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CN116144555A - 一种拮抗肉鸡肠道损伤的发酵饲料添加剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种拮抗肉鸡肠道损伤的发酵饲料添加剂及其制备方法和应用 Download PDF

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CN116144555A
CN116144555A CN202310288842.0A CN202310288842A CN116144555A CN 116144555 A CN116144555 A CN 116144555A CN 202310288842 A CN202310288842 A CN 202310288842A CN 116144555 A CN116144555 A CN 116144555A
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CN
China
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fermented feed
feed additive
bacterial liquid
preparation
antagonizing
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刘晓兰
郑喜群
樊磊
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Qiqihar University
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Qiqihar University
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Abstract

本发明提供了一种拮抗肉鸡肠道损伤的发酵饲料添加剂及其制备方法和应用，属于饲料添加剂技术领域。本发明将膨化玉米蛋白粉结合其他原料作为发酵底物，并且添加酸性蛋白酶和复合菌剂协同发酵，得到的发酵饲料添加剂中谷氨酰胺含量可达到总可溶性蛋白含量的8.6％。本发明发酵饲料添加剂可以显著提高肉鸡生长性能，增加小肠相对长度，促进小肠绒毛发育；缓解由LPS引起的肉鸡小肠相对长度的降低，小肠绒毛形态的损伤及空肠促炎因子IL‑6和TNF‑α含量的增加，同时增加抗炎因子IL‑10的含量，能够达到拮抗肉鸡肠道损伤的效果。

Description

一种拮抗肉鸡肠道损伤的发酵饲料添加剂及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于饲料添加剂技术领域，尤其涉及一种拮抗肉鸡肠道损伤的发酵饲料添加剂及其制备方法和应用。
背景技术
肠道作为肉鸡最大的免疫器官，在抵抗病原体入侵、促进营养消化吸收和维持机体健康等方面起着非常关键的作用，一旦肠道健康状况出现问题，鸡的生命和生产活动将受到巨大影响。在“饲料无抗”的大背景下，肉鸡养殖面临肠道疾病患病率增加、生产性能下降等问题。因此，有必要研发一种具有改善肉鸡肠道完整性、拮抗肉鸡肠道炎症持续发生、提高生长性能的绿色、安全、高效的饲料添加剂。
谷氨酰胺(Gln)和谷氨酰胺二肽常被用作肠内营养补充剂来维持肠道健康。研究表明，谷氨酰胺结合肽具有促进肉鸡肠道发育、改善肠道形态、保护肠道免疫屏障和促进肉鸡生长等功能。玉米蛋白粉是家禽中常用的蛋白饲料原料，其谷氨酰胺含量约占谷蛋白含量的三分之一，是谷氨酰胺结合肽的优良载体。由于玉米蛋白粉难溶于水，直接作为饲料使用时，谷氨酰胺肽的功能不能发挥出来。研究表明，采用酶解法水解玉米蛋白粉能有效地释放玉米谷氨酰胺肽维持肠道健康的功能。虽然酶解产物得率高，但酶解条件严苛，酶制剂用量大，操作过程复杂，生成本高，难以在实际生产中推广应用。目前没有发现关于膨化玉米蛋白粉制备富含谷氨酰胺肽饲料添加剂的研究。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种拮抗肉鸡肠道损伤的发酵饲料添加剂及其制备方法和应用，可以显著提高肉鸡生长性能，增加小肠相对长度，促进小肠绒毛发育，达到拮抗肉鸡肠道损伤的效果。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种用于制备拮抗肉鸡肠道损伤发酵饲料添加剂的复合菌剂，所述复合菌剂由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YY-12的菌液、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)YY-14的菌液和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)YY-7的菌液制备而成；所述枯草芽孢杆菌YY-12保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.24696；所述酿酒酵母YY-14保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24698；所述植物乳杆菌YY-7保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.24691。
优选的，所述枯草芽孢杆菌YY-12菌液的制备方法包括：枯草芽孢杆菌按0.5-1.5％接种量接种于LB培养基中，于35-40℃、转速150-200r/min条件下，发酵14-18h；所述酿酒酵母YY-14菌液的制备方法包括：酿酒酵母YY-14按0.5-1.5％接种量接种于YPD培养基中，于32-38℃、转速150-200r/min条件下，发酵14-18h；所述植物乳杆菌YY-7菌液的制备方法包括：植物乳杆菌YY-7按0.5-1.5％接种量接种于MRS培养基中，于35-40℃发酵18-20h。
更优选的，所述枯草芽孢杆菌YY-12菌液的菌体数量为(1.0-2.0)×108CFU/mL，所述酿酒酵母YY-14菌液的菌体数量为(1.0-2.0)×107CFU/mL，所述植物乳杆菌YY-7菌液的菌体数量为(1.0-3.0)×107CFU/mL；所述枯草芽孢杆菌YY-12菌液、酿酒酵母YY-14菌液和植物乳杆菌YY-7菌液的体积比为(1-3):(1-3):(1-3)。
本发明还提供了一种拮抗肉鸡肠道损伤的发酵饲料添加剂，包括以下重量份的原料：膨化玉米蛋白粉3-5份、麸皮0.5-2份、豆粕0.5-2份、玉米胚芽粕3-5份、玉米浆0.5-2份和权利要求1-3任意一项所述的复合菌剂0.05-0.15份。
本发明还提供了上述发酵饲料添加剂的制备方法，包括：将膨化玉米蛋白粉、麸皮、豆粕、玉米胚芽粕、玉米浆混合得到预发酵饲料，接种复合菌剂，添加酸性蛋白酶，于30-35℃密封发酵5-7d，即得所述发酵饲料添加剂；所述膨化玉米蛋白粉的制备方法包括：将玉米蛋白粉于150-160℃下挤压膨化5-10s。
优选的，按照所述预发酵饲料质量添加所述酸性蛋白酶，所述酸性蛋白酶的添加量为20-30U/g。
优选的，所述预发酵饲料的含水量为40-50％。
本发明还提供了上述发酵饲料添加剂在制备拮抗肉鸡肠道损伤产品中的应用。
本发明还提供了上述发酵饲料添加剂在替换豆粕饲料方面的应用。
优选的，所述发酵饲料添加剂的添加量为15％-30％。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明将玉米蛋白粉膨化，可提高饲料添加剂中谷氨酰胺的含量，通过酸性蛋白酶和复合菌剂协同发酵饲料，酸性蛋白酶的加入首先将膨化玉米蛋白粉中的大分子蛋白质进行部分分解，为后期微生物发酵利用和微生物分泌的蛋白酶提供更多的分解位点，提高对膨化玉米蛋白粉中蛋白质的分解利用，更高释放具有谷氨酰胺的小肽，得到的发酵饲料添加剂中谷氨酰胺含量可达到总可溶性蛋白含量的8.6％。本发明发酵饲料添加剂可以显著提高肉鸡生长性能，增加小肠相对长度，促进小肠绒毛发育；缓解由LPS引起的肉鸡小肠相对长度的降低，小肠绒毛形态的损伤及空肠促炎因子IL-6和TNF-α含量的增加，同时增加抗炎因子IL-10的含量，能够达到拮抗肉鸡肠道损伤的效果。
生物保藏信息：
本发明所述枯草芽孢杆菌YY-12，拉丁文为Bacillus subtilis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24696，保藏日期为2022年04月18日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明所述酿酒酵母YY-14，拉丁文为Saccharomyces cerevisiae，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24698，保藏日期为2022年04月18日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明所述植物乳杆菌YY-7，拉丁文为Lactobacillusplantarum，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24691，保藏日期为2022年04月18日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
附图说明
图1为不同日粮饲料对肉鸡体重的影响；
图2为不同日粮饲料对肉鸡日增重的影响；
图3为不同日粮饲料对肉鸡日采食量的影响；
图4为不同日粮饲料对肉鸡料重比的影响；
图5为不同日粮饲料对肉鸡小肠绒毛高度的影响；
图6为不同日粮饲料对肉鸡小肠隐窝深度的影响；
图7为不同日粮饲料对肉鸡小肠绒隐比的影响；
图8为不同日粮饲料对肉鸡小肠相对长度的影响；
图9为不同日粮饲料对肉鸡空肠组织IL-10含量的影响；
图10为不同日粮饲料对肉鸡空肠组织IL-6含量的影响；
图11为不同日粮饲料对肉鸡空肠组织TNF-α含量的影响。
具体实施方式
本发明提供了一种用于制备拮抗肉鸡肠道损伤发酵饲料添加剂的复合菌剂，由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YY-12的菌液、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YY-14的菌液和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)YY-7的菌液制备而成；所述枯草芽孢杆菌YY-12保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.24696；所述酿酒酵母YY-14保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24698；所述植物乳杆菌YY-7保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.24691。
在本发明中，所述枯草芽孢杆菌YY-12菌液的制备方法优选包括：枯草芽孢杆菌按0.5-1.5％接种量接种于LB培养基中，于35-40℃、转速150-200r/min条件下，发酵14-18h；所述接种量更优选为1％；所述发酵温度更优选为37℃，转速更优选为180r/min；所述枯草芽孢杆菌YY-12菌液的菌体数量为(1.0-2.0)×108CFU/mL，更优选为1.5×108CFU/mL；所述LB培养基优选包括：胰蛋白胨10g、酵母浸出物5g、氯化钠10g，蒸馏水定容至1000mL，121℃蒸汽灭菌15min。
在本发明中，所述酿酒酵母YY-14菌液的制备方法优选包括：酿酒酵母YY-14按0.5-1.5％接种量接种于YPD培养基中，于32-38℃、转速150-200r/min条件下，发酵14-18h；所述接种量更优选为1％；所述发酵温度更优选为35℃，转速更优选为180r/min；所述酿酒酵母YY-14菌液的菌体数量为(1.0-2.0)×107CFU/mL，更优选为1.6×107CFU/mL；所述YPD液体培养基优选包括：酵母膏10g、蛋白胨20g溶解于900mL蒸馏水中，121℃蒸汽灭菌15min；葡萄糖20g溶解于100mL蒸馏水中，121℃蒸汽灭菌15min；将灭菌后的两种溶液混合均匀。
在本发明中，所述植物乳杆菌YY-7菌液的制备方法优选包括：植物乳杆菌YY-7按0.5-1.5％接种量接种于MRS培养基中，于35-40℃发酵18-20h；所述接种量更优选为1％；所述发酵温度更优选为37℃；所述植物乳杆菌YY-7菌液的菌体数量为2.0-3.0×107CFU/mL，更优选为2.2×107CFU/mL。所述MRS液体培养基优选包括：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母粉5g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸二铵2g、醋酸钠5g、葡萄糖20g、吐温80 1mL、七水合硫酸镁0.58g、四水合硫酸锰0.25g，pH值调至6.2-6.6，蒸馏水定容至1000mL，121℃蒸汽灭菌15min。
在本发明中，所述枯草芽孢杆菌YY-12菌液的菌体数量优选为(1.0-2.0)×108CFU/mL，所述酿酒酵母YY-14菌液的菌体数量优选为(1.0-2.0)×107CFU/mL，所述植物乳杆菌YY-7菌液的菌体数量优选为(1.0-3.0)×107CFU/mL；所述枯草芽孢杆菌YY-12菌液、酿酒酵母YY-14菌液和植物乳杆菌YY-7菌液的体积比优选为(1-3):(1-3):(1-3)，更优选为2:2:2。
在本发明中，所述枯草芽孢杆菌YY-12产酶能力强，可以产生多种消化酶如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等来增加饲料中消化酶活性，促进动物对营养物质的吸收；所述酿酒酵母YY-14具有完整的胞内、胞外酶系统，对蛋白质消化利用率高有利于提高饲料转化率，同时产生香味物质，提高动物适口性；所述植物乳杆菌YY-7分泌多种酸类，如乳酸等，具有较强的杀菌能力，同时降低饲料pH，延长饲料货架期。并且，枯草芽孢杆菌YY-12和酵母菌YY-14繁殖速度快，消耗饲料中氧气，造成饲料中低氧环境，有利于植物乳杆菌YY-7繁殖；植物乳杆菌YY-7利用可以利用枯草芽孢杆菌YY-12和酵母菌YY-14产生的氨基酸、维生素和丙酮酸盐等其他物质，而植物乳杆菌YY-7的代谢产物又为酿酒酵母菌YY-14提供了能量来源。三种菌种协同作用提高对底物的利用效率，提高产品的蛋白质含量和营养功能。
本发明还提供了一种拮抗肉鸡肠道损伤的发酵饲料添加剂，包括以下重量份的原料：膨化玉米蛋白粉3-5份、麸皮0.5-2份、豆粕0.5-2份、玉米胚芽粕3-5份、玉米浆0.5-2份和上述的复合菌剂0.05-0.15份。
本发明还提供了上述发酵饲料添加剂的制备方法，包括：将膨化玉米蛋白粉、麸皮、豆粕、玉米胚芽粕、玉米浆混合得到预发酵饲料，接种复合菌剂，添加酸性蛋白酶，于30-35℃密封发酵5-7d，即得所述发酵饲料添加剂。
在本发明中，所述膨化玉米蛋白粉的制备方法优选包括：将玉米蛋白粉于150-160℃下挤压膨化5-10s，所述温度更优选为155℃，时间更优选为5s。在所述挤压膨化后还优选包括粉碎；所述粉碎的粒径优选为30-50目，更优选为40目。玉米蛋白粉经过挤压膨化过程，蛋白质的分子结构发生改变，分子间氢键、二硫键部分断裂，导致蛋白质变性，蛋白质的消化率明显提高，易于谷氨酰胺肽的释放。
本发明中，按照所述预发酵饲料质量添加所述酸性蛋白酶，所述酸性蛋白酶的添加量优选为20-30U/g，更优选为25U/g。本发明所述酸性蛋白酶购自南宁东恒华道生物科技有限公司。
在本发明中，所述预发酵饲料的含水量优选为40-50％，更优选为45％；所述发酵的pH值自然。
本发明密封发酵为生料固态发酵。本发明对密封发酵的设备没有特殊限定，采用本领域常规设备即可。作为一种可实施的方式，密封发酵采用单向阀透气袋。
本发明酸性蛋白酶的加入首先将膨化玉米蛋白粉中的大分子蛋白质进行部分分解，为后期微生物发酵利用和微生物分泌的蛋白酶提供更多的分解位点，提高对膨化玉米蛋白粉中蛋白质的分解利用，更高释放具有谷氨酰胺的小肽。
本发明采用菌酶协同发酵能够将酶制剂和微生物功效有机结合，两者协同发挥作用高效降解饲料原料，提高饲料有效成分含量，具有产物得率高、操作简单、价格低廉的优点。因此，采用菌酶协同法制备玉米蛋白粉发酵饲料，不仅可以降解玉米蛋白粉大分子蛋白释放谷氨酰胺肽，其产物还可以直接饲喂动物，提高饲料利用率。此外，菌酶协同发酵可以减少酶制剂的用量，从而解决酶解制备谷氨酰胺肽生产成本高的问题，其产物是一种绿色环保、经济节约型新产品。
本发明还提供了所述发酵饲料添加剂在制备拮抗肉鸡肠道损伤产品中的应用。本发明发酵饲料添加剂可以显著提高肉鸡生长性能，增加小肠相对长度，促进小肠绒毛发育；缓解由LPS引起的肉鸡小肠相对长度的降低，小肠绒毛形态的损伤及空肠促炎因子IL-6和TNF-α含量的增加，同时增加抗炎因子IL-10的含量，能够达到拮抗肉鸡肠道损伤的效果。
本发明还提供了上述制备方法得到的饲料添加剂在替换豆粕饲料方面的应用。
在本发明中，所述发酵饲料添加剂的添加量优选为15％-30％。
本发明对未提及原料的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规市售产品即可。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
菌种的筛选
1、枯草芽孢杆菌YY-12的筛选(筛选降解玉米蛋白粉能力强的菌株)
将实验室分离保藏的芽孢杆菌菌株分别进行梯度稀释，取10-3,10-4和10-5涂布于脱脂乳平板，37℃静置培养48h进行菌体初筛。将水解透明圈较大的菌株点种于玉米蛋白粉筛选培养基进行复筛，将玉米蛋白粉筛选培养基上水解透明圈较大的菌株进行鉴定。
脱脂乳筛选培养基配方：10％脱脂乳粉，2％琼脂；
玉米蛋白粉筛选培养基配方：玉米蛋白粉3％，琼脂2％。
2、酿酒酵母YY-14的筛选(筛选菌体蛋白大的菌株)
将实验室分离保藏的酿酒酵母菌株分别进行梯度稀释，取10-3,10-4和10-5涂布于YPD培养基，37℃静置培养48h。将能够在YPD固体培养基上良好生长的菌体接入YPD液体培养基，于37℃，180r/min培养24h，12000r/min离心，去上清液，反复三次用无菌水重悬菌体后，将得到的菌体烘干后称重，将干重较大的菌株进行鉴定。
3、植物乳杆菌YY-7的筛选(筛选产酸能力强的菌株)
将实验室分离保藏的乳酸菌菌株分别进行梯度稀释，取10-3,10-4和10-5涂布于MRS-CaCO3固体培养基，37℃静置培养48h。取水解透明圈较大的菌株进行鉴定。
MRS-CaCO3固体培养基配方：MRS培养基，1％CaCO3，2％琼脂。
实施例2
复合菌剂的制备
(1)枯草芽孢杆菌YY-12的培养
LB液体培养基：胰蛋白胨10g、酵母浸出物5g、氯化钠10g、pH自然，蒸馏水1000mL，121℃蒸汽灭菌15min。
枯草芽孢杆菌YY-12按1％接种量接种于LB培养基中，发酵温度37℃，摇床转速180r/min，发酵时间18h。菌体数量为1.5×108CFU/mL，得到菌液。
(2)酿酒酵母YY-14的培养
YPD液体培养基：酵母膏10g、蛋白胨20g溶解于900mL蒸馏水中，121℃蒸汽灭菌15min；葡萄糖20g溶解于100mL蒸馏水中，121℃蒸汽灭菌15min；将灭菌后的两种溶液混合均匀。
酿酒酵母YY-14按1％接种量接种于YPD培养基中，发酵温度35℃，摇床转速180r/min，发酵时间16h。菌体数量为1.6×107CFU/mL，得到菌液。
(3)植物乳杆菌YY-7的培养
MRS液体培养基：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母粉5g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸二铵2g、醋酸钠5g、葡萄糖20g、吐温80 1mL、七水合硫酸镁0.58g、四水合硫酸锰0.25g，pH调至6.2-6.6，定容至1000mL，121℃蒸汽灭菌15min。
植物乳杆菌YY-7按1％接种量接种于MRS培养基中，发酵温度37℃，静置培养18h。菌体数量为2.2×107CFU/mL，得到菌液。
(4)混合
将步骤(1)-(3)的枯草芽孢杆菌YY-12菌液，酿酒酵母YY-14菌液和植物乳杆菌YY-7菌液按照1:1:1比例等体积混合均匀，得到复合菌种菌液。
实施例3
膨化玉米蛋白粉的制备
将玉米蛋白粉于155℃下挤压膨化8s，粉碎过40目筛后，得到膨化玉米蛋白粉。
实施例4
将4kg实施例3膨化玉米蛋白粉、1kg麸皮、1kg豆粕、4kg玉米胚芽和1kg玉米浆混合补水至含水量为40％，接种100g实施例2得到的复合菌剂，按照所述预发酵饲料质量添加酸性蛋白酶，添加量为25U/g，混合置于单向阀透气袋中，于32℃密封发酵6d，即得发酵饲料添加剂。
实施例5
将5kg实施例3膨化玉米蛋白粉、2kg麸皮、2kg豆粕、5kg玉米胚芽和2kg玉米浆混合补水至含水量为50％，接种150g实施例2得到的复合菌剂，按照所述预发酵饲料质量添加酸性蛋白酶，添加量为25U/g，混合置于单向阀透气袋中，于35℃密封发酵5d，即得发酵饲料添加剂。
实施例6
将3kg实施例3膨化玉米蛋白粉、0.5kg麸皮、0.5kg豆粕、3kg玉米胚芽和0.5kg玉米浆混合补水至含水量为30％，接种80g实施例2得到的复合菌剂，按照所述预发酵饲料质量添加酸性蛋白酶，添加量为25U/g，混合置于单向阀透气袋中，于30℃密封发酵7d，即得发酵饲料添加剂。
实施例7
发酵饲料添加剂指标的检测
分别检测实施例4发酵前后可溶性蛋白和谷氨酰胺的含量。
可溶性蛋白含量采用福林-酚法；谷氨酰胺含量测定采用BTI([二(三氟乙酰氧基)碘]苯)保护法。
经检测，本发明实施例4制备得到的发酵饲料添加剂相对于发酵前，可溶性蛋白由81.2mg/g提高到140.5mg/g；谷氨酰胺含量由1.2mg/g提高到12.1mg/g，发酵饲料添加剂中谷氨酰胺含量可达到总可溶性蛋白含量的8.6％。
实施例8
发酵饲料添加剂动物实验
1、动物实验设计
实验设计分为6组，分为空白对照LPS-组(普通日粮)，空白对照+LPS组，15％豆粕替代LPS-组，15％豆粕替代+LPS组，30％豆粕替代LPS-组，30％豆粕替代+LPS组。选取144只1日龄爱拔益加(AA)肉鸡分为6个处理，每个处理4个重复，每个重复6只鸡。
商品日粮(正大肉510H肉小鸡饲料批准文号：Q/HFCT01-2019)饲喂7d，第8d后按照分组日粮进行预饲喂，第15d开始正式饲喂。三个处理于实验第14、16、18、20d时，从每组选取12只肉仔鸡按500μg/kg体重LPS的剂量腹腔注射LPS溶液，另外从每组选取12只鸡注射等量生理盐水。饲养实验在齐齐哈尔大学南校区鸡舍进行，为期28d，分为未注射LPS期(非应激期，1-14d)、注射LPS期(应激期，15-21d)，恢复期(22-28d)。肉仔鸡采用笼养方式进行饲养，自由采食和饮水，鸡舍温度在实验前三天保持33℃，之后每周下调3℃，按照日光进行光照控制。
表1动物实验设计与分组
Figure BDA0004141420920000101
注：15-21d应激期各组饲料见表2；发酵饲料添加剂为本发明实施例4制备得到的发酵饲料添加剂。
2、动物实验日粮组成及营养水平
肉鸡日粮根据美国NRC(1994)标准和中华人民共和国农业行业标准NY/T 33-2004鸡饲养标准进行能量和蛋白配制。日粮饲料中各营养成分组成和营养水平如表2所示。
表2各组日粮组成及营养水平(风干基础)
Figure BDA0004141420920000111
注：预混料为每千克日粮提供：VA6141.5 IU；VD31789 U；VE7.80 mg；VB10.66 mg；VB23.95 mg；VB62.01 mg；VB120.01 mg；烟酸18.06mg；泛酸钙6.75mg；叶酸0.59mg；生物素0.07mg；胆碱332.28mg；铁60.91mg；铜6.0mg；锌65.8mg；锰62.5mg；碘0.6mg；硒0.20mg。
3、爱拔益加(AA)肉鸡生长性能的测定
记录1日龄初始体重，于第14、21和28d对各处理组进行结料，并对肉鸡进行称重。
计算平均日增重(Average daily gain，ADG)、平均日采食量(Average dailyfeed intake，ADFI)及耗料增重比(Feed：Gain，F/G)。
其中，ADG＝(末重-初重)/天数；ADFI＝(饲料消耗量/肉鸡数量)/天数；F/G＝ADFI/ADG。
具体结果见表3和图1-图4。
表3各组饲料对肉鸡生长性能的影响
Figure BDA0004141420920000121
Figure BDA0004141420920000131
由表3和图1-图4可以看出，日粮中添加15％和30％发酵饲料添加剂可以提高肉鸡生长性能。与普通日粮组相比，15％和30％豆粕替代组肉鸡生长全期(1-28d)的体重、日增重和日采食量显著增加，15％豆粕替代组的体重、日增重和日采食量高于30％豆粕替代组。以上结果说明添加本发明的发酵饲料添加剂可以提高肉鸡的生长性能。
4、爱拔益加(AA)肉鸡小肠绒毛形态的测定
动物肠道屏障完整性是肠道发挥正常生理功能的基础，肠道绒毛高度和隐窝深度是衡量肠道屏障健康的重要指标。
分别检测各组肉鸡肠道绒毛高度和隐窝深度，具体结果见表4及图5-图7。
具体检测方法为：分离肠道，取十二指肠、空肠和回肠中段一小块置于4％多聚甲醛溶液中固定，用于肉鸡肠道绒毛高度，隐窝深度的检测。
表4各组饲料对肉鸡肠道形态影响
Figure BDA0004141420920000132
Figure BDA0004141420920000141
由表4及图5-图7可知，与普通日粮组相比，15％和30％豆粕替代组28d的肉鸡十二指肠绒毛高度增加141.1μm和79.5μm，空肠绒毛高度增加134.5μm和55.5μm，十二指肠隐窝深度降低21.9μm和30.0μm，空肠隐窝深度降低8.0μm和21.9μm，十二指肠绒隐比增加3.0和3.4，空肠绒隐比增加1.6和3.6。以上研究结果表明，日粮中添加15％和30％发酵饲料添加剂可以促进肉鸡小肠绒毛发育。注射LPS导致肉鸡十二指肠、空肠、回肠绒毛高度和绒隐比降低，十二指肠、空肠隐窝深度增加。LPS处理后，空白对照组肉鸡十二指肠隐窝深度增加53.2μm，30％豆粕替代组增加17.5μm，15％替代组未发生变化；空白对照组肉鸡十二指肠绒隐比降低4.1，15％替代组和30％替代组分别降低1.3和3.4。以上结果表明，日粮中添加15％和30％发酵饲料添加剂能够缓解由LPS引起的肉鸡肠道绒毛形态的损伤。
5、爱拔益加(AA)肉鸡小肠相对长度的测定
分别检测各组肉鸡小肠相对长度，具体结果见表5和图8。
小肠相对长度的检测方法为：分离肠道，用卷尺测量肉鸡肠道长度；肉鸡小肠相对长度(cm/100g BW)＝小肠长度(cm)/体重(100g)。
表5各组饲料对肉鸡小肠相对长度的影响
Figure BDA0004141420920000151
由表5及图8可以看出，与普通日粮组相比，15％和30％豆粕替代组肉鸡28d的小肠相对长度分别增加1.9和2.1cm/100g BW，15％和30％豆粕替代组之间差异不显著。注射LPS引起了肉鸡小肠相对长度的降低，普通日粮组、15％豆粕替代组及30％豆粕替代组组肉鸡小肠相对长度分别降低了1.6、0.9和0.2cm/100g BW，与普通日粮组相比，15％和30％豆粕替代组降低程度较少，且30％豆粕替代组优于15％豆粕替代组。以上结果表明，饲喂15％和30％发酵饲料添加剂可以增加肉鸡小肠相对长度，促进肉鸡小肠发育，同时可以缓解LPS引起的小肠长度的减少。
6、爱拔益加(AA)肉鸡空肠组织炎症因子的测定
炎症因子是机体炎症反应的重要信号分子，肠炎的严重程度与其表达水平密切相关。
分别检测各组肉鸡空肠组织炎症因子的含量，具体结果见由表6和图9-图11。
空肠组织炎症因子含量的检测方法为：取肉鸡空肠中段，生理盐水去除肠道食糜，研磨后用ELISA定量试剂盒测定炎症因子含量。
表6各组饲料对肉鸡炎症因子含量的影响
Figure BDA0004141420920000161
由表6及图9-图11可知，与LPS处理组相比，普通日粮组、15％豆粕替代组和30％豆粕替代组的IL-6分别增加7.2、4.6和4.4pg/mL，TNF-α分别增加20.5、10.9和15.1pg/mL；LPS处理后，普通日粮组抗炎因子IL-10显著降低，15％和30％豆粕替代组抗炎因子显著增加；以上结果说明日粮中添加15％和30％发酵饲料添加剂能够增加肉鸡空肠组织抗炎因子的含量，缓解LPS引起的空肠组织促炎因子含量的增加。研究结果表明，饲喂15％和30％发酵饲料添加剂能够在细胞水平上缓解LPS引起的空肠炎症反应，维持小肠健康。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于制备拮抗肉鸡肠道损伤发酵饲料添加剂的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂由枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)YY-12的菌液、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)YY-14的菌液和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)YY-7的菌液制备而成；
所述枯草芽孢杆菌YY-12保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.24696；
所述酿酒酵母YY-14保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.24698；
所述植物乳杆菌YY-7保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.24691。
2.根据权利要求1所述复合菌剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌YY-12菌液的制备方法包括：枯草芽孢杆菌按0.5-1.5％接种量接种于LB培养基中，于35-40℃、转速150-200r/min条件下，发酵14-18h；
所述酿酒酵母YY-14菌液的制备方法包括：酿酒酵母YY-14按0.5-1.5％接种量接种于YPD培养基中，于32-38℃、转速150-200r/min条件下，发酵14-18h；
所述植物乳杆菌YY-7菌液的制备方法包括：植物乳杆菌YY-7按0.5-1.5％接种量接种于MRS培养基中，于35-40℃发酵18-20h。
3.根据权利要求1或2所述的复合菌剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌YY-12菌液的菌体数量为(1.0-2.0)×108CFU/mL，所述酿酒酵母YY-14菌液的菌体数量为(1.0-2.0)×107CFU/mL，所述植物乳杆菌YY-7菌液的菌体数量为(1.0-3.0)×107CFU/mL；所述枯草芽孢杆菌YY-12菌液、酿酒酵母YY-14菌液和植物乳杆菌YY-7菌液的体积比为(1-3):(1-3):(1-3)。
4.一种拮抗肉鸡肠道损伤的发酵饲料添加剂，其特征在于，包括以下重量份的原料：膨化玉米蛋白粉3-5份、麸皮0.5-2份、豆粕0.5-2份、玉米胚芽粕3-5份、玉米浆0.5-2份和权利要求1-3任意一项所述的复合菌剂0.05-0.15份。
5.权利要求4所述发酵饲料添加剂的制备方法，其特征在于，包括：将膨化玉米蛋白粉、麸皮、豆粕、玉米胚芽粕、玉米浆混合得到预发酵饲料，接种复合菌剂，添加酸性蛋白酶，于30-35℃密封发酵5-7d，即得所述发酵饲料添加剂；所述膨化玉米蛋白粉的制备方法包括：将玉米蛋白粉于150-160℃下挤压膨化5-10s。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，按照所述预发酵饲料质量添加所述酸性蛋白酶，所述酸性蛋白酶的添加量为20-30U/g。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述预发酵饲料的含水量为40-50％。
8.权利要求4所述发酵饲料添加剂或权利要求5-7任意一项所述制备方法得到的发酵饲料添加剂在制备拮抗肉鸡肠道损伤产品中的应用。
9.权利要求4所述发酵饲料添加剂或权利要求5-7任意一项所述制备方法得到的发酵饲料添加剂在替换豆粕饲料方面的应用。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述发酵饲料添加剂的添加量为15％-30％。
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