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CN116162607A - 一种甜菊糖苷糖基转移酶基因及其编码产物与应用 - Google Patents

一种甜菊糖苷糖基转移酶基因及其编码产物与应用 Download PDF

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CN116162607A
CN116162607A CN202310010066.8A CN202310010066A CN116162607A CN 116162607 A CN116162607 A CN 116162607A CN 202310010066 A CN202310010066 A CN 202310010066A CN 116162607 A CN116162607 A CN 116162607A
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glycosyltransferase
stevioside
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steviol glycoside
seq
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CN202310010066.8A
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尹恒
王宇
朱理平
陈科材
宋维才
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Zhucheng Haotian Pharm Co ltd
Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
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Zhucheng Haotian Pharm Co ltd
Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
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Abstract

本发明属于植物基因工程领域，涉及一种甜菊糖苷生物合成相关的甜菊糖苷糖基转移酶基因及其编码产物与应用。本发明基因首次从甜叶菊中克隆得到，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1。本发明的甜菊糖苷糖基转移酶具有对C13位专一性糖基化的能力，而不能糖基化C19位，并对与C13位具有双糖基化的底物活性较高，对与C13位仅含单糖的糖苷，活性较弱。将本发明的糖基转移酶在甜叶菊中过表达能为甜叶菊品种改良提供新方向。

Description

一种甜菊糖苷糖基转移酶基因及其编码产物与应用
技术领域
本发明涉及一种甜菊糖苷生物合成相关的糖基转移酶(UDP-glycosyltransferases,UGT)基因，及甜菊糖苷生物合成途径中UGT基因及其编码产物与应用，属于植物基因工程领域。
背景技术
甜菊糖苷(Steviol glycosides,SGs)是一类从甜叶菊(Stevia rebaudiana)中提取的二萜皂苷类天然产物，具有高甜度、低热量等特点，被称为继蔗糖、甜菜糖外的“世界第三糖源”，并且还具有广泛的生物活性，包括抗炎、抑菌以及降血糖等。由于甜菊糖及其衍生物价格相对低廉且易于大量提取制备，已被广泛应用于食品饮料、医药和有机化学等领域。
所有SGs生物合成均以甜菊醇为前体，在不同的UGTs催化下，C13和C19位分别连接不同数量的葡萄糖基、鼠李糖基和木质糖基而形成各种具有不同性质的SGs。目前已知参与SGs生物合成的UGTs编码基因有4个，即SrUGT85C2、SrUGT91D2、SrUGT74G1和SrUGT76G1。SrUGT85C2能够糖基化甜菊醇C13位羟基；SrUGT74G1糖基化甜菊醇骨架C19位羧基；SrUGT91D2负责催化葡萄糖之间的β-1,2糖苷键；SrUGT76G1负责催化葡萄糖之间的β-1,3糖苷键。尽管这些UGTs的供体底物特异性较高，能特异性利用UDP活化的葡萄糖，但是它们的受体底物特异性较差，一个UGT往往能够糖基化多种糖苷底物，尤其是SrUGT76G1，能识别多达8种糖苷底物，这些UGTs在SGs生物合成途径中先后发挥作用、互相影响，形成了复杂的糖基化网络，使得甜叶菊体内含有超多60种甜菊糖苷，给糖苷制备分离带来较大干扰。
在目前已知的甜菊糖苷中，甜菊苷(stevioside,STV)和莱鲍迪A苷(rebaudiosideA，Reb A)是最主要的两种糖苷成分。STV苷占叶片干叶重的5％～10％，甜度是蔗糖的110～270倍。SrUGT76G1糖基化STV苷后产生Reb A苷，Reb A苷占叶片干叶重2％～4％，甜度为蔗糖的180～300倍，味质上与蔗糖较为接近，并且几乎没有苦涩后味，口感和品质均优于STV。SrUGT91D2能糖基化Reb A得到莱鲍迪D苷(rebaudioside D,Reb D)，Reb D是的甜味是蔗糖的350倍，几乎没有苦涩后味，甜味阈值低，但其含量仅占叶片干重的0.4-0.5％。同时，SrUGT76G1也能继续糖基化Reb A苷产生莱鲍迪I苷(rebaudioside I,Reb I)，而Reb I苷的甜度并没有随着糖基化数量增多而升高，且苦涩后味也更显著。因此，如何提高SrUGT76G1的选择性，降低副产物糖苷的合成，提高Reb D的累积，对于甜叶菊品种品质改良和体外酶催化甜菊糖苷合成具有重要的意义。
甜叶菊SrUGT76G1具有多态性，已有多篇文章报道过多种SrUGT76G1自然产生的突变体，但是这些突变体大多活性较低或为翻译中断的序列，仅SrUGT76G1(NCBI ID：AY345974)具有较好的活性，但是选择性较差，体内体外均能催化不同底物产生多种糖苷产物。Kim等曾通过位点饱和突变的方式对该酶进行改造，但是产生的38个突变体中副产物糖苷含量与野生型并无明显差别。
发明内容
本发明的目的在于提供一个具有甜菊糖苷C13位选择性的糖基转移酶基因及其编码的蛋白质。本发明提供的新的甜叶菊UGT能够特异性在甜菊糖苷C13位葡萄糖上通过β-1,3糖苷键连接一个葡萄糖，而不能糖基化C19位葡萄糖，选择性的显著变化降低了甜菊糖苷糖基化产物的分离成本。并且，本发明提供的具有C13位选择性的β-1,3糖基转移酶在底物识别和进入催化空腔的方式上存在差异，为SrUGT76G1底物选择机制解析提供了理论和实验基础。将本发明的糖基转移酶在甜叶菊中过表达能为甜叶菊品种改良提供了新方向。
本发明提供了一种甜菊糖苷糖基转移酶，其氨基酸序列具有如下特征中的一种或二种：
1)具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
MENKTETTVRRRRRIILFPVPFQGHINPILQLANVLYSKGFSITIFHTNFNKPKTSNYPHFTFR
FILDNDPQDERISNLPTHGPLAGMRIPIINEHGADELRRELELLMLASEEDEEVSCLITDALW
YFAQSVADSLNLRRLVLMTSSLFNFHAHVSLPQFDDLGYFDLDDKTRLEEQVIGFPMLKVK
DIKSAYSNWQVAKEIFGKMIKQTKASSGIIWNSFKELQEPEVETITRDFPTPSFLIPLPKHLTA
SSSSLLDEDRTVFTWLDQQPPNSIVYVCFGSTSEVDEKDFLEIAHGLVDSKQSFLWVVRPGF
VKGSTWVEPLPDGFLGERGRIVKWVPQQEVLAHGAIGAFWTHSGWNSTLESVCEGVPMIF
SDFGLDQPLNARYMSDVLKVGVYLENGWERGEIANAIRRVMVDEEGEYIRQNARVLKQK
ADVSLMKGGSSYESLESLVSYISSL
2)具有SEQ ID NO.1从氨基端开始的第1-458位氨基酸残基序列；
3)对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列进行一个或两个以上氨基酸取代、缺失或添加而形成的具有甜菊糖苷糖基转移酶活性的氨基酸序列。
本发明还提供了一种甜菊糖苷糖基转移酶基因，编码权利要求1所述的甜菊糖苷糖基转移酶。
上述技术方案中，进一步地，其核苷酸序列具有如下特征中的一种或二种以上：
1)具有SEQ ID No.2所示的脱氧核糖核酸序列；
ATGGAAAATAAAACGGAGACCACCGTTCGCCGGCGCCGGAGAATAATATTATTCCCGGT
ACCATTTCAAGGCCACATTAACCCAATTCTTCAGCTAGCCAATGTGTTGTACTCTAAAGG
ATTCAGTATCACCATCTTTCACACCAACTTCAACAAACCCAAAACATCTAATTACCCTCA
CTTCACTTTCAGATTCATCCTCGACAACGACCCACAAGACGAACGCATTTCCAATCTACC
GACTCATGGTCCGCTCGCTGGTATGCGGATTCCGATTATCAACGAACACGGAGCTGACG
AATTACGACGCGAACTGGAACTGTTGATGTTAGCTTCTGAAGAAGATGAAGAGGTATCG
TGTTTAATCACGGATGCTCTTTGGTACTTCGCGCAATCTGTTGCTGACAGTCTTAACCTCC
GACGGCTTGTTTTGATGACAAGCAGCTTGTTTAATTTTCATGCACATGTTTCACTTCCTCA
GTTTGATGATCTTGGTTACTTCGATCTTGATGACAAAACCCGTTTGGAAGAACAAGTGAT
TGGGTTTCCTATGCTAAAAGTGAAAGACATCAAGTCTGCGTATTCGAACTGGCAAGTAG
CCAAAGAGATATTCGGGAAGATGATAAAACAAACAAAAGCATCTTCAGGAATCATATGG
AACTCGTTTAAGGAACTCCAAGAGCCCGAGGTCGAAACGATTACCCGTGACTTCCCGAC
ACCAAGTTTCCTGATACCATTACCCAAACATTTGACAGCCTCATCAAGCAGCTTACTAGA
CGAAGATCGAACCGTTTTTACATGGTTAGACCAACAACCGCCGAATTCTATAGTTTATGT
TTGTTTTGGTAGCACTAGTGAAGTGGATGAGAAAGATTTCTTGGAAATAGCTCATGGGTT
GGTTGATAGTAAGCAGTCGTTTTTATGGGTGGTTCGACCTGGGTTTGTCAAGGGTTCGAC
ATGGGTCGAACCGTTGCCTGATGGGTTCTTGGGTGAAAGAGGACGTATTGTGAAATGGG
TTCCGCAGCAAGAAGTGCTAGCTCATGGAGCAATAGGCGCATTCTGGACTCATAGCGGA
TGGAACTCTACGTTGGAAAGCGTTTGTGAAGGTGTTCCTATGATTTTCTCGGATTTTGGG
CTCGATCAACCGTTGAATGCTAGATACATGAGTGATGTTTTGAAGGTAGGGGTGTATTTG
GAAAATGGGTGGGAAAGAGGAGAGATAGCAAATGCAATAAGAAGAGTTATGGTGGATG
AAGAAGGAGAATACATTAGACAGAATGCAAGAGTTTTGAAACAAAAGGCAGATGTTTC
TTTGATGAAGGGTGGTTCATCTTACGAATCATTAGAGTCTCTAGTTTCTTACATTTCATCG
TTGTAA
2)编码SEQ ID NO.1氨基酸序列的脱氧核糖核酸序列；
3)对SEQ ID NO.2的脱氧核糖核酸序列进行一个或两个以上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有甜菊糖苷糖基转移酶活性的核苷酸序列；
4)与SEQ ID NO.2限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到80％及以上，且能编码甜菊糖苷糖基转移酶的脱氧核糖核酸序列。
本发明还提供了包含前述甜菊糖苷糖基转移酶基因的重组表达质粒。
本发明还提供了包含前述甜菊糖苷糖基转移酶基因的重组基因工程菌。
本发明还提供了一种制备甜菊糖苷糖基转移酶的方法，将前述甜菊糖苷糖基转移酶基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的甜菊糖苷糖基转移酶；
优选地，所述的重组表达甜菊糖苷糖基转移酶的表达载体，是大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体中的一种或二种以上。
上述技术方案中，进一步地，所述宿主细胞包括大肠杆菌宿主细胞、酵母菌宿主细胞、枯草杆菌宿主细胞、乳酸菌宿主细胞、放线菌宿主细胞、丝状真菌宿主细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞中的一种。
本发明还提供了前述甜菊糖苷糖基转移酶在生产甜菊糖苷中的应用。
上述技术方案中，进一步地，所述甜菊糖苷产物为C13位具有β-1,3糖链的甜菊糖苷类化合物物；优选地，甜菊糖苷为甜菊双糖D(steviolbioside D)、莱鲍迪苷B(rebaudioside B)、莱鲍迪A苷(Rebaudioside A)、莱鲍迪D苷(Rebaudioside D)、莱鲍迪苷G(Rebaudioside G)、莱鲍迪苷E4(Rebaudioside E4)。
本发明还提供了前述甜菊糖苷糖基转移酶基因在甜叶菊遗传育种中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果：本发明公开了一个具有甜菊糖苷C13位选择性的糖基转移酶编码基因SrUGT76G6及其编码的蛋白。SrUGT76G6具有对C13位专一性糖基化的能力，而不能糖基化C19位，并对与C13位具有双糖基化的底物活性较高，对与C13位仅含单糖的糖苷，活性较弱。相对于不具有催化位点选择性的SrUGT76G1，应用本发明提供的具有C13位选择性的β-1,3糖基转移酶制备甜菊糖苷能显著降低甜菊醇糖苷糖基化产物的分离成本。本发明提供的具有C13位选择性的β-1,3糖基转移酶在底物识别和底物进入催化空腔的方式与SrUGT76G1相比发生变化，为β-1,3糖基转移酶底物选择机制解析提供了理论和实验基础。将本发明的糖基转移酶在甜叶菊中过表达能为甜叶菊品种改良提供了新方向。
附图说明
图1：目的基因SrUGT76G6的ORF扩增产物的电泳图。
图2：SrUGT76G6蛋白SDS-PAGE电泳图。
其中：M:蛋白分子质量标准；泳道1：SrUGT76G6蛋白纯化。
图3：SrUGT76G6的体外催化steviolmonoside液相检测图。
图4：SrUGT76G6的体外催化steviolbioside液相检测图。
图5：SrUGT76G6的体外催化rubusoside液相检测图。
图6：SrUGT76G6的体外催化STV液相检测图。
图7：SrUGT76G6的体外催化Reb A液相检测图。
图8：SrUGT76G6的体外催化Reb E液相检测图。
图9：SrUGT76G6的体外催化Reb D液相检测图。
图10：SrUGT76G6糖基化甜菊醇糖苷路线图。
具体实施方式
以下结合实例详细说明本发明。实施例是为更好的理解本发明，但不限定于本发明。以下实施方法中的实验方法均为常规方法，所涉及的实验试剂均为常规生化试剂。
实施例1SrUGT76G6编码基因的克隆表达
根据NCBI中公布的SrUGT76G1的序列设计引物，从甜叶菊cDNA中扩增目的基因。
全场引物：
SrUGT76G4-F:TAAGAAGGAGATATACATATGATGGAAAATAAAACGG(SEQ ID NO.3)
SrUGT76G4-R:GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTACAACGATGAAATG(SEQ ID NO.4)
测序验证序列正确性后，使用Gibson Assembly方法将目的基因连接在NdeI、XhoI双酶切后的pET21a载体上。取5μL连接产物转化E.coli TOP10感受态细胞，涂布在含100μg/mL氨苄青霉素的固体Luria-Bertani培养基上，37℃培养12-16h。挑取单克隆，使用通用引物进行菌落PCR验证，将扩增正确的单克隆接入含有100μg/mL氨苄青霉素的液体Luria-Bertani培养基中培养，提取质粒；使用内切酶NdeI和XhoI对提取的质粒进行双酶切，结果正确的重组质粒送华大基因测序。测序结果表明，在pET21a的NdeI和XhoI酶切位点之间插入了SEQ ID NO 2.所示候选基因，且插入方向正确，证明重组质粒构建成功，并将这些重组质粒命名为pET21a-SrUGT76G6。甜菊糖苷糖基转移酶SrUGT76G6基因全核苷酸序列全长1377bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码458个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，蛋白理论分子量为(52.2)kDa。
将pET21a-SrUGT76G6转化入E.coli BL21(DE3)，对其进行诱导表达及纯化。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测SrUGT76G6的表达及纯化情况，纯化后的糖基转移酶在电泳胶上呈单一条带，且位置与预测的分子量相吻合。
实施例2SrUGT76G6糖苷底物检测
纯化的糖基转移酶蛋白在体外按照以下反应体系进行功能验证(100μL)：
20mM Tris(pH 8.5)，100mM氯化钠，20μg纯化的蛋白，1mM UDP-Glucose，1mM的受体底物，受体底物包括：Steviolmonoside、Steviolbioside、Rubusoside、STV、Reb A、RebE、Reb D。反应2小时后，加入等体积无水丁醇终止反应，震荡混匀，12000rpm离心10分钟，取上清过0.22μm有机滤膜，利用液相色谱检测定性定量检测反应产物组成。仪器型号，Waterse2695。进样量10μL，色谱柱：依力特superil ODS2(5μm，250×4.6mm)，柱温：40℃。色谱条件：UV 210nm，流动相：(A)：水(含0.1％甲酸)，(B)：乙腈(1％甲酸)，流速：1mL/min，洗脱程序：0-4min，20％B；4-25min，线性增长至30％B；25-40min，30％B。
液相色谱检测结果(图3)显示SrUGT76G6能够糖基化Steviolmonoside、Steviolbioside、STV、Reb E，不能糖基化Reb A和Reb D，表明该酶具有对C13位的专一性糖基化选择能力，而不能糖基化C19位。而SrUGT76G1糖基化Reb A会产生Reb I，糖基化Reb D会产生Reb M糖苷，增加催化体系复杂性。SrUGT76G6对C13位具有双糖链的底物(如steviolbioside、STV、Reb E)活性较高，对C13位仅含单糖链的糖苷(如steviolmonoside、rubusoside)，活性较弱，因此推测，在复杂甜菊糖苷混合物体系中或者甜叶菊体内，可以减少甜度较低糖苷(如steviolbioside D、rubusoside G、Reb I)的累积，而提高高甜度糖苷(如Reb B、Reb A、Reb D)的累积进而实现甜菊糖苷混合物的品质，或者降低甜菊糖苷分离成本。
对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (10)

1.一种甜菊糖苷糖基转移酶，其特征在于，其氨基酸序列具有如下特征中的一种或二种：
1)具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
2)具有SEQ ID NO.1从氨基端开始的第1-458位氨基酸残基序列；
3)对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列进行一个或两个以上氨基酸取代、缺失或添加而形成的具有甜菊糖苷糖基转移酶活性的氨基酸序列。
2.一种甜菊糖苷糖基转移酶基因，其特征在于，编码权利要求1所述的甜菊糖苷糖基转移酶。
3.如权利要求2所述的甜菊糖苷糖基转移酶基因，其特征在于，其核苷酸序列具有如下特征中的一种或二种以上：
1)具有SEQ ID No.2所示的脱氧核糖核酸序列；
2)编码SEQ ID NO.1氨基酸序列的脱氧核糖核酸序列；
3)对SEQ ID NO.2的脱氧核糖核酸序列进行一个或两个以上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有甜菊糖苷糖基转移酶活性的核苷酸序列；
4)与SEQ ID NO.2限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到80％及以上，且能编码甜菊糖苷糖基转移酶的脱氧核糖核酸序列。
4.包含权利要求2或3所述甜菊糖苷糖基转移酶基因的重组表达质粒。
5.包含权利要求2或3所述甜菊糖苷糖基转移酶基因的重组基因工程菌。
6.一种制备甜菊糖苷糖基转移酶的方法，其特征在于：将权利要求2或3所述的甜菊糖苷糖基转移酶基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的甜菊糖苷糖基转移酶；
优选地，所述的重组表达甜菊糖苷糖基转移酶的表达载体，是大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体中的一种或二种以上。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述宿主细胞包括大肠杆菌宿主细胞、酵母菌宿主细胞、枯草杆菌宿主细胞、乳酸菌宿主细胞、放线菌宿主细胞、丝状真菌宿主细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞中的一种。
8.权利要求1所述的甜菊糖苷糖基转移酶在生产甜菊糖苷中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述甜菊糖苷为C13位具有3糖基化的甜菊糖苷类产物；优选地，甜菊糖苷类产物为莱鲍迪苷B、莱鲍迪A苷、莱鲍迪D苷、莱鲍迪苷G、莱鲍迪苷E4。
10.权利要求2或3所述的甜菊糖苷糖基转移酶基因在甜叶菊遗传育种中的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118599799A (zh) * 2024-06-05 2024-09-06 桂林莱茵生物科技股份有限公司 一种糖基转移酶及其在生产糖苷中的用途

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