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CN115851496B - 一株耐低温生防芽孢杆菌及其水产致病菌拮抗应用 - Google Patents

一株耐低温生防芽孢杆菌及其水产致病菌拮抗应用 Download PDF

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CN115851496B
CN115851496B CN202211115074.0A CN202211115074A CN115851496B CN 115851496 B CN115851496 B CN 115851496B CN 202211115074 A CN202211115074 A CN 202211115074A CN 115851496 B CN115851496 B CN 115851496B
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bacillus subtilis
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ctb2021
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liquid
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吴又多
王国旭
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Dalian University of Technology
Ningbo Research Institute of Dalian University of Technology
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Dalian University of Technology
Ningbo Research Institute of Dalian University of Technology
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Abstract

本发明公开了一株耐低温生防芽孢杆菌及其水产致病菌拮抗应用，属于生物技术领域。本发明涉及的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CTB2021，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 2022856，保藏日期为2022年6月10日。该枯草芽孢杆菌分离于大连地区海参人工养殖水体环境，在15‑25℃下兼具良好的低温耐受与生防拮抗特性，发酵24‑96h有效活菌数≥1011cfu/mL。本发明的枯草芽孢杆菌CTB2021及其发酵产物可高效拮抗多种水产致病菌，具有明显的水产应用优势。

Description

一株耐低温生防芽孢杆菌及其水产致病菌拮抗应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株耐低温生防芽孢杆菌及其水产致病菌拮抗应用。
背景技术
我国水产养殖产品种类丰富，以海参为例，其具有高蛋白、低糖低脂等特点，参体蛋白含量高达80％，且富含必需氨基酸及脂肪酸、维生素、酸性粘多糖、皂苷和胶原蛋白等有效活性成分，具有显著的抗肿瘤、抗凝血、抗氧化、降血压、降血脂、增强免疫等功效。截止2019年，我国海参养殖面积达到24.67万公顷，年产量17.17万吨，养殖规模居世界第一，直接经济收益超过300亿元。然而，海参养殖易受到假单胞菌、灿烂弧菌、霉菌等致病菌侵害，发病多见腐皮综合征、烂胃病、霉菌病等病害，传统防病治病手段多使用四环素类、磺胺类、喹诺酮类、酰胺醇类、大环内酯类抗生素。2020年，我国全面禁止使用抗生素，需每年组织开展兽药残留监控和动物源细菌耐药性监测。因而，亟待开发绿色替抗及高效水产养殖技术，满足海参等水产动物的快速生长发育与增产增重需要，同时提高成活率、减少发病率，已成为国外内研究学者和养殖业者的关注热点。
目前，海参饲用益生菌主要使用芽孢杆菌、乳杆菌、酵母等微生物。枯草芽孢杆菌是一种广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁衍的革兰氏阳性菌，可形成内生抗逆芽孢，适宜生长温度在37℃左右，pH在7.0左右。枯草芽孢杆菌代谢途径复杂，能够合成包括酶类、细菌素类、多肽类、有机酸、维生素在内的多种次级代谢产物，主要用于生产枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、B族维生素等抑菌活性物质与生长必须调节剂。其在海参等水产养殖行业具有重要应用，对养殖水体及机体内弧菌、大肠杆菌和杆状病毒等致病菌具有抑制作用，分泌复合降解酶系可分解有毒有害物质，促进水产动物免疫器官发育，增强机体免疫力，提高营养吸收利用。
现有枯草芽孢杆菌菌种适宜发酵温度大多为30-37℃，而海参等水产养殖适宜温度范围为15-25℃，普遍使用或报道的枯草芽孢杆菌菌种低温耐受性不足，无法在低温环境保持较高活力的生长代谢及生防拮抗特性，不能很好的满足水产养殖需求。中国专利CN114107120A公开了一种由乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌组成的复合菌群制剂，其中芽孢杆菌在温度30～37℃、pH5.0～6.0、转速120～200rpm、发酵时间36～48h情况下，芽孢杆菌活菌数CFU达6.0×1010。中国专利CN113773996A公开了一种饲用枯草芽孢杆菌高密度制备方法，以2％～10％(v/v)接入发酵培养基，在温度25～42℃条件下，发酵20～48h后有效活菌数为5.8×1010cfu/g。可见，目前枯草芽孢杆菌培养及应用环境局限于25℃以上，并不适用于低温水产养殖环境。因而，兼顾低温耐受性与致病菌拮抗特性，筛选优良的枯草芽孢杆菌菌种资源，以适应低温环境养殖特点，提高枯草芽孢杆菌细胞生长速率、有效活菌数及其拮抗作用活性产物浓度，对于提高低温环境下益生菌活力及其生物效价、提升低温水产养殖产能尤为重要。本发明中涉及的一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CTB2021，在15～25℃低温环境下，24-96h内发酵有效活菌数≥1011cfu/mL，能够高效拮抗多种海参致病菌，具有重要实际应用意义和规模化生产价值。
发明内容
为解决现有枯草芽孢杆菌菌种在海参等低温水产养殖环境中(15-25℃)，由于低温耐受性不足，造成细胞生长速率缓慢、有效活菌数低，进而影响菌体生长与生防拮抗效果的实际问题，本发明提供了一株耐低温生防芽孢杆菌及其水产致病菌拮抗应用。
本发明一方面提供了一株耐低温生防芽孢杆菌，分离于大连地区海参人工养殖水体环境，经鉴定分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CTB2021，该菌株已于2022年6月10日在中国典型培养物保藏中心保藏(地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号，邮编430072)，保藏编号为：CCTCC M 2022856。
进一步地，所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CTB2021在低温环境下的水产致病菌拮抗应用。
上述应用中，所述的水产养殖致病菌，包括溶藻弧菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌、黄海希瓦氏菌或哈维氏弧菌等。
进一步地，所述的耐低温生防芽孢杆菌，即枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CTB2021的水产致病菌拮抗应用方法，即添加使用1％-10％发酵菌剂，所述发酵菌剂的有效成分为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CTB2021及其发酵产物，或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CTB2021发酵菌液。
进一步地，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CTB2021发酵温度为15-25℃，24-96h内发酵菌液有效活菌数≥1011cfu/mL。
进一步地，所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CTB2021发酵菌液制备方法，包括以下步骤：
(1)无菌条件下将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CTB2021保藏液稀释涂布于平板培养基，30-37℃恒温静置培养24-36h后，使用无菌水收集平板培养基上孢子，制备孢子浓度108-1010个/mL的孢子悬液；
(2)在无菌条件下将上述步骤(1)中孢子悬液接种到液体种子培养基中，30-37℃，150-200rpm振荡培养24-48h，制备液体种子液；
(3)在无菌条件下，将上述步骤(2)中液体种子液按体积比5％～10％接入液体发酵培养基中，15-25℃，150-200rpm，通入无菌空气发酵培养24-96h，得到发酵菌液，所得发酵菌液中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CTB2021有效活菌数≥1011cfu/mL。
进一步地，所述种子培养基及发酵培养基的组成按质量百分比为：葡萄糖4％、牛肉膏2％、酵母粉1％、蛋白胨1％、氯化钠0.5％、七水硫酸镁0.06％、磷酸二氢钾0.2％；用50％氨水溶液将培养基pH调至6.5-7.0。
本发明所提供的耐低温生防芽孢杆菌，即枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CTB2021，在15-25℃培养温度下具有更强的低温耐受性，生长更快且发酵有效活菌数更高，液体发酵24-96h即可实现有效活菌≥1011cfu/mL，较对照组枯草芽孢杆菌发酵有效活菌数提高了5-10倍。此外，本发明枯草芽孢杆菌CTB2021及其发酵产物、或枯草芽孢杆菌CTB2021发酵菌液对低温水产养殖致病菌如溶藻弧菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌、黄海希瓦氏菌和哈维氏弧菌等具有高效的生防拮抗作用。本发明中枯草芽孢杆菌CTB2021具有的潜在应用优势在于，能够显著提高低温环境下益生菌活力及其生物效价、提升低温水产养殖产能。本发明提供的耐低温生防芽孢杆菌及其发酵菌剂一方面丰富了优势菌种资源与种类，拓宽了水产养殖制剂产品的功能化发展，另一方面兼顾菌株低温耐受及生防拮抗特性，为绿色水产养殖发展提供了新思路。
附图说明
图1枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CTB2021菌落形态
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步说明本发明内容，但不应该理解为对本发明的限制。若未特别说明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CTB2021的分离
本发明的耐低温生防芽孢杆菌，即枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CTB2021分离于大连地区海参人工养殖水体环境，对采集样品进行梯度稀释涂布后分离获得的。具体操作步骤为：
a.采集海参养殖区不同深度水体及底部污泥，采样环境温度为15-25℃，采样量为1mL或1g，加至含有99mL无菌水的三角瓶中，于15-25℃，200rpm条件下振荡培养120min。
b.用移液枪进行梯度稀释(10-3、10-4、10-5)，取100μL稀释液涂布于LB平板培养基上，每个稀释浓度涂布15个培养皿，5个一组分别于15℃、20℃、25℃培养箱中培养24-96h。每天观察形成的芽孢杆菌菌落生长情况，挑取培养时间内最早形成的芽孢杆菌单菌落分别进行稀释划线分离培养，转接到LB培养基上划线纯化与保藏。
所述LB培养基组分组成为(g/L)：蛋白胨10、酵母提取物5、氯化钠10、琼脂7。其余为水补足至1000mL，调pH到7.2-7.4，121℃高压湿热灭菌15min。
其中，在按不同稀释浓度所涂布的全部培养皿上，培养24-96h即出现生长最快的芽孢杆菌单菌落，纯化保藏后将该菌株命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CTB2021。
实施例2：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CTB2021的鉴定
菌株形态特征如下：在培养温度15-25℃条件下，在LB固体培养基上培养24-96h后，形成菌落成圆形或不规则状，菌落表面粗糙，成污白色或微黄色，可以起皱，内生孢子0.8×1.5—1.8μm，游离孢子表面着色弱。根据《伯杰氏细菌鉴定手册(第八版)》判断菌株CTB2021具有典型芽孢杆菌属形态特征。
提取上述分离并纯化得到的菌株基因组DNA，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行16s rDNA测序分析(测序结果详见序列表)，通过NCBI数据库中BLAST同源比对，选取同源性较高的枯草芽孢杆菌及其序列，用ClustalX1.81软件进行多序列比对分析，同时结合菌落形态特征，初步鉴定分离纯化菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，已于2022年6月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CTB2021，以下叙述简称枯草芽孢杆菌CTB2021或CTB2021，保藏编号为CCTCC M 2022856，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号。
实施例3：25℃条件下枯草芽孢杆菌发酵菌液的制备及其有效活菌数的测定
1.实验组枯草芽孢杆菌CTB2021发酵菌液的制备
利用实施例2中获得的枯草芽孢杆菌CTB2021，作为实验组，依次进行孢子悬液制备、种子培养、发酵培养实验，具体操作步骤如下：
a.无菌条件下将枯草芽孢杆菌CTB2021保藏液稀释涂布于平板培养基，30-37℃恒温静置培养24-36h后，使用无菌水收集平板培养基上孢子，制备孢子浓度108-1010个/mL的孢子悬液；
b.在无菌条件下将上述步骤a中孢子悬液接种到液体种子培养基中，30-37℃，200rpm振荡培养24-36h，制备液体种子液；
c.在无菌条件下，将上述步骤b中液体种子液按体积比10％接入液体发酵培养基中，25℃，200rpm，通入无菌空气发酵培养24-48h，即得到枯草芽孢杆菌CTB2021发酵菌液。
种子培养基及发酵培养基的组成按质量百分比为：葡萄糖4％、牛肉膏2％、酵母粉1％、蛋白胨1％、氯化钠0.5％、七水硫酸镁0.06％、磷酸二氢钾0.2％；用50％氨水溶液将培养基pH调至6.5-7.0。
2.对照组枯草芽孢杆菌LCCC10049的发酵液制备(对照例1)
对照组枯草芽孢杆菌LCCC10049(以下叙述或简称LCCC10049)，购买于辽宁省微生物菌种保藏中心，其最适培养温度为30-37℃，依次进行孢子悬液制备、种子培养、发酵培养对照实验，具体操作步骤如下：
a.无菌条件下将枯草芽孢杆菌LCCC10049保藏液稀释涂布于平板培养基，30-37℃培养24-36h后，使用无菌水收集平板培养基上孢子，制备孢子浓度108-1010个/mL的孢子悬液；
b.在无菌条件下将上述步骤a中孢子悬液接种到液体种子培养基中，30-37℃，200rpm振荡培养24-36h，制备液体种子液；
c.在无菌条件下，将上述步骤b中液体种子液按体积比10％接入液体发酵培养基中，25℃，200rpm，通入无菌空气发酵培养24-48h，即得到枯草芽孢杆菌LCCC10049发酵菌液。
种子培养基或发酵培养基的组成按质量百分比为：葡萄糖4％、牛肉膏2％、酵母粉1％、蛋白胨1％、氯化钠0.5％、七水硫酸镁0.06％、磷酸二氢钾0.2％；用50％氨水溶液将培养基pH调至6.5-7.0。
3.枯草芽孢杆菌有效活菌数的测定
在无菌条件下，分别取上述步骤c中24h与48h培养后的枯草芽孢杆菌CTB2021发酵菌液和枯草芽孢杆菌LCCC10049发酵菌液，用移液枪进行梯度稀释((10-1、10-2、10-3…10-7、10-8、10-9、10-10)，取100μL稀释液涂布于LB平板培养基，每个稀释浓度涂布5个培养皿，25℃培养箱中培养2-3天后进行平板菌落计数，结果取平均值，如表1所示。
表1枯草芽孢杆菌发酵菌液(25℃)有效活菌数
结果表明，实验组枯草芽孢杆菌CTB2021在25℃条件下，具有更高发酵有效活菌数水平，发酵24h-48h即可实现有效活菌数≥1012cfu/mL。如在25℃条件下，发酵至24h，对照组枯草芽孢杆菌LCCC10049发酵有效活菌数为2×1011cfu/mL，实验组枯草芽孢杆菌CTB2021发酵有效活菌数为1×1012cfu/mL，较对照组提高5倍；如在25℃条件下，发酵至48h，对照组枯草芽孢杆菌LCCC10049发酵有效活菌数为4.5×1011cfu/mL，实验组枯草芽孢杆菌CTB2021发酵有效活菌数为3×1012cfu/mL，较对照组提高6.7倍。可见，本发明的耐低温生防芽孢杆菌，即枯草芽孢杆菌CTB2021，在25℃低温环境兼具良好生长活性与低温耐受特性。
实施例4：20℃条件下枯草芽孢杆菌发酵菌液的制备及其有效活菌数的测定
1.实验组枯草芽孢杆菌CTB2021发酵菌液的制备
利用实施例2中获得的枯草芽孢杆菌，作为实验组，依次进行孢子悬液制备、种子培养、发酵培养实验，具体操作步骤如下：
a.无菌条件下将枯草芽孢杆菌CTB2021保藏液稀释涂布于平板培养基，30-37℃恒温静置培养24-36h后，使用无菌水收集平板培养基上孢子，制备孢子浓度108-1010个/mL的孢子悬液；
b.在无菌条件下将上述步骤a中孢子悬液接种到液体种子培养基中，30-37℃，200rpm振荡培养24-36h，制备液体种子液；
c.在无菌条件下，将上述步骤b中液体种子液按体积比10％接入液体发酵培养基中，20℃，200rpm，通入无菌空气发酵培养48-72h，即得到枯草芽孢杆菌CTB2021发酵菌液。
种种子培养基及发酵培养基的组成按质量百分比为：葡萄糖4％、牛肉膏2％、酵母粉1％、蛋白胨1％、氯化钠0.5％、七水硫酸镁0.06％、磷酸二氢钾0.2％；用50％氨水溶液将培养基pH调至6.5-7.0。
2.对照组枯草芽孢杆菌LCCC10049的发酵液制备(对照例2)
对照组枯草芽孢杆菌LCCC10049(以下叙述或简称LCCC10049)，购买于辽宁省微生物菌种保藏中心，其最适培养温度为30-37℃，依次进行孢子悬液制备、种子培养、发酵培养对照实验，具体操作步骤如下：
a.无菌条件下将枯草芽孢杆菌LCCC10049保藏液稀释涂布于平板培养基，30-37℃培养24-36h后，使用无菌水收集平板培养基上孢子，制备孢子浓度108-1010个/mL的孢子悬液；
b.在无菌条件下将上述步骤a中孢子悬液接种到液体种子培养基中，30-37℃，200rpm振荡培养24-36h，制备液体种子液；
c.在无菌条件下，将上述步骤b中液体种子液按体积比10％接入液体发酵培养基中，20℃，200rpm，通入无菌空气发酵培养48-72h，即得到枯草芽孢杆菌LCCC10049发酵菌液。
种子培养基或发酵培养基的组成按质量百分比为：葡萄糖4％、牛肉膏2％、酵母粉1％、蛋白胨1％、氯化钠0.5％、七水硫酸镁0.06％、磷酸二氢钾0.2％；用50％氨水溶液将培养基pH调至6.5-7.0。
3.枯草芽孢杆菌有效活菌数的测定
在无菌条件下，分别取上述步骤c中48h与72h培养后的枯草芽孢杆菌CTB2021发酵菌液和枯草芽孢杆菌LCCC10049发酵菌液，用移液枪进行梯度稀释(10-1、10-2、10-3…10-7、10-8、10-9、10-10)，取100μL稀释液涂布于LB平板培养基，每个稀释浓度涂布5个培养皿，20℃培养箱中培养2-3天后进行平板菌落计数，结果取平均值，如表2所示。
表2枯草芽孢杆菌发酵菌液(20℃)有效活菌数
结果表明，实验组枯草芽孢杆菌CTB2021在20℃条件下，具有更高发酵有效活菌数水平，发酵48h-72h即可实现有效活菌数≥1011cfu/mL。如在20℃条件下，发酵至48h，对照组枯草芽孢杆菌LCCC10049发酵有效活菌数为1×1011cfu/mL，实验组枯草芽孢杆菌CTB2021发酵有效活菌数为7×1011cfu/mL，较对照组提高7倍；如在20℃条件下，发酵至72h，对照组枯草芽孢杆菌LCCC10049发酵有效活菌数为3×1011cfu/mL，实验组枯草芽孢杆菌CTB2021发酵有效活菌数为2×1012cfu/mL，较对照组提高6.7倍。可见，本发明的耐低温生防芽孢杆菌，即枯草芽孢杆菌CTB2021，在20℃低温环境兼具良好生长活性与低温耐受特性。
实施例5：15℃条件下枯草芽孢杆菌发酵菌液的制备及其有效活菌数的测定
1.实验组枯草芽孢杆菌CTB2021发酵菌液的制备
利用实施例2中获得的枯草芽孢杆菌CTB2021，作为实验组，依次进行孢子悬液制备、种子培养、发酵培养实验，具体操作步骤如下：
a.无菌条件下将枯草芽孢杆菌CTB2021保藏液稀释涂布于平板培养基，30-37℃恒温静置培养24-36h后，使用无菌水收集平板培养基上孢子，制备孢子浓度108-1010个/mL的孢子悬液；
b.在无菌条件下将上述步骤a中孢子悬液接种到液体种子培养基中，30-37℃，200rpm振荡培养24-36h，制备液体种子液；
c.在无菌条件下，将上述步骤b中液体种子液按体积比10％接入液体发酵培养基中，15℃，200rpm，通入无菌空气发酵培养72-96h，即得到枯草芽孢杆菌CTB2021发酵菌液。
种子培养基或发酵培养基的组成按质量百分比为：葡萄糖4％、牛肉膏2％、酵母粉1％、蛋白胨1％、氯化钠0.5％、七水硫酸镁0.06％、磷酸二氢钾0.2％；用50％氨水溶液将培养基pH调至6.5-7.0。
2.对照组枯草芽孢杆菌LCCC10049的发酵液制备(对照例3)
对照组枯草芽孢杆菌LCCC10049(以下叙述或简称LCCC10049)，购买于辽宁省微生物菌种保藏中心，其最适培养温度为30-37℃，依次进行孢子悬液制备、种子培养、发酵培养对照实验，具体操作步骤如下：
a.无菌条件下将枯草芽孢杆菌LCCC10049保藏液稀释涂布于平板培养基，30-37℃培养24-36h后，使用无菌水收集平板培养基上孢子，制备孢子浓度108-1010个/mL的孢子悬液；
b.在无菌条件下将上述步骤a中孢子悬液接种到液体种子培养基中，30-37℃，200rpm振荡培养24-36h，制备液体种子液；
c.在无菌条件下，将上述步骤b中液体种子液按体积比10％接入液体发酵培养基中，15℃，200rpm，通入无菌空气发酵培养72-96h，即得到枯草芽孢杆菌LCCC10049发酵菌液。种子培养基或发酵培养基的组成按质量百分比为：葡萄糖4％、牛肉膏2％、酵母粉1％、蛋白胨1％、氯化钠0.5％、七水硫酸镁0.06％、磷酸二氢钾0.2％；用50％氨水溶液将培养基pH调至6.5-7.0。
3.枯草芽孢杆菌有效活菌数的测定
在无菌条件下，分别取上述步骤c中72h与96h培养后的枯草芽孢杆菌CTB2021发酵菌液和枯草芽孢杆菌LCCC10049发酵菌液，用移液枪进行梯度稀释((10-1、10-2、10-3…10-7、10-8、10-9、10-10)，取100μL稀释液涂布于LB平板培养基，每个稀释浓度涂布5个培养皿，15℃培养箱中培养2-3天后进行平板菌落计数，结果取平均值，如表3所示。
表3枯草芽孢杆菌发酵菌液(15℃)有效活菌数
结果表明，实验组枯草芽孢杆菌CTB2021在15℃条件下，具有更高发酵有效活菌数水平，发酵72h-96h即可实现有效活菌数≥1011cfu/mL。如在15℃条件下，发酵至72h，对照组枯草芽孢杆菌LCCC10049发酵有效活菌数为1×1011cfu/mL，实验组枯草芽孢杆菌CTB2021发酵有效活菌数为5×1011cfu/mL，较对照组提高5倍；如在15℃条件下，发酵至96h，对照组枯草芽孢杆菌LCCC10049发酵有效活菌数为2×1011cfu/mL，实验组枯草芽孢杆菌CTB2021发酵有效活菌数为2×1012cfu/mL，较对照组提高10倍。可见，本发明的耐低温生防芽孢杆菌，即枯草芽孢杆菌CTB2021，在15℃低温环境兼具良好生长活性与低温耐受特性。
实施例6：枯草芽孢杆菌发酵产物(10％作用浓度)拮抗海参致病菌
利用高速离心机将实施例3中获得的枯草芽孢杆菌CTB2021发酵菌液与枯草芽孢杆菌LCCC10049发酵菌液分别在25℃，8000rpm条件下离心10min，获得离心后的上清液，无菌条件下将上清液透过0.22μm滤膜，置于4℃环境冷藏备用。在100mL 2216E液体培养基摇瓶中按10％比例分别添加枯草芽孢杆菌CTB2021上清液和枯草芽孢杆菌LCCC10049上清液，随后分别接入1mL新鲜的溶藻弧菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌、黄海希瓦氏菌以及哈维氏弧菌保藏液，于28℃，200rpm条件下发酵培养24h，设置一组空白对照组，记录菌株OD600的变化。抑菌率计算公式：每个处理设置三组平行实验，结果取平均值。枯草芽孢杆菌CTB2021为实验组，枯草芽孢杆菌LCCC10049为对照组，相关拮抗作用效果即抑菌率，如下表4所示。
表4枯草芽孢杆菌CTB2021与LCCC10049的25℃发酵产物对海参致病菌拮抗作用
结果表明，利用实验组枯草芽孢杆菌CTB2021的发酵产物，在10％作用浓度下，即在2216E培养基中按照10％(v/v)添加CTB2021的发酵产物，培养12h后，其对溶藻弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、黄海西瓦氏菌、迟缓爱德华氏菌的抑菌效果显著，抑菌率分别达到95.7％、98.2％、94.6％、92.7％、93.5％，而利用对照组枯草芽孢杆菌LCCC10049的发酵产物，在10％(v/v)相同作用浓度下，培养12h后，其对溶藻弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、黄海西瓦氏菌、迟缓爱德华氏菌的抑菌率仅分别为42.9％、78.0％、43.3％、43.6％、44.0％。继续培养至24h，实验组枯草芽孢杆菌CTB2021的发酵产物(10％)抑菌率仍保持在93.4％、97.3％、92.9％、92.3％、91.9％，相反，对照组枯草芽孢杆菌LCCC10049的发酵产物(10％)抑菌率大幅降至30.6％、66.7％、16.7％、20.1％、22.4％。可见，本发明的耐低温生防芽孢杆菌，即枯草芽孢杆菌CTB2021，在25℃低温环境下，使用其10％发酵产物对海参致病菌具有更强的生防拮抗作用。
实施例7：枯草芽孢杆菌发酵产物(1％作用浓度)拮抗海参致病菌
利用高速离心机将实施例5中获得的枯草芽孢杆菌CTB2021发酵菌液与枯草芽孢杆菌LCCC10049发酵菌液分别在15℃，8000rpm条件下离心10min，获得离心后的上清液，无菌条件下将上清液透过0.22μm滤膜，置于4℃环境冷藏备用。在100mL2216E液体培养基摇瓶中按1％比例分别添加枯草芽孢杆菌CTB2021上清液和枯草芽孢杆菌LCCC10049上清液，随后分别接入1mL新鲜的溶藻弧菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌、黄海希瓦氏菌以及哈维氏弧菌保藏液，于28℃，200rpm条件下发酵培养12～24h，设置一组空白对照组，记录菌株OD600的变化。抑菌率计算公式：每个处理设置三组平行实验，结果取平均值。枯草芽孢杆菌CTB2021为实验组，枯草芽孢杆菌LCCC10049为对照组，相关拮抗作用效果即抑菌率，如下表5所示。
表5枯草芽孢杆菌CTB2021与LCCC10049的15℃发酵产物对海参致病菌拮抗作用
结果表明，利用实验组枯草芽孢杆菌CTB2021的发酵产物，在1％作用浓度下，即在2216E培养基中按照1％(v/v)添加CTB2021的发酵产物，培养12h后，其对溶藻弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、黄海西瓦氏菌、迟缓爱德华氏菌的抑菌效果显著，抑菌率分别达到82.3％、87.5％、80.8％、75.6％、77.4％，而利用对照组枯草芽孢杆菌LCCC10049的发酵产物，在1％(v/v)相同作用浓度下，培养12h后，其对溶藻弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、黄海西瓦氏菌、迟缓爱德华氏菌的抑菌率仅分别为8.9％、14.7％、7.7％、8.4％、9.3％。继续培养至24h，实验组枯草芽孢杆菌CTB2021的发酵产物(1％)抑菌率降低至60.4％、69.7％、58.6％、57.2％、60.1％，仍具有一定的抑菌效果；相反，对照组枯草芽孢杆菌LCCC10049的发酵产物(1％)抑菌率均＜5％，抑菌效果消失。可见，本发明的耐低温生防芽孢杆菌，即枯草芽孢杆菌CTB2021，在15℃低温环境下，使用其1％发酵产物对海参致病菌具有更强的拮抗作用。
所述的序列表如下：
CTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTC

Claims (6)

1.一株耐低温生防芽孢杆菌，分离于大连地区海参人工养殖水体环境，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CTB2021，保藏编号为：CCTCC M 2022856。
2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在低温环境下的水产致病菌拮抗中的应用，所述的水产致病菌，包括溶藻弧菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌、黄海希瓦氏菌或哈维氏弧菌。
3.根据权利要求2所述的水产致病菌拮抗中的应用，其特征在于：添加使用1％-10％发酵菌剂，所述发酵菌剂的有效成分为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CTB2021及其发酵产物，或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CTB2021发酵菌液。
4.根据权利要求3所述的水产致病菌拮抗中的应用，其特征在于，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CTB2021发酵温度为15-25℃，24-96h内发酵菌液有效活菌数≥1011cfu/mL。
5.根据权利要求3或4所述的水产致病菌拮抗中的应用，其特征在于：所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CTB2021的发酵菌液制备，包括以下步骤：
(1)无菌条件下将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CTB2021保藏液稀释涂布于平板培养基，30-37℃恒温静置培养24-36h后，使用无菌水收集平板培养基上孢子，制备孢子浓度108-1010个/mL的孢子悬液；
(2)在无菌条件下将上述步骤(1)中孢子悬液接种到液体种子培养基中，30-37℃，150-200rpm振荡培养24-48h，制备液体种子液；
(3)在无菌条件下，将上述步骤(2)中液体种子液按体积比5％～10％接入液体发酵培养基中，15-25℃，150-200rpm，通入无菌空气发酵培养24-96h，得到发酵菌液，所得发酵菌液中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CTB2021有效活菌数≥1011cfu/mL。
6.根据权利要求5所述的水产致病菌拮抗中的应用，其特征在于，所述液体种子培养基或液体发酵培养基的组成按质量百分比为：葡萄糖4％、牛肉膏2％、酵母粉1％、蛋白胨1％、氯化钠0.5％、七水硫酸镁0.06％、磷酸二氢钾0.2％；用50％氨水溶液将培养基pH调至6.5-7.0。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN103834596A (zh) * 2014-03-10 2014-06-04 上海海洋大学 一种枯草芽孢杆菌shou003、抗弧菌蛋白及其制备方法与应用
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