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CN116121085B - 一株适用于低温水产养殖的耐冷酵母及其生防应用 - Google Patents

一株适用于低温水产养殖的耐冷酵母及其生防应用 Download PDF

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CN116121085B
CN116121085B CN202211120026.0A CN202211120026A CN116121085B CN 116121085 B CN116121085 B CN 116121085B CN 202211120026 A CN202211120026 A CN 202211120026A CN 116121085 B CN116121085 B CN 116121085B
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candida utilis
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Abstract

本发明公开了一株适用于低温水产养殖的耐冷酵母及其生防应用，属于生物技术领域。本发明所涉及的产朊假丝酵母(Candida utilis)CTF2022，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 2022857，保藏日期为2022年6月10日。该产朊假丝酵母分离于大连人工水产养殖水体化境，在15‑25℃环境下兼具良好的低温耐受与生防拮抗特性，48‑72h内发酵有效活菌数≥109cfu/mL。本发明的产朊假丝酵母(Candida utilis)CTF2022及其发酵产物高效拮抗多种水产养殖致病菌，具有重要的低温水产养殖应用价值。

Description

一株适用于低温水产养殖的耐冷酵母及其生防应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一株适用于低温水产养殖的耐冷酵母及其生防应用。
背景技术
我国水产养殖产品种类丰富，主要由鱼类、虾蟹类和贝类等水产品组成。与畜禽动物肉质相比，鱼肉富含蛋白、钙、磷及维生素等营养物质，因而消费需求及养殖规模逐年增加。而在水产品中，海参具有远高于虾类的蛋白质含量，参体蛋白含量高达80％，其具有高蛋白、低糖低脂等特点，且富含必需氨基酸及脂肪酸、维生素、酸性粘多糖、皂苷和胶原蛋白等有效活性成分，具有显著的抗肿瘤、抗凝血、抗氧化、降血压、降血脂、增强免疫等功效。然而，海参养殖易受到假单胞菌、灿烂弧菌、霉菌等致病菌侵害，发病多见腐皮综合征、烂胃病、霉菌病等病害。2020年，我国全面禁止使用抗生素，传统防病治病手段被禁止，因此亟待开发绿色替抗及高效水产养殖技术，满足海参等水产动物的快速生长发育与增产增重需要，同时提高成活率、减少发病率。因而，以微生态制剂作为饲料添加剂，在畜禽及水产养殖行业得到广泛应用，能够调节动物肠道微环境，增强机体免疫力，促进生长发育，提高养殖产能与经济效益。
目前，海参饲用益生菌主要使用真菌或细菌中部分具有益生拮抗功能的微生物。产朊假丝酵母是一种分布范围广、易生长繁殖的真菌，一般为圆形、腊肠形或椭圆形。菌落呈现乳白色，表面光滑湿润，呈菌丝状，利用碳源种类广泛，可同时代谢五碳糖和六碳糖，产生蛋白转移酶。产朊假丝酵母菌能够利用糖蜜发酵，或利用工业废水中的营养物质进行发酵，为兼性厌氧菌，有氧条件下不产生乙醇，无氧条件下厌氧发酵产生乙醇。产朊假丝酵母菌体蛋白质含量极高，占菌体总干重的32％-75％，同时富含核酸、细胞壁、各种酶以及B族维生素等营养物质。用于饲料工业中，对养殖动物肠道消化、饲料营养吸收以及致病菌群抑制具有显著成效，同时有助于改善养殖动物肠道微生物种群，提高机体免疫力。因此，在海参饲料中添加产朊假丝酵母菌对海参的生长具有促进作用，对海参肠道耗氧致病菌具有抑制作用。
目前，产朊假丝酵母菌主要在30-37℃条件下进行发酵培养，海参生长温度为15-25℃，因而，兼顾低温耐受性与生长生防特性，筛选优良的产朊假丝酵母菌种资源，适应低温环境养殖特点，提高产朊假丝酵母细胞生长速率、有效活菌数及其生防拮抗活性产物浓度，对于提高低温环境下益生菌活力及其生物效价、提升低温水产养殖产能尤为重要。本发明的耐冷产朊假丝酵母(Candida utilis)CTF2022，在15-25℃低温环境下，48-72h内发酵有效活菌数≥109cfu/mL，同时高效拮抗多种水产致病菌，具有实际应用意义和规模化生产价值。
发明内容
为解决现有产朊假丝酵母菌种在海参等低温水产养殖环境中(15-25℃)，由于低温耐受性不足，造成细胞生长速率缓慢、有效活菌数低，进而影响生长与生防效果的实际问题，本发明提供了一株适用于低温水产养殖的耐冷酵母及其生防应用。
本发明一方面提供了一株适用于低温水产养殖的耐冷酵母，分离于大连地区海参人工养殖水体环境，经鉴定分类命名为产朊假丝酵母(Candida utilis)CTF2022，该菌株已于2022年6月10日在中国典型培养物保藏中心保藏(地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号，邮编430072)，保藏编号为：CCTCC M 2022857。
进一步地，所述的产朊假丝酵母(Candida utilis)CTF2022在低温环境下的生防应用。
上述应用中，所述的水产养殖致病菌，包括溶藻弧菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌、黄海希瓦氏菌或哈维氏弧菌等。
进一步地，所述的产朊假丝酵母(Candida utilis)CTF2022生防应用方法，即添加使用1％-10％发酵菌剂，所述发酵菌剂的有效成分为产朊假丝酵母(Candida utilis)CTF2022及其发酵产物，或产朊假丝酵母(Candida utilis)CTF2022发酵菌液。
进一步地，产朊假丝酵母(Candida utilis)CTF2022发酵温度为15-25℃，48-72h内发酵菌液有效活菌数≥109cfu/mL。
进一步地，所述的产朊假丝酵母(Candida utilis)CTF2022发酵菌液制备方法，包括以下步骤：
(1)无菌条件下将产朊假丝酵母(Candida utilis)CTF2022保藏液稀释涂布于YPD平板培养基，30-37℃恒温静置培养24-48h后，使用无菌水收集平板培养基上真菌，制备真菌浓度108-1010个/mL的真菌悬液；
(2)在无菌条件下将上述步骤(1)中真菌悬液接种到液体种子培养基中，30-37℃，200rpm振荡培养24-48h，制备液体种子液；
(3)在无菌条件下，将上述步骤(2)中液体种子液按体积比5％～10％接入液体发酵培养基中，15-25℃，150-200rpm，通入无菌氮气发酵培养48-72h，得到发酵菌液，所得发酵菌液中产朊假丝酵母(Candida utilis)CTF2022有效活菌数≥109cfu/mL。
进一步地，所述种子培养基及发酵培养基的组成按质量百分比为：葡萄糖4％、酵母提取物1％、蛋白胨2％。
本发明所提供的耐冷酵母，即产朊假丝酵母(Candida utilis)CTF2022，在15-25℃培养温度下具有良好的低温耐受性，生长快速且有效活菌数高，液体发酵48-72h即可实现有效活菌≥109cfu/mL，较对照组产朊假丝酵母发酵有效活菌数提高了5-12.5。此外，本发明菌株及其发酵产物、或发酵菌液对低温水产养殖致病菌如溶藻弧菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌、黄海希瓦氏菌和哈维氏弧菌等具有高效的拮抗作用，适用于低温水产养殖。本发明的耐冷酵母，即产朊假丝酵母的菌种优势，是提高低温环境下益生菌活力及其生物效价、提升低温水产养殖产能的重要前提。本发明提供的适用于低温水产养殖的耐冷酵母及其发酵菌剂一方面丰富了优势菌种资源与种类，拓宽了水产养殖制剂产品的功能化发展，另一方面很好地兼顾了菌株低温耐受及生防拮抗特性，为绿色水产养殖发展提供了新思路。
附图说明
图1产朊假丝酵母(Candida utilis)CTF2022菌落形态。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步说明本发明内容，但不应该理解为对本发明的限制。若未特别说明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：产朊假丝酵母(Candida utilis)CTF2022的分离
本发明的耐冷酵母，即产朊假丝酵母(Candida utilis)CTF2022，分离于大连地区海参人工养殖水体环境，对采集样品进行梯度稀释涂布后分离获得的。具体操作步骤为：a.采集海参养殖区不同深度水体及底部污泥，采样环境温度为15-25℃，采样量为1mL或1g，加至含有99mL无菌水的三角瓶中，于15-25℃，200rpm条件下振荡培养120min。b.用移液枪进行梯度稀释(10-3、10-4、10-5)，取100μL稀释液涂布于YPD平板培养基上，每个稀释浓度涂布15个培养皿，5个一组分别于15℃、20℃、25℃培养箱中培养24-48h。每天观察形成的真菌菌落生长情况，挑取培养时间内最早形成的真菌单菌落分别进行稀释划线分离培养，转接到YPD培养基上划线纯化与保藏。
所述YPD培养基组分组成为(g/L)：蛋白胨20、酵母提取物10、葡萄糖20、琼脂15。其余为水补足至1000mL，调pH到6.5-7.0，121℃高压湿热灭菌15min。
其中，在按不同稀释浓度所涂布的全部培养皿上，培养24-48h即出现生长最快的真菌单菌落，纯化保藏后将该菌株命名为产朊假丝酵母(Candida utilis)CTF2022。
实施例2：产朊假丝酵母(Candida utilis)CTF2022的鉴定
菌株形态特征如下：在培养温度15-25℃条件下，在YPD固体培养基上培养24-48h后，形成菌落成圆形，菌落成乳白色，平滑且有光泽，菌落边缘整齐。根据《真菌鉴定手册》判断菌株CTF2022具有典型真菌属形态特征。
提取上述分离并纯化得到的菌株基因组DNA，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行26s rDNA测序分析(测序结果详见序列表)通过NCBI数据库中BLAST同源比对，选取同源性较高的产朊假丝酵母菌及其序列，用ClustalX1.81软件进行多序列比对分析，同时结合菌落形态特征，初步鉴定分离纯化菌株为产朊假丝酵母(Candida utilis)，已于2022年6月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，命名为产朊假丝酵母(Candida utilis)CTF2022，以下叙述简称产朊假丝酵母CTF2022或CTF2022，保藏编号为CCTCC M 2022857，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号。
实施例3：25℃条件下产朊假丝酵母发酵菌液的制备及其有效活菌数的测定
1.产朊假丝酵母CTF2022发酵菌液的制备
利用实施例2中获得的产朊假丝酵母CTF2022，作为实验组，依次进行真菌悬液制备、种子培养与发酵培养实验，具体操作步骤如下：
a.无菌条件下将产朊假丝酵母CTF2022保藏液稀释涂布于YPD平板培养基，30-37℃恒温静置培养24-48h后，使用无菌水收集平板培养基上真菌，制备真菌浓度108-1010个/mL的真菌悬液；
b.在无菌条件下将上述步骤a中真菌悬液接种到液体种子培养基中，30-37℃，200rpm振荡培养24-48h，制备液体种子液；
c.在无菌条件下，将上述步骤b中液体种子液按体积比10％接入液体发酵培养基中，25℃，200rpm，通入无菌氮气发酵培养48-72h，即得到产朊假丝酵母CTF2022发酵菌液。
种子培养基及发酵培养基的组成按质量百分比为：葡萄糖4％、酵母提取物1％、蛋白胨2％。
2.对照组产朊假丝酵母ACCC20060发酵液制备(对照例1)
对照组产朊假丝酵母ACCC20060(以下叙述或简称ACCC20060)，购买于辽宁省微生物菌种保藏中心，其最适培养温度为30-37℃，依次进行真菌悬液制备、种子培养、发酵培养对照实验，具体操作步骤如下：
a.无菌条件下将产朊假丝酵母ACCC20060保藏液稀释涂布于YPD平板培养基，30-37℃培养24-48h后，使用无菌水收集平板培养基上真菌，制备真菌浓度108-1010个/mL的真菌悬液；b.在无菌条件下将上述步骤a中真菌悬液接种到液体种子培养基中，30-37℃，200rpm振荡培养24-48h，制备液体种子液；
c.在无菌条件下，将上述步骤b中液体种子液按体积比10％接入液体发酵培养基中，25℃，200rpm，通入无菌氮气发酵培养48-72h，即得到产朊假丝酵母ACCC20060发酵菌液。
种子培养基或发酵培养基的组成按质量百分比为：葡萄糖4％、酵母提取物1％、蛋白胨2％。
3.产朊假丝酵母有效活菌数的测定
在无菌条件下，分别取上述步骤c中48h与72h培养后的产朊假丝酵母CTF2022发酵菌液和产朊假丝酵母ACCC20060发酵菌液，用移液枪进行梯度稀释((10-1、10-2、10-3…10-7、10-8、10-9、10-10)，取100μL稀释液涂布于YPD平板培养基，每个稀释浓度涂布5个培养皿，25℃培养箱中培养24-48h后进行平板菌落计数，结果取平均值，如表1所示。
表1产朊假丝酵母发酵菌液(25℃)有效活菌数
结果表明，实验组产朊假丝酵母CTF2022在25℃条件下，具有更高的发酵有效活菌数水平，发酵48h-72h即可实现有效活菌数≥109cfu/mL。如在25℃条件下，发酵至48h，对照组产朊假丝酵母ACCC20060发酵有效活菌数为6×108cfu/mL，实验组产朊假丝酵母CTF2022发酵有效活菌数为3×109cfu/mL，较对照组提高了5倍；如在25℃条件下，发酵至72h，对照组产朊假丝酵母ACCC20060发酵有效活菌数为1×109cfu/mL，实验组产朊假丝酵母CTF2022发酵有效活菌数为6.5×109cfu/mL，较对照组提高了6.5倍。可见，本发明的产朊假丝酵母CTF2022，在25℃低温环境下，可保持良好的生长活性，具有更强的低温耐受性。
实施例4：20℃条件下产朊假丝酵母发酵菌液的制备及其有效活菌数的测定
1.产朊假丝酵母CTF2022发酵菌液的制备
利用实施例2中获得的产朊假丝酵母CTF2022，作为实验组，依次进行真菌悬液制备、种子培养与发酵培养实验，具体操作步骤如下：
a.无菌条件下将产朊假丝酵母CTF2022保藏液稀释涂布于YPD平板培养基，30-37℃恒温静置培养24-48h后，使用无菌水收集平板培养基上真菌，制备真菌浓度108-1010个/mL的真菌悬液；
b.在无菌条件下将上述步骤a中真菌悬液接种到液体种子培养基中，30-37℃，200rpm振荡培养24-48h，制备液体种子液；
c.在无菌条件下，将上述步骤b中液体种子液按体积比10％接入液体发酵培养基中，20℃，200rpm，通入无菌氮气发酵培养48-72h，即得到产朊假丝酵母CTF2022发酵菌液。
种子培养基及发酵培养基的组成按质量百分比为：葡萄糖4％、酵母提取物1％、蛋白胨2％。
2.对照组产朊假丝酵母ACCC20060发酵液制备(对照例2)
对照组产朊假丝酵母ACCC20060(以下叙述或简称ACCC20060)，购买于辽宁省微生物菌种保藏中心，其最适培养温度为30-37℃，依次进行真菌悬液制备、种子培养、发酵培养对照实验，具体操作步骤如下：
a.无菌条件下将产朊假丝酵母ACCC20060保藏液稀释涂布于YPD平板培养基，30-37℃培养24-48h后，使用无菌水收集平板培养基上真菌，制备真菌浓度108-1010个/mL的真菌悬液；b.在无菌条件下将上述步骤a中真菌悬液接种到液体种子培养基中，30-37℃，200rpm振荡培养24-48h，制备液体种子液；
c.在无菌条件下，将上述步骤b中液体种子液按体积比10％接入液体发酵培养基中，20℃，200rpm，通入无菌氮气发酵培养48-72h，即得到产朊假丝酵母ACCC20060发酵菌液。
种子培养基或发酵培养基的组成按质量百分比为：葡萄糖4％、酵母提取物1％、蛋白胨2％。
3.产朊假丝酵母有效活菌数的测定
在无菌条件下，分别取上述步骤c中48h与72h培养后的产朊假丝酵母CTF2022发酵菌液和产朊假丝酵母ACCC20060发酵菌液，用移液枪进行梯度稀释(10-1、10-2、10-3…10-7、10-8、10-9、10-10)，取100μL稀释液涂布于YPD平板培养基，每个稀释浓度涂布5个培养皿，20℃培养箱中培养24-48h后进行平板菌落计数，结果取平均值，如表2所示。
表2产朊假丝酵母发酵菌液(20℃)有效活菌数
结果表明，实验组产朊假丝酵母CTF2022在20℃条件下，具有更高的发酵有效活菌数水平，发酵48h-72h即可实现有效活菌数≥109cfu/mL。如在20℃条件下，发酵至48h，对照组产朊假丝酵母ACCC20060发酵有效活菌数为2.5×108cfu/mL，实验组产朊假丝酵母CTF2022发酵有效活菌数为2×109cfu/mL，较对照组提高8倍；如在20℃条件下，发酵至72h，对照组产朊假丝酵母ACCC20060发酵有效活菌数为6×108cfu/mL，实验组产朊假丝酵母CTF2022发酵有效活菌数为4.5×109cfu/mL，较对照组提高7.5倍。可见，本发明的耐冷酵母，即产朊假丝酵母CTF2022，在20℃低温环境下，可保持良好生长活性，具有更强耐冷特性。
实施例5：15℃条件下产朊假丝酵母发酵菌液的制备及其有效活菌数的测定
1.产朊假丝酵母CTF2022发酵菌液的制备
利用实施例2中获得的产朊假丝酵母CTF2022，作为实验组，依次进行真菌悬液制备、种子培养与发酵培养实验，具体操作步骤如下：
a.无菌条件下将产朊假丝酵母CTF2022保藏液稀释涂布于YPD平板培养基，30-37℃恒温静置培养24-48h后，使用无菌水收集平板培养基上真菌，制备真菌浓度108-1010个/mL的真菌悬液；
b.在无菌条件下将上述步骤a中真菌悬液接种到液体种子培养基中，30-37℃，200rpm振荡培养24-48h，制备液体种子液；
c.在无菌条件下，将上述步骤b中液体种子液按体积比10％接入液体发酵培养基中，15℃，200rpm，通入无菌氮气发酵培养48-72h，即得到产朊假丝酵母CTF2022发酵菌液。
种子培养基或发酵培养基的组成按质量百分比为：葡萄糖4％、酵母提取物1％、蛋白胨2％。
2.对照组产朊假丝酵母ACCC20060发酵液制备
对照组产朊假丝酵母ACCC20060(以下叙述或简称ACCC20060)，购买于辽宁省微生物菌种保藏中心，其最适培养温度为30-37℃，依次进行真菌悬液制备、种子培养、发酵培养对照实验，具体操作步骤如下：
a.无菌条件下将产朊假丝酵母ACCC20060保藏液稀释涂布于平板培养基，30-37℃培养24-48h后，使用无菌水收集平板培养基上真菌，制备真菌浓度108-1010个/mL的真菌悬液；b.在无菌条件下将上述步骤a中真菌悬液接种到液体种子培养基中，30-37℃，200rpm振荡培养24-48h，制备液体种子液；
c.在无菌条件下，将上述步骤b中液体种子液按体积比10％接入液体发酵培养基中，15℃，200rpm，通入无菌氮气发酵培养48-72h，即得到产朊假丝酵母ACCC20060发酵菌液。
种子培养基或发酵培养基的组成按质量百分比为：葡萄糖4％、酵母提取物1％、蛋白胨2％。
3.产朊假丝酵母有效活菌数的测定
在无菌条件下，分别取上述步骤c中48h与72h培养后的产朊假丝酵母CTF2022发酵菌液和产朊假丝酵母ACCC20060发酵菌液，用移液枪进行梯度稀释((10-1、10-2、10-3…10-7、10-8、10-9、10-10)，取100μL稀释液涂布于YPD平板培养基，每个稀释浓度涂布5个培养皿，15℃培养箱中培养24-48h后进行平板菌落计数，结果取平均值，如表3所示。
表3产朊假丝酵母发酵菌液(15℃)有效活菌数
结果表明，实验组产朊假丝酵母CTF2022在15℃条件下，具有更高的发酵有效活菌数水平，发酵48h-72h即可实现有效活菌数≥109cfu/mL。如在15℃条件下，发酵至48h，对照组产朊假丝酵母ACCC20060发酵有效活菌数为8×107cfu/mL，实验组产朊假丝酵母CTF2022发酵有效活菌数为1×109cfu/mL，较对照组提高了12.5倍；如在15℃条件下，发酵至72h，对照组产朊假丝酵母ACCC20060发酵有效活菌数为2×108cfu/mL，实验组产朊假丝酵母CTF2022发酵有效活菌数为2×109cfu/mL，较对照组提高了10倍。可见，本发明的耐冷酵母，即产朊假丝酵母CTF2022，在15℃低温环境下，可保持良好生长活性，具有更强耐冷特性。
实施例6：产朊假丝酵母发酵产物(10％作用浓度)对海参致病菌的作用
利用高速离心机将实施例3中获得的产朊假丝酵母CTF2022发酵菌液与产朊假丝酵母ACCC20060发酵菌液分别在25℃，8000rpm条件下离心10min，获得离心后的上清液，无菌条件下将上清液透过0.22μm滤膜，置于4℃环境冷藏备用。在100mL2216E液体培养基摇瓶中按10％比例分别添加产朊假丝酵母CTF2022上清液和产朊假丝酵母ACCC20060上清液，随后分别接入1mL新鲜的溶藻弧菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌、黄海希瓦氏菌以及哈维氏弧菌保藏液，于28℃，200rpm条件下发酵培养12～24h，设置一组空白对照组，记录菌株OD600的变化。抑菌率计算公式：每个处理设置三组平行实验，结果取平均值。产朊假丝酵母CTF2022为实验组，产朊假丝酵母ACCC20060为对照组，相关拮抗作用效果即抑菌率，如下表4所示。
表4产朊假丝酵母CTF2022与ACCC20060的25℃发酵产物对海参致病菌拮抗作用
结果表明，利用实验组产朊假丝酵母CTF2022的发酵产物，在10％作用浓度下，即在2216E培养基中按照10％(v/v)添加CTF2022的发酵产物，培养12h后，其对溶藻弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、黄海西瓦氏菌、迟缓爱德华氏菌的抑菌效果显著，抑菌率分别达到92.4％、94.7％、93.6％、93.8％、92.5％，而利用对照组产朊假丝酵母ACCC20060的发酵产物，在10％(v/v)相同作用浓度下，培养12h后，其对溶藻弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、黄海西瓦氏菌、迟缓爱德华氏菌的抑菌率仅分别为60.4％、57.6％、64.9％、66.1％、58.2％。继续培养至24h，实验组产朊假丝酵母CTF2022的发酵产物(10％)抑菌率仍保持在90.4％、93.3％、92.7％、92.9％、91.4％，相反，对照组产朊假丝酵母ACCC20060的发酵产物(10％)抑菌率大幅降至30.6％、24.7％、33.7％、30.5％、21.0％。可见，本发明的耐冷酵母，即产朊假丝酵母CTF2022，在25℃低温环境下，使用其10％发酵产物对海参致病菌具有更强的生防拮抗作用。
实施例7：产朊假丝酵母发酵产物(1％作用浓度)对海参致病菌的作用
利用高速离心机将实施例5中获得的产朊假丝酵母CTF2022发酵菌液与产朊假丝酵母ACCC20060发酵菌液分别在15℃，8000rpm条件下离心10min，获得离心后的上清液，无菌条件下将上清液透过0.22μm滤膜，置于4℃环境冷藏备用。在100mL2216E液体培养基摇瓶中按1％比例分别添加产朊假丝酵母CTF2022上清液和产朊假丝酵母ACCC20060上清液，随后分别接入1mL新鲜的溶藻弧菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌、黄海希瓦氏菌以及哈维氏弧菌保藏液，于28℃，200rpm条件下发酵培养12～24h，设置一组空白对照组，记录菌株OD600的变化。抑菌率计算公式：每个处理设置三组平行实验，结果取平均值。产朊假丝酵母CTF2022为实验组，产朊假丝酵母ACCC20060为对照组，相关拮抗作用效果即抑菌率，如下表5所示。
表5产朊假丝酵母CTF2022与ACCC20060的15℃发酵产物对海参致病菌拮抗作用
结果表明，利用实验组产朊假丝酵母CTF2022的发酵产物，在1％作用浓度下，即在2216E培养基中按照1％(v/v)添加CTF2022的发酵产物，培养12h后，其对溶藻弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、黄海西瓦氏菌、迟缓爱德华氏菌的抑菌效果显著，抑菌率分别达到55.3％、61.3％、57.2％、58.9％、66.7％，继续培养至24h，实验组产朊假丝酵母CTF2022的发酵产物(1％)抑菌率降至30.6％、36.4％、28.7％、37.4％、42.7％。而利用对照组产朊假丝酵母ACCC20060的发酵产物，在1％(v/v)相同作用浓度下，培养12-24h后，其对溶藻弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、黄海西瓦氏菌、迟缓爱德华氏菌的抑菌率均＜5％。可见，本发明的耐冷酵母，即产朊假丝酵母CTF2022，在15℃低温环境下，使用其1％发酵产物对海参致病菌具有更强的生防拮抗作用。
所述的序列表如下：
GACTCAGTACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGAGGCTCTCAGCCCCCGAGTTGTAATTTGAAGATGGTGTTCTGGCGCCGGCCCCCTGTCTACGTTCCTTGGAACAGGACATCACAGAGGGTGAGAATCCCGTCTGGCGGGGCGGCCTGGCTCCGTGTAGAGCGCCATCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTGGATCAGACTTGGTGCTGTGCGAATAGCGGCTCTTCTTGGGCCGCCCACTCGCACTCCACCGGGCCAGCATCGGTTTGGGCGGCAAG

Claims (6)

1.一株适用于低温水产养殖的耐冷酵母，分离于大连地区海参人工养殖水体环境，命名为产朊假丝酵母(Candida utilis)CTF2022，保藏编号为：CCTCC NO.M 2022857。
2.权利要求1所述的产朊假丝酵母在低温环境下的生防拮抗的应用，其特征在于：所述生防拮抗针对的致病菌为溶藻弧菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌、黄海希瓦氏菌或哈维氏弧菌；所述的低温为15-25℃。
3.根据权利要求2所述的生防拮抗应用，其特征在于：添加使用1％-10％发酵菌剂，所述发酵菌剂的有效成分为产朊假丝酵母(Candida utilis)CTF2022及其发酵产物，或产朊假丝酵母(Candida utilis)CTF2022发酵菌液。
4.根据权利要求3所述的生防拮抗应用，其特征在于，所述的产朊假丝酵母(Candidautilis)CTF2022发酵温度为15-25℃，48-72h内发酵菌液有效活菌数≥109cfu/mL。
5.根据权利要求3或4所述的生防拮抗应用,其特征在于：所述的产朊假丝酵母(Candida utilis)CTF2022的发酵菌液制备，包括以下步骤：
(1)无菌条件下将产朊假丝酵母(Candida utilis)CTF2022保藏液稀释涂布于YPD平板培养基，30-37℃恒温静置培养24-48h后，使用无菌水收集平板培养基上真菌，制备真菌浓度108-1010个/mL的真菌悬液；
(2)在无菌条件下将上述步骤(1)中真菌悬液接种到液体种子培养基中，30-37℃，150-200rpm振荡培养24-48h，制备液体种子液；
(3)在无菌条件下，将上述步骤(2)中液体种子液按体积比5％～10％接入液体发酵培养基中，15-25℃，200rpm，通入无菌氮气发酵培养48-72h，得到发酵菌液，所得发酵菌液中产朊假丝酵母(Candida utilis)CTF2022有效活菌数≥109cfu/mL。
6.根据权利要求5所述的生防拮抗应用，其特征在于，所述种子培养基及发酵培养基的组成按质量百分比为：葡萄糖4％、酵母提取物1％、蛋白胨2％。
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