KR101997597B1 - 변형 류코노스톡속 균주를 이용한 스테비오사이드 배당체의 합성 방법 및 이에 의하여 제조된 신규한 스테비오사이드 배당체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 변형 류코노스톡속 균주를 이용한 스테비오사이드 배당체의 합성 방법 및 이에 의하여 제조된 신규한 스테비오사이드 배당체에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 변형 류코노스톡속 균주로부터 생산된 글루칸수크라아제를 이용하여 스테비오사이드 배당체를 합성하는 방법 및 이에 의하여 제조된 신규한 스테비오사이드 배당체에 관한 것이다.
본 발명에 따른 스테비오사이드 배당체 생산 방법은 배지에 포함되는 수크로오스의 농도를 조절하여 변형 류코노스톡속 균주로부터 생성되는 글루칸수크라아제의 종류 및 농도를 조절하고, 또한, 이와 반응하는 스테비오사이드의 농도를 조절하여 신규한 스테비오사이드 배당체를 고효율로 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 생성된 스케비오사이드 배당체를 감미료로 이용될 수 있다.

Description

변형 류코노스톡속 균주를 이용한 스테비오사이드 배당체의 합성 방법 및 이에 의하여 제조된 신규한 스테비오사이드 배당체{Synthesis method of stevioside glucosides using modified Leuconostoc and Novel stevioside glucosides made by the same}

본 발명은 변형 류코노스톡속 균주를 이용한 스테비오사이드 배당체의 합성 방법 및 이에 의하여 제조된 신규한 스테비오사이드 배당체에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 변형 류코노스톡속 균주로부터 생산된 글루칸수크라아제를 이용하여 스테비오사이드 배당체를 합성하는 방법 및 이에 의하여 제조된 신규한 스테비오사이드 배당체에 관한 것이다.

최근 설탕의 과잉 섭취와 기존의 당류의 다량 섭취로 생기는 충치, 비만, 당뇨병, 성인병 등의 문제점을 보완하기 위해서 생물공학 기술을 통해 천연식품 소재의 새로운 종류의 대체 당질이 개발되고 있다. 천연 고감미료 소재의 주요 시장인 한국·미국(유럽)에서 모두 사용이 가능한 고감미료 소재는 총 8종 성분이 있으며, 이 중 천연 컨셉을 부여 가능한 제품은 단 2종(Stevioside 계열, Mogroside 계열)이 존재 한다. 각 소재의 원료(Stevia Leaf, Luo Han Guo Fruit)의 감미성분 함량,경작 환경 등을 분석한 결과, 기존의 설탕 혹은 합성감미료와 유사한 단위원가(가공식품에 적용 시 감미료가 차지하는 가격 수준)가 가능한 천연 고감미료 소재는 Stevioside 계열이 유일하다고 알려져 있다.

스테비오사이드는 천연 감미료의 일종으로 설탕에 비하여 저칼로리이며 감미도는 설탕의 약 200-300배로 높아 그의 수요가 급속하게 높아지고 있다. 스테비오사이드는 남미 파라과이가 원산지인 국화과 다년생 초본인 스테비아 레바우디아나 베르토니 (Stevia rebaudiana BERTONI)로부터 추출한 감미성분으로 스테비아의 단맛 성분으로는 스테비오사이드(C38H60O18), 레바우디오사이드 A(C44H70O23), 레바우디오사이드 C, D, E, 둘코사이드 A 등이 알려져 있다.

천연 감미료로서 전세계적으로 사용되고 있는 스테비아는 미국의 식품음료산업에서 빠르게 성장하고 있으며, 미국식품의약국(FDA)에 의해 주요 식품원료 중 하나로 선정되었다. 각각의 성분은 모두 diterpene계 물질인 Steviol에 다양한 형태의 당(포도당, 만노스)이 결합된 형태에 따라서 분류되며, 각각의 물질은 조금씩 다른 감미도 및 미질을 가지는 것으로 알려져 있다. 상대적으로 Stevioside에 비하여 Rebaudioside 계열의 구조가 보다 미질이 우수한 것으로 알려져 있다. 하지만, 스테비오사이드는 뒷맛이 오래 남으며 단맛 이외에 쓴맛, 불쾌감, 낮은 수용성 등이 있는 단점을 지니고 있으며, 그로 인해 사용량 및 용도의 한계가 발생하는 문제점이 있어 스테비오사이드의 미질을 개선할 필요가 있다.

현재의 스테비오사이드의 감미질 개선 방법은 (1) 설탕, 포도당, 과당 등과 같은 천연 당질 감미료를 1종 또는 그 이상을 첨가하는 방법, (2) 아미노산 또는 아미노산의 염과 배합하는 방법, (3) 싸이클로덱스트린과 같이 포접능을 갖는 환형 당질에 물리적으로 결합시키는 방법 등이 있다. 그러나 이상의 방법은 첨가물을 상당히 많은 양을 첨가하여야 하며 결국 스테비오사이드가 저칼로리 감미료라는 특징을 잃어버리는 단점이 있다.

덱스트란수크레이즈(dextransucrase) (EC 2.4.1.5)는 설탕으로부터 글루칸을 합성하는 효소들을 포괄적으로 일컬으며 Leuconostoc과 Streptococcus 속의 미생물들로부터 주로 생산된다. 덱스트란수크레이즈의 설탕에 대한 반응기작은 다음과 같다.

수크로오스 → (글루코오스)n-m-w + n-m 프락토오스 + m 루크로오스(Leucrose) + w 글루코오스

한국특허출원 제1998-0024355호에는 설탕을 기질로 하고 말토오스, 겐티오바이오스, 라피노스 또는 락토오스를 수용체로 사용하여, Leuconostoc mesenteroides의 돌연변이 균주로부터 얻은 덱스트란수크레이즈를 사용하여 신규한 올리고당을 생산하는 하는 방법이 개시되어 있다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 변형 류코노스톡속 균주로부터 생산된 글루칸수크라아제를 이용하여 스테비오사이드 배당체를 합성하는 경우, 스테비오사이드 배당체를 고효율로 생산할 수 있을 뿐만 아니라 신규한 스테비오사이드 배당체를 합성할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

KR 10-0453576 B KRKR10-2000-0003189 A

본 발명은 고효율로 스테비오사이드 배당체를 합성할 수 있는 변형 류코노스톡속 균주를 이용한 스테비오사이드 배당체의 생산방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 또한, 상기 스테비오사이드 배당체의 생산방법을 이용한 신규한 스테비오사이드 배당체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여,

A) 류코노스톡 메센테로이데스 B-512F/KM(KCCM11728P), 류코노스톡 메센테로이데스 B-1299C/KM(KCCM11729P) 및 류코노스톡 시트레움 B-1355C/KM(KCCM11730P)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 변형 류코노스톡속 균주를 수크로오스(sucrose) 함유 배지에서 배양하여 글루칸수크라아제를 생성하는 단계;

B) 상기 배양에 의해 생성된 글루칸수크라아제(glucansucrase)와 수용체로서 스테비오사이드를 반응시키는 단계; 및

C) 상기 수용체 반응에 의해 생성된 스테비오사이드 배당체를 회수하는 단계;를 포함하는 스테비오사이드(stevioside) 배당체의 고효율 생산방법을 제공한다.

본 발명자는 512FMCM균을 지속적으로 돌연변이 진행을 하였고, 이 균보다 1.5배 향상된 효소 생산성 균, 즉, 산업 균에 비해서 글루코오스 배지에서 1500배 이상의 효소 활성 생산 균을 찾아내어 본 발명을 완성하였다. 또한 난소화성 올리고당을 합성하기 위한 효소 고생산 균으로 1355, 1299 계통의 균을 돌연변이하여 모균보다 효소 생산성이 크게 우수한 균주를 개발하였다.

본 발명에 따른 류코노스톡 메센테로이데스 B-512F/KM, 류코노스톡 메센테로이데스 B-1299C/KM 및 류코노스톡 시트레움 B-1355C/KM은 2015년 7월 14일 자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 수탁번호 KCCM11728P, 수탁번호 KCCM11729P 및 수탁번호 KCCM11730P로 기탁되어 있다.

본 발명에서 상기 A) 단계의 글루칸수크라아제는 별도의 정제과정 없이 발효액을 그대로 사용할 수 있다.

본 발명에서는 이와 같은 변이 균주가 생성하는 글루칸수크라아제를 이용하여 스테비오사이드 배당체를 합성하였다.

본 명세서에서 사용된 용어 "글루칸수크라아제(glucansucrase)"는 수크로오스(sucrose)로부터 글루칸(glucan)을 합성하는 효소로서 글리코실트랜스퍼라제(glucosyltransferase) 또는 덱스트란수크라아제(dextransucrase)라고도 한다.

일반적으로 글루칸수크라아제는 주로 류코토스톡속(Leuconostoc) 균주 또는 스트렙토코커스속(Streptococcus) 균주로부터 생산된다. 상기 두 균주는 그람 양성이며 통성 혐기성 구균으로서 서로 밀접한 관계가 있으나 이들 간에 가장 큰 차이점은 류코토스톡속 균주는 효소 생산을 위하여 설탕을 요구하는 반면 스트렙토코커스속 균주는 설탕을 필요로 하지 않는다.

즉 류코토스톡속 균주는 덱스트란수크라아제를 유도적으로 생산하며 스트렙토코커스속 균주는 덱스트란수크라아제를 지속적으로 생산한다. 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)는 글루코스가 주로 α1→6로 연결되어 있는 덱스트란을 생합성하는 효소를 생산하며, 상기 효소가 수크로오스를 이용하여 덱스트란을 생합성 하는 반응 기작은 다음과 같다:

수크로오스 글루칸(혹은 덱스트란) + 프럭토오스 + 류크로오스

상기 효소반응의 주된 산물은 약 10⁷~10⁸ Da 정도의 고분자량의 글루칸과 프럭토오스며 부산물로는 글루코오스와 류크로오스 (5-O-α-D- glucopyranosyl -Dfructopyranose) 가 생산된다.

본 발명에 의한 각기 다른 류코노스톡속 균주는 다른 종류의 덱스트란 수크라아제를 생산하며 이에 의해 합성되는 덱스트란들은 그의 결합 형태나 정도가 효소에 따라 다르다.

현재까지 덱스트란의 결합은 주로 α1→3가 알려져 있으며, α1→2 및 α1→4 결합도 보고되어 있다. 대부분의 류코노스톡속 균주는 수크로오스를 효소 생산 기질에 넣어 주어야만 덱스트란수크라아제를 생산할 수 있으나, 수크로오스를 기질에 넣지 않아도 독특한 덱스트란수크라아제를 생산하는 구성적 돌연변이 균주들이 개발되어 있다 (Kim, D, Robyt, JF(1995b) Enz. hficrob. TeGhnol. 17, 689). 즉, 수크로오스가 아닌 글루코오스와 프럭토오스 등을 탄소원으로 사용하여도 생장시 덱스트란수크라아제를 생산함으로써, 수크로오스를 포함하는 LM 배지에서 생산하는 경우 글루칸수크라아제가 생산된 덱스트란과 결합된 생태로 얻어지는 것에 비해, 덱스트란에 오염되지 않은 단백질 만의 효소를 얻는 것이 가능해 진다.

한편, 효소 고생산 균주의 개발은 산업적으로 매우 큰 의미를 갖는다. 효소 생산을 위한 배지의 비용이 전체 효소 생산 비용의 80%를 차지하고 있으므로, 같은 비용의 배지를 사용하여 더 많은 효소를 생산하는 것은 효소의 산업적 활용을 위해 매우 중요하다. 본 발명에 따른 스테비오사이드 배당체의 고효율 생산을 위한 변형 류코노스톡속 균주는 모균보다 효소 생산성이 현저히 증가함으로써, 효소의 산업적 활용 증대를 기대할 수 있게 한다.

본 발명의 스테비오사이드(stevioside) 배당체의 고효율 생산방법에 있어서, 상기 변형 류코노스톡속 균주는 화학적 돌연변이에 의해 변형된 것을 특징으로 한다.

상기 변형 류코노스톡 균주는 돌연변이 유발물질 처리에 의한 화학적 돌연변이법, UV 처리에 의한 물리적 변이법 또는 유전공학 조작에 의한 돌연변이법에 의해 수행될 수 있으며, 바람직하게는 돌연변이 유발물질 처리에 의한 화학적 돌연변이법에 의하여 변형시킬 수 있다. 상기 돌연변이 유발물질은 NTG(N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidine), EMS(ethylmethane sulfonate) 및 트리에틸렌 멜라민(triethylene melamine)으로부터 1종 이상 선택될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "변형된(modified)" 또는 “조작된(engineered)” 균주는 유전 물질을 선택된 숙주 또는 모균 내로 도입하여 세포 생리와 생화학을 변형하거나 변경함으로써 생산된다. 유전 물질의 도입을 통하여, 모균은 새로운 성질, 예를 들면, 새로운 세포내 대사산물 또는 더욱 많은 양의 세포내 대사산물을 생산하는 능력을 획득한다. 예를 들면, 유전 물질의 모균 내로의 도입은 효소를 생산하는 새롭거나 변형된 능력을 초래한다. 모균에 도입된 유전 물질은 효소의 생산을 위한 생합성 경로에 관여하는 하나 이상의 효소를 코딩하는 유전자 또는 유전자의 일부를 포함하고, 이들 유전자의 발현 또는 발현 조절을 위한 추가 구성요소, 예를 들면, 프로모터 서열을 포함할 수도 있다.

본 발명의 스테비오사이드(stevioside) 배당체의 고효율 생산방법에 있어서, 상기 균주 배양 배지에 포함되는 수크로오스는 300 내지 1100mM 농도로 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 700 내지 1100Mm 농도로 포함되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 스테비오사이드(stevioside) 배당체의 고효율 생산방법에 있어서, 상기 글루칸수크라아제는 1 내지 5 Unit/ml의 활성으로 사용될 수 있으며, 바람직하게는 3 내지 5 Unit/ml의 활성으로 사용되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 스테비오사이드(stevioside) 배당체의 고효율 생산방법에 있어서, B) 상기 배양에 의해 생성된 글루칸수크라아제(glucansucrase)와 수용체로서 스테비오사이드를 반응시키는 단계에서 상기 스테비오사이드는 30 내지 150mM 농도로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 30 내지 90Mm 농도로 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 스테비오사이드(stevioside) 배당체의 고효율 생산방법에 있어서, 상기 B) 단계에서 반응하는 글루칸수크라아제 농도(X1), 스테비오사이드의 농도(X2), A) 단계에서 배지에 함유되는 수크로오스의 농도(X3), 및 스테비오사이드 배당체의 생산율(Y) 사이에는 하기의 관계식이 성립하는 것을 특징으로 한다.

[관계식 1]

Y= 46.466740+12.802404(X1)-0.226268(X2)+0.045081(X3)+0.030300(X1)(X2) +0.007352(X1)(X3)-0.000049(X2)(X3)-2.131815(X1)²+0.000087(X2)²-0.000043(X3)²

본 발명의 일 실험예에 따르면, 상기 본 발명의 글루칸수크라아제 농도, 스테비오사이드의 농도 및 수크로오스의 농도 범위 내에서 스테비오사이드 배당체의 생산율이 전반적으로 우수한 것을 확인하였으며, 특히 효소 활성이 5 Unit/mL, 스테비오사이드 농도가 30 mM 및 수크로오스 농도가 1100mM 일 때 가장 높은 생산율을 보였다. 또한, 상기 관계식은 변수들을 대입해서 얻은 예상값과 실험값이 거의 유사하다는 것을 통해 유효성을 확인할 수 있었다.

본 발명의 스테비오사이드(stevioside) 배당체의 고효율 생산방법에 있어서, C) 상기 수용체 반응에 의해 생성된 스테비오사이드 배당체를 회수하는 단계; 에서는 상기 수용체 반응액에 탄소수 1 내지 4의 알코올을 첨가하여 스테비오사이드 배당체를 분리하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 스테비오사이드(stevioside) 배당체의 고효율 생산방법에 있어서, 상기 탄소수 1 내지 4의 알코올은 70 내지 100%의 에탄올인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한, 상기 제조방법으로 제조된 하기 화학식 1로 표시된 스테비오사이드 배당체를 제공한다.

[화학식 1]

본 발명은 또한, 상기 제조방법으로 제조된 하기 화학식 2로 표시된 스테비오사이드 배당체를 제공한다.

[화학식 2]

본 발명에 따른 화학식 1의 스테비오사이드 배당체는 말디토프 질량 분석 결과 m/z가 980 내지 990이며, 화학식 2의 스테비오사이드 배당체는 말디토프 질량 분석 결과 m/z가 1140 내지 1160인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한, 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 스테비오사이드 배당체를 포함하는 감미료를 제공한다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 스테비오사이드 배당체 생산 방법은 스테비오사이드 배당체를 고효율로 생산할 수 있을 뿐만 아니라 신규한 스케비오사이드 배당체를 합성함으로써 감미료로 이용될 수 있다.

도 1은 류코노스톡 효소들의 스테비오사이드 수용체 반응 산물의 TLC 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 실험예 3-1에 따른 TLC 결과를 나타낸다.
도 3은 실험예 3-2에 따른 TLC 결과를 나타낸다.
도 4는 실시예 3에 따른 TLC 결과를 나타낸다.
도 5는 실험예 4에 따른 HPLC 결과를 나타낸다.
도 6은 실험예 4에 따른 TLC 결과를 나타낸다.
도 7은 스테비올 배당체의 최적화를 위한 3가지 변수의 농도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 실험예 6에 따른 시료 1의 Maldi-tof 분석 결과를 나타낸다.
도 9는 실험예 6에 따른 시료 2의 Maldi-tof 분석 결과를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 모균의 배양

글루코오스 (18.8 g/L) 또는 수크로오스 (25 g/L), 박토펩톤 (4.2 g/L), 효모 추출물 (4.2 g/L), K₂HPO₄ (글루코오스의 경우 20 g/L, 수크로오스의 경우 16.7g/L), MgSO₄ (0.17 g/L), NaCl (0.008 g/L), FeSO₄7H₂O (0.008 g/L), MnSO₄2H₂O (0.008 g/L), 및 CaCl₂2H₂O (0.011 g/L)를 포함하는 배지를 준비하고, Leuconostoc mesenteroides B-512F, L. mesenteroides B-512FMCM, L. mesenteroidesB-1299,L. mesenteroidesB-1299C, L. citreum B-1355 및 L. citreum B-1355C 균주를 28℃에서 배양하였다.

실시예 2: 변형 류코노스톡속 균주의 제작

실시예 1에 따른 L. mesenteroides B-512FMCM, L. mesenteroides B-1299C 및 L. citreum B-1355C를 1.2mL의 글루코오스 배지에 접종하여 24시간 동안 배양한 후 200㎕를 원심분리하고 상등액을 제거하였다. 그 다음, 상기 분리된 균주들을 200㎕의 sterile 20mM sodium-citrate buffer pH 6.0로 3회 세척하였다.

세척된 균주에 화학적 돌연변이를 유도하기 위해 200㎕의 500㎍/ml-1N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) solution을 넣고 21℃의 온도에서 30분 동안 배양하였다. 상기 배양된 균주들을 20mM sodium citrate buffer pH 6.0로 3회 세척한 후 500㎕의 글루코오스 배지에 넣고 21℃의 온도에서 3시간 동안 배양하였다.

배양된 균주 배양액을 1:10⁵으로 희석한 후, 100㎕를 글루코오스를 포함하는 아가(agar)배지 (2.5%)에 플레이팅 했다.

실험예 1: 모균 및 변형 류코노스톡속 균주의 효소 생산성 비교

상기 실시예에 따른 각각의 균주들을 글루코오스 및 수크로오스를 포함하는 액체 배지에서 24시간 동안 배양한 후, 원심분리를 통해 상등액을 얻어 100mM 설탕과 1:1(v/v)로 혼합하였다. 그 다음, 28℃의 온도에서 반응시키고, 반응 후 생성된 당 글루칸을 원심 분리하여 모은 뒤 1 M NaOH를 이용하여 녹인 후 TLC에 점적하여 전개시켰다.

전개가 끝나면, 실온에서 건조시킨 후에 에탄올:황산을 9:1로 섞은 발색 시약을 스프레이로 TLC판에 골고루 분사하여 120℃ 에서 15 내지 20분 동안 태워서 발색한 후 AlphaEase FC 프로그램을 이용하여 활성 여부를 계산하고, 그 결과를 표 1에 나타내었다. 효소 1유닛은 반응 조건 1분 하에서 1mM의 프럭토오스를 수크로오스부터 생산하는 효소의 능력을 의미한다.

	글루코오스 배지 (IU ml-1)	수크로오스 배지 (IU ml-1)
B-512F	0	0.01
B-512FMCM	6.5	8.2
B-512F/KM	12.3	13.1
B-1299	0	0.01
B-1299C	0.1	0.3
B-1299C/KM	0.8	1.5
B-1355	0	0.02
B-1355C	0.32	0.6
B-1355C/KM	1.1	1.7

그 결과, 상기 표 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 변형 류코노스톡속 균주인 B-512F/KM, B-1299C/KM 및 B-1355C/KM의 효소 생산성이 모균보다 2배 이상 높은 것을 확인하였다.

실험예 2: 류코노스톡 메센테로이데스 B-1299C/KM, B-512F/KM. 혹은 류코노스톡 시트레움 B-1355C/KM 효소를 이용한 스테비오사이드 배당체 수용체 반응 및 생산 스테비오사이드 배당체 확인

수크로오스(S)는 sigma로부터 구입하고, 스테비오사이드는 ㈜ 대평 (경기도, 한국)에서 구입하고, 효소는 상기 실험예 1에 따라 류코노스톡 시트레움 B-1355C/KM 균주에서 유래한 것을 이용하였다.

상기 실시예 2에서 제조한 류코노스톡 메센테로이데스 B-1299C/KM, 류코노스톡 시트리움 B-1355C/KM 균주로부터 생산된 효소 0.9 U/ml, 그리고 류코노스톡 메센테로이데스 B-512F/KM 균주로부터 생산한 효소 5 U/ml를 수크로오스(S) 600mM, 및 수크로오스(S) 600mM 및 스테비오사이드(Ste) 100mM 혼합물과 각각 28℃에서 6시간 동안 반응(R)시킨 후, 얇은막크로마토그래피(TLC)를 수행하였다. 얇은막크로마토그래피 전개 용매로는 nitromethane: n-propanol: water(2:5:1.5, v/v/v)를 사용하여 한 번 전개하였다. 그 결과는 도 1과 같다.

도 1을 참고하면, 상기 레인 1 내지 3 모두 스테비오사이드 배당체로 전환된 것을 확인할 수 있다((Frc; 프락토오스. STV; 스테비오사이드 수용체, 래인 1; B-1299C/KM 유래 효소를 이용한 수용체 반응산물, 래인 2; B-1355C/KM 유래 효소를 이용한 수용체 반응산물, 래인 3; B-512F/KM 유래 효소를 이용한 수용체 반응산물).

실험예 3:. 류코노스톡 메센테로이데스 B-512F/KM의 효소 활성 온도에 따른 스테비오사이드 배당체 생산 비교

3-1. 류코노스톡 메센테로이데스 B-512F/KM의 효소 반응 시간에 따른 스테비오사이드 배당체 생산 비교

설탕 350 mM, 1% 스테비오사이드, 512F/KM 덱스트란수크라아제 (1-10 U/mL) 를 20mM Na-세테이트 buffer를 이용하여 pH 5.2로 준비하였다.

스테비오사이드 배당체의 생산 반응은 28℃에서 1시간 내지 24시간 동안 진행하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2를 참고하면, 1유닛의 효소를 이용한 경우 24시간 반응 후 초기 스테비오사이드(화살표로 표시함)는 모두 스테비오사이드 배당체로 전환됨이 확인되었다. 효소의 활성을 2유닛으로 증가시킨 경우 7시간 후에 거의 모든 스테비오사이드가 수용체 반응 후 스테비오사이드 배당체로 전환 됨이 확인되었다.

3-2. 류코노스톡 메센테로이데스 B-512F/KM의 고정된 활성의 효소 반응에서 설탕 농도에 따른 스테비오사이드 배당체 생산 비교

설탕 100mM - 1M, 2% 스테비오사이드, 덱스트란수크라아제 3U/mL을 20 mM Na-아세테이트 buffer를 이용하여 pH 5.2로 준비하였다.

스테비오사이드 배당체 생산 반응은 28℃에서 7시간 동안 진행하고, TLC를 이용하여 당과 스테비오사이드 배당체를 확인하고, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 이때 TLC 전개 용매는 아세토니트릴(acetonitrile):물 = 85:15 (v/v), 그리고 이후 니트로메탄(nitromethane):엔-프로필 알코올(n-propyl alcohol):물 = 2:5:1.5 (v/v)를 이용하였다.

도 3을 참고하면, 7시간 반응 후 점적 한 결과 100 mM - 500 mM 설탕 모두에서 비슷한 분포의 스테비오사이드 배당체 합성이 잘 이루어졌음이 확인되었다.

실시예 3: 효소 반응 후 반응액에서 단당과 glucosyl-stevioside 분리

준비한 효소 반응(설탕 500 mM, 류코노스톡 메센테로이데스 B-512F/KM의 효소 3 U/mL, Na-Ac buffer 20 mM, 반응시간 12 시간) 후 반응액에 90% ethyl alcohols을 넣어 올리고당 제거 한 상등액을 분리한다. 분리한 상등액을 Diaion HP- 20 resin 컬럼에 로딩하고, 물을 이용하여 단당을 제거하였다. 이후 남아 있는 glucosyl steviosides를 회수하기 위해서 80% ethyl alcohols을 이용하였다. 도 4와 같이 70% 내지 100%의 에탄올을 이용하였을 때 용출성분을 확인할 수 있었으며, 이에 따라 80% 에탄올을 이용하였다.

이때 80% 에탄올로 용해되어 나오는 산물을 모두 회수하였다. 회수한 액은 rotary evaporator (Heidolph, Germany)를 이용하여 45°C에서 농축하고 freeze dryer (EYELA, Japan)를 이용하여 분말화하였다. 이 분말은 TLC plate (Silica Gel 60, Merck, Darmstadt, Germany)에 점적하여 nitromethan:n-propyl:water = 2:5:1.5 (v/v) 전개용매로 1회, 그리고 acetonitrile:water = 85:15 (v/v) 용매로 1회 전개 한 후, 0.3% (w/v) N-(1-naphthyl)-ethylene diamine과 5% (v/v) H₂SO₄ 이 들어 있는 메탄올 용액에 담근 후 말리고 125 °C에서 5 min 간 구워 발색 하였다.

실험예 4: High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)를 이용한 glucosyl stevioside 정제

상기 실시예 3에서 준비한 glucosyl-stevioside를 정제하기 위하여 High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)를 이용하였다.

구체적으로, 상기 실시예 3에서 주비한 시료를 NH₂ column(5μm, 150 x 4.6 mm)이 장착된 HPLC-RI system을 이용하여 정제하였으며, 이때 정제 조건은 하기 표 2와 같다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

Instrument	HPLC condition
column	Amino column
Mobile phase	A : 75% 아세토나이트릴
Flow rate	1.0 mL/min
Column temperature	40 °C
Injection vol.	20 μL
Analysis time	30 min

그 결과, HPLC에서 1 내지 3의 시료를 얻을 수 있었으며(도 5), 여기서 얻은 1 내지 3의 시료로 TLC 크로마토그램을 통해 glucosyl-stevioside를 확인하였다(도 6).

이후, 상기에서 얻은 1 내지 3의 glucosyl-stevioside를 정체하고 구조 결정을 확인하였다.

실험예 5: 스테비올 배당체 생산 최적화(반응표면분석: response surface methodology: RSM)

반응표면분석(response surface methodology: RSM)을 이용하여 stevioside에서 glucosyl-stevioside가 생산되는 정도를 최적화 하고자 하였다.

고려한 3가지 변수는 효소농도(x1), 설탕농도(x2) 및 스테비오사이드농도(x3) 였으며, 실험 조건은 하기 표 3의 조건에서 진행하였다.

Run no.	Coded number Stevioside 전환 (%)
	X1	X2	X3	실험값	예상값
	Unit/mL	Stevioside(mM)	Sucrose(mM)
1	1	150	300	40.42	39.37
2	3	90	700	80.39	77.25
3	1	30	300	63.43	62.79
4	3	90	700	77.92	77.25
5	3	90	700	76.68	77.25
6	5	150	1100	77.85	78.34
7	5	30	300	78.27	75.30
8	5	90	700	84.72	84.50
9	1	30	1100	57.86	55.93
10	5	150	300	64.63	66.42
11	1	150	1100	24.95	27.76
12	1	90	700	52.16	52.96
13	3	150	700	72.36	68.30
14	3	90	700	79.90	77.25
15	3	90	700	75.77	77.25
16	3	90	700	74.00	77.25
17	3	90	1100	74.00	71.72
18	5	30	1100	91.05	91.96
19	3	90	300	66.33	69.19
20	3	30	700	82.20	86.83

3가지 변수, 효소농도(x1), 설탕농도(x2) 및 스테비오사이드농도(x3)와 스테비오사이드 전환율(Y) 와의 상관관계는

Y= 46.466740 + 12.802404(X1)-0.226268(X2)+0.045081(X3)+0.030300(X1)(X2) +0.007352(X1)(X3)-0.000049(X2)(X3)-2.131815(X1)²+0.000087(X2)²-0.000043(X3)² 로 확인되었다.

이 식은 변수들의 대입에서 얻은 예상치와 실험치가 거의 동일함을 확인함으로써 유효성이 확인할 수 있었다.

실험예 6: 말디토프(MALDI-TOF) 질량분석

말디토프 질량분석기 (MALDI-TOF MS, Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization -Time-of-Flight Mass Spectrometer)를 이용하여 스테비올 배당체의 분자량(시료 1 및 시료 2)을 확인하고 그 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다.

구체적으로, 시료 1 및 시료 2의 스테비올 배당체(3 mg/mL)를 탈이온수로 녹인 다음 Voyager DE-STR MALDI-TOF mass spectrometer (Applied Biosystems, Foster, CA, USA)를 이용하여 분자량 결정하였다. Mass spectra는 positive reflector mode로 얻었는데, 평균 300 laser shots으로 하였고, acceleration voltage는 25 kV 로 하여 그 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다.

분자량을 분석한 결과, 정제한 시료 1, 2에 대한 말디토프 질량분석기 (MALDI-TOP) 분석 결과로 얻은 분자량 결과로부터 스테비오사이드에 글루코오스가 1-2개 결합된 시료인 것을 확인하였다.

또한, 시료 1(Compounds 1)의 분자량은 m/z 989.5 (M + Na)+로 한 개의 글루코오스가 결합된 시료이며, 시료 2(Compounds 2)는 m/z 1151.4 (M + Na)+으로 2개의 포도당이 stevioside에 결합된 것으로 확인되었다.

실험예 7: Nuclear Magnetic Resonance (NMR) 분석

각각 정제한 스테비오사이드 배당체 (10 mg) (시료 1 및 시료 2) 를 600μL DMSO-d6 에 녹이고 5 mm NMR tubes에 넣어 준비하였다. NMR spectra는 AVANCEIII system(Bruker, Germany) 1H NMR 경우 850 MHz로, 13C NMR경우 125 MHz로 25 °C에서 분석하였다.

결합구조는 homonuclear correlation spectroscopy(COSY), total correlation spectroscopy (TOCSY) heteronuclear single-quantum coherence (HSQC), 및 heteronuclear multiple-bond correlation (HMBC)로 확인하고 그 결과를 하기 표 4 및 표 5에 나타내었다.

또한, 시료 1 및 2의 구조를 확인한 결과, 시료 1의 Glucosyl-stevioside은 하기 화학식 2와 같이 13-O-β-sophorosyl-19-O-β-isomaltosyl-steviol이며, 시료 2의 Glucosyl-stevioside는 하기 화학식 1과 같이 13-O-[β-D-glucosyl(1 → 2)-β-nigerosyl]-19-O-β-isomaltosyl-steviol로서 신규 화합물임을 확인하였다.

[화학식 1]

[화학식 2]

Claims (13)

1. A) 기탁번호 KCCM11728P로 기탁된 류코노스톡 메센테로이데스 B-512F/KM, 기탁번호 KCCM11729P로 기탁된 류코노스톡 메센테로이데스 B-1299C/KM 및 기탁번호 KCCM11730P로 기탁된 류코노스톡 시트레움 B-1355C/KM으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 변형 류코노스톡속 균주를 수크로오스(sucrose) 함유 배지에서 배양하여 글루칸수크라아제를 생성하는 단계;
   B) 상기 배양에 의해 생성된 글루칸수크라아제(glucansucrase) 및 수용체로서 스테비오사이드를 반응시켜서 스테비오사이드 배당체를 생성하는 단계; 및
   C) 상기 수용체 반응액에서 생성된 스테비오사이드 배당체를 회수하는 단계;를 포함하고,
   상기 B) 단계의 글루칸수크라아제 농도(X1), 스테비오사이드의 농도(X2), A) 단계의 수크로오스의 농도(X3)와 상기 C)단계의 분리되는 스테비오사이드 배당체의 생산량(Y)은 하기 관계식 1을 만족하는 것인
   스테비오사이드(stevioside) 배당체의 고효율 생산방법.
   [관계식 1]
   Y = 46.466740+12.802404(X1)-0.226268(X2) + 0.045081 (X3) + 0.030300 (X1)(X2)+0.007352(X1)(X3)-0.000049(X2)(X3)-2.131815(X1)²+0.000087(X2)²-0.000043(X3)²
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 수크로오스는 300 내지 1100mM 농도로 포함되는 것인
   스테비오사이드(stevioside) 배당체의 고효율 생산방법.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 글루칸수크라아제는 1 내지 5 Unit/ml의 활성으로 사용되는 것인
   스테비오사이드(stevioside) 배당체의 고효율 생산방법.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 스테비오사이드는 30 내지 150mM 농도로 포함하는 것인
   스테비오사이드(stevioside) 배당체의 고효율 생산방법.
   
5. 삭제
6. 제1항에 있어서,
   C) 상기 수용체 반응액에서 생성된 스테비오사이드 배당체를 회수하는 단계에서는 상기 수용체 반응액에 탄소수 1 내지 4의 알코올을 첨가하여 스테비오사이드 배당체를 분리하는 것인
   스테비오사이드(stevioside) 배당체의 고효율 생산방법.
   
7. 제6항에 있어서,
   상기 탄소수 1 내지 4의 알코올은 50 내지 100%의 에탄올인 것인
   스테비오사이드(stevioside) 배당체의 고효율 생산방법.
   
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제

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