-TATTTTTTTTTTTTTT-3' (서열번호 21)에 기인하여 TAT14, 또는 그의 서열 5'-TATTTTTTTTTTTTTTT-3' (서열번호 22)에 기인하여 TAT15로 명명되었다. 프로모터 영역 중 상기 폴리(A:T) 트랙은 효모에서 뉴클레오솜 결합에 부정적인 영향을 미치고, 인근 부위에서의 TF 결합을 자극하는 것으로 공지되어 있다.

실시예 3: 탄소원 관련 전사 인자 Mxr1 , Rgt1 , Cat8 -1, Cat8 -2 및 Mig1은 pG1의 조절 특성에 중요한 것으로 밝혀졌다.

추가 분석을 위해 글루코스 또는 탄소원에 의존하는 것으로 예측되는 전사 인자 결합 부위를 선택하였다 (도 1 및 표 2 참조). 중복 연장 PCR을 사용하여 각 영역이 결실된 pG1 변이체를 생성하였다. 표 3에는 선택된 모든 TFBS가 열거되어 있고, 결실에 의해 (부분적으로) 영향을 받은 TFBS 모두가 제시되어 있다 (표 2에 상세한 설명된 목록). 일부 결실의 경우 (예컨대, 9 및 10), 각 TFBS의 일부 뉴클레오티드는 가까운 이웃 TFBS를 기능성인 상태로 유지시키기 위해 및 그의 효과를 별도로 조사하기 위해 본래 그대로 유지시켰다.

억제 (글리세롤) 및 유도 조건 (글루코스 공급 비드)하에서 실시예 8에 기술되는 바와 같이 eGFP 발현에 대하여 모든 TFBS 결실 및 TAT 돌연변이 변이체를 스크리닝하였다 (도 3). 개별 TF/TFBS는 일반적으로 프로모터의 조절을 이행하는 데 충분하지 않은 것으로 간주하는 것이 중요하다. TFBS 결실은 또한 프로모터 서열은 새로 형성된 인접한 서열에 의해, TFBS 사이의 변경된 거리에 의해, 또는 고차 특성 (크로마틴 조직화) 변화에 의해 영향을 받을 수 있다는 것을 암시한다. 프로모터의 다른 위치의 동일한 TFBS는 다른 인접한 TFBS로 인해서도 다른 기능을 가질 수 있다. 가까운 이웃 TFBS에서 TF는 시너지적으로 작용할 수 있거나, 또는 입체 장애에 기인하여 다른 TF의 결합을 제한할 수도 있다.

pG1 프로모터 변이체에서 4개의 상이한 탄소원 관련 TF 패밀리를 결실시켰다 (표 2 및 표 3 참조): 효모 대사 조절인자 (F$ADR; 매트릭스: F$ADR1.01), 단량체 Gal4 부류 모티프 (F$MGCM; 매트릭스: F$RGT1.01, F$RGT1.02), 탄소원 반응성 요소 (F$CSRE, 매트릭스: F$CSRE.01, F$SIP4.01) 및 효모 GC-Box 단백질 (F$YMIG; 매트릭스: F$MIG1.01 및 F$MIG1.02). S. 세레비지아에에서의 상응하는 전사 인자는 각각 Adr1, Rgt1, Sip4/Cat8 및 Mig1이다.

탄소원 의존성 프로모터는 글루코스 억제에 의해 제어되고/거나, 탄수화물 또는 다른 비당 탄소원에 의해 유도된다. 글루코스 억제는 대개 Snf1 단백질 키나제 복합체, 전사 억제인자 Mig1 및 단백질 포스파타제 1에 의해 수행된다. S. 세레비지아에에서 하류 인자는 예컨대, 호흡 유전자 (Hap4), 글루코스 신생 합성 유전자 (Cat8, Sip4) 및 글루코스 수송체 (Rgt1)를 조절한다.

P. 파스토리스는 Mig1-1 및 Mig1-2로 불리는 2개의 Mig1 상동체를 가지며, 이중 2번째 것은 가능하게는 탄소 이화 생성물 억제인자로서 작용한다. 글루코스가 이용가능할 때, Mig1은 억제인자로서 작용하는 반면, Rgt1은 전사 활성인자로서 작용한다. 억제인자 기능을 이행하기 위해, Mig1은 탈인산화되고, 핵 안으로 내수송되고, 여기서, 보조억제인자 Ssn6 및 Tup1을 동원한다.

글루코스를 제한할 때, Rgt1은 탈인산화되고, 전사 억제인자로서 작용한다. Rgt1 기능은 그의 인산화 상태에 의해 제어되고 (Rgt1은 4개의 인산화 부위를 가진다), 조절된 프로모터의 유도는 전사 억제인자에 대해 전형적으로 관찰되는 바와 같이, S. 세레비지아에에서 Rgt1 해리를 필요로 하지 않는다.

탄소원 반응성 아연 핑거 전사 인자 Adr1은 S. 세레비지아에에서의 글루코스 억제 알콜 데히드로게나제 (ADH2) 유전자의 전사 활성화를 위해 요구된다. P. 파스토리스에서의 Adr1 상동체는 메탄올 물질대사의 중요한 조절인자인 Mxr1 (PAS_chr4_0487)이고, 이는 메탄올 상에서의 강력한 P_AOX 유도를 위해서는 필수적인 긍정적으로 작용하는 전사 인자인 것으로 보고되었다. Mxr1에 대하여 보고된 TFBS 코어 모티프 5' CYCC 3'은 pG1 프로모터 서열에서 발견되는 두 F$ADR1.01 부위 모두와 매칭된다.

탄소원 반응 요소 (CSRE)는 S. 세레비지아에에서 전사 활성인자 Sip4 및 Cat8에 의해 결합되고, 글루코스 신생 합성 유전자의 발현을 유도하는 작용을 한다. ScCat8의 P. 파스토리스 상동체 2개, Cat8-1 (PAS_chr2-1_0757) 및 Cat8-2 (PAS_chr4_0540)를 발견할 수 있는데, 이 둘 모두도 역시 ScSip4에 대하여 최상의 blastp 히트이다. Cat8-2는 ScCat8과 약하게 유사하고, 잠재적으로는 억제 조건하에서 중요한 역할을 한다.

실시예 4: pG1 프로모터의 결실 변이체를 통해 그의 억제 및 유도를 담당하는 TFBS를 밝힌다.

앞서 확인된 pG1의 주요 조절 영역 (도 1 및 표 2에서 대시 기호로 표시된 박스 참조)의 상류 (5')에 상주하는 5개의 결실 변이체 중, 변이체 pG1-Δ1, -Δ2 및 -Δ4는 프로모터 강도에 유익한 영향을 미치는 것으로 보이는 반면, 결실 변이체 pG1-Δ3 및 Δ5는 원래의 pG1 프로모터 (서열번호 9)와 비교하였을 때, GFP 발현에는 어떤 영향도 미치지 않았다. 이러한 결과는 프로모터의 5' 단축이 pG1 조작에 유익할 수 있다는 것을 제안한다. pG1의 주요 조절 영역 (pG1-Δ6 내지 -Δ12, 도 1 및 표 2 참조) 내의 TFBS 결실은 eGFP 발현에 상이한 영향을 미쳤지만, 억제 특성을 상실시키지 않으면서 증가된 유도를 보인 것은 없었다. 그러므로, pG1의 주요 조절 영역은 그의 엄격한 조절을 유지하기 위해서는 조작된 pG1 프로모터 변이체에서 유지되어야 한 필요가 있는 것으로 간주된다. 따라서, 상기 영역이 없는 경우, 실시예 1에서 글루코스 제한시 유도는 훨씬 더 낮은 것으로 관찰되었다 (pG1-328 및 pG1-283, 도 2).

pG1-Δ3, -Δ4, -Δ10 및 -Δ11에서 Mig1 결합 부위를 결실시켰고 (Δ3에서 F$MIG1.02, Δ4, Δ10 및 Δ11에서 F$MIG1.01), 여기서, pG1-Δ10 및 pG1-Δ11은 각각 F$ADR1.01 및 F$RGT1.02 결실도 포함한다. Δ3의 경우 조금 더 엄격한 억제가 관찰된 반면, Δ4는 억제는 변화되지 않았지만, 유도 후 eGFP 수준은 증진되었다.

Δ10에 대해 관찰된 해방된 억제 및 Δ10 및 Δ11의 더 약한 프로모터 유도는 또한 상기 영역 중 F$RGT1 결합 부위와 관련이 있을 수 있다 (Δ9 및 Δ11에서 결실된 F$RGT1.01 및 F$RGT1.02). 또한, Mig1은 pG1 조절에서 이작용성 역할을 할 수 있고: P. 파스토리스에서 2개의 MIG1 유전자가 관찰되고 (MIG1 -1, MIG1 -2), 이는 글루코스 이용가능성에 따라 반대로 조절되는 것으로 나타났다.

비록 Mxr1 (Pp에서 메탄올 물질대사의 양성 조절인자, ScADR1의 상동체) 결합 부위 결실이 프로모터를 더욱 약화시킬 것으로 예상되기는 하였지만, F$ADR1.01의 결실이 변이체 pG1-Δ1에서 eGFP 수준을 증가시켰다. pG1-Δ10에서 F$MIG1.01과 F$ADR1.01의 조합된 결실이 글리세롤에 대한 프로모터 억제를 해방시켰고, 그의 유도를 약화시켰으며, 이는 Mig1 TFBS 결실에 대한 결정적인 반응이다.

주요 조절 영역에서, 결합 부위 F$RGT1.02가 변이체 pG1-Δ6 (2개 부위), -Δ7, -Δ8, -Δ11 및 -Δ12에서 결실되었고, F$RGT1.01은 Δ9에서 결실되었다. 쌍을 형성한 F$RGT1.02 부위 (Δ6, 7 bp가 이동된 반대 가닥 상의 결합 부위)의 결실을 보유하는 변이체는 약간 해방된 억제 및 감소된 유도를 보였다. 변이체 Δ7 및 Δ8은 매우 가까운 F$RGT1.02 부위를 함유하며, 여기서, 첫번째 것은 (-) 가닥 상에 위치하고, 두번째 것은 (+) 가닥 상에 위치하고; Δ8 또한 F$SIP4.01 부위의 결실을 함유한다. 첫번째 것 (Δ7)은 약간 해방된 억제 및 증가된 유도를 보인 반면, 두번째 것 (Δ8)은 훨씬 더 약한 유도를 보였다 (그러나, 프로모터 억제에 있어서는 변함이 없었다). 이는 pG1 유도에 있어서 전사 활성인자 Cat8-1 및/또는 Cat8-2 (ScSip4에 대한 가장 강력한 상동체)가 강력한 역할을 한다는 것을 나타낸다. 가깝께 위치하는 F$RGT1.01 및 F$CSRE.01 TFBS (반대 가닥 상의 결합 부위)를 결실시키기 위해 변이체 Δ9를 생성하였고, 급격한 억제 손실은 상기 TFBS가 가장 가능하게는 Rgt1, Cat8-1 및/또는 Cat8-2의 결합을 통해 pG1을 엄격하게 제어하는 강력한 역할을 한다는 것을 나타내는 것이다. 변이체 pG1-Δ12에서 F$RGT1.02의 결실은 eGFP 발현 성능에는 어떤 영향도 미치지 않았다. 흥미롭게도, CAT8 -2 전사는 글루코스 과잉과 비교하였을 때 글루코스 제한시에 강력하게 상향조절되는 반면, RGT1 및 CAT8-2는 시험 조건하에서 전사에 의해 조절되지 못했다.

실시예 5: pG1 프로모터 강도는 폴리 ( A:T ) 트랙 TAT14에 의존한다.

TAT 모티프는 pG1의 주요 조절 영역의 대략 80 bp 상류쪽 (5', 예컨대, 위치 -390 내지 -374)에 위치한다. P. 파스토리스 CBS2612, CBS7435 또는 GS115에서의 GTH1의 5'-영역의 반복된 서열분석을 통해 TAT 모티프에서 15 +/- 1 Ts가 검출되었다. 그가 프로모터 성능에 미치는 영향을 밝히기 위해, 결실 (pG1-ΔTAT14) 및 돌연변이 (T16, T18 및 T20으로의 돌연변이; pG1-T16, pG1-T18, pG1-T20)를 위해 TAT14 모티프를 선택하였다. 먼저, T18, T20 및 T22를 수득할 수 있도록 프라이머 (표 4에서 프라이머 #37-42 참조)를 디자인하였지만, 길이가 상이한 변이체 (각각 T16, T20 및 T18)를 수득하였고, 이를 사용하였다. TAT14 모티프 결실로 GFP 신호는 저하된 반면, 그의 연장은 pG1의 발현 강도를 증가시켰다. 이는 연장된 TAT14 모티프가 pG1을 조작하는 데 유익할 것이라는 것을 나타낸다.

실시예 6: pG1의 주요 조절 영역의 부분적인 서열 중복이 그의 발현 강도를 유의적으로 개선시킨다.

두 서열 단편 (-472 내지 -188 및 -472 내지 -1)의 PCR 증폭 및 제한 부위 PstI 및 BglII (위치 509-514 및 525-530)를 사용한 삽입에 의해 pG1 프로모터의 2개의 중복 변이체 (pG1-D1240 (서열번호 49) 및 pG1-D1427 (서열번호 85), 숫자는 각 프로모터 변이체의 길이를 언급한다)를 생성하였다. 첫번째 변이체 (pG1-D1240)의 경우, 중복 부분은 pG1-Δ5에서 결실된 TFBS의 상류쪽에서 출발하여 pG1의 주요 조절 영역 이후에 종료된 반면, 제2 중복 (pG1-D1427)은 pG1 프로모터의 3' 단부까지 도달한다. TFBS 결실 및 TAT14 돌연변이 변이체에 대하여 기술된 것과 동일한 방식으로 (실시예 8 참조) 상기 변이체를 eGFP 발현에 대하여 스크리닝하였다. 두 중복 변이체 모두 과도한 글리세롤에서 더욱 엄격한 억제를, 및 글루코스 제한시에는 더욱 강력한 유도를 보였다 (도 4).

약 20 세대인, 선택압 없이 이루어진 3회 연속된 회분식 배양을 수행함으로써 중복 변이체 클론 pG1-D1240 #3의 형질전환 이후의 안정성에 대하여 시험하였다. eGFP 발현은 배양 전 기간 동안에 걸쳐 안정적이었다 (데이터는 나타내지 않음). 비교시, 전형적인 P. 파스토리스 생물반응기 프로세스는 회분식 상에서 OD₆₀₀=1 (~0.2-0.4 g/L YDM)로 출발하여, 유가식 상 이후 ~100 g/L YDM으로 종료되며, 이로써, 약 10 세대가 소요된다.

실시예 7: 유가식 생물반응기 배양에서의 pG1 프로모터 변이체 성능 확인

바이오프로세스 조건하에서의 생성된 프로모터 변이체의 성능을 확인하기 위하여, 유가식 배양을 위해, 그의 변경된 eGFP 발현 성능에 기초하여 일부 변이체를 선택하였다: pG1-Δ2 (서열번호 211)가 가장 크기 증진된, 주요 조절 영역 상류쪽 변이체였고, pG1-T16 (서열번호 257) 및 pG1-D1240 (서열번호 49)은 글리세롤 조건하에서 프로모터 억제를 상실하지 않으면서, 글루코스 제한시 더 높은 eGFP 발현 수준을 보였다. 각각의 한 클론에 대하여 글리세롤 회분식 상으로 출발하여 공간 시간 수율 최적화된 유가식으로 진행된 생물반응기 배양 (문헌 [Prielhofer et al., 2013])을 수행하고, eGFP 발현에 대하여 대조군 균주 pG1 #8과 비교하였다 (도 5 및 표 5 참조).

최종 작업 부피 0.7 L로 DASGIP 반응기에서 유가식 발효를 수행하였다.

하기 배지를 사용하였다:

1 ℓ당 함유되어 있는 PTM ₁ 미량 염 스톡 용액

6.0 g CuSO₄ _·5H₂O, 0.08 g NaI, 3.36 g MnSO₄ _·H₂O, 0.2 g Na₂MoO₄ _·2H₂O, 0.02 g H₃BO₃, 0.82 g CoCl₂, 20.0 g ZnCl₂, 65.0 g FeSO₄ _·7H₂O, 0.2 g 비오틴 및 5.0 ml H₂SO₄(95%-98%).

1 ℓ당 함유되어 있는 글리세롤 회분식 배지

2 g 시트르산 일수화물 (C₆H₈O₇ _·H₂O), 39.2 g 글리세롤, 12.6 g NH₄H₂PO₄, 0.5 g MgSO₄ _·7H₂O, 0.9 g KCl, 0.022 g CaCl₂ _·2H₂O, 0.4 mg 비오틴 및 4.6 ml PTM1 미량 염 스톡 용액. pH를 5로 설정하기 위해 HCl을 첨가하였다.

1 ℓ당 함유되어 있는 글루코스 유가식 배지

464 g 글루코스 일수화물, 5.2 g MgSO₄ _·7H₂O, 8.4 g KCl, 0.28 g CaCl₂ _·2H₂O, 0.34 mg 비오틴 및 10.1 mL PTM1 미량 염 스톡 용액.

용존 산소량은 교반기 속도 (400-1,200 rpm)로 DO = 20%로 제어되었다. 에어레이션 비율은 24 L h^-1 대기였고, 온도는 25℃로 제어되었고, 5인 pH 설정점은 NH₄OH (25%) 첨가에 의해 제어되었다.

발효를 개시하기 위해, 400 mL 회분식 배지를 발효기 내로 멸균 여과시키고, 출발 광학 밀도 (OD600)를 1로 하여 각 P. 파스토리스 클론의 엄선된 사전 배양물로부터 접종하였다. 대략 25 h의 회분식 상 (대략 20 g/L의 건조 바이오매스 농도에 도달)에 이어서, 7h 동안의 지수 공급으로 출발하고, 13h 동안 15 g/L의 일정한 공급률로 수행된 글루코스 제한된 유가식이 진행되었고, 이를 통해 대략 100 g/L의 최종 건조 바이오매스 농도를 얻었다. 회분식 및 유가식 상 동안 샘플을 채취하고, 플레이트 판독기 (인피니트 200(Infinite 200), 테칸(Tecan: 스위스))를 사용하여 eGFP 발현에 대해 분석하였다. 그러므로, 샘플을 광학 밀도 (OD600) = 5로 희석시켰다. 결과는 생물반응기당 상대 형광 (FL/r)으로서 도 5에 제시되어 있다.

실시간 PCR 을 사용하여 상기 3개의 클론의 유전자 카피수에 대하여 분석하였고, 그들 모두에 대해 1개의 GCN을 얻었다 (데이터는 나타내지 않음). pG1-변이체는 모두 회분식 상에서 우수한 억제 및 유도된 상태에서 강력한 발현을 나타내었다 (표 5). 중복 변이체 pG1-D1240의 강력한 개선은 생물반응기 조건에서 확인할 수 있었고, 클론 pG1-D1240 #3은 유가식 종료시 pG1 대비 GFP 형광이 50% 증가된 것으로 나타났다. 비록 신호는 회분식 종료시에 이미 증가되어 있었지만, 유도비는 원래의 pG1의 것보다 조금 더 높았다. 스크리닝 이외에서도, 클론 pG1-Δ2 #3은 회분식 종료시에 약간 증가된 신호, 및 유가식 종료시에 약 10% 약화된 신호를 나타내었다. TAT14 돌연변이 변이체 클론 pG1-T16 #3은 회분식 종료에 가장 강력한 신호를 보였고, 유가식 종료시 중복 변이체 아래로 떨어졌고, 스크리닝 결과에서와 유사하게, 대조군 pG1 #8에 비하여 약 20% 개선된 값에 도달하였다. 회분식 상에서 클론의 상이한 유도 거동은 회분식 상 전 기간 동안에 걸친 글리세롤 농도 감소에 기인한 탈억제로 설명된다 (도 5a 참조). 전반적으로, 유가식 배양은 대체로 소규모 스크리닝에서 수득된 결과를 확인시켜 줄 수 있었다.

달성 결과 및 결론

제조 단계가 성장과 분리될 수 있기 때문에, 탄소원에 의존하여 조절되는 유전자 프로모터는 바이오프로세스 적용에 바람직하다. 잠재적인 프로모터 기반 단백질 제조 개선은 최적의 성장 조건 (예컨대, 성장률, 공급 전략법)을 발견함으로써, 또는 프로모터 서열을 직접 조작함으로써 (예컨대, 돌연변이, 결실) 달성될 수 있다.

단축된 길이, TFBS 결실, TAT 모티프 돌연변이 및 단편 중복을 이용하여 수개의 pG1 프로모터 변이체를 구축하였다. 이로써, 그의 중요한 TFBS를 포함하는, pG1의 주요 조절 영역을 확인하였다. TFBS 결실 분석 결과, 전사 인자 Rgt1 및 Cat8-1 및/또는 Cat8-2가 pG1 억제 및 유도에서 필수적이 역할을 하고: 반대 가닥 상의 동일 위치에 결합하는 F$RGT1 및 F$CSRE로 이루어진 두 모티프가 결실된 것으로 나타났다. 제1 부분의 결실 (pG1-Δ8, 위치 -293 내지 -285; RGT1: (+) -310 내지 -299, CSRE: (-) -299 내지 -285)은 프로모터 유도를 약화시킨 반면, 제2 부분의 결실 (pG1-Δ9, 위치 -275 내지 -261; RGT1: (-) -275 내지 -259, CSRE: (+) -276 내지 -260)은 프로모터 억제를 감소시켰다. 이로써, pG1 조절을 위해 필수적이고, 그의 특징이 되는 조절 모티프가 확인되었다.

전사 조절인자 Mig1 (F$MIG1) 및 Mxr1 (F$ADR1)의 역할은 다른 조건, 예컨대, 과도한 글루코스 또는 메탄올 유도에서 더욱 중요할 수 있다. 상기 영역에서 결합하거나, 또는 그에 근접한 위치에서 결합하는 다른 전사 인자 또한 pG1의 조절에 기여할 수 있다.

폴리(A:T) 트랙은 프로모터 서열에서 중요한 역할을 하는 것으로 공지되어 있고, 주요 조절 영역의 상류 (예컨대, 위치 -390 내지 -375)에 위치하는, pG1 중의 TAT 모티프는 그의 강도에 필수적인 것으로 제시될 수 있다. 상기 모티프를 T16, T18 및 T20으로 신장시키는 것은 프로모터 성능에 긍정적인 영향을 미쳤다.

pG1의 결실 변이체를 통해 5' 단축 또한 프로모터 조작에 유익할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 비록 하기와 같은 효과가 5' 단축형 프로모터 변이체에 대해서는 관찰되지 않았지만, pG1의 주요 조절 영역의 상류가 결실된 Mxr1, Mig1, Rgt1 및 Cat8에 대한 TFBS는 eGFP 발현을 개선시켰다.

부분적으로 서열이 중복된 두 변이체는 야생형 pG1과 비교하였을 때, 크게 증진된 발현 능력에 도달하였다.

합리적인 프로모터 조작: 5' 단출, TAT 모티프 사용 및 임의적 돌연변이/신장 및 단편 중복을 위한 확실한 근거가 되는, pG1의 우수한 발현 성능의 독특한 특성이 부여될 수 있다. 소듀모 스크리닝에서의 pG1 변이체 성능을 유가식 배양에서 성공적으로 확인할 수 있었다.

약어:

CSRE: 탄소원 반응 요소, F$: 진균 특이 TF 매트릭스, GCN: 유전자 카피수, GOI: 관심 유전자, Pp: 피치아 파스토리스, Sc: 사카로마이세스 세레비지아에, TF: 전사 인자(들), TFBS: 전사 인자 결합 부위(들), YDM: 효모 건조 질량

실시예 8: 억제, 유도, pG1 -x 발현 수준 ( pG1 대비 발현 수준), 유도비 측정

하기 표준 검정법을 사용하여 pG1 프로모터 대비 프로모터 강도 및 유도비를 측정할 수 있다: P. 파스토리스 균주를 웰당 2 mL 배양물을 이용하여 280 rpm으로 진탕시키면서, 25℃에서 24 딥 웰 플레이트 중에서 스크리닝한다. 글루코스 공급 비드 (6 mm, 쿠너: 스위스)를 사용하여 글루코스 제한 성장 조건을 생성한다. 유세포 분석법을 사용하여 억제 (YP + 1% 글리세롤, 지수 증식기) 및 유도 (YP + 1 공급 비드, 20-28시간) 동안 eGFP 발현에 대해 세포를 분석한다. 유세포 분석법 데이터의 적어도 3000개의 데이터 점에 대한 형광 강도 및 전방 산란으로부터 비 eGFP 형광을 산출한다. 전방 산란은 세포 부피에 대한 상대적인 척도이다. 비 eGFP 형광은 형광 강도 (FI)를 전방 산란 (FSC)으로 나눈 값의 1.5승, 즉, FI/FSC¹ ^.5와 같다 (문헌 [Hohenblum, H., N. Borth & D. Mattanovich, (2003) Assessing viability and cell-associated product of recombinant protein producing Pichia pastoris with flow cytometry. J Biotechnol 102: 281-290]). 상기 데이터로부터 집단의 비 형광의 기하 평균을 사용하고, 비-생산 P. 파스토리스 야생형 세포의 배경 신호를 감산함으로써 정규화시킨다. 글리세롤 조건의 비 eGFP 형광은 "억제"로 명명되고, 제한된 글루코스 조건 (글루코스 공급 비드)의 비 eGFP 형광은 "유도"로 명명된다. 그러므로, 동일한 스크리닝 및 유세포 분석법 측정의 억제 및 유도 값만이 비교될 수 있고, 산출을 위해 사용될 수 있다. 상대적인 pG1-x 프로모터 강도를 측정하기 위해, pG1-x 프로모터를 포함하는 균주의 유도 값을 원래의 pG1 프로모터를 포함하는 균주의 유도 값으로 나눔으로써 pG1-x 프로모터의 유도된 상태에서의 eGFP 발현 수준을 원래의 pG1 프로모터의 것과 비교하였다. 유도 값을 동일한 균주/프로모터의 억제 값으로 나눔으로써 유도비를 산출한다. 수개의 프로모터 변이체에 대한 억제, 유도, 상대적인 pG1-x 프로모터 강도 및 유도비는 표 6에 제시되어 있다.

추가의 실시예에서는 뉴클레오티드 서열 서열번호 49를 포함하거나, 또는 그로 이루어진 pG1-x 프로모터를 사용함으로써 모델 단백질 (POI)은 P. 파스토리스에서 비변형된 pG1 프로모터 (참조 서열번호 7)와 비교하였을 때, 훨씬 더 높은 수율 (증가 배수 3.5배 초과), 유가식 실험)로 제조되었다는 것이 입증되었다.

실시예 9: "고속 발효"와 표준 발효 비교

요약: 표준 유가식 방식을 사용하는 대신 공간 시간 수율 최적화된 유가식 프로토콜을 사용함으로써 서열번호 39의 pG1-3 실시양태 (pG1-D1240 (서열번호 49))의 제어하에 모델 단백질로서 대안적 스캐폴드 단백질의 발현을 위한 발효 시간을 유의적으로 단축시킬 수 있다.

유가식 배양을 위해 pG1-D1240 (서열번호 49)의 제어하에 모델 단백질을 발현하는 클론을 선택하였다. 최종 작업 부피가 0.5 L인 DASGIP 반응기 (에펜도르프(Eppendorf: 독일))에서 유가식 배양을 수행하였다. 배지 및 미량 원소 용액은 앞서 실시예 7에 기술된 바와 같이 제조하였지만, 단, 예외적으로, 글리세롤 회분식 배지 중의 글리세롤 농도는 45 g/L였다. 배양하는 동안, 용존 산소량 수준은 교반기 속도 (400-1,200 rpm)로 DO = 30%로 제어되었다. 에어레이션 비율은 1 vvm 대기였고, 온도는 25℃로 제어되었고, 5.0인 pH 설정점은 NH₄OH (25%) 첨가에 의해 제어되었다. 생물반응기 배양을 시작하기 위해, 1.0을 출발 광학 밀도 (OD600)로 하여 각 P. 파스토리스 클론의 사전 배양물로부터 250 mL 회분식 배지를 접종하였다. 글리세롤에 대한 회분식 상은 대략 30h 소요되었고, 건식 바이오매스 농도 25 - 29 g/L에 도달하였다. 글리세롤 회분식 상에 이어서, 글루코스 제한된 유가식으로 이어졌다. 2개의 상이한 유가식 배양 모드를 비교하였다: (a) 일정한 공급률을 사용하여 표준 유가식 프로토콜, (b) 발효의 부피 생산성을 최대화시키기 위해 글루코스 공급률이 최적화된 공간 시간 수율 최적화된 유가식 프로토콜 ("고속 발효").

표준 배양을 위해, 1.25 mL h^-1인 일정한 글루코스 공급률을 선택하였다. 100h 동안 (총 배양 시간 126 h) 유가식 배양을 유지시킴으로써 대략 90 g L^-1의 최종 건조 바이오매스 농도를 얻었다. "고속 발효"를 위해, 선형 증가 함수: F(t)[mLoh^-1]= 0.3234omLoh^-2o*ot+ 3.3921omLoh^-1에 의해 최적화된 부피 글루코스 공급률 F(t)의 근사치를 구한 모델 기반 최적화 알고리즘 (문헌 [Maurer et al., Microbial Cell Factories, 2006, 5:37])을 채택하였다. 유가식 상은 t= 33h (총 배양 시간 60 h) 동안 유지되었고, 이로써, 최종 건조 바이오매스 농도는 대략 140 g L^-1이었다.

회분식 상 종료시 및 유가식 상 동안 샘플을 채취하였다. HT 저 MW 단백질 발현 시약 키트 및 캘리퍼 랩칩 GXI 시스템(Caliper LabChip GXI system) (퍼킨 엘머(Perkin Elmer: 미국))을 사용하여 정화된 상청액으로부터 생성물 역가를 분석하였다. 절대 정량화를 위한 참조 표준로서, 대안적 스캐폴드 단백질의 정제된 표준을 사용하였다.

도 9는 표준 배양 (a) 및 "고속 발효" (b)를 위한 총 배양 시간에 걸친 생성물 및 바이오매스 생성을 보여주는 것이다. 비교시, "고속 발효" 및 표준 발효의 경우, 각각 60h 및 126h 경과 후 6.4 g L^-1및 4.3 g L^-1인 최종 생성물 역가에 도달할 수 있었다. 다시 말해, 기술된 표준 공급 방식을 사용하는 대신 "고속 발효"에 대하여 기술된 바와 같이, pG1-D1240 (서열번호 49) 프로모터하에 발현하는 동안 글루코스 공급물을 보충하였을 때, 유의적으로 더 짧은 발효 시간 (-66h) 경과 후 1.4배 더 높은 역가 (각각 1.2배 더 높은 브로쓰 역가)를 관찰할 수 있었다.

표

Claims

서열번호 1에 의해 확인되는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)의 탄소원 조절가능한 pG1 프로모터의 기능성 변이체인 단리된 및/또는 인공 pG1-x 프로모터로서, 상기 pG1-x 프로모터는
하기 프로모터 영역:
a) 뉴클레오티드 서열 서열번호 2 및 서열번호 3을 포함하는 적어도 하나의 코어 조절 영역; 및
b) pG1-x 프로모터 서열 내의, 코어 조절 영역 이외의 다른 임의 영역인 비-코어 조절 영역
을 특징으로 하는, 길이가 적어도 293 bp인, 서열번호 1의 적어도 일부로 이루어지거나, 또는 그를 포함하고;
여기서, pG1-x 프로모터는 프로모터 영역 중 임의의 것에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 서열번호 2 및 서열번호 3에서 적어도 80%의 서열 동일성, 및 서열번호 2 또는 서열번호 3 이외의 다른 임의 영역에서 적어도 50%의 서열 동일성을 포함하고; 추가로
여기서, pG1-x 프로모터는 pG1 프로모터와 비교하여 동일하거나, 또는 증가된 프로모터 강도 및 유도비를 특징으로 하고, 여기서,
- 프로모터 강도는 pG1 프로모터와 비교하여 유도된 상태에서 적어도 1.1배 증가되어 있고/거나,
- 유도비는 pG1 프로모터와 비교하여 적어도 1.1배 증가되어 있는 것인, 단리된 및/또는 인공 pG1-x 프로모터.
제1항에 있어서, 서열번호 2 및/또는 서열번호 3이 하나 이상의 전사 인자 결합 부위 (TFBS)를 포함하는 것인 pG1-x 프로모터.
제1항 또는 제2항에 있어서, 코어 조절 영역이 뉴클레오티드 서열 서열번호 4, 또는 하나 이상의 TFBS를 포함하는 그의 기능성 변이체, 바람직하게는, 적어도 80%의 서열 동일성을 가지는 기능성 변이체를 포함하는 것인 pG1-x 프로모터.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 코어 조절 영역이 서열번호 5로 제시되는 주요 조절 영역, 또는 하나 이상의 TFBS를 포함하는 그의 기능성 변이체, 바람직하게는, 적어도 80%의 서열 동일성을 가지는 기능성 변이체 내로 도입되는 것인 pG1-x 프로모터.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 TFBS가 Rgt1, Cat8-1 및 Cat8-2로 이루어진 군으로부터 선택되는 전사 인자 중 임의의 것에 대한 TFBS인 것인 pG1-x 프로모터.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 바람직하게는 pG1 서열의 3' 영역의 적어도 293개의 뉴클레오티드 또는 3' 영역의 기능성 변이체는 그대로 남겨 두면서, pG1 서열의 5' 단부에 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 pG1 프로모터의 기능성 변이체인 것인 pG1-x 프로모터.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 코어 조절 영역이 뉴클레오티드 서열 서열번호 2 및 서열번호 3 사이에 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 pG1-x 프로모터.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 코어 조절 영역 또는 주요 조절 영역의 카피를 적어도 2개 포함하는 것인 pG1-x 프로모터.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 12-29 중 임의의 것에 의해 확인되는 적어도 하나의 또는 적어도 2개의 T 모티프를 포함하는 것인 pG1-x 프로모터.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, T 모티프가 코어 조절 영역의 상류 및 임의로 주요 조절 영역의 상류에 위치하는 것인 pG1-x 프로모터.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, T 모티프가 코어 조절 영역의 하류 및 임의로 주요 조절 영역의 하류에 위치하는 것인 pG1-x 프로모터.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 번역 개시 부위의 적어도 일부를 포함하는 3'-말단 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 pG1-x 프로모터.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 길이가 최대 2,000 bp인 것인 pG1-x 프로모터.
서열번호 1에 의해 확인되는 피치아 파스토리스의 탄소원 조절가능한 pG1 프로모터의 기능성 변이체 단리된 및/또는 인공 pG1-x 프로모터로서,
a) 서열번호 37-44, 바람직하게는, 서열번호 45-76 중 임의의 것;
b) 서열번호 77-80, 바람직하게는, 서열번호 81-112 중 임의의 것;
c) 서열번호 113-114, 바람직하게는, 서열번호 115-130 중 임의의 것;
d) 서열번호 131-132, 바람직하게는, 서열번호 133-148 중 임의의 것;
e) 서열번호 149-150, 바람직하게는, 서열번호 151-166 중 임의의 것;
f) 서열번호 167-168, 바람직하게는, 서열번호 169-184 중 임의의 것;
g) 서열번호 185-186, 바람직하게는, 서열번호 187-202 중 임의의 것;
h) 서열번호 203-204, 바람직하게는, 서열번호 205-220 중 임의의 것;
i) 서열번호 221-222, 바람직하게는, 서열번호 223-238 중 임의의 것;
j) 서열번호 239-240, 바람직하게는, 서열번호 241-256 중 임의의 것; 및
k) 서열번호 32-36 또는 서열번호 257-259
중 임의의 것으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열; 또는
l) 상기 a) - k) 중 임의의 것의 기능성 변이체
를 포함하거나, 또는 그로 이루어진 것인, 단리된 및/또는 인공 pG1-x 프로모터.
제14항에 있어서, 하기 특성:
a) 서열이, 바람직하게는, 프로모터 서열의 3' 영역의 적어도 293개의 뉴클레오티드 또는 3' 영역의 기능성 변이체는 그대로 남겨 두면서, 프로모터 서열의 5' 단부에 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실을 포함하는, 상기 a) - k)의 pG1-x 프로모터 중 임의의 것의 프로모터 서열의 기능성 변이체인 것인 특성;
b) 서열이 하나 이상의 TFBS를 포함하고, 바람직하게는, 여기서, TFBS는 Rgt1, Cat8-1 및 Cat8-2로 이루어진 군으로부터 선택되는 전사 인자 중 임의의 것에 대한 것인 특성:
c) 코어 조절 영역이 뉴클레오티드 서열 서열번호 4, 또는 하나 이상의 TFBS를 포함하는 그의 기능성 변이체, 바람직하게는, 적어도 80%의 서열 동일성을 가지는 기능성 변이체를 포함하는 특성:
d) 코어 조절 영역이 서열번호 5로 제시되는 주요 조절 영역, 또는 TFBS를 포함하는 그의 기능성 변이체, 바람직하게는, 적어도 80%의 서열 동일성을 가지는 기능성 변이체 내로 도입되는 특성:
e) 코어 조절 영역이 뉴클레오티드 서열 서열번호 2 및 서열번호 3 사이에 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 특성:
f) 서열이 코어 조절 영역 카피 또는 주요 조절 영역 카피를 적어도 2개 포함하는 특성:
g) 서열이 서열번호 12-29 중 임의의 것으로 확인되는 적어도 하나의 또는 적어도 2개의 T 모티프를 포함하고; 바람직하게는, 여기서, T 모티프는 코어 조절 영역의 상류 또는 하류 및 임의로 주요 조절 영역의 상류 또는 하류에 위치하는 특성:
h) 서열이 번역 개시 부위의 적어도 일부를 포함하는 3'-말단 뉴클레오티드 서열을 포함하는 특성:
i) 서열이 최대 2,000 bp 길이까지 신장된 특성
중 하나 이상의 것을 특징으로 하는, 뉴클레오티드 서열 중 임의의 것의 기능성 변이체, 바람직하게는, 서열번호 45-76 중 임의의 것의 기능성 변이체인 것인 pG1-x 프로모터.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 pG1-x 프로모터를 포함하는 단리된 pG1-x 프로모터 핵산, 또는 상보적인 서열을 포함하는 핵산.
제16항에 있어서, 관심 단백질 (POI)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결되고, 상기 핵산은 천연적으로는 POI를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 회합되어 있지 않는 것인 pG1-x 프로모터 핵산.
제17항에 있어서, POI의 분비를 가능하게 하는 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하고, 바람직하게는, 여기서, 상기 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 POI를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5' 단부에 인접하게 위치하는 것인 핵산.
제16항 내지 제18항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 발현 구축물, 바람직하게는, 자가 복제 벡터 또는 플라스미드, 또는 숙주 세포의 염색체 DNA 내로 통합되는 벡터 또는 플라스미드.
제19항의 발현 구축물을 포함하는 재조합 숙주 세포, 바람직하게는, 진핵 세포, 더욱 바람직하게는, 효모 또는 사상성 진균 세포, 더욱 바람직하게는, 사카로마이세스(Saccharomyces) 또는 피치아 속의 효모 세포.
a) POI를 발현시키는 조건하에서 세포주를 배양하는 단계, 및
b) POI를 회수하는 단계
를 포함하는, 제20항의 재조합 숙주 세포주를 배양함으로써 POI를 제조하는 방법.
제21항에 있어서, 배양이
a) 기초 탄소원을 사용하여 pG1-x 프로모터를 억제시키는 제1 단계, 이어서,
b) 보충 탄소원을 사용하지 않거나, 또는 제한된 양을 사용하여 pG1-x 프로모터를 탈억제시킴으로써 POI의 제조를 유도하는 제2 단계
를 포함하는 것인 방법.
제22항에 있어서, 제2 단계 b)가 비성장률을 0.001 h^-1 내지 0.2 h^-1, 바람직하게는, 0.005 h^-1 내지 0.15 h^-1 범위 이내로 유지시키기 위한 성장 제한량으로 보충 탄소원을 제공하는 공급 배지를 사용하는 것인 방법.
제22항 또는 제23항에 있어서,
a) 기초 탄소원이 글루코스, 글리세롤, 에탄올, 그의 혼합물, 및 복합 영양 물질로 이루어진 군으로부터 선택되고;
b) 보충 탄소원이 헥소스, 예컨대, 글루코스, 프럭토스, 갈락토스 또는 만노스, 이당류, 예컨대, 사카로스, 알콜, 예컨대, 글리세롤 또는 에탄올, 또는 상기 중 임의의 것의 혼합물인 것인 방법.
제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 배양이 생물반응기에서 제1 단계로서 회분식 상(phase)으로 출발한 후, 이어서, 제2 단계로서, 유가식 상 또는 연속 배양 상으로 수행되는 것인 방법.
제25항에 있어서, 회분식 상이 기초 탄소원이 세포주에 의해 소비될 때까지 수행되는 것인 방법.
제25항 또는 제26항에 있어서, 회분식 상은 산소 분압 (pO2) 신호의 연속적인 감소를 특징으로 하고, 여기서, 회분식 상의 종료는 pO2의 증가를 특징으로 하는 것인 방법.
제27항에 있어서, pO2가 회분식 상 동안 65% 미만의 포화도로 감소한 후, 이어서, 회분식 상의 종료시 65% 초과의 포화도로 증가하는 것인 방법.
제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 회분식 상이 약 20 내지 36h 동안 수행되는 것인 방법.
제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 회분식 상이 회분식 배지 중 45 g/L 글리세롤을 사용하여 수행되고, 배양이 25℃에서 약 27 내지 30h 동안, 또는 30℃에서 약 23 내지 36h 동안 수행되는 것인 방법.
제25항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 유가식 상에서의 배양이 약 15 내지 80h, 약 15 내지 70h, 약 15 내지 60h, 약 15 내지 50h, 약 15 내지 45h, 약 15 내지 40h, 약 15 내지 35h, 약 15 내지 30h, 약 15 내지 35h, 약 15 내지 25h, 또는 약 15 내지 20h; 바람직하게는, 약 20 내지 40h 중 임의의 시간 동안 수행되는 것인 방법.
제25항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 유가식 상에서의 배양이 약 80h, 약 70h, 약 60h, 약 55h, 약 50h, 약 45h, 약 40h, 약 35h, 약 30h, 약 25h, 약 20h, 또는 약 15h 중 임의의 시간 동안 수행되는 것인 방법.
제25항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 단계 b)가 유가식 상에서 비성장률을 0.04 h^-1 내지 0.2 h^-1 범위 이내로 유지시키기 위한 성장 제한량으로 보충 탄소원을 제공하는 공급 배지를 사용하는 것인 방법.
제25항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 약 30 mg (L h)^-1의 공간 시간 수율이 달성되는 것인 방법.
제34항에 있어서, 유가식 상에서의 배양이 약 30h 동안 수행되는 것인 방법.
제25항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 숙주 세포가 사카로마이세스 속 또는 피치아 속 또는 코마가타엘라(Komagataella) 속 중 임의의 것의 효모, 바람직하게는, 피치아 파스토리스 또는 코마가타엘라 파스토리스(Komagataella pastoris)인 것인 방법.
제25항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, pG1-x 프로모터가 서열번호 37-44 중 임의의 것, 바람직하게는, 서열번호 45-76 중 임의의 것인 방법.
제37항에 있어서, pG1-x 프로모터가 서열번호 39, 바람직하게는, 서열번호 49를 특징으로 하는 것인 방법.
제21항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, POI가 세포의 천연 pGAP 프로모터와 비교하여 적어도 15%의 전사율로 제조되는 것인 방법.
제21항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, POI가, 바람직하게는, 항체 또는 그의 단편, 효소 및 펩티드, 단백질 항생제, 독소 융합 단백질, 탄수화물 - 단백질 접합체, 구조 단백질, 조절 단백질, 백신 및 백신 유사 단백질 또는 입자, 프로세스 효소, 성장 인자, 호르몬 및 시토카인, 또는 POI의 대사산물을 포함하는 치료학적 단백질로부터 선택되는 이종성 단백질인 것인 방법.