[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

CN114703205A - 一种疱疹病毒糖蛋白gE重组蛋白、疫苗、制备方法和应用 - Google Patents

一种疱疹病毒糖蛋白gE重组蛋白、疫苗、制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114703205A
CN114703205A CN202210239561.1A CN202210239561A CN114703205A CN 114703205 A CN114703205 A CN 114703205A CN 202210239561 A CN202210239561 A CN 202210239561A CN 114703205 A CN114703205 A CN 114703205A
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
recombinant
vaccine
bacteroides
thr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210239561.1A
Other languages
English (en)
Inventor
夏慧
傅文彬
茅倩宇
王圆
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Bowei Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Shanghai Bowei Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Bowei Biotechnology Co ltd filed Critical Shanghai Bowei Biotechnology Co ltd
Priority to CN202210239561.1A priority Critical patent/CN114703205A/zh
Publication of CN114703205A publication Critical patent/CN114703205A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • C07K16/085—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus, Epstein-Barr virus
    • C07K16/087—Herpes simplex virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • C07K16/085—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus, Epstein-Barr virus
    • C07K16/088—Varicella-zoster virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G01N33/56994—Herpetoviridae, e.g. cytomegalovirus, Epstein-Barr virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
    • C12N2710/16622—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
    • C12N2710/16634—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16722—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16734—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G01N2333/03—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus
    • G01N2333/035—Herpes simplex virus I or II
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G01N2333/03—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus
    • G01N2333/04—Varicella-zoster virus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种水痘‑带状疱疹病毒糖蛋白gE的重组表达方法，涉及gE蛋白编码基因的优化筛选、重组表达载体的构建、目的菌株的获取、以及目的菌株的发酵培养，其中，所述gE蛋白编码基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述gE蛋白可应用于带状疱疹疫苗的开发。本发明制备的重组gE蛋白抗原得率高、纯度好，免疫原性优良，解决了大肠杆菌中不能直接大量可溶性表达gE蛋白且产量低的问题。本发明还公开了一种疫苗用新型佐剂组合物及其用途。本发明所述gE蛋白与新型佐剂组合物复配制备疫苗，具有明显优异的免疫强化效果，应用前景广泛。

Description

一种疱疹病毒糖蛋白gE重组蛋白、疫苗、制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种水痘-带状疱疹病毒糖蛋白gE重组蛋白、疫苗、制备方法和其应用。
背景技术
水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus，VZV)又称3型人疱疹病毒(humanherpesvirus3，HHV-3)，它与1型和2型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type 1and2，HSV-1and HSV-2)同属于人α-疱疹病毒。VZV主要由四层结构组成，由内至外依次为：双链病毒DNA所组成的圆杆状病毒核心；由162个壳粒构成的直径约为100nm二十面体对称结构，即核衣壳；覆盖在核衣壳外侧，由蛋白质及酶类组成的一层无定型物质，亦称作皮层(tugement)；最外层为囊膜，呈典型脂质双分子层结构，上有大量突起，完整病毒颗粒呈圆形亦或多角形，直径为120～300nm。
VZV具有严格的宿主特异性，仅感染人类。在机体内，不同组织感染VZV会造成不同结果，同时引起不同的临床表型。VZV的初发感染多从上呼吸道粘膜上皮细胞开始，其子代病毒可传播至扁桃体和上呼吸道局部淋巴结，同时感染T细胞，并随循环系统传播至身体不同位点，引起全身弥散性的皮疹——水痘(varicella)。带状疱疹还会诱发其他的并发症，包括脑膜脑炎、脊髓炎、颅神经麻痹、血管病变、角膜炎、视网膜病、溃疡、肝炎、胰腺炎等(Gershon et al.,2015)。
带状疱疹发病非常痛苦，多见于成年人，尤其是大于60岁的老年人群更易发病。随着年龄的增加，老年人群的带状疱疹发病几率也逐步增加，同时相关并发症的发生率也随着年龄的增长而增加。儿童和年轻人也可能出现带状疱疹，但通常其病症较轻，并发症风险较低。每年带状疱疹的发生率约为3/1000。由带状疱疹引起的疼痛可致残，持续数月甚至数年，严重影响老年人的生活质量。抗病毒疗法可有效针对于带状疱疹，能够限制病毒复制，并减少疼痛、病症持续时间、并发症风险，不过无法根治带状疱疹及减缓带状疱疹后遗神经痛(Amlie-Lefond and Gilden,2016)。因此疫苗接种是控制老年人带状疱疹发病和其并发症的有效手段。
现有上市或处于临床研究的重组带状疱疹疫苗，都是利用哺乳动物细胞制备的水痘-带状疱疹病毒的糖蛋白gE，而利用哺乳动物细胞制备疫苗，存在诸多问题，如培养工艺繁琐，成本高，培养后获得的细胞成分复杂，纯化步骤多，不利于大规模生产等。由于gE为糖蛋白，现有技术研究中未能明确糖基化对蛋白功能的影响，以及该蛋白作为抗原激发人体免疫响应时糖基化程度的贡献，致使研究者优先选择糖基化修饰能力更好的哺乳动物细胞生产该蛋白，但目前积累的研究结果表明带状疱疹发病的主要因素是机体针对VZV的细胞免疫响应的减弱，因此有效的抗原成分主要以T细胞表位多肽为主，糖基化修饰对蛋白激发人体细胞免疫响应的影响较小。因此，哺乳动物细胞并不利于构建高水平表达具有较高免疫原性的gE蛋白的表达系统。因此，亟需开发新的表达系统，能够高表达具有较高免疫原性的gE蛋白抗原。
发明内容
在现有技术的基础上，本发明为了克服现有技术中存在的诸多缺陷(如表达产量低，纯化困难、成本高等)，提供了一种成本低廉、稳定、高效的可在细菌中直接可溶性表达疱疹病毒gE蛋白的方法。为了实现高效和可控地表达所需蛋白，本发明构建了gE蛋白多核苷酸编码序列，重组表达载体，重组工程菌，优化了重组gE蛋白的重组表达方法。本发明方法利用的是细菌表达系统，所述细菌表达系统具有培养成本低廉、工艺放大简便等优势，更有助于疱疹病毒疫苗的开发。
本发明一方面是提供一种用于编码gE蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸的序列如SEQID NO：1所示或与SEQ ID NO：1具有90％及以上同一性。
本发明另一方面是提供一种重组表达载体，所述重组表达载体中含有如上所述的多核苷酸。
本发明另一方面是提供一种重组工程菌，所述重组工程菌中含有或者整合有如上所述的重组表达载体。
本发明另一方面是提供一种表达系统，包括如上所述的重组工程菌，所述重组工程菌中含有或者整合有如上所述的重组表达载体。
本发明另一方面是提供一种制备gE蛋白的方法，包括如下步骤：构建整合有或者含有如上所述的多核苷酸的重组工程菌，培养，收集菌体，纯化，即可获得所述gE蛋白。具体地，所述方法包括：
1)构建上述gE蛋白的重组表达载体；
2)将上述重组表达载体转化至细菌中构建重组工程菌；
3)验证重组工程菌，获得正确构建的目的重组工程菌；
4)在特定条件下培养目的重组工程菌，收集培养菌体，破碎菌体获得裂解液，分离纯化裂解液，并进行重组gE蛋白的纯化，得到纯化的所述gE蛋白。
本发明另一方面是提供一种gE蛋白，采用如上所述的用于编码gE蛋白的多核苷酸编码获得或采用如上所述的制备gE蛋白的方法获得。
本发明另一方面是提供如上所述的用于编码gE蛋白的多核苷酸，重组表达载体，重组工程菌，表达系统，或gE蛋白在制备预防和/或治疗由疱疹病毒感染引起的疾病的药物，或在制备针对疱疹病毒的抗体，或在制备疱疹病毒疫苗和/或诊断试剂中的应用。
本发明另一方面是提供一种疫苗佐剂组合物，所述疫苗佐剂组合物包括脂质体和皂苷，所述皂苷和脂质体的体积比为3-6：40-60。
本发明另一方面是提供如上所述的疫苗佐剂组合物在制备疱疹病毒疫苗中的应用。
本发明另一方面是提供一种疱疹病毒疫苗，包含如上所述的用于编码gE蛋白的多核苷酸，重组表达载体，重组工程菌，表达系统，或gE蛋白中的一种或几种。
优选地，所述疱疹病毒疫苗包括gE蛋白、脂质体和皂苷，所述gE蛋白、脂质体和皂苷的用量关系为10-20μg的gE蛋白、30-60μL皂苷和400-600μL脂质体。
本发明所述的应用、方法或制备的疫苗制品中，所述疱疹病毒为水痘-带状疱疹病毒VZV、1型单纯疱疹病毒HSV-1、2型单纯疱疹病毒HSV-2中的一种或几种；优选为水痘-带状疱疹病毒VZV。
如上所述，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种疱疹病毒尤其是水痘-带状疱疹病毒糖蛋白gE的重组表达策略，涉及gE蛋白编码基因的优化筛选、重组表达载体的构建、目的菌株的获取、以及目的菌株的发酵培养，所述gE蛋白的编码基因如SEQ ID NO.1所示，所述gE蛋白可应用带状疱疹疫苗的开发。
本发明对编码gE蛋白的基因序列进行密码子优化，使其更符合大肠杆菌表达系统的密码子偏爱性；此外，本发明还采用了新的分子构建方案，获得重组生物工程菌株pET28a-gE-BL21(DE3)，该重组生物工程菌能够高效表达不带任何标签的gE蛋白，并且易于培养，蛋白表达水平大幅提高，生产工艺简便，原料成本、时间成本、生产成本低和质量控制成本都具有非常明显的优势，安全可控，方便操作，利于后期工艺放大。本发明能够实现在大肠杆菌中大量可溶性表达gE蛋白，制备的重组蛋白抗原得率高、纯度好，免疫原性优良，解决大规模疫苗生产中疱疹病毒不易释放出细胞导致获得的病毒毒力滴度低、纯度低、免疫原性差等缺陷，有助于开发成本更低的疱疹病毒疫苗。本发明的重组蛋白作为疫苗抗原具有安全可控，不会产生较强的毒副反应，不良反应少等优点，是新一代带状疱疹疫苗的有力候选，具有广泛应用前景。
附图说明
图1显示为重组质粒pET28a-gE图谱结构示意图。
图2显示为重组工程菌pET28a-gE-BL21(DE3)的重组gE蛋白表达结果；其中，1：pET28a-gE-BL21(DE3)诱导前；2：pET28a-gE-BL21(DE3)诱导后；3：pET28a-gE-BL21(DE3)破菌上清；4：pET28a-gE-BL21(DE3)破菌沉淀。
图3显示为重组工程菌pET28a-gE-BL21(DE3)发酵培养后重组gE蛋白的纯化结果；其中，1：pET28a-gE-BL21(DE3)发酵破菌上清；2：层析流穿液；3：层析洗脱液。
图4显示为不同疫苗组别免疫小鼠后的血清抗体滴度水平测定结果。
图5显示为不同疫苗组别免疫小鼠后激发的细胞响应；其中，图5A对应IL-2；图5B对应IL-4；图5C对应IL-5；图5D对应IL-10；图5E对应INF-γ；图5F对应TNF-α。
具体实施方式
本发明根据细菌尤其是大肠杆菌密码子偏爱性合成编码gE蛋白的DNA序列，将所述基因连接到表达载体(如大肠杆菌表达载体)上，得到表达gE蛋白的重组质粒。重组质粒通过基因工程方法导入到菌株(如大肠杆菌)中，经验证得到目的重组工程菌株。以所述重组工程菌株为种子，通过发酵培养表达得到重组gE蛋白。通过变复性、柱层析等纯化方法获得高纯度的gE蛋白，纯化后的gE蛋白吸附适当的佐剂(如AS01或其类似物)成为重组疫苗制剂。
为了能够在菌株(如细菌)中高效表达gE蛋白，本发明根据日本疫苗株Oka如SEQID NO.2所示的gE蛋白序列，对gE基因进行分析，通过优化gE基因编码的密码子在原核表达中的密码子偏好性、转录因子结合区、重复序列和RNA高级结构等，对gE蛋白编码基因序列进行优化，获得的优化后的符合菌株(如细菌)密码子偏爱的gE蛋白编码序列，如SEQ IDNO.1所示，其编码的蛋白氨基酸序列仍为SEQ ID NO.2所示。
本发明提供了一种符合细菌密码子偏爱的编码gE蛋白的分离的多核苷酸序列，其可在细菌中表达gE蛋白。
所述核酸分子可以主要由编码本发明所述gE蛋白的核酸序列组成，或可以仅编码本发明所述的gE蛋白。此类核酸分子可以用本领域已知的方法合成。由于遗传密码的简并性，本领域技术人员应理解，不同核酸序列的核酸分子可以编码相同的氨基酸序列。
在一具体实施方式中，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码如SEQ IDNO.2所示的gE蛋白。本领域技术人员可以基于该多核苷酸序列获得其相应的互补序列或RNA序列等，这些内容均在本发明的保护范围内。
进一步地，与SEQ ID No.1具有90％以上序列同一性且具有所述多核苷酸的功能的多核苷酸也在本发明的保护范围内容，具体地，其他具有同一性的多核苷酸包括如SEQID No.1所示的核苷酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)核苷酸而得到的，或者在N-末端和/或C-末端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)核苷酸而得到的，且具有如SEQ ID No.1所示的多核苷酸的功能的多核苷酸。或者，其他具有同一性的多核苷酸可以是与SEQ ID No.1具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上的序列同一性的多核苷酸。
进一步地，与SEQ ID No.2具有90％以上序列同一性且具有所述氨基酸的功能的氨基酸也在本发明的保护范围内容，具体地，其他具有同一性的氨基酸包括如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)氨基酸而得到的，或者在N-末端和/或C-末端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)氨基酸而得到的，且具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸的功能的氨基酸。或者，其他具有同一性的氨基酸可以是与SEQ ID No.2具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上的序列同一性的氨基酸。
本发明还提供了一种gE蛋白重组表达载体(重组质粒)，所述重组表达载体通过质粒改造获得，所述重组表达载体中含有一个或多个拷贝的如上所述的多核苷酸。
进一步地，所述重组表达载体由如SEQ ID No.1所示的符合细菌密码子偏爱的gE蛋白编码序列和载体连接所得。
进一步地，所述细菌为球菌、杆菌螺形菌，选自大肠杆菌、卵形拟杆菌、空肠弯曲菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、多形拟杆菌、普通拟杆菌、单形拟杆菌、干酪乳杆菌、脆弱拟杆菌、鲁氏不动杆菌、具核梭杆菌、乔氏拟杆菌、拟南芥拟杆菌、鼠李糖乳杆菌、马赛拟杆菌、粪副拟杆菌、死亡梭杆菌、finegoldii拟杆菌和短双歧杆菌中的一种或几种。
优选地，所述细菌为大肠杆菌；进一步优选地，所述大肠杆菌选自BL21(包括BL21(DE2)、BL21(DE3)、BL21 star(DE3)、BL21(DE3)PlysS)、BW25113、JM109、MG1655、DH5a、TOP10、HB101、BLR、C43(DE3)、C41(DE3)或TB1；更进一步优选地，所述大肠杆菌为BL21(DE2)。
进一步地，合适的载体可以是载体构建领域已知的，包括启动子的选择和其他调控元件，比如增强子元件。作为优选地，本发明所述载体例如可以选自pET28a、pET30a、pBAD、pcold、pQE、pKK；进一步优选地，所述载体为pET28a。
在一具体实施方式中，本发明提供的gE蛋白的重组表达载体由符合大肠杆菌密码子偏爱的gE蛋白编码序列和载体pET28a连接所得，所述的gE蛋白编码序列如SEQ ID NO.1所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，所述重组表达载体还含有启动子和终止子。
进一步地，所述启动子可以是T7启动子、Trc启动子、Lac启动子和Tac启动子，所述终止子可以为T7终止子。
在一具体实施方式中，所述表达载体为在质粒pET28a的NcoI和HindIII位点之间插入上述多核苷酸。
进一步地，所述重组表达载体中还含有选择标志物基因。
优选地，本发明所述的选择标志物基因优选不包含在目的蛋白的表达片段的核酸表达盒中。因此，在一具体实施方式中，本发明所述重组表达载体还包含一个或多个包含选择标志物基因的核酸表达盒。选择标志物基因的表达可以指示宿主细胞的核酸表达盒已经转化，因此，允许选择经转化的宿主细胞。选择标志物基因盒通常还包括启动子和转录终止子序列，其可操作地连接到所述重组表达载体中。
合适的选择标志物基因可以选自赋予抗生素抗性、视觉标志物或互补宿主细胞营养缺陷的标志物。例如，选择标志物基因可以赋予对抗生素如潮霉素B(如hph基因)、zeocin/腐草霉素(如ble基因)、卡那霉素或G418(如nptII或aphVIII基因)、壮观霉素(如aadA基因)、新霉素(如aphVIII基因)、杀稻瘟素(如bsd基因)、诺尔丝菌素(如natR基因)、嘌呤霉素(如pac基因)和巴龙霉素(如aphVIII基因)或者其他目前常用的抗生素的抗性。也可以使用视觉标志物并包括例如β-葡糖醛酸酶(GUS)、萤光素酶和荧光蛋白，如绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白的任意一种或几种等。也可以使用互补宿主细胞营养缺陷的标志物，营养缺陷的两个突出实例是氨基酸亮氨酸缺陷(例如LEU2基因)或尿嘧啶缺陷(例如URA3基因)。乳清苷-5'-磷酸脱羧酶阴性(ura3-)的细胞不能在缺乏尿嘧啶的培养基上生长。因此，功能性URA3基因可以在具有尿嘧啶缺陷的宿主细胞上用作选择标志物，并且可以在缺乏尿嘧啶的培养基上选择成功的转化体。仅用功能性URA3基因转化的细胞能够合成尿嘧啶并在此类培养基上生长。如果野生型菌株不具有尿嘧啶缺陷，则必须制备具有缺陷的营养缺陷型突变体，以便使用URA3作为菌株的选择标志物。实现这点的方法是本领域公知的。
本发明还提供了一种重组工程菌，该重组工程菌是由上述的gE蛋白重组表达载体转化菌株细胞所得。所述重组工程菌含有或者整合有如上所述的重组表达载体。
所述重组工程菌为细菌；其中，所述细菌选自大肠杆菌、卵形拟杆菌、空肠弯曲菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、多形拟杆菌、普通拟杆菌、单形拟杆菌、干酪乳杆菌、脆弱拟杆菌、鲁氏不动杆菌、具核梭杆菌、乔氏拟杆菌、拟南芥拟杆菌、鼠李糖乳杆菌、马赛拟杆菌、粪副拟杆菌、死亡梭杆菌、finegoldii拟杆菌和短双歧杆菌中的一种或几种；优选地，所述细菌为大肠杆菌；进一步优选地，所述大肠杆菌选自BL21(包括BL21(DE2)、BL21(DE3)、BL21star(DE3)、BL21(DE3)PlysS)、BW25113、JM109、MG1655、DH5a、TOP10、HB101、BLR、C43(DE3)、C41(DE3)或TB1；更进一步优选地，所述大肠杆菌为BL21(DE2)。
在一具体实施方式中，优选的，所述重组工程菌为大肠杆菌BL21(DE2)。
在一具体实施方式中，本发明提供的重组工程菌为重组大肠杆菌，该重组大肠杆菌是由上述的gE蛋白重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)所得。本文用于转化重组工程菌的方法是技术人员所公知的。例如，可以使用如本领域已知的电穿孔和/或化学(例如基于氯化钙或乙酸锂的)转化方法或根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的转化方法。
本发明的另一方面提供了一种用于表达gE蛋白抗原的表达系统，所述表达系统包括所述重组工程菌，所述重组工程菌中含有或者整合有上述重组表达载体。
本发明所述的gE蛋白可以通过任何公知的方法获得，例如，采用如下方法其一进行：
a)采用化学合成的方法合成；
b)将如上所述的重组表达载体转化至重组工程菌中，利用重组工程菌表达gE蛋白；
c)利用如上所述的重组工程菌表达gE蛋白获得。
作为优选地，本发明提供的重组gE蛋白的制备方法，使用如SEQ ID NO.1所示的多核苷酸序列编码gE蛋白，即构建整合有或者含有如SEQ ID NO：1所示的多核苷酸的重组工程菌，培养，收集菌体，破碎菌体获得裂解液，分离纯化裂解液，即可获得gE蛋白。具体地，所述方法包括以下步骤：
1)构建上述gE蛋白重组表达载体；
2)将上述重组表达载体转化至细菌中构建重组工程菌；
3)验证重组工程菌，获得正确构建的目的重组工程菌；
4)在特定条件下培养目的重组工程菌，收集培养菌体并进行重组gE蛋白的纯化。
步骤1)中，设计引物扩增目的gE蛋白区域(1-546aa)的编码序列，并引入NcoI和HindIII酶切位点。利用NcoI和HindIII酶切所扩增的产物和载体，酶切后的产物利用T4DNA连接酶连接，将编码gE蛋白的多核苷酸序列克隆至原核表达载体中，得到含有编码gE蛋白的多核苷酸序列的重组质粒，其中，所述编码gE蛋白的多核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述gE蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
其中，所述引物序列为SEQ ID No.3、SEQ ID No.4。
合适的载体可以是载体构建领域已知的，包括启动子的选择和其他调控元件，比如增强子元件。作为优选地，本发明所述载体例如可以选自pET28a、pET30a、pBAD、pcold、pQE、pKK；进一步优选地，所述载体为pET28a。本发明所述的载体包括适合引入细胞的序列。比如，所述载体可以是表达载体，在该载体中，所述蛋白的编码序列受到它自身顺式作用调控元件的控制，载体的设计便于宿主细胞的基因整合或基因替换等。
进一步地，所述重组表达载体通过质粒改造获得。
步骤1)中，所述重组表达载体中还含有报告蛋白基因编码序列。
步骤2)中，所述细菌选自大肠杆菌、卵形拟杆菌、空肠弯曲菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、多形拟杆菌、普通拟杆菌、单形拟杆菌、干酪乳杆菌、脆弱拟杆菌、鲁氏不动杆菌、具核梭杆菌、乔氏拟杆菌、拟南芥拟杆菌、鼠李糖乳杆菌、马赛拟杆菌、粪副拟杆菌、死亡梭杆菌、finegoldii拟杆菌和短双歧杆菌中的一种或几种；优选地，所述细菌为大肠杆菌；进一步优选地，所述大肠杆菌选自BL21(包括BL21(DE2)、BL21(DE3)、BL21star(DE3)、BL21(DE3)PlysS)、BW25113、JM109、MG1655、DH5a、TOP10、HB101、BLR、C43(DE3)、C41(DE3)或TB1；更进一步优选地，所述大肠杆菌为BL21(DE2)。
步骤2)中，当细菌为大肠杆菌时，将步骤1)中所述重组表达载体转化至大肠杆菌细胞中，得到重组大肠杆菌菌株。
步骤3)中，可通过本领域公知的常规方法验证获得的重组工程菌；例如通过培养、筛选等方法验证步骤2)中获得的重组大肠杆菌菌株，得到正确构建且高度表达的菌株。
步骤4)中，发酵培养步骤3)中所述高度表达的菌株，纯化后得到重组可溶性表达gE蛋白。
步骤4)中，所述特定条件包括种子液培养和发酵培养。
其中，所述种子液培养是指，将重组工程菌株如pET28a-gE-BL21(DE3)，按1:1000比例(v/v)接种于LB培养基中，摇瓶培养16-24小时，获得种子液。
其中，所述发酵培养基的组成为(质量百分比)：十二水磷酸氢二钠1.7％，磷酸二氢钾0.3％，硫酸镁0.0225％，无水氯化钙0.00113％，葡萄糖阿0.5％，硫酸铵0.2％，酵母粉1％，胰蛋白胨1％，氯化钠0.5％。发酵培养过程中补料(质量百分比)：20％酵母粉。
发酵培养条件为：温度37℃，pH7.0，诱导浓度0.5mmol/l IPTG，诱导时间3～4小时，罐压维持在0.04～0.05MPa，溶氧值维持>30％。
本发明还提供了一种重组gE蛋白，采用前述的产生重组gE蛋白的方法获得；进一步地，所述重组gE蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示蛋白或其保守性变异蛋白。
本领域技术人员已知，本发明所述的蛋白/抗原肽可以在氨基酸序列之间的一个或多个位置进行翻译后修饰。
本发明还提供上述蛋白/抗原肽的类似物。这些类似物与天然的蛋白/肽差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白/肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白/抗原肽并不限于上述例举的代表性的肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的蛋白/肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白/肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白/肽。这种修饰可以通过将蛋白/肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白/肽。
本发明还提供了所述编码重组gE蛋白的多核苷酸序列、所述重组表达载体、重组工程菌、表达系统、重组gE蛋白的制备方法、重组gE蛋白在制备用于预防和/或治疗由疱疹病毒感染引起的疾病的药物中的应用。所述疾病包括水痘和带状疱疹、疱疹后神经痛、水痘肺炎，以及由水痘-带状疱疹病毒引起的急性小脑共济失调和脑炎等。所述疱疹病毒为水痘-带状疱疹病毒VZV、1型单纯疱疹病毒HSV-1、2型单纯疱疹病毒HSV-2中的一种或几种；优选为水痘-带状疱疹病毒VZV。
本发明还提供了编码重组gE蛋白的多核苷酸序列、所述重组表达载体、重组工程菌、表达系统、重组gE蛋白的制备方法、重组gE蛋白在制备针对疱疹病毒的抗体中的应用。所述疱疹病毒为水痘-带状疱疹病毒VZV、1型单纯疱疹病毒HSV-1、2型单纯疱疹病毒HSV-2中的一种或几种；优选为水痘-带状疱疹病毒VZV。
本发明还提供了一种所述编码重组gE蛋白的多核苷酸序列、所述重组表达载体、重组工程菌、表达系统、重组gE蛋白的制备方法、重组gE蛋白在制备疱疹病毒疫苗和/或诊断试剂中的应用。该重组gE蛋白可以作为重组带状疱疹疫苗的主要抗原成分，也可以作为联合疫苗、单(多)价疫苗的主要抗原成分，还可以作为疱疹病毒相关研究中抗原、抗体定性、定量检测使用。所述疱疹病毒为水痘-带状疱疹病毒VZV、1型单纯疱疹病毒HSV-1、2型单纯疱疹病毒HSV-2中的一种或几种；优选为水痘-带状疱疹病毒VZV。
本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物中含有如上所述编码重组gE蛋白的多核苷酸序列、重组gE蛋白、重组表达载体或者重组表达系统，以及任选的一种或多种药学上可接受的载体、介质。所述可接受的载体、介质例如无菌水或生理盐水、稳定剂、赋形剂、抗氧化剂(抗坏血酸等)、缓冲剂(磷酸、枸橼酸、其它的有机酸等)、防腐剂、表面活性剂(PEG、Tween等)、螯合剂(EDTA等)、粘合剂等。而且，也可含有其它低分子量的多肽；血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白等蛋白质；甘氨酸、谷酰胺、天冬酰胺、精氨酸和赖氨酸等氨基酸；多糖和单糖等糖类或碳水化物；甘露糖醇或山梨糖醇等糖醇。当制备用于注射的水溶液时，例如生理盐水、含有葡萄糖或其它的辅助药物的等渗溶液，如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化钠，可并用适当的增溶剂例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇，PEG等)、非离子表面活性剂(吐温80，HCO-50)等。
本发明还提供了一种疱疹病毒疫苗的制备方法，包括以下步骤：利用前述的产生gE蛋白的方法，制备gE蛋白，加入药学上可用的疫苗佐剂制备得到所述疱疹病毒疫苗。所述疱疹病毒为水痘-带状疱疹病毒VZV、1型单纯疱疹病毒HSV-1、2型单纯疱疹病毒HSV-2中的一种或几种；优选为水痘-带状疱疹病毒VZV。
本发明还提供了一种疫苗制剂，采用前述的疱疹病毒疫苗的制备方法获得。所述疫苗制剂中含有如上所述重组gE蛋白(抗原肽)和佐剂。
较佳地，所述佐剂可以含有氢氧化铝、磷酸铝、明矾、CpG DNA、poly I:C、脂质体、细菌脂多糖、细菌鞭毛蛋白、细菌类毒素、皂树皂苷、角鲨烯、生育酚等成分，或是这些佐剂成分的提取物、类似物、衍生物及其组合。
更佳地，所述佐剂含有脂质体、MPL、QS-21的组合物。
在一优选实施方式中，所述佐剂组合物包括脂质体和皂苷，所述皂苷和脂质体的体积比为3-6：40-60；优选地，为1：9。
其中，所述脂质体是指由DOPC、胆固醇组成的脂质单层囊泡，所述脂质体中DOPC浓度为2mg/mL、胆固醇浓度为500mg/mL。
其中，所述皂苷是指QS21，浓度为100μg/mL。
进一步地，与上述佐剂组合物混合获得疫苗制品，所述疫苗制品包括gE蛋白、脂质体和皂苷物；所述gE蛋白、脂质体和皂苷的用量关系为10-20μg的gE蛋白、30-60μL皂苷和400-600μL脂质体。
在一具体实施方式中，所述疫苗制品包括gE蛋白(10μg)，50μL皂苷和450μL脂质体。
在一具体实施方式中，本发明疫苗制品可制备单价疫苗，也可制备2-价、3-价、4-价疫苗，等等。
本发明还提供了一种疫苗佐剂组合物，所述疫苗佐剂组合物包括脂质体和皂苷，所述皂苷和脂质体的体积比为3-6：40-60；优选地，为1：9。
本发明还提供了所述疫苗佐剂组合物在制备疱疹病毒疫苗中的应用。所述疫苗佐剂组合物应用于疫苗中，具有明显优异的免疫强化效果。所述疱疹病毒为水痘-带状疱疹病毒VZV、1型单纯疱疹病毒HSV-1、2型单纯疱疹病毒HSV-2中的一种或几种；优选为水痘-带状疱疹病毒VZV。
本发明中，所述组合物或疫苗可以通过药学领域已知的任何方法制备，例如在无菌条件下，通过将活性成分与载体或赋形剂混合。所述药物组合物或疫苗适用于任何适当的给药途径，如注射(包括皮下，肌肉，腹腔或静脉注射)、吸入或口服、或经鼻、或经肛门等途径。所述药物组合物或疫苗的剂型选自：注射剂、注射用无菌粉末、片剂、丸剂、胶囊、锭剂、醑剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、酊剂、气雾剂、粉雾剂、或栓剂。本领域技术人员可根据给药方式，选择合适的制剂形式，例如，适合于口服给药的制剂形式可以是包括但不限于丸剂、片剂、咀嚼剂、胶囊剂、颗粒剂、溶液剂、滴剂、糖浆、气雾剂或粉雾剂等，再例如，适合于胃肠外给药的制剂形式可以是包括但不限于溶液、悬浮液、可复水的干制剂或喷雾剂等，再例如，适合于直肠给药的通常可以是栓剂，再例如，适合注射给药的可以是注射剂、注射用无菌粉末等。
根据用于治疗的疾病或病症、患者的个体年龄和状况等，本发明药物组合物或疫苗等制剂的给药剂量可以在较宽的范围内变化。恰当的给药剂量将由医师最终决定。
本发明中，所述药物组合物或疫苗还可以与其他药物或疫苗联用。所述其他药物或疫苗可以是水痘-带状疱疹病毒相关药物或疫苗，也可以是其他病原体相关药物或疫苗
本发明还提供了一种预防和/或治疗由疱疹病毒感染引起的疾病的方法，所述方法包括向有需要的个体施用本发明所述的编码重组gE蛋白的多核苷酸序列、所述重组表达载体、重组工程菌、表达系统、重组gE蛋白、药物组合物、疫苗中的一种或几种。
上文中，所述疱疹病毒为水痘-带状疱疹病毒VZV、1型单纯疱疹病毒HSV-1、2型单纯疱疹病毒HSV-2中的一种或几种；优选为水痘-带状疱疹病毒VZV。所述由疱疹病毒感染引起的疾病包括水痘和带状疱疹、疱疹后神经痛、水痘肺炎，以及由水痘-带状疱疹病毒引起的急性小脑共济失调和脑炎等。
应当理解，本发明所述gE蛋白质可以或可以不被翻译后修饰，例如糖基化。因此，当提及gE蛋白时，本发明也包括翻译后修饰的蛋白质，例如糖蛋白。
术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用，并且通常是指基本上由核苷酸，例如脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸组成的任何长度的聚合物。核酸可包含嘌呤和/或嘧啶碱基，和/或其他天然的、化学或生物化学修饰的(例如甲基化的)、非天然的或衍生化的核苷酸碱基。核酸的主链可以包含糖和磷酸基团，如通常可以在RNA或DNA中发现的，和/或一种或多种修饰的或取代的(例如，2'-O-烷基化，例如，2'-O-甲基化或2'-O-乙基化；或2'-O,4'-C-炔基化，例如2'-O,4'-C-乙基化)糖或一个或多个修饰或取代的磷酸基团。
术语“核酸表达盒”指包含一种或多种转录控制元件(例如但不限于启动子、增强子、多腺苷酸化序列和内含子)的核酸分子，所述转录控制元件指导与它们可操作地连接的(转)基因表达。
术语“可操作地连接”是指各种核酸分子元件相对于每一种的排列，使得元件功能性连接并且能够在基因表达的背景下彼此相互作用。此类元件可以包括但不限于启动子、增强子、多腺苷酸化序列、一个或多个内含子、以及待表达的感兴趣基因的编码序列(例如目的基因)。当适当取向或可操作地连接时，核酸序列元件一起起作用以确保或调节编码序列的表达。调节是指增加、降低或维持特定元件的活性水平。每个元件相对于其他元件的位置可以以每个元件的5'末端和3'末端而言表示，并且任何特定元件之间的距离可以通过元件之间的居间核苷酸或碱基对的数目来表示。
术语“目的基因”或“编码目的蛋白的基因”是指要在导入有核酸序列的宿主细胞中表达的编码多肽或多肽的一部分的特定核酸序列。如何将核酸序列导入宿主细胞中不是必需的，例如它可以通过整合到基因组中或作为附加型质粒。
术语“启动子”是指能够结合RNA聚合酶并且启动与其可操作连接的一个或多个核酸编码序列(例如目的基因)的转录的核酸序列。启动子通常位于同一链上的基因的转录起始位点附近和核苷酸编码序列的上游(有义链中的5')。启动子可以单独发挥功能以调节转录或可以通过一个或多个调节序列(例如增强子或沉默子)进一步调节。
术语“选择标志物基因”包括赋予表达它的宿主细胞表型以促进鉴定和/或选择用转基因转染或转化的宿主细胞的任何基因。
术语“载体”是指可以接受多核苷酸插入或克隆的多核苷酸分子，优选源自例如质粒、噬菌体或植物病毒的DNA分子。载体优选含有一个或多个独特的限制性内切酶位点，并且可以能够在确定的宿主细胞中自主复制，或者可以整合在确定的宿主的基因组内，使得克隆的序列是可复制的。载体的选择通常取决于载体与要导入载体的宿主细胞的相容性。
术语“重组工程菌”是指用于转化的那些细胞，即用于表达目的基因的细胞。重组工程菌可以是分离的细胞或培养物中培养的细胞系，或者是存在于活组织或生物体中的细胞。在本发明的上下文中，宿主细胞优选是能够在培养物中生长的细胞。
术语“转化”是指将外源核酸导入生物体中，使得核酸可作为染色体外元件或通过染色体整合而复制。
同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1重组gE蛋白工程菌株构建
1.gE蛋白编码基因的选择与密码子的优化设计
编码gE蛋白的氨基酸序列参照日本疫苗株Oka的gE蛋白序列，如SEQ ID NO.2所示。
对SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的对应核苷酸编码序列进行改造，密码子尽可能采用大肠杆菌表达系统中使用频率较高的密码子，同时避免可能影响表达的转录因子结合区、重复序列和RNA高级结构。密码子优化后得到的gE蛋白编码基因序列如SEQ ID NO.1所示。
2.gE蛋白重组表达载体的构建
设计gE蛋白编码基因序列并进行全基因合成，获得SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
设计引物扩增目的gE蛋白区域(1-546aa)的编码序列，并引入NcoI和HindIII酶切位点。利用NcoI和HindIII酶切所扩增的产物和pET28a，酶切后的产物利用T4 DNA连接酶连接，获得重组质粒，将获得的重组质粒转化大肠杆菌DH5α菌株，37℃过夜倒置培养。挑取若干克隆进行PCR鉴定及测序，构建成功的重组质粒命名为pET28a-gE，结构示意图见图1所示。
所述引物序列为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4。
3.gE蛋白重组表达菌株构建
将构建成功的重组质粒pET28a-gE转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株，构建得到的重组工程菌株命名为pET28a-gE-BL21(DE3)。挑取部分克隆进行表达验证，使用SDS-PAGE验证培养菌液中重组gE蛋白的表达情况，具体过程为；1)收集培养菌液，8000rpm离心10min；2)弃去离心上清，并使用pH7.0的Tris-HCl缓冲液重悬菌体；3)重悬后的菌液进行匀浆破碎；4)破碎后的溶液12000rpm离心30min，分别收集离心上清和沉淀。
pET28a-gE-BL21(DE3)的重组gE蛋白的表达结果如图2所示，其中，1：pET28a-gE-BL21(DE3)诱导前培养菌液；2：pET28a-gE-BL21(DE3)诱导后培养菌液；3：pET28a-gE-BL21(DE3)匀浆破菌上清；4：pET28a-gE-BL21(DE3)匀浆破菌沉淀。其中，诱导前是指未加诱导剂IPTG；诱导后是指添加诱导剂IPTG后。由图2可知，重组工程大肠杆菌培养菌体中存在明确的异源蛋白表达条带。gE的理论分子量为61.3kDa，图2中的异源蛋白符合该理论分子量，表明gE蛋白有效表达。
实施例2重组gE蛋白的制备工艺
1.pET28a-gE-BL21(DE3)工程菌株的发酵罐培养
将甘油管保存的pET28a-gE-BL21(DE3)表达菌株，按1:1000比例(v/v)接种于LB培养基中，摇瓶培养16-24小时，获得种子液。将种子液按1:20的比例(v/v)接种至发酵培养基，使大肠杆菌菌体增长，诱导4小时后，终止发酵。离心后收集发酵菌体，用于后续纯化。
其中，发酵培养基的组成为：十二水磷酸氢二钠1.7％，磷酸二氢钾0.3％，硫酸镁0.0225％，无水氯化钙0.00113％，葡萄糖阿0.5％，硫酸铵0.2％，酵母粉1％，胰蛋白胨1％，氯化钠0.5％。发酵培养过程中补料(质量比)：20％酵母粉。
发酵培养条件为：温度37℃，pH7.0，诱导浓度0.5mmol/l IPTG，诱导时间3～4小时。罐压维持在0.04～0.05MPa，溶氧值维持>30％。
2.重组gE蛋白的纯化
将发酵菌体通过匀浆破碎方法进行破壁，发酵破菌上清经SF phenyl层析柱分离纯化，洗脱收集得到纯化蛋白。对发酵破菌上清、层析流穿液和该纯化蛋白进行SDS-PAGE纯度鉴定(如图3)和BCA蛋白定量(结果为0.702mg/mL)。结果表明，重组gE蛋白纯化样品的电泳纯度>85％，表明获得纯化的目的蛋白，冻存于-80℃备用。
图3显示为重组工程菌pET28a-gE-BL21(DE3)发酵培养后重组gE蛋白的纯化结果。其中，1：pET28a-gE-BL21(DE3)发酵破菌上清；2：层析流穿液；3：层析洗脱液。
实施例3重组gE蛋白的免疫原性检测
1.疫苗制备
将实施例2纯化获得的重组gE蛋白和对照蛋白(CHO细胞表达的gE蛋白，蛋白序列为SEQ ID NO.5)分别混合自制佐剂组合物或铝佐剂制备获得VZV疫苗成品。配制比例见表1和表2。
表1自制佐剂组合物配制比例
Figure BDA0003543796550000151
注：根据实际需要配制佐剂组合物的量
2.重组gE蛋白在小鼠体内的免疫原性
取6-8周龄Balb/c雌鼠24只，随机分成3组(A-C组)，每组8只小鼠。疫苗制剂分组和免疫程序见表2。
表2小鼠免疫方案
Figure BDA0003543796550000152
Figure BDA0003543796550000161
(2.1)抗体滴度检测
在免疫后第49天取血，进行抗体滴度检测。具体如下：
以对照gE蛋白包被96孔板，4℃放置过夜，PBST洗板5次。每孔加入封闭液(含5％(质量百分比)奶粉的PBST)，置37℃2小时。PBST洗板5次。血清样品按2倍梯度进行稀释(检测最后得到的数据是能正常显色的最高稀释倍数，称之为抗体滴度。测定抗体滴度时，具体的稀释方案可根据不同实验室、不同检测需求而定)，100μl/孔加入酶标板，室温孵育1小时。PBST洗板5次。每孔加入100μl 1:5000(体积比)稀释的羊抗鼠IgG-HRP(北京鼎国)，室温孵育1小时。PBST洗板5次。每孔加入100μl新鲜配制的显色液(TMB显色)，37℃显色10分钟。每孔加入50μl 2M硫酸终止显色，振荡混匀后使用酶标仪读数，测定波长为450nm，参比波长为620nm。
图4显示重组gE蛋白抗原在小鼠体内的免疫原性，具体为不同疫苗组别免疫小鼠后的血清抗体滴度水平测定结果，由图4可知，免疫含有重组gE蛋白和自制佐剂组合物的疫苗的可诱导小鼠产生高水平的gE特异性抗体反应。
(2.2)细胞免疫水平检测
在免疫49天后处死上述各免疫组中的小鼠，无菌分离A-C每组小鼠脾脏淋巴细胞(每组8只小鼠的脾脏合并后研磨分离得淋巴细胞)，将每组小鼠的淋巴细胞浓度调整为1×107/mL。随后分别取100μL细胞悬液(含106个细胞)，加入预包被好对应细胞因子(IL-2，IL-4，IL-5，IL-10，IFN-γ，TNF-α)抗体的96孔板，针对每个细胞因子抗体包被板而言，每组细胞样品检测8孔(其中4个孔加入gE(全长蛋白)，3个孔加入阳性刺激物刀豆素A(ConA)，1个孔加入培养基作为阴性对照)。随后将96孔板放置于37℃，5％的CO2培养箱中培养24小时后，根据Elispot试剂盒(Cellular Technology Limited，CTL)说明书进行斑点显色并拍照计数。
图5显示重组gE蛋白抗原在小鼠体内的免疫原性，具体为不同疫苗组别免疫小鼠后激发的细胞响应的计数结果，由图5可知，免疫含有重组gE蛋白和佐剂组合物的疫苗的小鼠产生了明显的特异性细胞响应。其中，各图中，柱状图从左至右依次代表A、B、C组。
其中，gE(对照蛋白，即全长蛋白)的作用为：gE蛋白为细胞因子检测所用的刺激抗原，不是对照组的意思。
阳性刺激物的作用为：能够刺激淋巴细胞分泌上述细胞因子，作为实验系统阳性的指标，不是检测实验结果的阳性对照。
图5中的柱状图显示的是3组小鼠免疫的结果，纵坐标具体数值是指106个淋巴细胞中经全长gE蛋白特异性刺激后分泌相应细胞因子的细胞数。例如图5A是指3组小鼠在免疫不同抗原的疫苗后，提取脾脏中的淋巴细胞后，106个淋巴细胞在全长gE蛋白的刺激下，其中能够响应此特异性抗原进而分泌IL-2细胞因子的细胞数。
SEQ ID NO:1
ATGGGCACCGTTAACAAGCCTGTTGTCGGCGTTCTGATGGGCTTCGGTATCATTACTGGCACCCTGAGAATTACCAACCCTGTTAGAGCCTCCGTCCTGAGATACGACGATTTCCACATCGACGAGGACAAGCTGGACACCAACTCCGTTTACGAGCCTTACTACCACTCCGACCACGCAGAATCTTCGTGGGTTAACAGAGGCGAGTCCTCTAGAAAGGCATACGATCACAACTCCCCATACATCTGGCCTAGAAACGATTACGACGGCTTCCTGGAGAACGCCCACGAGCATCACGGTGTTTACAACCAGGGTAGAGGCATTGACTCCGGTGAGAGACTCATGCAGCCTACCCAAATGTCCGCTCAGGAAGACCTGGGCGACGATACTGGTATCCACGTCATCCCTACTCTGAACGGTGACGATAGACACAAGATCGTTAACGTCGACCAGAGACAGTACGGTGACGTCTTCAAGGGTGACCTGAACCCTAAGCCACAAGGTCAGAGACTGATCGAGGTTTCCGTCGAAGAGAACCACCCATTCACTCTGAGAGCACCTATTCAGAGAATCTACGGCGTTAGATATACCGAGACTTGGTCCTTCCTGCCTTCCTTGACCTGCACTGGAGATGCCGCACCTGCCATTCAGCACATCTGTCTGAAGCACACCACTTGCTTCCAAGACGTTGTCGTTGATGTCGACTGCGCAGAGAACACCAAGGAGGACCAACTGGCTGAGATTTCCTACAGATTCCAGGGCAAGAAAGAGGCCGACCAGCCTTGGATTGTTGTCAACACCTCGACTCTGTTCGACGAACTAGAGCTGGACCCACCTGAAATTGAGCCTGGTGTCCTGAAGGTTCTGAGAACTGAGAAGCAATACCTGGGCGTCTACATCTGGAACATGAGAGGCTCCGACGGCACCTCCACTTACGCTACCTTCCTGGTTACCTGGAAGGGTGACGAGAAGACCAGAAACCCAACTCCTGCCGTTACTCCACAGCCTAGAGGTGCAGAGTTTCACATGTGGAACTATCATTCCCACGTCTTCTCCGTTGGAGATACCTTCTCTCTGGCTATGCACCTGCAGTACAAGATTCACGAAGCTCCATTTGACCTGCTCCTTGAGTGGCTGTACGTTCCTATTGATCCTACTTGCCAGCCTATGAGACTGTACTCTACCTGTCTGTACCACCCTAACGCACCTCAGTGTCTTTCTCACATGAACTCCGGATGCACCTTCACCTCCCCTCACCTTGCTCAGAGAGTTGCCTCCACTGTCTATCAGAACTGCGAGCACGCAGACAACTACACCGCCTACTGCCTGGGTATCTCCCACATGGAGCCTTCCTTTGGTCTGATCCTCCACGACGGAGGCACTACCCTGAAGTTCGTTGACACCCCTGAGTCCCTGTCTGGACTCTACGTCTTCGTCGTTTACTTCAACGGTCACGTTGAGGCCGTTGCATACACCGTTGTCTCCACCGTTGACCACTTCGTTAACGCCATTGAGGAAAGAGGCTTCCCTCCAACCGCCGGTCAGCCTCCAGCCACTACCAAGCCTAAGGAGATCACTCCAGTTAACCCTGGTACTTCCCCACTGCTTAGATACGCCGCATGGACCGGCGGACTGGCCTGATAA
SEQ ID NO.2
MGTVNKPVVGVLMGFGIITGTLRITNPVRASVLRYDDFHIDEDKLDTNSVYEPYYHSDHAESSWVNRGESSRKAYDHNSPYIWPRNDYDGFLENAHEHHGVYNQGRGIDSGERLMQPTQMSAQEDLGDDTGIHVIPTLNGDDRHKIVNVDQRQYGDVFKGDLNPKPQGQRLIEVSVEENHPFTLRAPIQRIYGVRYTETWSFLPSLTCTGDAAPAIQHICLKHTTCFQDVVVDVDCAENTKEDQLAEISYRFQGKKEADQPWIVVNTSTLFDELELDPPEIEPGVLKVLRTEKQYLGVYIWNMRGSDGTSTYATFLVTWKGDEKTRNPTPAVTPQPRGAEFHMWNYHSHVFSVGDTFSLAMHLQYKIHEAPFDLLLEWLYVPIDPTCQPMRLYSTCLYHPNAPQCLSHMNSGCTFTSPHLAQRVASTVYQNCEHADNYTAYCLGISHMEPSFGLILHDGGTTLKFVDTPESLSGLYVFVVYFNGHVEAVAYTVVSTVDHFVNAIEERGFPPTAGQPPATTKPKEITPVNPGTSPLLRYAAWTGGLAAVVLLCLVIFLICTAKRMRVKAYRVDKSPYNQSMYYAGLPVDDFEDSESTDTEEEFGNAIGGSHGGSSYTVYIDKTR
SEQ ID NO.3
TCATGCCATGGGCACCGTTAACAAG
SEQ ID NO.4
ACCCAAGCTTATCAGGCCAGTCCGCCG
SEQ ID NO.5
MGTVNKPVVGVLMGFGIITGTLRITNPVRASVLRYDDFHIDEDKLDTNSVYEPYYHSDHAESSWVNRGESSRKAYDHNSPYIWPRNDYDGFLENAHEHHGVYNQGRGIDSGERLMQPTQMSAQEDLGDDTGIHVIPTLNGDDRHKIVNVDQRQYGDVFKGDLNPKPQGQRLIEVSVEENHPFTLRAPIQRIYGVRYTETWSFLPSLTCTGDAAPAIQHICLKHTTCFQDVVVDVDCAENTKEDQLAEISYRFQGKKEADQPWIVVNTSTLFDELELDPPEIEPGVLKVLRTEKQYLGVYIWNMRGSDGTSTYATFLVTWKGDEKTRNPTPAVTPQPRGAEFHMWNYHSHVFSVGDTFSLAMHLQYKIHEAPFDLLLEWLYVPIDPTCQPMRLYSTCLYHPNAPQCLSHMNSGCTFTSPHLAQRVASTVYQNCEHADNYTAYCLGISHMEPSFGLILHDGGTTLKFVDTPESLSGLYVFVVYFNGHVEAVAYTVVSTVDHFVNAIEERGFPPTAGQPPATTKPKEITPVNPGTSPLIRYAAWTGGLA
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
序列表
<110> 上海博唯生物科技有限公司
<120> 一种疱疹病毒糖蛋白gE重组蛋白、疫苗、制备方法和应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1644
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgggcaccg ttaacaagcc tgttgtcggc gttctgatgg gcttcggtat cattactggc 60
accctgagaa ttaccaaccc tgttagagcc tccgtcctga gatacgacga tttccacatc 120
gacgaggaca agctggacac caactccgtt tacgagcctt actaccactc cgaccacgca 180
gaatcttcgt gggttaacag aggcgagtcc tctagaaagg catacgatca caactcccca 240
tacatctggc ctagaaacga ttacgacggc ttcctggaga acgcccacga gcatcacggt 300
gtttacaacc agggtagagg cattgactcc ggtgagagac tcatgcagcc tacccaaatg 360
tccgctcagg aagacctggg cgacgatact ggtatccacg tcatccctac tctgaacggt 420
gacgatagac acaagatcgt taacgtcgac cagagacagt acggtgacgt cttcaagggt 480
gacctgaacc ctaagccaca aggtcagaga ctgatcgagg tttccgtcga agagaaccac 540
ccattcactc tgagagcacc tattcagaga atctacggcg ttagatatac cgagacttgg 600
tccttcctgc cttccttgac ctgcactgga gatgccgcac ctgccattca gcacatctgt 660
ctgaagcaca ccacttgctt ccaagacgtt gtcgttgatg tcgactgcgc agagaacacc 720
aaggaggacc aactggctga gatttcctac agattccagg gcaagaaaga ggccgaccag 780
ccttggattg ttgtcaacac ctcgactctg ttcgacgaac tagagctgga cccacctgaa 840
attgagcctg gtgtcctgaa ggttctgaga actgagaagc aatacctggg cgtctacatc 900
tggaacatga gaggctccga cggcacctcc acttacgcta ccttcctggt tacctggaag 960
ggtgacgaga agaccagaaa cccaactcct gccgttactc cacagcctag aggtgcagag 1020
tttcacatgt ggaactatca ttcccacgtc ttctccgttg gagatacctt ctctctggct 1080
atgcacctgc agtacaagat tcacgaagct ccatttgacc tgctccttga gtggctgtac 1140
gttcctattg atcctacttg ccagcctatg agactgtact ctacctgtct gtaccaccct 1200
aacgcacctc agtgtctttc tcacatgaac tccggatgca ccttcacctc ccctcacctt 1260
gctcagagag ttgcctccac tgtctatcag aactgcgagc acgcagacaa ctacaccgcc 1320
tactgcctgg gtatctccca catggagcct tcctttggtc tgatcctcca cgacggaggc 1380
actaccctga agttcgttga cacccctgag tccctgtctg gactctacgt cttcgtcgtt 1440
tacttcaacg gtcacgttga ggccgttgca tacaccgttg tctccaccgt tgaccacttc 1500
gttaacgcca ttgaggaaag aggcttccct ccaaccgccg gtcagcctcc agccactacc 1560
aagcctaagg agatcactcc agttaaccct ggtacttccc cactgcttag atacgccgca 1620
tggaccggcg gactggcctg ataa 1644
<210> 2
<211> 623
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Gly Thr Val Asn Lys Pro Val Val Gly Val Leu Met Gly Phe Gly
1 5 10 15
Ile Ile Thr Gly Thr Leu Arg Ile Thr Asn Pro Val Arg Ala Ser Val
20 25 30
Leu Arg Tyr Asp Asp Phe His Ile Asp Glu Asp Lys Leu Asp Thr Asn
35 40 45
Ser Val Tyr Glu Pro Tyr Tyr His Ser Asp His Ala Glu Ser Ser Trp
50 55 60
Val Asn Arg Gly Glu Ser Ser Arg Lys Ala Tyr Asp His Asn Ser Pro
65 70 75 80
Tyr Ile Trp Pro Arg Asn Asp Tyr Asp Gly Phe Leu Glu Asn Ala His
85 90 95
Glu His His Gly Val Tyr Asn Gln Gly Arg Gly Ile Asp Ser Gly Glu
100 105 110
Arg Leu Met Gln Pro Thr Gln Met Ser Ala Gln Glu Asp Leu Gly Asp
115 120 125
Asp Thr Gly Ile His Val Ile Pro Thr Leu Asn Gly Asp Asp Arg His
130 135 140
Lys Ile Val Asn Val Asp Gln Arg Gln Tyr Gly Asp Val Phe Lys Gly
145 150 155 160
Asp Leu Asn Pro Lys Pro Gln Gly Gln Arg Leu Ile Glu Val Ser Val
165 170 175
Glu Glu Asn His Pro Phe Thr Leu Arg Ala Pro Ile Gln Arg Ile Tyr
180 185 190
Gly Val Arg Tyr Thr Glu Thr Trp Ser Phe Leu Pro Ser Leu Thr Cys
195 200 205
Thr Gly Asp Ala Ala Pro Ala Ile Gln His Ile Cys Leu Lys His Thr
210 215 220
Thr Cys Phe Gln Asp Val Val Val Asp Val Asp Cys Ala Glu Asn Thr
225 230 235 240
Lys Glu Asp Gln Leu Ala Glu Ile Ser Tyr Arg Phe Gln Gly Lys Lys
245 250 255
Glu Ala Asp Gln Pro Trp Ile Val Val Asn Thr Ser Thr Leu Phe Asp
260 265 270
Glu Leu Glu Leu Asp Pro Pro Glu Ile Glu Pro Gly Val Leu Lys Val
275 280 285
Leu Arg Thr Glu Lys Gln Tyr Leu Gly Val Tyr Ile Trp Asn Met Arg
290 295 300
Gly Ser Asp Gly Thr Ser Thr Tyr Ala Thr Phe Leu Val Thr Trp Lys
305 310 315 320
Gly Asp Glu Lys Thr Arg Asn Pro Thr Pro Ala Val Thr Pro Gln Pro
325 330 335
Arg Gly Ala Glu Phe His Met Trp Asn Tyr His Ser His Val Phe Ser
340 345 350
Val Gly Asp Thr Phe Ser Leu Ala Met His Leu Gln Tyr Lys Ile His
355 360 365
Glu Ala Pro Phe Asp Leu Leu Leu Glu Trp Leu Tyr Val Pro Ile Asp
370 375 380
Pro Thr Cys Gln Pro Met Arg Leu Tyr Ser Thr Cys Leu Tyr His Pro
385 390 395 400
Asn Ala Pro Gln Cys Leu Ser His Met Asn Ser Gly Cys Thr Phe Thr
405 410 415
Ser Pro His Leu Ala Gln Arg Val Ala Ser Thr Val Tyr Gln Asn Cys
420 425 430
Glu His Ala Asp Asn Tyr Thr Ala Tyr Cys Leu Gly Ile Ser His Met
435 440 445
Glu Pro Ser Phe Gly Leu Ile Leu His Asp Gly Gly Thr Thr Leu Lys
450 455 460
Phe Val Asp Thr Pro Glu Ser Leu Ser Gly Leu Tyr Val Phe Val Val
465 470 475 480
Tyr Phe Asn Gly His Val Glu Ala Val Ala Tyr Thr Val Val Ser Thr
485 490 495
Val Asp His Phe Val Asn Ala Ile Glu Glu Arg Gly Phe Pro Pro Thr
500 505 510
Ala Gly Gln Pro Pro Ala Thr Thr Lys Pro Lys Glu Ile Thr Pro Val
515 520 525
Asn Pro Gly Thr Ser Pro Leu Leu Arg Tyr Ala Ala Trp Thr Gly Gly
530 535 540
Leu Ala Ala Val Val Leu Leu Cys Leu Val Ile Phe Leu Ile Cys Thr
545 550 555 560
Ala Lys Arg Met Arg Val Lys Ala Tyr Arg Val Asp Lys Ser Pro Tyr
565 570 575
Asn Gln Ser Met Tyr Tyr Ala Gly Leu Pro Val Asp Asp Phe Glu Asp
580 585 590
Ser Glu Ser Thr Asp Thr Glu Glu Glu Phe Gly Asn Ala Ile Gly Gly
595 600 605
Ser His Gly Gly Ser Ser Tyr Thr Val Tyr Ile Asp Lys Thr Arg
610 615 620
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcatgccatg ggcaccgtta acaag 25
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acccaagctt atcaggccag tccgccg 27
<210> 5
<211> 546
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Gly Thr Val Asn Lys Pro Val Val Gly Val Leu Met Gly Phe Gly
1 5 10 15
Ile Ile Thr Gly Thr Leu Arg Ile Thr Asn Pro Val Arg Ala Ser Val
20 25 30
Leu Arg Tyr Asp Asp Phe His Ile Asp Glu Asp Lys Leu Asp Thr Asn
35 40 45
Ser Val Tyr Glu Pro Tyr Tyr His Ser Asp His Ala Glu Ser Ser Trp
50 55 60
Val Asn Arg Gly Glu Ser Ser Arg Lys Ala Tyr Asp His Asn Ser Pro
65 70 75 80
Tyr Ile Trp Pro Arg Asn Asp Tyr Asp Gly Phe Leu Glu Asn Ala His
85 90 95
Glu His His Gly Val Tyr Asn Gln Gly Arg Gly Ile Asp Ser Gly Glu
100 105 110
Arg Leu Met Gln Pro Thr Gln Met Ser Ala Gln Glu Asp Leu Gly Asp
115 120 125
Asp Thr Gly Ile His Val Ile Pro Thr Leu Asn Gly Asp Asp Arg His
130 135 140
Lys Ile Val Asn Val Asp Gln Arg Gln Tyr Gly Asp Val Phe Lys Gly
145 150 155 160
Asp Leu Asn Pro Lys Pro Gln Gly Gln Arg Leu Ile Glu Val Ser Val
165 170 175
Glu Glu Asn His Pro Phe Thr Leu Arg Ala Pro Ile Gln Arg Ile Tyr
180 185 190
Gly Val Arg Tyr Thr Glu Thr Trp Ser Phe Leu Pro Ser Leu Thr Cys
195 200 205
Thr Gly Asp Ala Ala Pro Ala Ile Gln His Ile Cys Leu Lys His Thr
210 215 220
Thr Cys Phe Gln Asp Val Val Val Asp Val Asp Cys Ala Glu Asn Thr
225 230 235 240
Lys Glu Asp Gln Leu Ala Glu Ile Ser Tyr Arg Phe Gln Gly Lys Lys
245 250 255
Glu Ala Asp Gln Pro Trp Ile Val Val Asn Thr Ser Thr Leu Phe Asp
260 265 270
Glu Leu Glu Leu Asp Pro Pro Glu Ile Glu Pro Gly Val Leu Lys Val
275 280 285
Leu Arg Thr Glu Lys Gln Tyr Leu Gly Val Tyr Ile Trp Asn Met Arg
290 295 300
Gly Ser Asp Gly Thr Ser Thr Tyr Ala Thr Phe Leu Val Thr Trp Lys
305 310 315 320
Gly Asp Glu Lys Thr Arg Asn Pro Thr Pro Ala Val Thr Pro Gln Pro
325 330 335
Arg Gly Ala Glu Phe His Met Trp Asn Tyr His Ser His Val Phe Ser
340 345 350
Val Gly Asp Thr Phe Ser Leu Ala Met His Leu Gln Tyr Lys Ile His
355 360 365
Glu Ala Pro Phe Asp Leu Leu Leu Glu Trp Leu Tyr Val Pro Ile Asp
370 375 380
Pro Thr Cys Gln Pro Met Arg Leu Tyr Ser Thr Cys Leu Tyr His Pro
385 390 395 400
Asn Ala Pro Gln Cys Leu Ser His Met Asn Ser Gly Cys Thr Phe Thr
405 410 415
Ser Pro His Leu Ala Gln Arg Val Ala Ser Thr Val Tyr Gln Asn Cys
420 425 430
Glu His Ala Asp Asn Tyr Thr Ala Tyr Cys Leu Gly Ile Ser His Met
435 440 445
Glu Pro Ser Phe Gly Leu Ile Leu His Asp Gly Gly Thr Thr Leu Lys
450 455 460
Phe Val Asp Thr Pro Glu Ser Leu Ser Gly Leu Tyr Val Phe Val Val
465 470 475 480
Tyr Phe Asn Gly His Val Glu Ala Val Ala Tyr Thr Val Val Ser Thr
485 490 495
Val Asp His Phe Val Asn Ala Ile Glu Glu Arg Gly Phe Pro Pro Thr
500 505 510
Ala Gly Gln Pro Pro Ala Thr Thr Lys Pro Lys Glu Ile Thr Pro Val
515 520 525
Asn Pro Gly Thr Ser Pro Leu Ile Arg Tyr Ala Ala Trp Thr Gly Gly
530 535 540
Leu Ala
545

Claims (12)

1.一种用于编码gE蛋白的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO：1所示或与SEQ ID NO：1具有90％及以上同一性。
2.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体中含有如权利要求1所述的多核苷酸；和/或，所述重组表达载体由pET28a-gE构建获得。
3.一种重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌中含有或者整合有如权利要求2所述的重组表达载体。
4.如权利要求3所述的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌为重组细菌；
其中，所述细菌选自大肠杆菌、卵形拟杆菌、空肠弯曲菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、多形拟杆菌、普通拟杆菌、单形拟杆菌、干酪乳杆菌、脆弱拟杆菌、鲁氏不动杆菌、具核梭杆菌、乔氏拟杆菌、拟南芥拟杆菌、鼠李糖乳杆菌、马赛拟杆菌、粪副拟杆菌、梭杆菌、finegoldii拟杆菌和短双歧杆菌中的一种或几种；优选的，所述重组工程菌为重组大肠杆菌。
5.如权利要求4所述的重组工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌选自BL21、BW25113、JM109、MG1655、DH5a、TOP10、HB101、BLR、C43(DE3)、C41(DE3)或TB1中的一种或几种，所述BL21选自BL21(DE2)、BL21(DE3)、BL21 star(DE3)或BL21(DE3)PlysS；优选地，所述大肠杆菌为BL21(DE2)。
6.一种表达系统，其特征在于，包括如权利要求3～5之任一项所述的重组工程菌。
7.一种制备gE蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：培养如权利要求3～5之任一项所述的重组工程菌，收集菌体，纯化，获得所述gE蛋白。
8.一种gE蛋白，其特征在于，采用如权利要求7所述的制备gE蛋白的方法获得。
9.如权利要求1所述的多核苷酸，或权利要求2所述的重组表达载体，或权利要求3～6之任一项所述的重组工程菌，或权利要求6所述的表达系统，或权利要求8所述的gE蛋白在制备预防和/或治疗由疱疹病毒感染引起的疾病的药物，或在制备针对疱疹病毒的抗体，或在制备疱疹病毒疫苗和/或诊断试剂中的应用。
10.一种疱疹病毒疫苗，其特征在于，包含如权利要求1所述的多核苷酸，或权利要求2所述的重组表达载体，或权利要求3～5之任一项所述的重组工程菌，或权利要求6所述的表达系统，或权利要求8所述的gE蛋白中的一种或几种。
11.如权利要求10所述的疱疹病毒疫苗，其特征在于，所述疱疹病毒疫苗包括gE蛋白、脂质体和皂苷，所述gE蛋白、脂质体和皂苷的用量关系为：10-20μg的gE蛋白、30-60μL皂苷和400-600μL脂质体。
12.如权利要求9所述的应用或如权利要求10或11所述的疱疹病毒疫苗，其特征在于，所述疱疹病毒为水痘-带状疱疹病毒VZV、1型单纯疱疹病毒HSV-1、2型单纯疱疹病毒HSV-2中的一种或几种；优选为水痘-带状疱疹病毒VZV。
CN202210239561.1A 2022-03-11 2022-03-11 一种疱疹病毒糖蛋白gE重组蛋白、疫苗、制备方法和应用 Pending CN114703205A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210239561.1A CN114703205A (zh) 2022-03-11 2022-03-11 一种疱疹病毒糖蛋白gE重组蛋白、疫苗、制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210239561.1A CN114703205A (zh) 2022-03-11 2022-03-11 一种疱疹病毒糖蛋白gE重组蛋白、疫苗、制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114703205A true CN114703205A (zh) 2022-07-05

Family

ID=82169448

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210239561.1A Pending CN114703205A (zh) 2022-03-11 2022-03-11 一种疱疹病毒糖蛋白gE重组蛋白、疫苗、制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114703205A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118085111A (zh) * 2024-04-28 2024-05-28 天津中逸安健生物科技有限公司 一种融合蛋白gE-Fc及其在制备重组带状疱疹疫苗中的应用

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107022559A (zh) * 2016-12-08 2017-08-08 长春祈健生物制品有限公司 一种水痘‑带状疱疹病毒糖蛋白e胞外区蛋白的制备方法
CN109234302A (zh) * 2017-07-10 2019-01-18 武汉博沃生物科技有限公司 水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e基因表达载体及其重组酵母菌株与应用
CN109602901A (zh) * 2019-01-08 2019-04-12 成都迈科康生物科技有限公司 一种带状疱疹病毒疫苗及其制备方法和应用
CN110621339A (zh) * 2017-04-28 2019-12-27 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 疫苗接种
CN111032080A (zh) * 2017-05-30 2020-04-17 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 用于制造佐剂的新型方法
CN111670044A (zh) * 2017-12-01 2020-09-15 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 皂苷纯化
CN112142828A (zh) * 2019-06-28 2020-12-29 怡道生物科技(苏州)有限公司 一种gE基因及表达该基因的载体
CN113226364A (zh) * 2018-11-06 2021-08-06 牛津大学科技创新有限公司 组合物和方法
CN113683704A (zh) * 2021-07-28 2021-11-23 安徽智飞龙科马生物制药有限公司 一种水痘-带状疱疹病毒r-gE融合蛋白、重组水痘-带状疱疹疫苗及其制备方法和应用

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107022559A (zh) * 2016-12-08 2017-08-08 长春祈健生物制品有限公司 一种水痘‑带状疱疹病毒糖蛋白e胞外区蛋白的制备方法
CN110621339A (zh) * 2017-04-28 2019-12-27 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 疫苗接种
CN111032080A (zh) * 2017-05-30 2020-04-17 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 用于制造佐剂的新型方法
CN109234302A (zh) * 2017-07-10 2019-01-18 武汉博沃生物科技有限公司 水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e基因表达载体及其重组酵母菌株与应用
CN111670044A (zh) * 2017-12-01 2020-09-15 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 皂苷纯化
CN113226364A (zh) * 2018-11-06 2021-08-06 牛津大学科技创新有限公司 组合物和方法
CN109602901A (zh) * 2019-01-08 2019-04-12 成都迈科康生物科技有限公司 一种带状疱疹病毒疫苗及其制备方法和应用
CN112142828A (zh) * 2019-06-28 2020-12-29 怡道生物科技(苏州)有限公司 一种gE基因及表达该基因的载体
CN113683704A (zh) * 2021-07-28 2021-11-23 安徽智飞龙科马生物制药有限公司 一种水痘-带状疱疹病毒r-gE融合蛋白、重组水痘-带状疱疹疫苗及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WAGENAAR,T.R等: "Human herpesvirus 3 isolate 376VZV glycoprotein E gene, complete cds", 《GENBANK: AY253674.1》 *
高燕等: "水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E原核表达及免疫反应初步评价", 《国际病毒学杂志》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118085111A (zh) * 2024-04-28 2024-05-28 天津中逸安健生物科技有限公司 一种融合蛋白gE-Fc及其在制备重组带状疱疹疫苗中的应用
CN118085111B (zh) * 2024-04-28 2024-08-09 天津中逸安健生物科技有限公司 一种融合蛋白gE-Fc及其在制备重组带状疱疹疫苗中的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7464789B2 (ja) ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対するタンパク質及びワクチン
CN113164586B (zh) 免疫组合物及其制备方法与应用
JP2022515271A (ja) 組換え水痘帯状疱疹ウイルスワクチン
JPH11501804A (ja) 免疫治療剤として役立つポリペプチド及びポリペプチド調製の方法
CN112142829B (zh) 水痘-带状疱疹病毒gE蛋白突变体及其表达方法
JPH06502989A (ja) 単純ヘルペスウィルスのｖｐ１６のワクチン
CN114891072B (zh) 预防和/或治疗疱疹病毒的截短的疫苗抗原肽及其制备方法和应用
CN112142828B (zh) 一种gE基因及表达该基因的载体
CN114163505B (zh) 猪瘟、猪伪狂犬病毒二联亚单位疫苗及其制备方法
CN114703205A (zh) 一种疱疹病毒糖蛋白gE重组蛋白、疫苗、制备方法和应用
CN113862284B (zh) 一种编码重组禽流感病毒ha蛋白的基因、病毒样颗粒、疫苗及制备与应用
JPH05509226A (ja) Ｅｈｖ―４糖蛋白質ワクチン
CN108503696B (zh) 一种酵母细胞表达的寨卡病毒亚单位疫苗
CN114702556A (zh) 一种冠状病毒rbd变异体及其应用
CN110229219B (zh) 一种新型的呼吸道合胞病毒疫苗抗原的制备方法及其用途
CN106905434A (zh) 一种包含蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的重组融合蛋白及其制备方法和应用
CN117003892A (zh) 一种含有PADRE和Fc的gE融合蛋白及其制备方法和应用
CN111454989A (zh) 一种嵌合型基因i型乙型脑炎病毒病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用
CN115161344A (zh) 一种针对呼吸道合胞病毒感染的疫苗的制备方法
CN111729078B (zh) 鸡传染性贫血病毒基因工程疫苗
CN115322247A (zh) 一种新型冠状病毒受体结合区电荷突变体抗原及应用
CN117003895B (zh) 一种含有IL2、Fc和PADRE的gE融合蛋白及其制备方法和应用
CN117003891B (zh) 一种含有P2和Fc的gE融合蛋白及其制备方法和应用
CN117003896B (zh) 一种含有P2和PADRE表位的gE融合蛋白及其制备方法和应用
CN117003893B (zh) 一种含有IL-2和P2表位的gE融合蛋白及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20220705

RJ01 Rejection of invention patent application after publication