CN118599799A - 一种糖基转移酶及其在生产糖苷中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种糖基转移酶及其在生产糖苷的中应用。本发明利用分子克隆技术从一株耐低温的枯草芽孢杆菌中克隆得到一种糖基转移酶，将克隆得到的糖基转移酶分子构建表达载体在体外进行了成功表达。酶活试验表明，体外表达的糖基转移酶能够将莱鲍迪苷A催化为莱鲍迪苷D，且该糖基转移酶具有耐低温的特性，在25℃条件下依然可以催化反应的发生，具有广泛的pH值反应范围，在pH6‑8范围内均可以实现催化反应的进行。本发明公开的新的糖基转移酶具有的耐低温宽pH值反应的优点，适合各种糖苷糖基化产物的生产。

Description

一种糖基转移酶及其在生产糖苷中的用途

技术领域

本发明涉及基因克隆及分子生物学领域，具体涉及一种糖基转移酶及其在生产糖苷中的用途。

背景技术

植物体内参与催化化合物糖苷化的酶叫做糖基转移酶类(Glycosyltransferase，GTs)，它将活性的糖供体转移到糖受体上，从而形成受体糖苷化产物。UDPG-糖基转移酶类(UGTs)是一个依赖于UDPG(尿嘧啶核苷二磷酸糖)糖供体的糖基转移酶类。

糖基转移酶(EC2.4.X.Y)是自然界存在的最为多样性的一大类酶，糖基转移酶负责将活性供体的单糖部分转移至糖、蛋白质、脂类、核酸以及另外一些小分子，即完成糖基化反应，形成具有很多生物学功能的糖基化产物。在原核生物和真核生物中存在大量的糖基转移酶，其用于催化糖基化反应生成寡糖、多糖和糖复合物。这些结构多样性的糖分子参与和介导从结构、存储到信号传递等生命活动。糖基转移酶能够将活化的糖基供体上的糖基团转移至特定的受体分子形成糖苷键，而在糖基团转移过程中异头碳原子构型保留或者翻转而形成不同构型的糖基化产物。

UGTs属于GT1多基因家族，GT1家族约占整个GTs家族的一半左右。这类基因编码的蛋白在C端通常有一段44个氨基酸的保守序列，该序列在糖苷化反应中可能参与结合UDPG，又被称为PSPG盒。在植物多基因GTs家族，普遍参与植物各种生长调控和逆境胁迫等。

糖基转移酶在所有生命体中都扮演着重要的生物学角色，日益引起人们的重视。蛋白质的糖基化修饰和天然糖蛋白的去糖基化是研究糖蛋白糖链结构和功能的重要手段之一。其中糖基转移酶是该反应中的有用工具。

糖基转移酶(Glycosyltransferase，GT)作为一种生物体中广泛存在的转移酶类，可以将活化的糖基供体上的糖基，转移到底物受体上。大多数的糖基供体为核苷酸糖，但同时糖磷酸、糖脂和其他糖类也能成为供体。而糖基受体的种类包括蛋白质，糖类、脂类、核酸和多种次级代谢产物如抗生素、生物碱、植物激素、植物多糖等。

在过去几十年，大量研究集中在探索糖基转移酶在生物体中的重要性。有限的生化数据限制了对特定单酶功能的进一步理解。几年来对GTs基因的鉴定、生化表征以及其在生物体中转录水平和代谢水平上的分析，有利于研究糖基化机制。而大规模的植物基因组测序有助于破译在植物次级代谢过程中，GTs在糖缀合物生物合成中的功能。

植物GTs参与具有不同特性的糖复合物的生物合成，将糖基转移至苷元或支链糖基上，从而形成广谱次级特异代谢物。植物通过次级代谢过程产生大量在医药、食品行业均有巨大应用价值的天然产物。

糖基化机制作为生物过程中发生的关键修饰步骤，有助于形成复杂多样的植物次级代谢物。由于大部分高价值的次级代谢物天然含量并不高，从天然植物中直接提取通常产量较低，而耗能较高。此外，天然提取的收益可能高度依赖于地理、季节甚至政治因素。通过体外植物细胞培养或对天然植物进行代谢工程改造，可一定程度解决季节性因素和低产量的问题，但其经济成本较高。天然糖苷类型种类繁多，且大多具有特定糖苷键的立体选择性，使其受许多反应性基团的影响，因此也难以通过化学合成的方法获得大量的产物。

因此，在对高价值天然产物的高需求和可持续发展需求的推动下，生物合成的方法应运而生。其中GT的催化具有高选择性及高催化效率，可以实现大分子聚糖及糖共轭物分支延伸糖基化的立体选择性及区域选择性，已成功应用在了多种代谢产物中糖苷类分子的合成中。

糖苷的合成在制药、化妆品、食品和保健品等行业具有重要意义，尤其是对复杂底物进行选择性糖基化更是化学合成中的重大挑战，需要多步且条件复杂的合成过程。糖基转移酶因其特殊的区域选择性和立体选择性，使得其能够在不需要化学合成中的基团保护的情况下对复杂化合物的特定位置进行一步糖基化反应。此外糖基转移酶还具有广泛的底物谱，使得其具有更高的应用价值。然而核苷二磷酸糖的成本高且可用量少，限制糖基转移酶在工业上的应用。

甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)是菊科(Tribe Eupatorieae)中的一种多年生根茎灌木，原产于巴拉圭和巴西，数百年来被应用于茶水风味的优化上。在这个种属中有220-230个相关甜叶菊品种。甜菊糖苷(Steviol glycosides,SGs)是一种提取自甜叶菊叶子中的二萜糖苷成分的总称，是甜叶菊中的甜味来源。基于近年来大量的有益证据，现在甜菊糖已获得美国食品药品监管局(FDA)、FAO/WHO食品添加剂联合专家委员会(JECFA)和欧洲食品安全局批准，是一种可被人类消费的食品。随着市场上的甜菊糖产品越来越多，欧洲食品安全局对过去几年欧洲不同国家不同年龄人群的甜菊糖苷摄入量进行分析。根据2015及2018两年的分析报告，目前日常饮食中使用甜叶菊成分的趋势在增加。未来几年，甜叶菊甜味剂的全球市场预计将增长至数百万吨。

除了甜味特性外，甜菊糖在临床上的研究也受到关注。目前研究发现，甜菊糖苷具有重要的药理和治疗活性，如抗氧化剂、抗菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤、利尿及护胃止泻等功能，并对免疫调节和肾功能、血压血糖等调节具有积极作用。甜菊糖苷作为甜味剂加入日常饮食中，对患有代谢综合征、II型糖尿病、高血压、心血管疾病、低血糖、龋齿和念珠菌病的患者十分有益。且甜叶菊本身，可作为伤口愈合和皮肤擦伤的敷料进行外用。目前实验结果表明，甜菊糖苷非致癌，无遗传毒性且与人类的生殖、发育毒性无关。

目前市售的甜菊糖苷产品均存在轻微的苦味和涩味，人类味觉感官上会出现无法掩盖的金属余味，使甜菊糖苷在食品和医药产品中的应用受到限制。为了最大限度地减少后苦味，采取了多种工业手段，如以麦芽糊精和菊粉为胶囊剂采用喷雾干燥技术，改善其风味。同时，通过复合其他甜味剂，如赤藓糖醇、麦芽糖醇、菊糖、低聚果糖等也可有效掩盖余味。

不同类型的甜菊糖苷的结构还决定其甜度及后苦味。甜菊糖苷的C-19(R 1)与C-13(R 2)的糖基残基对甜度形成影响。甜菊苷(Stevioside,ST)与莱鲍迪苷A(RebaudiosideA,Reb A)作为市面上最常见的两种甜菊糖苷，Reb A的甜度高于ST。与ST相比，steviolbioside仅在R1处少一个葡糖基，但其甜度低于ST。通过分析C13的R1基团，对比RebA和rubusoside，可发现R1基团上的糖基变化可能与甜菊糖苷的后苦味相关。延长C19侧链上的糖基苷元，可以提高甜菊糖苷的甜度。其中莱鲍迪苷D(Rebaudioside D，Reb D)与其他甜菊糖苷相比，后苦味相对较低。

在甜叶菊提取所得的糖苷种类中，甜菊苷(Stevioside,ST)与莱鲍迪苷A

(Rebaudioside A,Reb A)是含量最高的两种成分。其中Reb A含量较ST低，但其后苦味较其减少，同时稳定性也更高，在实际应用中更具有优势。自2008年以来，RebA已通过美国食品和药物管理局安全认证，允许作为食品添加剂。2011年12月后，在欧盟也允许将ST作为食品添加剂进行销售和使用。目前在我国，已有多种类型的食品和饮料应用了甜菊糖苷产品替代蔗糖。提高甜菊糖苷产品中Reb A的含量有利于扩大甜菊糖产品的适用范围，符合市场需求。

尽管在此前的研究中，预测认为Reb A会是甜味最高的甜菊糖苷。，通过志愿者品尝的方式，对Reb A、Reb D及Reb M的风味进行了主观评估。实验表明，Reb A的甜度显著低于Reb M，与Reb D在实际品尝时，甜度略有降低但没有显著差异。然而相较来说，Reb A的苦味在样品中十分突出，而Reb D和Reb M与蔗糖相比没表现出太强的后苦味。因此Reb D与Reb M作为新一代甜味剂，更受消费者喜爱，具有更广阔的的应用前景。

已纯化的糖基转移酶是目前糖基化工程中的重要酶，为研究糖蛋白糖链的结构与功能的关系以及细胞表面糖基化修饰提供了极好的方法。目前对这些酶的研究还处于起步阶段，纯化的酶种类依然很少。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中糖基转移酶不足的问题，尤其是有特色的糖基转移酶缺乏，制约着甜菊糖苷多种类型的产品的产业化生产，提供一种新的糖基转移酶。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明公开了一种糖基转移酶，所述糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明公开了编码所述的糖基转移酶的核苷酸分子。

优选的，所述核苷酸分子的序列如SEQ ID NO.3所示。

优选的，所述糖基转移酶来自枯草芽孢杆菌。

本发明公开了表达载体，所述表达载体包含所述的核苷酸分子。

本发明公开了细胞，所述细胞包含所述的表达载体。

优选的，所述细胞为真核细胞或原核细胞。

优选的，所述细胞为酵母或大肠杆菌。

本发明公开了糖基转移酶，所述糖基转移酶由所述的细胞在体外表达获得。

本发明公开了所述的糖基转移酶和/或所述的核苷酸分子和/或所述的表达载体和/或所述的细胞在生产糖苷中的用途。

本发明公开了一种生产糖苷的方法，其特征在于，采用所述的糖基转移酶进行生产。

本发明公开了一种生产糖苷的方法，包括将莱鲍迪苷A催化为莱鲍迪苷D的操作，所述操作使用的糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

优选的，所述催化反应的温度为25℃。

本发明利用分子克隆技术从一株耐低温的枯草芽孢杆菌中克隆得到一种糖基转移酶，将克隆得到的糖基转移酶分子构建表达载体在体外进行了成功表达。酶活试验表明，体外表达的糖基转移酶能够将莱鲍迪苷A催化为莱鲍迪苷D，且该糖基转移酶具有耐低温的特性，在25℃条件下依然可以催化反应的发生，具有广泛的pH值反应范围，在pH6-8范围内均可以实现催化反应的进行。本发明公开的新的糖基转移酶具有的耐低温宽pH值反应的优点，适合各种糖苷糖基化产物的生产。

附图说明

图1.PCR扩增的枯草芽孢杆菌的糖基转移酶的凝胶电泳结果，其中泳道1和2是PCR扩增的产物，泳道3是阴性对照。

图2.构建的表达载体GT-PET-28A的PCR扩增鉴定结果。

图3.构建的表达载体GT-PET-28A的双酶切鉴定结果。

图4.表达的目的蛋白菌体破碎后的SDS-PAGE电泳图；

图5.表达的目的蛋白经镍柱纯化后的SDS-PAGE电泳图；

图6.酶促反应产物经HPLC检测结果，其中，图6a为反应产物的检测结果，图6b为仅含有莱鲍迪苷A(Reb A)的反应液的检测结果，图6c为仅含有莱鲍迪苷D(Reb D)的配制反应液的检测结果。

图7.低温酶促反应产物经HPLC检测结果，其中，图7a为反应产物的检测结果，图7b为仅含有莱鲍迪苷A(Reb A)的反应液的检测结果，图7c为仅含有莱鲍迪苷D(Reb D)的配制反应液的检测结果。

图8.不同pH值反应条件下的酶促反应产物检测结果。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

实施例1糖基转移酶基因的克隆和测序

提取耐低温枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的基因组DNA作为扩增模板，该耐低温枯草芽孢杆菌菌株为本实验筛选保存，该菌株可以在温度低至10℃时仍然具有与普通的枯草芽孢杆菌在正常温度小的生长繁殖。

根据NCBI中已经公开的枯草芽孢杆菌的糖基转移酶基因的序列信息，根据其保守区段设计扩增引物序列如下：

上游引物：5’-atgaaaaagcaccatattt-3’(SEQ ID NO.1)；

下游引物：5’-ttattgcggtacagcgga-3’(SEQ ID NO.2)。

以提取的耐低温的枯草芽孢杆菌的基因组作为模板，建立PCR扩增体系如下：

10XPCR反应buffer 2μL，

1μmo l/L正上下游引物，

1U Taq DNA酶,

模板DNA 1μL，

反应体积补齐至20μL。

PCR扩增反应条件如下：预变性95℃5min，循环扩增94℃1min、58℃1.5min、72℃3min(30次循环)，延伸72℃5min。扩增产物凝胶电泳检测(图1)，检测的扩增片段大小与已经公开的枯草芽孢杆菌的糖基转移酶的大小近似。回收连接PMD-T载体进行测序，测序结果如下序列3所示。

克隆得到的糖基转移酶经测序后的序列(SEQ ID NO.3)：atgaaaaagc accatatttcgatgatcaat atccctgcgt acgggcatgt caatcctacgctagcattag tggagaagct ttgtgagaaagggcatcgtg tcacgtatgc gacgactgaggaatttgcgc ccgctgttca gcaagccggt ggagaagcattgatttatca tacatccttgaatattgatc ctaagcaaat cagggagatg atggaaaaga atgacgcgacgctcagtctattgaaagaat cactcagcat tctgccgcag cttgaggagt tatataaagatgatcagcctgatctgatca tctatgactt tgtcgcactt gcgggaaaat tgtttgctgataaacttaatgtgccggtca tcaagctctg ttcatcatat gcccaaaatg aatcctttcagcttggaaatgaagacatgc tgaaaaagat aaaagaagcc gaggctgaat ttaaagcctacttggagcaagagcaattgc cggctgtttc atttgaacaa ttagctgtgc cggaagcattaaatattgtctttatgccga aatcctttca gattcagcat gagacgttcg atgaccgtttctgttttgtcggcccttccc ttggaaaacg gacggaacaa gaaagcctgt tgattgacaagggtgatcgtgcgcttatgc tgatttcttt gggaacggca tttaacgcat ggccggaattttacaagatgtgcatcgatg catttcggga ttcttcatgg caagtgatca tgtcggtcgggaaatcgattcatcctgaaa gcttggatga tacccctgct aactttacca ttcgccaaagcgtgccgcatcttgaggtgt tagcgaaagc cgatttgttt atttctcatg gcgggatgaacagtacgatggaagcgatga atgccggtgt gccgctcgtc gtcattccgc aaatgtatgagcaggagctcaccgcaaagc gtgtcgatga gttaggtctt ggcgtttatt tgcaaagagaagaagttcctgtttccaagc tgcaggaagc ggttcaggcc gtatccggtg atcaagagctgctcagccgcgtcaagagta tgcaaaagga tgtaaaagaa gcaggcggag cggagcgtgcggcagctgagattgaagcgt ttatgaaaaa atccgctgta ccgcaataa。

对应的编码氨基酸序列如下(SEQ ID NO.4)：

MKKHHISMINIPAYGHVNPTLALVEKLCEKGHRVTYATTEEFAPAVQQAGGEALIYHTSLNIDPKQ

IREMMEKNDATLSLLKESLSILPQLEELYKDDQPDLIIYDFVALAGKLFADKLNVPVIKLCSSYAQ

NESFQLGNEDMLKKIKEAEAEFKAYLEQEQLPAVSFEQLAVPEALNIVFMPKSFQIQHETFDDRFC

FVGPSLGKRTEQESLLIDKGDRALMLISLGTAFNAWPEFYKMCIDAFRDSSWQVIMSVGKSIHPES

LDDTPANFTIRQSVPHLEVLAKADLFISHGGMNSTMEAMNAGVPLVVIPQMYEQELTAKRVDELGLGVYLQREEVPVSKLQEAVQAVSGDQELLSRVKSMQKDVKEAGGAERAAAEIEAFMKKSAVPQ。

实施例2糖基转移酶的原核表达及纯化

2.1糖基转移酶基因的克隆及表达载体的构建

根据测出的糖基转移酶序列，设计表达引物，在设计的引物两端分别引入BamH I与Xho I酶切位点：

上游引物：5’-ggatccatgaaaaagcaccatat-3’(SEQ ID NO.5)；

下游引物：5’-ctcgagttattgcggtacagcg-3’(SEQ ID NO.6)。

PCR扩增反应条件如下：预变性95℃5min，循环扩增94℃1min、58℃1.5min、72℃3min(30次循环)，延伸72℃5min。

将扩增产物与PMD-18T载体连接后，转化DH5α感受态细胞，并挑取阳性克隆放大培养，提取阳性重组质粒，经BamHI与Xho I双酶切，双酶切产物回收与同样酶切的PET-28A连接转化DH5α，PCR以及双酶切鉴定阳性重组质粒GT-PET-28A，转化到BL21(DE3)感受态中，挑阳性克隆培养。PCR以及双酶切鉴定结果分别如图2-图3。

2.2糖基转移酶的诱导表达和纯化

将含有GT-PET-28A的BL21(DE3)工程菌，接种后过夜培养.按1/1000转接到新的氨苄LB培养基中，在OD值达到0.6-0.8之间，加入IPTG进行诱导，经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE鉴定，考马斯亮蓝染色后，在大约47KD处有一明显的特异蛋白条带。SDS-PAGE电泳检测结果参见图4。

根据PET-28A载体所带的HIS标签特性，利用镍柱纯化粗酶液，经过SDS-PAGE胶鉴定，可以在47KD处有一条明显特异性条带，纯化的糖基转移酶蛋白电泳图片参见图5。

实施例3糖基转移酶催化底物的鉴定

建立酶催化反应体系，包括：

UDP-葡萄糖(UDPG)2.5mM/L；

纯化制备的糖基转移酶蛋白25μg/μL；

候选的催化底物，0.2mM：莱鲍迪苷A(Reb A)；

反应的缓冲体系为：100mM/L的pH值7.5Tris-盐酸；

β巯基乙醇(体积比)：0.1％；

反应体系为50μL酶反应体系，反应条件为：37℃水浴锅条件下反应进行30分钟，并通过加入50μL色谱纯甲醇终止反应，然后保存在-20℃待HPLC检测。

HPLC检测甜菊糖苷的条件：

色谱柱Phenomenex Gemini C18反向柱(250mm×4.6mm)；

柱温为42℃；

流动相A为50mM Tris-HCl缓冲液，

流动相B为乙腈；

流速为1mL/min；进样量为10μL；检测波长为262nm。

打开液相色谱及工作站。乙腈冲洗系统至压力稳定，打开液相色谱及工作站。先以1mL/min乙腈冲洗系统至压力稳定，将流速降至0.5mL/min后，连接色谱柱后冲洗至压力稳定。将流动相调整为80％超纯水及20％乙腈，冲至系统压力稳定。将流动相调整为65％流动相A，35％流动相B，冲至系统压力稳定后进行样品检测。检测结果参见图6。

样品检测结束后，将流动相调整为80％超纯水及20％乙腈，冲至系统压力稳定后。以1mL/min乙腈冲洗系统至压力稳定，将流速降至0.5mL/min后，卸下色谱柱并冲洗至压力稳定。

图6的检测结果表明，从枯草芽孢杆菌中克隆得到的糖基转移酶基因，经体外表达纯化之后，能够将莱鲍迪苷A(Reb A)糖基化催化生成莱鲍迪苷D(Reb D)。

实施例4糖基转移酶催化底物反应温度的鉴定

考虑到制备的糖基转移酶来源于耐低温的枯草芽孢杆菌，该枯草芽孢杆菌可以在低温下进行正常的生理代谢，因此，我们推测制备的糖基转移酶也可能也具有耐低温的特性。

在实施例3的反应体系的基础上，调整反应温度为25℃进行酶促反应。

具体操作如下：

建立酶催化反应体系，包括：

UDP-葡萄糖(UDPG)2.5mM/L；

纯化制备的糖基转移酶蛋白25μg/μL；

候选的催化底物，0.2mM：莱鲍迪苷A(Reb A)；

反应的缓冲体系为：100mM/L的pH值7.5Tris-盐酸；

β巯基乙醇(体积比)：0.1％；

反应体系为50μL酶反应体系，反应条件为：25℃水浴锅条件下反应进行30分钟，并通过加入50μL色谱纯甲醇终止反应，然后保存在-20℃待HPLC检测。

检测结果参见图7。从检测结果来看，将酶反应体系调整到25℃反应可以实现与37℃相同的反应，表明，本发明获得的糖基转移酶是一种耐低温型的，在较低的温度下仍然能够保持酶活性。

实施例5糖基转移酶催化底物反应pH的鉴定

对纯化的糖基转移酶的合适的反应pH值进行了检测，具体操作如下：

建立酶催化反应体系，包括：

UDP-葡萄糖(UDPG)2.5mM/L；

纯化制备的糖基转移酶蛋白25μg/μL；

候选的催化底物，0.2mM：莱鲍迪苷A(Reb A)；

反应的缓冲体系为：100mM/L的pH值Tris-盐酸，pH值分别为6.0、7.0、8.0、和9.0；

β巯基乙醇(体积比)：0.1％；

反应体系为50μL酶反应体系，反应条件为：37℃水浴锅条件下反应进行60分钟，并通过加入50μL色谱纯甲醇终止反应，然后保存在-20℃待HPLC检测，每个pH值进行三次平行反应。通过检测的峰面积来反应酶促反应的产物情况。检测结果参见图8，表明本发明纯化的糖基转移酶的反应的最适pH值在8.0左右，pH6-8均可实现催化反应的发生，pH值达到9之后，酶反应活性迅速下降。

本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (11)

1.一种糖基转移酶，其特征在于，所述糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.编码权利要求1所述的糖基转移酶的核苷酸分子。

3.根据权利要求2所述的核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子的序列如SEQ IDNO.3所示。

4.根据权利要求1所述的糖基转移酶，其特征在于，所述糖基转移酶来自枯草芽孢杆菌。

5.表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求2-3所述的核苷酸分子。

6.细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求5所述的表达载体。

7.根据权利要求6所述的细胞，其特征在于，所述细胞为真核细胞或原核细胞。

8.根据权利要求7所述的细胞，其特征在于，所述细胞为酵母或大肠杆菌。

9.糖基转移酶，其特征在于，所述糖基转移酶由权利要求6-8任一所述的细胞在体外表达获得。

10.权利要求1、4、9任一所述的糖基转移酶和/或权利要求2-3任一所述的核苷酸分子和/或权利要求5所述的表达载体和/或权利要求6-8任一所述的细胞在生产糖苷中的用途。

11.一种生产糖苷的方法，其特征在于，采用权利要求1、4、9任一所述的糖基转移酶进行生产。