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CN115569115B - 一种同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂及其制备方法与应用 - Google Patents

一种同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂及其制备方法与应用 Download PDF

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CN115569115B CN202211235322.5A CN202211235322A CN115569115B CN 115569115 B CN115569115 B CN 115569115B CN 202211235322 A CN202211235322 A CN 202211235322A CN 115569115 B CN115569115 B CN 115569115B
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Abstract

本发明涉及一种同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂及其制备方法与应用，属于医药技术领域。为解决二甲双胍口服生物利用度低，纳米化后包封效率低、稳定性差的问题，并为肺纤维化治疗提供一种新方案。本发明纳米制剂的组分包括全氟化碳、二甲双胍或其盐、磷脂、表面活性剂和水相介质。本发明提供的脂质纳米制剂形态规则、稳定性良好，二甲双胍或其盐的包封率达到70％以上，雾化前后理化性质稳定，小动物吸入流畅。体外实验证明了同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂具有良好的生物相容性，以及协助穿透粘膜屏障的作用；体内实验证实了其对经典的肺纤维化小鼠模型具有良好的治疗效果，同时降低了给药量，减少药物不良作用。

Description

一种同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂及其制备 方法与应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂及其制备方法与应用。
背景技术
特发性肺纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一种进行性的、最终可致命的呼吸系统疾病，涉及异常活化的肺上皮细胞，其产生的细胞介质可以促进成纤维细胞的迁移、增殖以及分化为活跃的肌成纤维细胞。这些特殊的成纤维细胞灶分泌过多的细胞外基质(ECM)，主要成分是胶原，从而导致纤维化瘢痕和肺结构破坏。当肺纤维化患者肺部功能严重不全时，会发生呼吸困难，通过吸氧治疗一方面可以缓解患者的喘憋情况，另一方面还可以缓解心肺功能。然而目前IPF除肺移植外尚无有效的治疗手段，而肺移植手术不仅具有一定的风险，对于患者本身的基础状态也有较高的要求，另外手术费用也较为昂贵，因此大大限制了其应用范围。临床上有效的治疗IPF的药物有两种，分别为吡非尼酮和尼达尼布，然而吡非尼酮有肝肾功能损害、晕眩以及光过敏等副作用，尼达尼布则可使患者出现肝酶升高、腹泻等不良反应，这在一定程度上影响了药物的临床应用。
盐酸二甲双胍是一种水溶性的经典双胍类口服降糖药，早在1957年在英国被正式应用于临床。近年来有大量研究结果表明，二甲双胍除了具有降糖作用外，还有抗衰、抗炎、抗肿瘤等功效。半衰期短，生物利用度低是二甲双胍制剂普遍存在的问题，因为药物通过静脉注射或口服方式进入体内，往往会在全身循环过程中造成损失，抵达作用部位时产生的药效不够，若加大药物初始剂量则容易导致全身毒性累积增加。
全氟碳化合物又称全氟化碳，具有极高的氧溶解度和良好的生物相容性，在相同氧分压下，全氟化碳的载氧能力大约是水和血浆的20-25倍，这种高载氧能力使其在临床研究中被开发用于血液替代品、肿瘤氧合以及器官保存。全氟化碳也具有易获取、氧亲和性高和化学性质稳定等特点，并在新生儿呼吸窘迫的治疗上获得了美国食品和药品监督管理局批准。此外全氟化碳还能够有效穿透粘液屏障的阻碍，协助纳米药物有效递送至病灶部位。但是由于全氟化碳是一种极其惰性的液体，而二甲双胍易溶解于水，用同一脂质递送载体将两种物质负荷在一起，具有较大的技术难度，可能会导致共包覆于脂质纳米制剂中的二甲双胍或其盐含量较低，脂质纳米制剂的稳定性较差，无法实现理想的递送能力和治疗效果。
发明内容
为解决二甲双胍口服生物利用度低，纳米化后包封效率低、稳定性差的问题，并为肺纤维化治疗提供一种新方案，本发明提供了一种可经雾化吸入使用，同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂及其制备方法与应用。
本发明的技术方案：
一种同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂，组分包括全氟化碳、二甲双胍或其盐、磷脂、表面活性剂和水相介质，其中所述全氟化碳重量份为1～2份，所述二甲双胍或其盐重量份为5～10份，所述磷脂重量份为45～65份，所述表面活性剂重量份为14～29份，所述水相介质与磷脂的体积质量比为10mL︰45～65mg。
进一步的，所述磷脂为卵磷脂、大豆磷脂、氢化大豆卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻磷脂酰胆碱、二油酰基卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、二棕榈酰磷脂酰甘油或二硬脂酰磷脂酰甘油。
进一步的，所述表面活性剂为甘油、明胶、胆固醇、L-半胱氨酸、山梨醇、泊洛沙姆、精氨酸、海藻酸钠、透明质酸、淀粉浆、聚乙二醇、壳聚糖、两性霉素B、维生素C、维生素E、聚胺或硬脂胺中的一种或多种的混合物。
进一步的，所述水相介质为蒸馏水，或者所述水相介质为蒸馏水与弱酸弱碱或其盐的组合，所述弱酸弱碱或其盐为枸橼酸、枸橼酸钠、磷酸三钠、醋酸铵或硫酸铵中的一种或几种。
一种同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、用水相介质中的蒸馏水配制二甲双胍或其盐的水溶液；按处方量配制水相介质中的水化液；
步骤二、将磷脂和表面活性剂溶于氯仿中，旋转蒸发成膜，将所得薄膜真空干燥过夜备用；
步骤三、将所述水化液加入步骤二所得薄膜中，25～45℃水浴超声震摇5～10min使所述薄膜水化；
步骤四、将全氟化碳加入步骤三所得水化体系，冰浴100～300W超声处理6min得到混悬溶液，4℃条件下透析8h备用；
步骤五、将二甲双胍或其盐的水溶液加入步骤四所得透析后的混悬液中，45～55℃共孵育15～30min，冷却后过膜挤压、透析纯化即得同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂。
一种同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、用水相介质蒸馏水配置二甲双胍或其盐的水溶液；
步骤二、将磷脂和表面活性剂溶于氯仿中，旋转蒸发成膜，将所得薄膜真空干燥过夜备用；
步骤三、将二甲双胍或其盐的水溶液加入步骤二所得薄膜中，25～45℃水浴超声震摇5～10min使所述薄膜水化；
步骤四、将全氟化碳加入步骤三所得水化体系，冰浴100～300W超声处理6min得到混悬溶液，过膜挤压、透析纯化即得同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂。
一种同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、用水相介质蒸馏水配置二甲双胍或其盐的水溶液；
步骤二、将磷脂和表面活性剂溶于50℃纯乙醇中，将所得溶液匀速注入二甲双胍溶液中；
步骤三、待步骤二搅拌体系中的乙醇挥发除尽后加入全氟化碳，冰浴100～300W超声处理6min得到混悬溶液，过膜挤压、透析纯化即得同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂。
一种同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂在制备用于治疗肺部纤维化的药物中的应用。
进一步的，所述用于治疗肺部纤维化的药物为呼吸道给药剂型，还含有药学上可接受的赋形剂。
进一步的，所述呼吸道给药剂型包括雾化吸入剂型、喷雾剂、气雾剂或粉雾剂。
本发明的有益效果：
本发明提供的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂具有良好的稳定性，二甲双胍或其盐的包封率达到70％以上。本发明脂质纳米制剂能够改善二甲双胍的释放性能，具有良好的药物缓释作用。
本发明制备的脂质纳米制剂具有良好的可吸入性，经呼吸道给药具有吸入流畅且良好的治疗效果。将本发明脂质纳米制剂经雾化吸入递送至博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型，证明了脂质纳米制剂对小鼠雾化吸入的适用性，以及对肺纤维化小鼠的治疗效果。相对于口服用二甲双胍商品药，本发明所得的脂质纳米制剂能够大大降低给药剂量，减少药物的全身循环和潜在的不良作用，具有良好的生物相容性。而相对于不含全氟化碳的二甲双胍脂质体，本发明所得的脂质体纳米制剂在体外动物疗效实验中，表现出更好的改善小动物生存状态和肺纤维化治疗效果。这可能是因为本发明脂质纳米制剂不仅具有良好的稳定性和可吸入性，而且携载的全氟化碳不仅能够携氧改善病灶部位的氧化应激水平，还能协助脂质纳米制剂穿透部分粘液屏障的阻碍，将二甲双胍有效递送至病灶部位，进一步增强二甲双胍对特发性肺纤维化的治疗效果。
附图说明
图1为本发明制备的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂的TEM图像；
图2为本发明制备的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂的DLS粒径分布图；
图3为本发明制备的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂连续四周检测所得粒径大小对比图；
图4为本发明制备的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂连续四周检测所得多分散系数PDI对比图；
图5为本发明制备的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂连续四周检测所得Zeta电位对比图；
图6为高效液相色谱仪测得的二甲双胍标准曲线；
图7为本发明制备的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂经人用雾化装置雾化后的粒径分布图；
图8为本发明制备的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂与二甲双胍在人工肺液中的释放效果对比图；
图9为本发明制备的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂和二甲双胍溶液、二甲双胍脂质体经黏膜渗透吸收率的对比图；
图10为不同稀释倍数的本发明制备的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂对A549细胞的影响结果对比图；
图11为体内动物实验中不同处理组小鼠20天生存曲线对比图；
图12为体内动物实验中不同处理组小鼠21天体重变化对比图；
图13为体内动物实验中不同处理组小鼠肺组织羟脯氨酸含量对比图；
图14为体内动物实验中不同处理组小鼠肺组织的免疫组化图像。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置，若未特别指明，本发明实施例中所用的原料等均可市售获得；若未具体指明，本发明实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
本实施例提供了一种同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂及其制备方法。
本实施例中脂质纳米制剂的组分包括全氟化碳、二甲双胍、磷脂、表面活性剂和水相介质，具体原料及组分为：浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL、大豆磷脂SPC 55mg、全氟化碳1mg、胆固醇15mg、泊洛沙姆9mg、浓度为150mM·L-1的硫酸铵溶液5mL。
本实施例脂质纳米制剂的制备方法包括如下步骤：
步骤一、按处方量分别配制浓度为150mM·L-1的硫酸铵溶液5mL和浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL；
步骤二、将大豆磷脂SPC 55mg、胆固醇15mg和泊洛沙姆9mg溶于氯仿中，旋转蒸发成膜，将所得薄膜真空干燥过夜备用；
步骤三、将硫酸铵溶液5mL加入步骤二所得薄膜中，45℃水浴超声震摇10min使所述薄膜水化；
步骤四、将全氟化碳1mg加入步骤三所得水化体系，冰浴200W超声处理6min得到混悬溶液，4℃条件下透析8h，去除体系中多余的硫酸铵，备用；
步骤五、将浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL加入步骤四所得透析后的混悬液中，55℃共孵育30min，冷却至室温后通过0.2μm薄膜来回挤压15次，透析纯化去除未包封的二甲双胍，即得同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂。
实施例2
本实施例提供了一种同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂及其制备方法。
本实施例中脂质纳米制剂的组分包括全氟化碳、二甲双胍或其盐、磷脂、表面活性剂和水相介质，具体原料及组分为：浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL、大豆磷脂SPC55mg、全氟化碳1mg、胆固醇15mg、泊洛沙姆9mg、浓度为300mM·L-1的枸橼酸缓冲液5mL。
本实施例脂质纳米制剂的制备方法包括如下步骤：
步骤一、按处方量分别配制浓度为300mM·L-1的枸橼酸缓冲液5mL和浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL；
步骤二、将大豆磷脂SPC 55mg、胆固醇15mg和泊洛沙姆9mg溶于氯仿中，旋转蒸发成膜，将所得薄膜真空干燥过夜备用；
步骤三、将枸橼酸缓冲液5mL加入步骤二所得薄膜中，45℃水浴超声震摇10min使所述薄膜水化；
步骤四、将全氟化碳1mg加入步骤三所得水化体系，冰浴200W超声处理6min得到混悬溶液，4℃条件下透析8h，去除体系中多余的枸橼酸或其盐，备用；
步骤五、将浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL加入步骤四所得透析后的混悬液中，55℃共孵育30min，冷却至室温后通过0.2μm薄膜来回挤压15次，透析纯化去除未包封的二甲双胍，即得同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂。
实施例3
本实施例提供了一种同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂及其制备方法。
本实施例中脂质纳米制剂的组分包括全氟化碳、二甲双胍或其盐、磷脂、表面活性剂和水相介质，具体原料及组分为：浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL、大豆磷脂SPC55mg、全氟化碳1mg、胆固醇15mg、泊洛沙姆9mg、浓度为300mM·L-1的醋酸铵溶液5mL。
本实施例脂质纳米制剂的制备方法包括如下步骤：
步骤一、按处方量分别配制浓度为300mM·L-1的醋酸铵溶液5mL和浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL；
步骤二、将大豆磷脂SPC 55mg、胆固醇15mg和泊洛沙姆9mg溶于氯仿中，旋转蒸发成膜，将所得薄膜真空干燥过夜备用；
步骤三、将醋酸铵溶液5mL加入步骤二所得薄膜中，45℃水浴超声震摇10min使所述薄膜水化；
步骤四、将全氟化碳1mg加入步骤三所得水化体系，冰浴200W超声处理6min得到混悬溶液，4℃条件下透析8h，去除体系中多余的醋酸铵，备用；
步骤五、将浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL加入步骤四所得透析后的混悬液中，55℃共孵育30min，冷却至室温后通过0.2μm薄膜来回挤压15次，透析纯化去除未包封的二甲双胍，即得同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂。
实施例4
本实施例提供了一种同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂及其制备方法。
本实施例中脂质纳米制剂的组分包括全氟化碳、二甲双胍或其盐、磷脂、表面活性剂和水相介质，具体原料及组分为：浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液10mL、大豆磷脂SPC65mg、全氟化碳1mg、胆固醇10mg、泊洛沙姆4mg。
本实施例脂质纳米制剂的制备方法包括如下步骤：
步骤一、按处方量配制浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液10mL；
步骤二、将大豆磷脂SPC 65mg、胆固醇10mg和泊洛沙姆4mg溶于氯仿中，旋转蒸发成膜，将所得薄膜真空干燥过夜备用；
步骤三、将二甲双胍溶液10mL加入步骤二所得薄膜中，45℃水浴超声震摇10min使所述薄膜水化；
步骤四、将全氟化碳1mg加入步骤三所得水化体系，冰浴200W超声处理6min得到混悬溶液，通过0.2μm薄膜来回挤压15次，透析纯化去除未包封的二甲双胍，即得同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂。
实施例5
本实施例提供了一种同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂及其制备方法。
本实施例中脂质纳米制剂的组分包括全氟化碳、二甲双胍或其盐、磷脂、表面活性剂和水相介质，具体原料及组分为：浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液10mL、大豆磷脂SPC55mg、全氟化碳1mg、胆固醇15mg、泊洛沙姆9mg。
本实施例脂质纳米制剂的制备方法包括如下步骤：
步骤一、按处方量配制浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液10mL；
步骤二、将大豆磷脂SPC 65mg、胆固醇10mg和泊洛沙姆4mg溶于50℃纯乙醇中，将所得溶液缓慢匀速注入45℃，60r.min-1磁力搅拌的二甲双胍溶液中；
步骤三、待步骤二搅拌体系中的乙醇挥发除尽后加入全氟化碳1mg，在冰浴条件下冰浴200W超声处理6min，通过0.2μm薄膜来回挤压15次，透析纯化去除未包封的二甲双胍，即得同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂。
实施例6
本实施例提供了一种同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂及其制备方法。
本实施例中脂质纳米制剂的组分包括全氟化碳、二甲双胍或其盐、磷脂、表面活性剂和水相介质，具体原料及组分为：浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL、卵磷脂EPC55mg、全氟化碳1mg、胆固醇15mg、泊洛沙姆9mg、浓度为150mM·L-1的硫酸铵溶液5mL。
本实施例脂质纳米制剂的制备方法包括如下步骤：
步骤一、按处方量分别配制浓度为150mM·L-1的硫酸铵溶液5mL和浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL；
步骤二、将卵磷脂EPC 55mg、胆固醇15mg和泊洛沙姆9mg溶于氯仿中，旋转蒸发成膜，将所得薄膜真空干燥过夜备用；
步骤三、将硫酸铵溶液5mL加入步骤二所得薄膜中，45℃水浴超声震摇10min使所述薄膜水化；
步骤四、将全氟化碳1mg加入步骤三所得水化体系，冰浴200W超声处理6min得到混悬溶液，4℃条件下透析8h，去除体系中多余的硫酸铵，备用；
步骤五、将浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL加入步骤四所得透析后的混悬液中，55℃共孵育30min，冷却至室温后通过0.2μm薄膜来回挤压15次，透析纯化去除未包封的二甲双胍，即得同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂。
实施例7
本实施例提供了一种同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂及其制备方法。
本实施例中脂质纳米制剂的组分包括全氟化碳、二甲双胍或其盐、磷脂、表面活性剂和水相介质，具体原料及组分为：浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL、二棕榈酰磷脂酰胆碱DPPC 50mg、全氟化碳1mg、胆固醇16mg、泊洛沙姆13mg、浓度为150mM·L-1的硫酸铵溶液5mL。
本实施例脂质纳米制剂的制备方法包括如下步骤：
步骤一、按处方量分别配制浓度为150mM·L-1的硫酸铵溶液5mL和浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL；
步骤二、将二棕榈酰磷脂酰胆碱DPPC 50mg、胆固醇16mg和泊洛沙姆13mg溶于氯仿中，旋转蒸发成膜，将所得薄膜真空干燥过夜备用；
步骤三、将硫酸铵溶液5mL加入步骤二所得薄膜中，45℃水浴超声震摇10min使所述薄膜水化；
步骤四、将全氟化碳1mg加入步骤三所得水化体系，冰浴200W超声处理6min得到混悬溶液，4℃条件下透析8h，去除体系中多余的硫酸铵，备用；
步骤五、将浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL加入步骤四所得透析后的混悬液中，55℃共孵育30min，冷却至室温后通过0.2μm薄膜来回挤压15次，透析纯化去除未包封的二甲双胍，即得同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂。
实施例8
本实施例提供了一种同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂及其制备方法。
本实施例中脂质纳米制剂的组分包括全氟化碳、二甲双胍或其盐、磷脂、表面活性剂和水相介质，具体原料及组分为：浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL、氢化大豆卵磷脂HSPC 55mg、全氟化碳1mg、胆固醇15mg、泊洛沙姆9mg、浓度为150mM·L-1的硫酸铵溶液5mL。
本实施例脂质纳米制剂的制备方法包括如下步骤：
步骤一、按处方量分别配制浓度为150mM·L-1的硫酸铵溶液5mL和浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL；
步骤二、将氢化大豆卵磷脂HSPC 55mg、胆固醇15mg和泊洛沙姆9mg溶于氯仿中，旋转蒸发成膜，将所得薄膜真空干燥过夜备用；
步骤三、将硫酸铵溶液5mL加入步骤二所得薄膜中，45℃水浴超声震摇10min使所述薄膜水化；
步骤四、将全氟化碳1mg加入步骤三所得水化体系，冰浴200W超声处理6min得到混悬溶液，4℃条件下透析8h，去除体系中多余的硫酸铵，备用；
步骤五、将浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL加入步骤四所得透析后的混悬液中，55℃共孵育30min，冷却至室温后通过0.2μm薄膜来回挤压15次，透析纯化去除未包封的二甲双胍，即得同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂。
实施例9
本实施例提供了一种同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂及其制备方法。
本实施例中脂质纳米制剂的组分包括全氟化碳、二甲双胍或其盐、磷脂、表面活性剂和水相介质，具体原料及组分为：浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL、氢化大豆卵磷脂HSPC 30mg和二棕榈酰磷脂酰乙醇胺DPPE 15mg、全氟化碳1mg、胆固醇15mg、泊洛沙姆9mg、浓度为150mM·L-1的硫酸铵溶液5mL。
本实施例脂质纳米制剂的制备方法包括如下步骤：
步骤一、按处方量分别配制浓度为150mM·L-1的硫酸铵溶液5mL和浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL；
步骤二、将氢化大豆卵磷脂HSPC 30mg、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺DPPE 15mg、胆固醇15mg和泊洛沙姆9mg溶于氯仿中，旋转蒸发成膜，将所得薄膜真空干燥过夜备用；
步骤三、将硫酸铵溶液5mL加入步骤二所得薄膜中，45℃水浴超声震摇10min使所述薄膜水化；
步骤四、将全氟化碳1mg加入步骤三所得水化体系，冰浴200W超声处理6min得到混悬溶液，4℃条件下透析8h，去除体系中多余的硫酸铵，备用；
步骤五、将浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL加入步骤四所得透析后的混悬液中，55℃共孵育30min，冷却至室温后通过0.2μm薄膜来回挤压15次，透析纯化去除未包封的二甲双胍，即得同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂。
实施例10
本实施例提供了一种同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂及其制备方法。
本实施例中脂质纳米制剂的组分包括全氟化碳、二甲双胍或其盐、磷脂、表面活性剂和水相介质，具体原料及组分为：浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL、氢化大豆卵磷脂HSPC 30mg和二棕榈酰磷脂酰乙醇胺DPPE 15mg、全氟化碳1mg、胆固醇15mg、泊洛沙姆9mg、浓度为150mM·L-1的硫酸铵溶液5mL。
本实施例脂质纳米制剂的制备方法包括如下步骤：
步骤一、按处方量分别配制浓度为150mM·L-1的硫酸铵溶液5mL和浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL；
步骤二、将氢化大豆卵磷脂HSPC 30mg、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺DPPE 15mg、胆固醇15mg和泊洛沙姆9mg溶于氯仿中，旋转蒸发成膜，将所得薄膜真空干燥过夜备用；
步骤三、将硫酸铵溶液5mL加入步骤二所得薄膜中，45℃水浴超声震摇10min使所述薄膜水化；
步骤四、将全氟化碳1mg加入步骤三所得水化体系，冰浴300W超声处理6min得到混悬溶液，4℃条件下透析8h，去除体系中多余的硫酸铵，备用；
步骤五、将浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL加入步骤四所得透析后的混悬液中，55℃共孵育30min，冷却至室温后通过0.2μm薄膜来回挤压15次，透析纯化去除未包封的二甲双胍，即得同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂。
实施例11
本实施例提供了一种同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂及其制备方法。
本实施例中脂质纳米制剂的组分包括全氟化碳、二甲双胍或其盐、磷脂、表面活性剂和水相介质，具体原料及组分为：浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL、氢化大豆卵磷脂HSPC 30mg和二棕榈酰磷脂酰乙醇胺DPPE 15mg、全氟化碳1mg、胆固醇15mg、泊洛沙姆9mg、浓度为150mM·L-1的硫酸铵溶液5mL。
本实施例脂质纳米制剂的制备方法包括如下步骤：
步骤一、按处方量分别配制浓度为150mM·L-1的硫酸铵溶液5mL和浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL；
步骤二、将氢化大豆卵磷脂HSPC 30mg、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺DPPE 15mg、胆固醇15mg和泊洛沙姆9mg溶于氯仿中，旋转蒸发成膜，将所得薄膜真空干燥过夜备用；
步骤三、将硫酸铵溶液5mL加入步骤二所得薄膜中，45℃水浴超声震摇10min使所述薄膜水化；
步骤四、将全氟化碳1mg加入步骤三所得水化体系，冰浴100W超声处理6min得到混悬溶液，4℃条件下透析8h，去除体系中多余的硫酸铵，备用；
步骤五、将浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL加入步骤四所得透析后的混悬液中，55℃共孵育30min，冷却至室温后通过0.2μm薄膜来回挤压15次，透析纯化去除未包封的二甲双胍，即得同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂。
实施例12
本实施例提供了一种同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂及其制备方法。
本实施例中脂质纳米制剂的组分包括全氟化碳、二甲双胍或其盐、磷脂、表面活性剂和水相介质，具体原料及组分为：浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL、氢化大豆卵磷脂HSPC 30mg和二棕榈酰磷脂酰乙醇胺DPPE 15mg、全氟化碳1mg、胆固醇15mg、泊洛沙姆9mg、浓度为150mM·L-1的硫酸铵溶液5mL。
本实施例脂质纳米制剂的制备方法包括如下步骤：
步骤一、按处方量分别配制浓度为150mM·L-1的硫酸铵溶液5mL和浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL；
步骤二、将氢化大豆卵磷脂HSPC 30mg、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺DPPE 15mg、胆固醇15mg和泊洛沙姆9mg溶于氯仿中，旋转蒸发成膜，将所得薄膜真空干燥过夜备用；
步骤三、将硫酸铵溶液5mL加入步骤二所得薄膜中，45℃水浴超声震摇10min使所述薄膜水化；
步骤四、将全氟化碳1mg加入步骤三所得水化体系，冰浴100W超声处理6min得到混悬溶液，4℃条件下透析8h，去除体系中多余的硫酸铵，备用；
步骤五、将浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL加入步骤四所得透析后的混悬液中，55℃共孵育15min，冷却至室温后通过0.2μm薄膜来回挤压15次，透析纯化去除未包封的二甲双胍，即得同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂。
实施例13
本实施例提供了一种同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂及其制备方法。
本实施例中脂质纳米制剂的组分包括全氟化碳、二甲双胍或其盐、磷脂、表面活性剂和水相介质，具体原料及组分为：浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL、氢化大豆卵磷脂HSPC 30mg和二棕榈酰磷脂酰乙醇胺DPPE 15mg、全氟化碳1mg、胆固醇15mg、泊洛沙姆9mg、浓度为150mM·L-1的硫酸铵溶液5mL。
本实施例脂质纳米制剂的制备方法包括如下步骤：
步骤一、按处方量分别配制浓度为150mM·L-1的硫酸铵溶液5mL和浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL；
步骤二、将氢化大豆卵磷脂HSPC 30mg、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺DPPE 15mg、胆固醇15mg和泊洛沙姆9mg溶于氯仿中，旋转蒸发成膜，将所得薄膜真空干燥过夜备用；
步骤三、将硫酸铵溶液5mL加入步骤二所得薄膜中，45℃水浴超声震摇10min使所述薄膜水化；
步骤四、将全氟化碳1mg加入步骤三所得水化体系，冰浴100W超声处理6min得到混悬溶液，4℃条件下透析8h，去除体系中多余的硫酸铵，备用；
步骤五、将浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL加入步骤四所得透析后的混悬液中，45℃共孵育30min，冷却至室温后通过0.2μm薄膜来回挤压15次，透析纯化去除未包封的二甲双胍，即得同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂。
实施例14
本实施例提供了一种同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂及其制备方法。
本实施例中脂质纳米制剂的组分包括全氟化碳、二甲双胍或其盐、磷脂、表面活性剂和水相介质，具体原料及组分为：浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL、氢化大豆卵磷脂HSPC 30mg和二棕榈酰磷脂酰乙醇胺DPPE 15mg、全氟化碳1mg、胆固醇15mg、泊洛沙姆9mg、浓度为300mM·L-1的醋酸铵溶液5mL。
本实施例脂质纳米制剂的制备方法包括如下步骤：
步骤一、按处方量分别配制浓度为300mM·L-1的醋酸铵溶液5mL和浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL；
步骤二、将氢化大豆卵磷脂HSPC 30mg、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺DPPE 15mg、胆固醇15mg和泊洛沙姆9mg溶于氯仿中，旋转蒸发成膜，将所得薄膜真空干燥过夜备用；
步骤三、将醋酸铵溶液5mL加入步骤二所得薄膜中，45℃水浴超声震摇10min使所述薄膜水化；
步骤四、将全氟化碳1mg加入步骤三所得水化体系，冰浴100W超声处理6min得到混悬溶液，4℃条件下透析8h，去除体系中多余的醋酸铵，备用；
步骤五、将浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL加入步骤四所得透析后的混悬液中，55℃共孵育30min，冷却至室温后通过0.2μm薄膜来回挤压15次，透析纯化去除未包封的二甲双胍，即得同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂。
实施例15
本实施例提供了一种同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂及其制备方法。
本实施例中脂质纳米制剂的组分包括全氟化碳、二甲双胍或其盐、磷脂、表面活性剂和水相介质，具体原料及组分为：浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL、氢化大豆卵磷脂HSPC 30mg和二棕榈酰磷脂酰乙醇胺DPPE 15mg、全氟化碳1mg、胆固醇15mg、泊洛沙姆9mg、浓度为300mM·L-1的枸橼酸缓冲液5mL。
本实施例脂质纳米制剂的制备方法包括如下步骤：
步骤一、按处方量分别配制浓度为300mM·L-1的枸橼酸缓冲液5mL和浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL；
步骤二、将氢化大豆卵磷脂HSPC 30mg、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺DPPE 15mg、胆固醇15mg和泊洛沙姆9mg溶于氯仿中，旋转蒸发成膜，将所得薄膜真空干燥过夜备用；
步骤三、将枸橼酸缓冲液5mL加入步骤二所得薄膜中，45℃水浴超声震摇10min使所述薄膜水化；
步骤四、将全氟化碳1mg加入步骤三所得水化体系，冰浴100W超声处理6min得到混悬溶液，4℃条件下透析8h，去除体系中多余的枸橼酸或其盐，备用；
步骤五、将浓度为10mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL加入步骤四所得透析后的混悬液中，55℃共孵育30min，冷却至室温后通过0.2μm薄膜来回挤压15次，透析纯化去除未包封的二甲双胍，即得同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂。
实施例16
本实施例提供了一种同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂及其制备方法。
本实施例中脂质纳米制剂的组分包括全氟化碳、二甲双胍或其盐、磷脂、表面活性剂和水相介质，具体原料及组分为：浓度为20mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL、氢化大豆卵磷脂HSPC 30mg和二棕榈酰磷脂酰乙醇胺DPPE 15mg、全氟化碳1mg、胆固醇15mg、泊洛沙姆9mg、浓度为300mM·L-1的醋酸铵溶液5mL。
本实施例脂质纳米制剂的制备方法包括如下步骤：
步骤一、按处方量分别配制浓度为300mM·L-1的醋酸铵溶液5mL和浓度为20mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL；
步骤二、将氢化大豆卵磷脂HSPC 30mg、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺DPPE 15mg、胆固醇15mg和泊洛沙姆9mg溶于氯仿中，旋转蒸发成膜，将所得薄膜真空干燥过夜备用；
步骤三、将醋酸铵溶液5mL加入步骤二所得薄膜中，45℃水浴超声震摇10min使所述薄膜水化；
步骤四、将全氟化碳1mg加入步骤三所得水化体系，冰浴100W超声处理6min得到混悬溶液，4℃条件下透析8h，去除体系中多余的醋酸铵，备用；
步骤五、将浓度为20mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL加入步骤四所得透析后的混悬液中，55℃共孵育30min，冷却至室温后通过0.2μm薄膜来回挤压15次，透析纯化去除未包封的二甲双胍，即得同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂。
实施例17
本实施例提供了一种同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂及其制备方法。
本实施例中脂质纳米制剂的组分包括全氟化碳、二甲双胍或其盐、磷脂、表面活性剂和水相介质，具体原料及组分为：浓度为20mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL、氢化大豆卵磷脂HSPC 30mg和二棕榈酰磷脂酰乙醇胺DPPE 15mg、全氟化碳1mg、胆固醇15mg、泊洛沙姆9mg、浓度为300mM·L-1的醋酸铵溶液5mL。
本实施例脂质纳米制剂的制备方法包括如下步骤：
步骤一、按处方量分别配制浓度为300mM·L-1的醋酸铵溶液5mL和浓度为20mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL；
步骤二、将氢化大豆卵磷脂HSPC 30mg、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺DPPE 15mg、胆固醇15mg和泊洛沙姆9mg溶于氯仿中，旋转蒸发成膜，将所得薄膜真空干燥过夜备用；
步骤三、将醋酸铵溶液5mL加入步骤二所得薄膜中，25℃水浴超声震摇5min使所述薄膜水化；
步骤四、将全氟化碳1mg加入步骤三所得水化体系，冰浴100W超声处理6min得到混悬溶液，4℃条件下透析8h，去除体系中多余的醋酸铵，备用；
步骤五、将浓度为20mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL加入步骤四所得透析后的混悬液中，55℃共孵育30min，冷却至室温后通过0.2μm薄膜来回挤压15次，透析纯化去除未包封的二甲双胍，即得同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂。
实施例18
本实施例提供了一种同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂及其制备方法。
本实施例中脂质纳米制剂的组分包括全氟化碳、二甲双胍或其盐、磷脂、表面活性剂和水相介质，具体原料及组分为：浓度为20mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL、氢化大豆卵磷脂HSPC 30mg和二棕榈酰磷脂酰乙醇胺DPPE 15mg、全氟化碳2mg、胆固醇15mg、泊洛沙姆8mg、浓度为300mM·L-1的醋酸铵溶液5mL。
本实施例脂质纳米制剂的制备方法包括如下步骤：
步骤一、按处方量分别配制浓度为300mM·L-1的醋酸铵溶液5mL和浓度为20mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL；
步骤二、将氢化大豆卵磷脂HSPC 30mg、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺DPPE 15mg、胆固醇15mg和泊洛沙姆8mg溶于氯仿中，旋转蒸发成膜，将所得薄膜真空干燥过夜备用；
步骤三、将醋酸铵溶液5mL加入步骤二所得薄膜中，25℃水浴超声震摇5min使所述薄膜水化；
步骤四、将全氟化碳2mg加入步骤三所得水化体系，冰浴100W超声处理6min得到混悬溶液，4℃条件下透析8h，去除体系中多余的醋酸铵，备用；
步骤五、将浓度为20mg·mL-1的二甲双胍溶液5mL加入步骤四所得透析后的混悬液中，55℃共孵育30min，冷却至室温后通过0.2μm薄膜来回挤压15次，透析纯化去除未包封的二甲双胍，即得同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂。
一、考察本发明制备的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂的显微外观
将实施例14制备的脂质纳米制剂溶液滴加到铜网上，烘干后滴加1滴2％磷钨酸染色液至铜网上染色30s，吸去染色液，烘干后进行TEM拍摄，结果如图1所示；由图1可以看出，本发明准备的脂质纳米制剂形态圆整规则，粒径均一，平均粒径为170nm左右。
二、考察本发明制备的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂的DLS表征
将实施例14透析纯化去除未包封纳米药物后的脂质纳米制剂在4℃放置24h后，用马尔文帕纳科粒径仪对脂质纳米载体的粒径大小，结果如图2所示。继续放置并每周表征一次，得到如图3、图4和图5所示的连续四周检测所得粒径大小、多分散系数PDI和Zeta电位对比图。
从图2-图5中可以看出，本发明制备的脂质纳米制剂具有良好的稳定性，平均粒径为170nm，多分散系数PDI小于0.2，分布较为均一，Zeta电位在-16mV左右。继续放置观察，本实施例制备的脂质纳米制剂在三个月内未发生沉降，具有良好的稳定性。
三、考察本发明制备的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂的DLS表征及包封率
测量并绘制二甲双胍的标准曲线，测定纳米制剂中的药物包封率。
(1)配制200μg/mL的二甲双胍标准溶液，等比稀释为一系列标准样品，经高效液相色谱仪测量后，分析计算结果。绘制出的标准曲线见图6，R2值大于0.999，说明标准曲线线性较好。
(2)包封率测量：采用透析法测定脂质纳米制剂中二甲双胍的含量。
取纳米制剂置于透析管中，在4℃恒温箱中以100r·min-1转速进行透析。精密吸取50μL透析后的脂质体，加入适量甲醇进行超声破乳。按公式计算包封率：
包封率＝(W包封/W投药)×100％，
对实施例1-实施例18所得脂质纳米制剂进行DLS表征、包封率测量及外观稳定性观测，结果如表1所示。
表1
外观稳定性说明：
++:外观均匀、呈白色，一个月内无分层；
+:外观呈均匀、白色，两周内无分层，一个月内无明显分层；
-:外观呈均匀、白色，两周内无明显分层，重新混匀后静置24小时无明显沉降；
--:两周内无明明显分层，混匀后静置24小时内沉降。
由表1数据可以看出，本发明制备的脂质纳米制剂二甲双胍包封率能达到70％以上，具有良好的稳定性且分布均一。
四、考察本发明制备的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂雾化前后DLS表征及经人用雾化装置雾化后的纳米制剂粒径分布图
对实施例1、实施例16和实施例17制备的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂雾化前后DLS进行表征对比，结果如表2所示。
表2
由表2数据可以看出，脂质纳米制剂雾化后粒径均略微增大，三者的Zeta电位增加或基本不变，PDI均不同程度变大，但大小都在0.3左右。这说明制备的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂在雾化后也较为稳定，给小动物雾化给药递送后理化性质与雾化前基本保持一致，动物实验能够较准确的反映本发明纳米制剂的在体疗效。
将实施例16制备的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂经人用雾化装置进行雾化，结果如图7所示，本发明的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂粒径＜1μm的体积占比为7.3％，粒径＜5μm的体积占比为92％，中值粒径为2.33μm；本发明的纳米制剂和灭菌超纯水混合后(v:v＝1:1)，体积占比3.28％的本发明纳米制剂粒径＜1μm，体积占比为87.85％的本发明纳米制剂粒径＜5μm，中值粒径为2.6μm，因为水与纳米制剂的结合可能会致使粒径增大。以上结果说明，本发明制备的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂能够较好的满足人体雾化吸入要求，具有较好的临床应用性。
五、考察本发明制备的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂的释放效果
取1mL本实施例1制备的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂放入透析袋中，在100mL人工模拟肺液中以100转/分钟的速率，在37℃下透析48h。在不同时间点取1mL透析介质，并加入等体积等温度的人工模拟肺液。用高效液相色谱仪测量不同时间点取出的透析介质中的药物浓度，绘制体外累积释放曲线，结果如图8所示。
从图8可以看出，二甲双胍在两个小时内快速完成释放，而同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂48小时内持续缓慢释放，说明本发明提供的脂质纳米制剂能够改善二甲双胍的释放性能，具有良好的缓释效果。
六、考察本发明制备的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂对生物黏膜屏障的穿透能力
用含有等量二甲双胍或其盐的本发明同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂组-MPLN(Rho)-ih、生理盐水稀释的二甲双胍溶液组-MW(Rho)-ih、二甲双胍脂质体组ML(Rho)-ih进行黏膜穿透实验，在0h、0.5h、1h、1.5h、3h、4h和5h分别取相同体积的渗透液，用高效液相色谱仪检测二甲双胍或其盐成分的含量，计算不同分组的液体经家兔气道上皮黏膜渗透吸收的比率。
从图9可知，以脂质作为载体递送二甲双胍或其盐，能够提高二甲双胍的吸收效率。相比另外两组，本发明的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂组具有显著的生物黏膜穿透能力，这对提高药物及其纳米制剂的生物利用度，减少生物屏障阻碍，进而提高动物疗效起着重要的意义。
七、考察本发明制备的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂的体外安全性
肺纤维化研究中常用A549细胞代替肺泡Ⅱ型上皮细胞进行体外研究，肺泡Ⅱ型上皮细胞的损伤、衰老等变化在肺纤维化发生发展过程中起重要作用。
将实施例17制备的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂不同稀释倍数下，和A549细胞体外共孵育，结果如图10所示。
图10显示，本发明制备的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂在不同二甲双胍浓度下均具有良好的体外安全性。
八、通过体内动物实验考察本发明制备的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂的在体疗效和安全性
(1)实验方法：首先将25只C57BL/c小鼠随机分为5组，每组5只，分别为正常对照组(Control)、博来霉素组(BLM)、二甲双胍商品药灌胃组(M-ig)、二甲双胍纳米化脂质体雾化吸入组(ML-ih)、实施例17制备的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂雾化吸入组(MPLN-ih)。本实验使用的二甲双胍脂质体中二甲双胍的浓度与实施例17制备的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂的二甲双胍浓度相同。
IPF小鼠模型建立采用博来霉素诱导，第0天给模型小鼠气管内滴注博来霉素(3.5mg/只)建立IPF小鼠模型，随后隔天监测各组小鼠体重。博来霉素建模1-6天是肺炎向肺纤维化过渡期，之后是肺纤维化期，因此选择在建模后第8天开始隔天给药治疗，能比较客观地反映动物模型给药治疗效果。雾化吸入组每只雾化吸入50μL二甲双胍脂质体或实施例17制备的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂，灌胃组则每只小鼠给相同剂量的二甲双胍商品药灌胃。在第21天取鼠肺，进行组织切片H&E和Masson染色实验，并用试剂盒检测不同处理组小鼠肺组织中的羟脯氨酸含量。
(2)实验结果及评价：
图11为动物实验中不同处理组小鼠20天生存曲线对比图；由图11可以看出，建模后第20天，正常对照组小鼠全部存活，存活率为100％，博来霉素组存活率为20％，而二甲双胍灌胃给药组存活率为60％，二甲双胍脂质体雾化给药组存活率为40％，实施例17制备的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂雾化给药组存活率则为80％；二甲双胍组的存活曲线明显要优于博来霉素组。这说明二甲双胍可以提高肺纤维化小鼠的生存率，且同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂的效果明显优于二甲双胍脂质体和二甲双胍商品药，这说明本发明提供的脂质纳米制剂成功共携载二甲双胍和全氟化碳，能显著增强二甲双胍对特发性肺纤维化的有益治疗效果，这可能是因为全氟化碳不仅携氧改善了病灶部位的氧化应激水平，还能够协助脂质纳米载体穿透粘液屏障的阻碍，将二甲双胍有效递送至病灶部位，大大提高了二甲双胍对肺纤维化动物模型的治疗改善作用。
图12为动物实验中不同处理组小鼠21天体重变化对比图；图13为动物实验中不同处理组小鼠肺组织羟脯氨酸含量对比图，由图12和图13可以看出，实施例17制备的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂相比博来霉素组，对纤维化模型小鼠的体重和生存质量有明显的改善作用，相比等剂量的二甲双胍商品药灌胃给药组以及二甲双胍纳米化脂质体雾化吸入组，也有不同程度的优势作用，且体重变化和羟脯氨酸含量变化趋势相似，一定程度上说明本发明提供的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂具有较好的特发性肺纤维化治疗效果。
图14为不同处理组小鼠肺组织的免疫组化图像。首先，对H&E染色结果进行分析，可见与BLM组相比，治疗组的肺纤维化程度均减弱，其中，MPLN-ih组的效果尤为的好，优于ML-ih、M-ig组，更进一步的，MPLN-ih组与正常肺组织切片表现较为一致，可以看出清晰完整的肺泡结构；再分析Masson染色后肺组织切片的蓝色的胶原蛋白面积，即使不通过定量分析，也可以看出三组治疗组的蓝染面积明显小于BLM组，而其中MPLN-ih组的蓝染面积较另外两个治疗组又明显较少。
综上结果所述，本发明制备的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂，经雾化吸入给药能够有效的治疗肺纤维化。本发明为肺纤维化的治疗提供了一种创新可靠、具有现实临床意义的纳米药物制剂。

Claims (9)

1.一种治疗肺部纤维化的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂，其特征在于，组分包括全氟化碳、二甲双胍或其盐、磷脂、表面活性剂和水相介质，其中所述全氟化碳重量份为 1~2份，所述二甲双胍或其盐重量份为 5~10份，所述磷脂重量份为45~65份，所述表面活性剂重量份为14~29份，所述水相介质与磷脂的体积质量比为10 mL︰45~65 mg。
2.根据权利要求1所述一种治疗肺部纤维化的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂，其特征在于，所述磷脂为卵磷脂、大豆磷脂、氢化大豆卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻磷脂酰胆碱、二油酰基卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、二棕榈酰磷脂酰甘油或二硬脂酰磷脂酰甘油。
3.根据权利要求1或2所述一种治疗肺部纤维化的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂，其特征在于，所述表面活性剂为甘油、明胶、胆固醇、L-半胱氨酸、山梨醇、泊洛沙姆、精氨酸、海藻酸钠、透明质酸、淀粉浆、聚乙二醇、壳聚糖、两性霉素B、维生素C、维生素E、聚胺或硬脂胺中的一种或多种的混合物。
4.根据权利要求3所述一种治疗肺部纤维化的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂，其特征在于，所述水相介质为蒸馏水，或者所述水相介质为蒸馏水与弱酸弱碱或其盐的组合，所述弱酸弱碱或其盐为枸橼酸、枸橼酸钠、磷酸三钠、醋酸铵或硫酸铵中的一种或几种。
5.一种如权利要求1-4所述治疗肺部纤维化的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、用水相介质中的蒸馏水配制二甲双胍或其盐的水溶液；按处方量配制水相介质中的水化液；
步骤二、将磷脂和表面活性剂溶于氯仿中，旋转蒸发成膜，将所得薄膜真空干燥过夜备用；
步骤三、将所述水化液加入步骤二所得薄膜中，25~45 ℃水浴超声震摇5~10 min使所述薄膜水化；
步骤四、将全氟化碳加入步骤三所得水化体系，冰浴100~300 W超声处理6 min得到混悬溶液，4 ℃条件下透析8 h备用；
步骤五、将二甲双胍或其盐的水溶液加入步骤四所得透析后的混悬液中，45~55 ℃共孵育15~30 min，冷却后过膜挤压、透析纯化即得同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂。
6.一种如权利要求1-4所述治疗肺部纤维化的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、用水相介质蒸馏水配置二甲双胍或其盐的水溶液；
步骤二、将磷脂和表面活性剂溶于氯仿中，旋转蒸发成膜，将所得薄膜真空干燥过夜备用；
步骤三、将二甲双胍或其盐的水溶液加入步骤二所得薄膜中，25~45 ℃水浴超声震摇5~10 min使所述薄膜水化；
步骤四、将全氟化碳加入步骤三所得水化体系，冰浴100~300 W超声处理6 min得到混悬溶液，过膜挤压、透析纯化即得同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂。
7.一种如权利要求1-4所述治疗肺部纤维化的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、用水相介质蒸馏水配置二甲双胍或其盐的水溶液；
步骤二、将磷脂和表面活性剂溶于50 ℃纯乙醇中，将所得溶液匀速注入二甲双胍溶液中；
步骤三、待步骤二搅拌体系中的乙醇挥发除尽后加入全氟化碳，冰浴100~300 W超声处理6 min得到混悬溶液，过膜挤压、透析纯化即得同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂。
8.一种如权利要求1-4所述治疗肺部纤维化的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂在制备用于治疗肺部纤维化的药物中的应用，其特征在于，所述用于治疗肺部纤维化的药物为呼吸道给药剂型，还含有药学上可接受的赋形剂。
9.根据权利要求8所述一种治疗肺部纤维化的同时包载全氟化碳和二甲双胍的脂质纳米制剂在制备用于治疗肺部纤维化的药物中的应用，其特征在于，所述呼吸道给药剂型包括雾化吸入剂型、喷雾剂、气雾剂或粉雾剂。
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